(LUẬN án TIẾN sĩ) bệnh tiêu chảy cấp trên heo (porcine epidemic diarrhea) tại đồng bằng sông cửu long đặc điểm bệnh học và di truyền virus

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

HUỲNH MINH TRÍ

Bệnh Tiêu Chảy Cấp Trên Heo
(Porcine Epidemic Diarrhea)
Tại Đồng Bằng Sông Cửu Long: Đặc
Điểm Bệnh Học và Di Truyền Virus

LUẬN ÁN TIẾN SĨ
CHUYÊN NGÀNH BỆNH LÝ HỌC VÀ CHỮA BỆNH VẬT NUÔI

MÃ NGÀNH: 62 64 01 02

2022

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

HUỲNH MINH TRÍ
Mã số NCS: P1014007

Bệnh Tiêu Chảy Cấp Trên Heo
(Porcine Epidemic Diarrhea)
Tại Đồng Bằng Sông Cửu Long: Đặc
Điểm Bệnh Học và Di Truyền Virus
LUẬN ÁN TIẾN SĨ

CHUYÊN NGÀNH BỆNH LÝ HỌC VÀ CHỮA BỆNH VẬT NUÔI

MÃ NGÀNH: 62 64 01 02

Ngƣời hƣớng dẫn

PGS TS Nguyễn Ngọc Hải

2022
0

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


TÓM TẮT
Nghiên cứu đƣợc thực hiện từ 01/2015 – 12/2018 nhằm xác định sự lƣu
hành của Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV); xác định các đặc điểm
bệnh học và phân tích di truyền của các chủng PEDV tại một số tỉnh Đồng
bằng sông Cửu Long.
Kết quả khảo sát tỷ lệ lƣu hành PEDV bằng phƣơng pháp ELISA tại 431
cơ sở chăn ni heo nái chƣa tiêm phịng vaccine PED, với 1.605 mẫu huyết
thanh heo nái tại một số tỉnh Đồng bằng sơng Cửu Long ghi nhận, có 206 cơ
sở (47,80%) với 408 mẫu huyết thanh (25,42%) có kháng thể kháng PEDV.
Trong đó, tỷ lệ lƣu hành PEDV cao nhất ở tỉnh Tiền Giang (33,72%) và thấp
nhất ở Đồng Tháp (17,06%). Tỷ lệ cá thể nái có kháng thể kháng PEDV cao
nhất ở qui mô 50 - 100 nái với tỷ lệ 27,04%; trên 100 nái (26,83%); 20 đến
dƣới 50 nái (26,76%); 10 đến dƣới 20 nái (25,21) và thấp nhất ở qui mô dƣới
10 nái (19,75%). Khảo sát hàm lƣợng kháng thể kháng PEDV cho thấy, trung
bình tỷ số S/P ở các cơ sở đã xảy ra dịch PED đều trên 1 (1,340 – 1,797),
trong khi ở những cơ sở chƣa xảy ra dịch PED dƣới 1 (0,740 – 0,885).

Phân tích các yếu tố nguy cơ có liên quan đến bệnh PED cho thấy, nguy
cơ cao nhất là không sát trùng chuồng trại hoặc sát trùng chuồng trại ít hơn 2
tuần/lần (OR = 3,22), khơng có hố sát trùng trƣớc trại (OR = 3,01), khoảng
cách với các hộ chăn ni có dịch bệnh (OR = 2,26) và mua con giống bên
ngoài (OR = 2,06).
Khảo sát tình hình dịch bệnh PED tại một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu
Long cho thấy, 20,76% (109/525) heo nái mắc bệnh tiêu chảy do PEDV, và tỷ
lệ nhiễm PEDV trên heo con theo mẹ mắc bệnh tiêu chảy là 27,72%
(627/2.262). Tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ chết trong các ổ dịch tiêu chảy cấp trên
heo con theo mẹ tƣơng ứng là 97,97% (627/640 con) và 80,70% (506/627),
trong đó, tỷ lệ bệnh và chết cao nhất là ở giai đoạn heo con dƣới 7 ngày tuổi
(tƣơng ứng 100 và 84,47%), kế đến ở giai đoạn 7 – 10 ngày tuổi (97,71 và
77,34%) và thấp nhất là giai đoạn trên 10 ngày tuổi (88,10 và 64,86%).
Triệu chứng lâm sàng đặc trƣng trên heo con theo mẹ trong các ổ dịch
PED là tiêu chảy phân lỏng, nhiều nƣớc, màu vàng và xanh, đơi khi kèm theo
ói. Bệnh tích đại thể đặc trƣng là dạ dày căng phồng, chứa nhiều sữa vón cục
khơng tiêu hóa, thành ruột non bị bào mỏng, trong suốt, ruột già phồng to,
thành ruột mỏng. Bệnh tích vi thể đặc trƣng là lơng nhung ruột non bị đứt nát,
bong tróc ra và ngắn lại, biểu mô tuyến ruột già đứt nát, niêm mạc dạ dày hoại
tử bong tróc, hạch màng treo ruột sung huyết. Trên heo nái, triệu chứng lâm
sàng chủ yếu là tiêu chảy phân lỏng màu xám.
Khảo sát mức tƣơng đồng trình tự nucleotidevà amino acid gene E của
10 chủng thu thập tại 5 tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long cho thấy, mức độ
tƣơng đồng trình tự nucleotide từ 98,2 – 100%, và 96,1 – 99,7% với các chủng
tham khảo ở châu Á, Âu và Mỹ. Mức tƣơng đồng về trình tự amino acid giữa
các chủng trong nghiên cứu là 97,3 – 100%, và 93,4 – 100% với các chủng ở

LUAN VAN CHAT LUONG download : add

châu Á, Âu và Mỹ. Dựa trên gene E, các chủng trong nghiên cứu thuộc nhóm
G2.
Tƣơng đồng trình tự nucleotide gene M giữa 10 chủng dao động từ 98,6 100%, và 97,2 – 99,8% với các chủng ở châu Á, Âu và Mỹ. Mức tƣơng đồng
về trình tự amino acid gene M giữa các chủng trong nghiên cứu là 98,6 100%, và với các chủng ở châu Á, Âu và Mỹ là 96,9 – 100%. Dựa trên gene
M, các chủng trong nghiên cứu thuộc phân nhóm G2 – 2.
Gene N giữa các chủng có sự tƣơng đồng về trình tự nucleotide từ 97,2 –
100%, và 94,6 – 98,7% với các chủng ở châu Á, Âu và Mỹ. Mức tƣơng đồng
về trình tự amino acid giữa các chủng trong nghiên cứu là 97,9 – 100%, và
94,3 – 98,6% với các chủng ở châu Á, Âu và Mỹ. Dựa trên gene N, các chủng
PEDV trong nghiên cứu đƣợc xếp vào 2 nhóm: G1 và G2 (với 2 phân nhóm
G2.1 và G2.2).
Phân tích gene S cho thấy, tỷ lệ tƣơng đồng giữa các chủng về trình tự
nucleotide dao động từ 97,5 – 99,6%, tƣơng đồng 93,2 – 98,3% với các chủng
ở châu Á, Âu và Mỹ. Mức tƣơng đồng về trình tự amino acid giữa các chủng
trong nghiên cứu là 93,0 – 99,2%, với các chủng ở châu Á, Âu và Mỹ là 73,5
– 95,5%. Dựa trên gene S, tất cả các chủng trong nghiên cứu này đều thuộc
nhóm G2.
Từ khóa: bệnh tiêu chảy cấp ở heo (PED), heo con theo mẹ, heo nái,
triệu chứng lâm sàng, bệnh tích, trình tự nucleotide, Đồng bằng sông Cửu
Long

ii

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


ABSTRACTS
The aim of research was conducted from January 2015 to December
2018 to identify the prevalence of PEDV infection; Determination of the
pathological characteristics and genetic analysis of PEDV sampling from

some provinces in Mekong Delta.
By antibody Elisa test, with 1,605 sow serum samples taking from 431
breeding farms in some provinces in Mekong Delta, the results showed that
47.8% (206/431) farms and 25.42% (408/1,605) serum samples was positive
for PEDV infection. The highest prevalence was found in Tien Giang province
(33.72%) and lowest in Dong Thap (17.06%). By the herd size, the highest
PEDV infection prevalence was found in the herd from 50 - 100 sows with
27.04%; over 100 sows (26.83%); then 20 to less than 50 sows (26.76%); 10
to less than 20 sows (25.21) and lowest in less than 10 sows (19.75%). By S/P
ratio, the results showed that the mean S/P ratios in facilities with PED were
above 1 (1,340 - 1,797), whereas these in facilities without PED were less than
1 (0.740 - 0.885).
Analysis of risk factors related to PED showed that the highest risk was
not disinfecting the barn or disinfecting the barn less than once every 2 weeks
(OR = 3.22), not having a disinfection pit in front of the farm (OR = 3.01),
distance from diseased livestock households (OR = 2.26) and buying animals
from outside (OR = 2.06).
Analysing the diarrhea samples of sows and suckling piglets in some
provinces in Mekong Delta, the results showed that 20.76% (109/525) of
diarrhea sows and 27.72% (627/2,262) of diarrhea suckling piglets were
positive with PEDV. Morbility and mortality in the acute diarrhea outbreak on
piglets was 97.97% (627/640) and 80.70% (506/627) respectively. The
morbidity and mortality was highest in piglets under 7 days of age (100 and
84.47%), 7-10 days of age (97.71 and 77.34%) and lowest in piglets over 10
days old (88.10 and 64.86%, respectively).
Clinical signs in the PED outbreaks were characterized by severe watery
diarrhea, yellow and green feces, sometimes accompanied by vomiting.
Common gross lesions in PEDV infected piglets were limited to the
gastrointestinal tract, the stomach filled with undigested milk, thin and
transparent intestinal wall. Histophathology lesions have been observed in the

small intestine with severe damage of intestinal microvilli, intestinal glands,
colon glandular epithelium; necrosis of the gastric mucosa; mesenteric lymph
nodes hemorrhaged. In sows, the clinical sign is diarrhea, gray feces.
The nucleotide and amino acid sequences of E gene of 10 isolates taken
from the provinces in Mekong Delta in 2015-2017 analysis showed that the
similarity between strains ranged from 98.2 to 100%; and 96.1 to 99.7% with
iii

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


the strains in Asia, Europe and the US for nucleotide sequence, and was 97.3 100% and 93.4 - 100% for amino acid sequence, respectively. Based on E
gene, all 10 isolates belongs to G2 group.
Nucleotide sequence homology of M gene between 10 strains ranged
from 98.6 to 100%; and 97.2 to 99.8% with the strains in Asia, Europe and
America. The amino acid sequences of M gene of 10 strains was 98.6 - 100%,
and 96,9 - 100% with those of Asian, European and American strains. Based
on M gene, all 10 isolates belongs to G2.2 subgroup.
Within the strains, in the nucleotide sequences, N gene was similary
from 97.2 - 100% , and 94.6 - 98.7% with the strains in Asia, Europe and
USA. The amino acid sequences of N gene of 10 isolates in the study was 97.9
– 100%, and 94.3 – 98.6% with those of Asian, European and American
strains. Based on N gene, 10 isolates in this study belong to two groups G1
(group of vaccinal strains) and G2. The strains in group G2 belongs to two
subgroup G2.1, and G2.2.
For the S gene, the results showed the homogeneity of nucleotide
sequence ranged from 97.5 - 99.6% between 10 isolates, and 93.2% - 98.3%
with the strains in Asia, Europe and America. The amino acid sequences of S
gene of 10 isolates in the study was 93.0 - 99.2%, and 73.5 - 95.5% with those
of Asian, European and American strains. Based on S gene, all 10 isolates in

this study belong to group G2.
Keywords: Porcine epidemic diarrhea (PED), Suckling piglet, Sow, Clinical
sign, Lesions, Genomic, Mekong Delta

iv

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


v

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


Lời Cảm Tạ
Xin thành kính dâng lên Ơng Bà, Cha Mẹ lịng biết ơn sâu sắc và sự kính
trọng cao quí nhất. Ngƣời đã sinh thành, dƣỡng dục với biết bao sự khó nhọc
và hy sinh để tơi khơn lớn nên ngƣời.
Xin ghi nhớ và biết ơn Thầy PGS.TS. Nguyễn Ngọc Hải đã hết lòng yêu
thƣơng, chỉ bảo, hổ trợ và truyền đạt những kiến thức q báu để tơi hoàn
thành luận án
Xin chân thành cảm ơn Thầy PGS.TS. Nguyễn Đức Hiền đã hết lịng dạy
bảo, u thƣơng, dìu dắt, truyền đạt những kiến thức quí báu và tạo mọi điều
kiện để cho tôi học tập, công tác và làm luận án tốt nghiệp.
Xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc công ty Cổ Phần Sản Xuất Kinh
Doanh vật tƣ và thuốc thú y Vemedim, Ban giám đốc trung tâm nghiên cứu và
phát triển, cùng tồn thể các cơ chú, anh chị và các em công tác tại Trung tâm
RD đã tạo mọi điều kiện, tận tình chỉ bảo, chia sẻ cơng việc và giúp đỡ tơi
trong q trình học tập và làm luận án tốt nghiệp.
Xin bày tỏ lòng biết ơn đến q Thầy Cơ trong bộ mơn Thú Y, q Thầy

Cơ tham gia giảng dạy, hƣớng dẫn và chấm chuyên đề, tiểu luận NCS đã tận
tình chỉ bảo và truyền đạt những kiến thức quí báu. Chân thành cảm ơn Ban
Giám Hiệu Trƣờng Đại Học Cần Thơ, Ban Chủ nhiệm Khoa Nông Nghiệp,
Khoa Sau Đại Học, tạo mọi điều kiện thuận lợi trong học tập, nghiên cứu và
thực hiện luận án.
Chân thành biết ơn anh Võ Tấn Hùng, Nguyễn Thị Phƣơng Bình và các
anh chị cơng tác tại Phịng xét nghiệm chẩn đốn Thú Y Hàn Việt đã tạo mọi
điều kiện và giúp đỡ tôi trong công tác xét nghiệm.
Chân thành cảm ơn các em sinh viên Trần Văn Minh, Phan Công Hậu,
Nguyễn Anh Duy, Nguyễn Nhựt Anh, Lê Thị Cẩm Tú, Ngô Quốc Bảo sinh
viên lớp Thú Y và Dƣợc Thú Y K39 - Đại Học Cần Thơ, Trần Hoàng Anh
Thƣ, Phạm Thị Tố Li lớp DH13SHA – Đại Học Nông Lâm TP HCM đã hổ trợ
theo dõi, thu thập mẫu và chẩn đoán xét nghiệm
Chân thành cảm ơn các anh chị và các em ở bộ phận Chăm Sóc Khách
Hàng - Phịng Kinh Doanh Vemedim; các anh, các bạn và các em làm kinh
doanh của các công ty thức ăn Greenfeed, Deheus, Cagrill, Anco địa bàn Bến
Tre, Vĩnh Long, Sóc Trăng, Hậu Giang; các cơ chú, anh chị và các bạn ở Chi
cục thú y Cần Thơ, Tiền Giang, Bến Tre, Đồng Tháp, Hậu Giang và các cơ sở
chăn nuôi heo ở Bến Tre, Cần Thơ, Đồng Tháp, Hậu Giang, Sóc Trăng, Tiền
Giang và Vĩnh Long đã giúp đỡ tôi trong thu thập số liệu và lấy mẫu xét
nghiệm.
Chân thành cảm ơn các anh chị NCS Khóa 2014 đã giúp đỡ và động viên
tơi trong q trình học tập cũng nhƣ trong suốt quá trình làm luận án tốt
nghiệp.
vi

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


Mục Lục

TÓM TẮT ..................................................................................................................... i
ABSTRACTS.............................................................................................................. iii
Lời Cam Đoan .............................................................................................................. v
Lời Cảm Tạ ................................................................................................................. vi
Mục Lục ..................................................................................................................... vii
Danh Sách Chữ Viết Tắt ............................................................................................. ix
Danh Sách Hình ........................................................................................................... x
Danh Sách Bảng ......................................................................................................... xii
CHƢƠNG 1 GIỚI THIỆU ........................................................................................... 1
1.1 Đặt vấn đề .............................................................................................................. 1
1.2 Mục tiêu của nghiên cứu ........................................................................................ 2
1.3 Nội dung nghiên cứu .............................................................................................. 2
1.4 Ý nghĩa của luận án ................................................................................................ 3
1.5 Những điểm mới của luận án ................................................................................. 3
CHƢƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................... 4
2.1 Tổng quan về bệnh tiêu chảy cấp do PEDV (Porcine epidemic diarrhea virus)
trên heo ......................................................................................................................... 4
2.1.1 Lịch sử ................................................................................................................. 4
2.1.2 Tác nhân gây bệnh .............................................................................................. 4
2.1.3 Dịch tễ học .......................................................................................................... 7
2.1.4 Miễn dịch ............................................................................................................ 7
2.1.5 Sinh bệnh học ...................................................................................................... 8
2.1.6 Triệu chứng lâm sàng .......................................................................................... 8
2.1.7 Bệnh tích ............................................................................................................. 9
2.1.8 Chẩn đốn ......................................................................................................... 12
2.1.9 Phịng và trị bệnh .............................................................................................. 15
2.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngồi nƣớc về bệnh PED .................................... 17
2.2.1 Tình hình nghiên cứu ngồi nƣớc ..................................................................... 17
2.2.2 Tình hình nghiên cứu trong nƣớc ...................................................................... 33
2.3 Sơ lƣợc về Đồng bằng sông Cửu Long và một số tỉnh trong nghiên cứu ............ 36

2.3.1 Bến Tre ............................................................................................................. 36
2.3.2 Cần Thơ ............................................................................................................ 37
2.3.3 Đồng Tháp ......................................................................................................... 37
2.3.4 Hậu Giang ......................................................................................................... 37
2.3.5 Sóc Trăng .......................................................................................................... 38
2.3.6 Tiền Giang......................................................................................................... 38
2.3.7 Vĩnh Long ......................................................................................................... 38
CHƢƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................. 39
3.1 Vật liệu nghiên cứu .............................................................................................. 39
3.1.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ..................................................................... 39
vii

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


3.1.2 Vật liệu .............................................................................................................. 39
3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu ..................................................................................... 41
3.2.1 Nội dung 1: Khảo sát sự lƣu hành của PEDV bằng phƣơng pháp ELISA và
phân tích các yếu tố nguy cơ ...................................................................................... 41
3.3.2 Nội dung 2: Đánh giá tỷ lệ bệnh do PEDV ....................................................... 45
3.2.3 Nội dung 3: Khảo sát tần suất xuất hiện các biểu hiện bệnh lý của bệnh PED. 48
3.2.4 Nội dung 4: Phân tích trình tự 4 gene cấu trúc S, E, M, N của PEDV ............. 49
3.3 Các chỉ tiêu theo dõi ............................................................................................. 57
3.4 Phƣơng pháp xử lý số liệu.................................................................................... 58
CHƢƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................. 59
4.1. Khảo sát tỷ lệ nhiễm PEDV tại một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long và phân
tích các yếu tố nguy cơ ............................................................................................... 59
4.1.1 Tỷ lệ nhiễm PEDV trên heo nái theo địa phƣơng ............................................. 59
4.1.2 Tỷ lệ nhiễm PEDV trên heo nái theo qui mô tổng đàn nái ............................... 61
4.1.3 Tỷ lệ nhiễm PEDV trên heo nái theo lứa đẻ ..................................................... 64

4.1.4 Đáp ứng tạo kháng thể kháng PEDV trên heo nái ở những cơ sở đã xảy ra dịch
và chƣa xảy ra dịch PED ............................................................................................ 66
4.1.5 Kết quả khảo sát một số yếu tố nguy cơ liên quan đến bệnh PED.................... 67
4.2 Đánh giá tỷ lệ bệnh do PEDV trên heo tiêu chảy tại một số tỉnh đồng bằng sông
Cửu Long ................................................................................................................... 70
4.2.1 Đánh giá tỷ lệ bệnh do PEDV trên heo con theo mẹ và heo nái mắc bệnh tiêu
chảy do PEDV ............................................................................................................ 70
4.2.2 Tỉ lệ mắc bệnh và tỉ lệ chết trên đàn heo con nhiễm PEDV theo địa phƣơng .. 73
4.2.3 Tỉ lệ mắc bệnh và tỉ lệ chết trên đàn heo con nhiễm PEDV theo ngày tuổi ..... 75
4.2.4 Mối tƣơng quan về tỷ lệ nhiễm PEDV giữa heo con và heo mẹ ....................... 76
4.3 Đánh giá tần suất các biểu hiện bệnh lý của PED trên heo bệnh tiêu chảy cấp ... 77
4.3.1 Đánh giá tần suất các triệu chứng lâm sàng trên heo mắc bệnh tiêu chảy cấp . 77
4.3.2 Đánh giá tần suất các bệnh tích đại thể trên heo con theo mẹ mắc PED .......... 82
4.3.3 Đánh giá tần suất các bệnh tích vi thể trên heo con theo mẹ mắc PED ............ 85
4.4 Nghiên cứu 4 gene cấu trúc S, E, M, N của PEDV.............................................. 91
4.4.1 Nhân bản gene E, M, N và S của PEDV bằng kỹ thuật RT - PCR ................... 91
4.4.2 Tạo dòng gene E, M, N và S vào vector pGEM - T Easy ................................ 92
4.4.3 Phân tích gene S, E, M, N của PEDV ............................................................... 95
Chƣơng 5 Kết Luận Và Đề Nghị ............................................................................. 126
5.1 Kết Luận ............................................................................................................. 126
5.2 Đề Nghị .............................................................................................................. 127
Tài Liệu Tham Khảo ................................................................................................ 128
Phụ Lục 1 ................................................................................................................. 137

viii

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


Danh Sách Chữ Viết Tắt

Viết tắt

Chữ viết đầy đủ

Nghĩa tiếng việt

aa
ASC
CPE
DNA
ELISA

Amino acid
Antibody secreting cells
Cytopathic effect
Desoxyribonucleic acid
Enzyme linked immunosorbent
assay
Epidemic viral diarrhea

Axít amin
Tế bào chế tiết kháng thể
Bệnh tích tế bào

EVD
FFN
FMIA
IF
IFN
IgG

IgM
IgA
IHC
IL-8
IPMA
N
nt
ORF
PCR
PED
PEDV
RNA
RT-PCR
SAB
TCID50
TGE
TGEV
UTR

Fluorescent Foci Neutralization
assay
Fluorescent Microsphere
Immunoassay Immunofluorescence
Interferon
Immunoglobulin G
Immunoglobulin M
Immunoglobulin A
Immunohistochemistry
Interleukin – 8
Immunoperoxidase monolayer

assay
Nucleoprotein
Nucleotide
Open Reading Frame
Polymerase chain reaction
Porcine epidemic diarrhea
Porcine epidemic diarrhea virus
Ribonucleic acid
Reverse transcription - Polymerase
chain reaction
Streptavidin-biotin
Tissue culture infective dose 50 %
Transmissible Gastro enteritis
Transmissible Gastro enteritis
virus
Untranslated Region

Phản ứng miễn dịch gắn men
Bệnh tiêu chảy thành dịch do
virus

Miễn dịch huỳnh quang
Kháng thể IgG
Kháng thể IgM
Kháng thể IgA
Hóa mơ miễn dịch
Phƣơng pháp miễn dịch tế bào
1 lớp với peroxydase

Khung đọc mở

Phản ứng nhân chuỗi gene
Bệnh tiêu chảy cấp trên heo
Virus gây bệnh tiêu chảy cấp
trên heo
Phản ứng nhân chuỗi gene sao
chép ngƣợc
Liều gây nhiễm 50% tế bào
Bệnh viêm dạ dày ruột truyền
nhiễm
Virus gây bệnh viêm dạ dày
ruột truyền nhiễm
Vùng khơng mã hóa

ix

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


Danh Sách Hình
Hình
2.1
2.2
2.3
2.4
2.5
3.1
3.2
3.3
3.4
3.5

4.1
4.2
4.3
4.4
4.5
4.6
4.7
4.8
4.9
4.10
4.11
4.12
4.13
4.14
4.15
4.16
4.17
4.18
4.19
4.20
4.21
4.22
4.23
4.24
4.25
4.26
4.27
4.28
4.29
4.30

4.31
4.32
4.33
4.34

Tựa Hình
Mơ phỏng cấu trúc của virus PED
Lơng nhung ruột non bị cùn, ngắn lại trên heo con bệnh PED
Tế bào biểu mơ ruột bong tróc, thâm nhiễm bạch cầu
Lông nhung ruột bị teo ngắn và hoại tử, có sự co lại
Bản đồ khu vực đồng bằng sơng Cửu Long
Vector tạo dòng TA: pGEM-T Easy
Bộ kit ELISA phát hiện kháng thể IgG của PEDV
Kết quả phản ứng ELISA
Các bƣớc thực hiện phản ứng bằng bộ kít PED-Ag test kít
Đọc kết quả: Mẫu âm tính, chỉ có vạch màu đỏ ở vị trí C (control);
Mẫu dƣơng tính có vạch màu đỏ ở cả vị trí C và T (test) với kháng
nguyên PEDV
Mẫu phân dƣơng tính với PEDV
Kết quả điện di RT – PCR
Heo mẹ nhiễm PED tiêu chảy phân xám
Heo con theo mẹ nhiễm PED tiêu chảy phân vàng
Heo con theo mẹ nhiễm PED tiêu chảy phân lỏng
Heo con theo mẹ nhiễm PED tiêu chảy phân xanh
Heo con theo mẹ nhiễm PED nằm dồn đống
Heo con theo mẹ nhiễm PED ói mửa
Ruột non căng phồng, sung huyết, xuất huyết
Ruột già xuất huyết
Dạ dày căng phồng, sung huyết
Dạ dày căng phồng chứa sữa không tiêu, xuất huyết

Niêm mạc ruột non bình thƣờng dƣới kính hiển vi ở vật kính 10X
và 40X
Nhung mao ruột non đứt nát
Nhung mao ruột non gần nhƣ mất hết
Lớp dƣới niêm mạc ruột non bị phù
Xuất huyết niêm mạc ruột non
Tăng sinh tế bào lympho ruột non
Viêm hoại tử niêm mạc ruột non
Biểu mô tuyến ruột già bình thƣờng
Tuyến niêm ruột già mạc đứt nát, phù
Biểu mô tuyến niêm mạc ruột già mạc đứt nát
Xuất huyết, hoại tử niêm mạc ruột già
Niêm mạc dạ dày bình thƣờng
Hạch ruột bình thƣờng
Bong tróc niêm mạc dạ dày
Xuất huyết hoại tử niêm mạc dạ dày
Tăng sinh tế bào lympho, sung huyết và xuất huyết hạch ruột
Kết quả điện di RT – PCR nhân bản đoạn gene E
Kết quả điện di RT – PCR nhân bản đoạn gene M
Kết quả điện di RT – PCR nhân bản đoạn gene N
Kết quả điện di RT – PCR nhân bản đoạn gene S
Kết quả sản phẩm tạo dịng trên mơi trƣờng LB/amp/IPTG/X – gal
Kết quả sản phẩm tạo dịng trên mơi trƣờng LB/amp/IPTG/X – gal
(TT)

Trang
6
10
11
11

36
41
45
45
46
46
73
73
80
80
80
80
81
81
83
84
84
84
86
87
87
87
87
87
87
88
88
88
88
90

90
90
90
90
91
91
92
92
93
94

x

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


4.35
4.36
4.37
4.38
4.39

4.40

4.41
PL 2.1
PL 2.2
PL 2.3
PL 2.4
PL 2.5

PL 2.6

Kết quả điện di nhân bản đoạn gene từ khuẩn lạc chứa plasmid
mang gene S1, S2, S3, S4, E, M, N
Sơ đồ mối quan hệ di truyền dựa trên gene S giữa các chủng PEDV
trong nghiên cứu và các chủng PEDV tham khảo trên ngân hàng
gene
So sánh trình tự nucleotide của gene E giữa các chủng PEDV trong
nghiên cứu này với nhau và với các chủng PEDV tham chiếu khác
So sánh trình tự amino acid của gene E giữa các chủng PEDV trong
nghiên cứu này với nhau và với các chủng PEDV tham chiếu khác
Sơ đồ mối quan hệ di truyền dựa trên gene E giữa các chủng PEDV
trong nghiên cứu và các chủng PEDV tham khảo trên ngân hàng
gene
Sơ đồ mối quan hệ di truyền dựa trên gene M giữa các chủng PEDV
trong nghiên cứu và các chủng PEDV tham khảo trên ngân hàng
gene
Sơ đồ mối quan hệ di truyền dựa trên gene N giữa các chủng PEDV
trong nghiên cứu và các chủng PEDV tham khảo trên ngân hàng
gene
So sánh trình tự nucleotide của gene M giữa các chủng PEDV trong
nghiên cứu này với nhau và với các chủng PEDV tham chiếu khác
So sánh trình tự amino acid của gene M giữa các chủng PEDV
trong nghiên cứu này với nhau và với các chủng PEDV tham chiếu
khác
So sánh trình tự nucleotide của gene N giữa các chủng PEDV trong
nghiên cứu này với nhau và với các chủng PEDV tham chiếu khác
So sánh trình tự amino acid của gene N giữa các chủng PEDV trong
nghiên cứu này với nhau và với các chủng PEDV tham chiếu khác
So sánh trình tự nucleotide của gene S giữa các chủng PEDV trong

nghiên cứu này với nhau và với các chủng PEDV tham chiếu khác
So sánh trình tự amino acid của gene S giữa các chủng PEDV trong
nghiên cứu này với nhau và với các chủng PEDV tham chiếu khác

95
103
106
108
110

116

122
151
152
157
159
175
180

xi

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


Danh Sách Bảng
Bảng
3.1
3.2
3.3

3.4
3.5
3.6
3.7
3.8
3.9
3.10
3.11
3.12
3.13
3.14
3.15
3.16
3.17
3.18
3.19
4.1
4.2
4.3
4.4
4.5
4.6
4.7
4.8
4.9
4.10
4.11
4.12
4.13
4.14

4.15
4.16
4.17
4.18
4.19
4.20

Tựa Bảng
Số mẫu thu thập trong nghiên cứu
Bảng phân phối mẫu trong xét nghiệm ELISA
Thành phần phản ứng phiên mã RNA thành cDNA
Trình tự primer
Thành phần phản ứng PCR
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Các mẫu bệnh phẩm thu thập để giải trình tự gene
Trình tự primer phản ứng PCR 4 gene S, E, M, N của PEDV
Trình tự primer T7 và SP6 (Promega)
Thành phần hóa chất tổng hợp sợi cDNA
Thành phần phản ứng PCR giải trình tự từng gene
Chu trình trình nhiệt phản ứng PCR đối với gene S
Chu trình trình nhiệt phản ứng PCR đối với gene E
Chu trình trình nhiệt phản ứng PCR đối với gene M
Chu trình trình nhiệt phản ứng PCR đối với gene N
Thành phần phản ứng nối gene vào vector pGEM-T Easy
Thành phần phản ứng PCR khuẩn lạc
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR khuẩn lạc
Danh sách trình tự các chủng PEDV dùng để so sánh
Tỉ lệ heo nái có kháng thể kháng PEDV theo địa phƣơng
Tỉ lệ heo nái có kháng thể kháng PEDV theo quy mô tổng đàn nái
Tỉ lệ heo nái có kháng thể kháng PEDV theo lứa đẻ

Tỉ lệ heo nái có kháng thể kháng PEDV ở những cơ đã xảy ra dịch và
chƣa xảy ra dich PED
Kết quả phân tích yếu tố nguy cơ đối với bệnh PED
Kết quả phân tích yếu tố nguy cơ gần chợ, gần đƣờng giao thơng, gần
lị mổ và với hộ chăn nuôi gần kề, nhà ở
Tỷ lệ mắc bệnh PED trên heo nái
Tỷ lệ heo con theo mẹ bị tiêu chảy do PEDV
Tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ chết trên đàn heo con theo mẹ mắc bệnh tiêu
chảy cấp do PEDV theo địa phƣơng
Tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ chết trên đàn heo con theo mẹ mắc bệnh tiêu
chảy cấp nghi do PEDV theo ngày tuổi
Tƣơng quan tỷ lệ nhiễm PEDV trên heo nái và heo con theo mẹ
Tần suất các triệu chứng thƣờng gặp trên heo con theo mẹ tiêu chảy
do PEDV
Tần suất các triệu chứng thƣờng gặp trên heo mẹ mắc PED
Tần suất bệnh tích đại thể trên heo con theo mẹ mắc PED
Tần suất xuất bệnh tích vi thể ở ruột trên heo con theo mẹ mắc PED
Tần suất bệnh tích vi thể ở hạch màng treo ruột và dạ dày trên heo
con theo mẹ bị PED
Tổng hợp sự tƣơng đồng về trình tƣ nucleotide gene S và amino acid
quy định bởi gene S của các chủng PEDV
Tổng hợp sự tƣơng đồng về trình tự nucleotid gene E và amino acid
quy định bởi gene E của các chủng PEDV
Tổng hợp sự tƣơng đồng về trình tự nucleotid gene M và amino acid
quy định bởi gene M của các chủng PEDV
Tổng hợp sự tƣơng đồng về trình tự nucleotid gene N và amino acid
quy định bởi gene N của các chủng PEDV

Trang
42

43
47
47
47
48
49
49
50
51
51
52
52
52
52
53
55
55
56
59
61
64
66
68
69
70
71
74
75
77
78

81
82
85
89
96
104
111
117

xii

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


4.21
4.22

PL1.1

PL1.2

PL1.3

PL1.4

PL1.5

PL1.6

PL1.7

PL1.8

PL1.9

PL1.10

PL1.11

PL1.12

Tổng hợp sự tƣơng đồng (%) về trình tự nucleotide của 4 gene cấu
trúc E, M, N, S của PEDV
Tổng hợp sự tƣơng đồng về trình tự amino acid quy định bởi 4 gene
cấu trúc E, M, N, S của PEDV
Tỷ lệ (%) tƣơng đồng về thành phần nucleotide (dƣới đƣờng chéo) và
amino acid (trên đƣờng chéo) của gene E của các chủng PEDV trong
nghiên cứu này với nhau và với các chủng PEDV tham chiếu khác ở
Việt Nam và Trung Quốc
Tỷ lệ (%) tƣơng đồng về thành phần nucleotide (dƣới đƣờng chéo) và
amino acid (trên đƣờng chéo) của gene E của các chủng PEDV trong
nghiên cứu này với nhau và với các chủng PEDV tham chiếu khác ở
Hàn Quốc, Nhật Bản, Thái Lan
Tỷ lệ (%) tƣơng đồng về thành phần nucleotide (dƣới đƣờng chéo) và
amino acid (trên đƣờng chéo) của gene E của các chủng PEDV trong
nghiên cứu này với nhau và với các chủng PEDV tham chiếu khác ở
Mỹ và một số nƣớc ở châu Âu
Tỷ lệ (%) tƣơng đồng về thành phần nucleotide (dƣới đƣờng chéo) và
amino acid (trên đƣờng chéo) của gene M của các chủng PEDV trong
nghiên cứu này với nhau và với các chủng PEDV tham chiếu khác ở

Việt Nam và Trung Quốc
Tỷ lệ (%) tƣơng đồng về thành phần nucleotide (dƣới đƣờng chéo) và
amino acid (trên đƣờng chéo) của gene M của các chủng PEDV trong
nghiên cứu này với nhau và với các chủng PEDV tham chiếu khác ở
Hàn Quốc, Nhật Bản, Thái Lan
Tỷ lệ (%) tƣơng đồng về thành phần nucleotide (dƣới đƣờng chéo) và
amino acid (trên đƣờng chéo) của gene M của các chủng PEDV trong
nghiên cứu này với nhau và với các chủng PEDV tham chiếu khác ở
Mỹ và một số nƣớc ở châu Âu
Tỷ lệ (%) tƣơng đồng về thành phần nucleotide (dƣới đƣờng chéo) và
amino acid (trên đƣờng chéo) của gene N của các chủng PEDV trong
nghiên cứu này với nhau và với các chủng PEDV tham chiếu khác ở
Việt Nam và Trung Quốc
Tỷ lệ (%) tƣơng đồng về thành phần nucleotide (dƣới đƣờng chéo) và
amino acid (trên đƣờng chéo) của gene N của các chủng PEDV trong
nghiên cứu này với nhau và với các chủng PEDV tham chiếu khác ở
Hàn Quốc, Nhật Bản, Thái Lan
Tỷ lệ (%) tƣơng đồng về thành phần nucleotide (dƣới đƣờng chéo) và
amino acid (trên đƣờng chéo) của gene N của các chủng PEDV trong
nghiên cứu này với nhau và với các chủng PEDV tham chiếu khác ở
Mỹ và một số nƣớc ở châu Âu
Tỷ lệ (%) tƣơng đồng về thành phần nucleotide (dƣới đƣờng chéo) và
amino acid (trên đƣờng chéo) của gene S của các chủng PEDV trong
nghiên cứu này với nhau và với các chủng PEDV tham chiếu khác ở
Việt Nam và Trung Quốc
Tỷ lệ (%) tƣơng đồng về thành phần nucleotide (dƣới đƣờng chéo) và
amino acid (trên đƣờng chéo) của gene S của các chủng PEDV trong
nghiên cứu này với nhau và với các chủng PEDV tham chiếu khác ở
Hàn Quốc, Nhật Bản, Thái Lan
Tỷ lệ (%) tƣơng đồng về thành phần nucleotide (dƣới đƣờng chéo) và

amino acid (trên đƣờng chéo) của gene S của các chủng PEDV trong
nghiên cứu này với nhau và với các chủng PEDV tham chiếu khác ở
Mỹ và một số nƣớc ở châu Âu

123
124

137

138

139

140

141

142

143

144

145

146

147

148

xiii

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


CHƢƠNG 1
GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề
Bệnh tiêu chảy cấp trên heo (Porcine epidemic diarrhea - PED) là bệnh
truyền nhiễm do virus, lây lan rất nhanh. Bệnh do Porcine epidemic diarrhea
virus (PEDV) thuộc loài Coronavirus gây ra, với các triệu chứng lâm sàng
đặc trƣng nhƣ ói mữa, tiêu chảy, xảy ra ở hầu hết heo mọi lứa tuổi (Pospischil
et al., 2002). Bệnh lây lan rất nhanh trong đàn, với tỷ lệ bệnh rất cao (100%)
và tỷ lệ chết thay đổi từ 30 – 90% trên heo con theo mẹ. Đặc biệt, trong các ổ
dịch PED ở châu Á nhƣ Hàn Quốc, Thái Lan, Philippines, tỷ lệ chết trên heo
con theo mẹ lên đến 100% (Kim et al., 2001; Pensaert and Yeo, 2006;
Puranaveja et al., 2009). PEDV không gây chết trên heo trƣởng thành, nhƣng
ảnh hƣởng đến năng suất sinh sản (tỷ lệ đẻ giảm 12,6%; không lên giống lại
5,7%; sảy thai 1,3%; thai khô 2,0%). Những heo nái mang thai lứa đầu nhiễm
PEDV sẽ ảnh hƣởng đến năng suất sinh sản sau này (Olanratmanee et al.,
2010).
Nhiều nghiên cứu về gene và đặc điểm dịch tễ phân tử của PEDV ở các
nƣớc xảy ra dịch tiêu chảy cấp trên heo cho thấy, có sự đa dạng cao về gene
do sự đột biến nhanh ở chủng virus gây bệnh, hay lây lan từ quốc gia khác
(Duarte and Laude, 1994; Kocherhans et al., 2001; Yeo et al., 2003; Park et
al., 2007; Puranaveja et al., 2009; Lee et al., 2010 và Duy et al., 2011).
Tại Việt Nam, vào cuối năm 2008, dịch tiêu chảy cấp xảy ra đầu tiên ở
Đồng Nai, sau đó bệnh lây lan ở nhiều tỉnh thành khác. Bệnh gây thiệt hại
nặng nề trên đàn heo của các tỉnh miền Đông Nam bộ, với tỷ lệ bệnh ở các

lứa tuổi có thể đến 100%, tỷ lệ chết khác nhau giữa các lứa tuổi, nhƣng đặc
biệt cao ở nhóm heo con theo mẹ từ 50-100% (Nguyễn Tất Toàn và ctv.,
2012). Các chủng PEDV ở Việt Nam có sự tƣơng đồng gene rất cao với các
chủng phân lập từ các nƣớc láng giềng nhƣ Trung Quốc (JS-2004-2) và Thái
Lan (07np01, Ku01cb08), với sự khác biệt rất nhỏ lần lƣợt 0,56-2,86% và
0,00-1,71%. Các chủng PEDV ở Việt Nam bắt đầu hình thành sự đa dạng (đột
biến điểm) ở các địa phƣơng khác nhau nhƣ Bình Dƣơng, Đồng Nai và TP
HCM (Nguyễn Tất Toàn và Đỗ Tiến Duy, 2012). Khi phân tích trình tự
nucleotide và amino acid một phần gene S (Spike gene), ghi nhận các chủng
PEDV ở các tỉnh phía Bắc Việt Nam có tỷ lệ tƣơng đồng về nucleotide và
amino acid rất cao khi so sánh với các chủng tham chiếu trƣớc đây của Việt
Nam (Nguyễn Trung Tiến và ctv, 2015).
Bệnh tiêu chảy cấp do PEDV xuất hiện và gây thiệt hại rất lớn cho
ngành chăn nuôi heo ở Việt Nam, tuy nhiên mới chỉ có những nghiên cứu ở
các tỉnh Miền Đơng Nam bộ và một số tỉnh ở khu vực phía Bắc Việt Nam.
Việc phòng chống bệnh tiêu chảy do PEDV gây ra chủ yếu dựa vào sử dụng
vaccine, nhƣng hiện tỷ lệ sử dụng vaccine để phòng bệnh cũng rất hạn chế.
Trong khi các chủng virus thực địa thƣờng xuyên có những biến đổi phức tạp
1

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


về mặt di truyền, do đó việc nắm bắt và cập nhật đƣợc các đặc tính phân tử
của các chủng PEDV đóng vai trị quan trọng, giúp cho việc lựa chọn đƣợc
vaccine thích hợp và hiệu quả phục vụ cho cơng tác tiêm phịng. Trong khi đó,
việc đánh giá và phân tích đặc điểm di truyền của các chủng PEDV lƣu hành ở
Việt Nam cịn hạn chế, đã gây khó khăn trong việc định hƣớng sử dụng
vaccine trong công tác phòng bệnh. Dịch tiêu chảy cấp cũng đã xuất hiện ở
các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long là vùng chăn nuôi heo quan trọng ở khu

vực Tây Nam Bộ. Do đó để khẳng định sự hiện diện của PEDV gây ra dịch
bệnh tiêu chảy cấp trên heo ở Đồng bằng sông Cửu Long, đồng thời xác định
các đặc điểm về triệu chứng lâm sàng, bệnh tích, cũng nhƣ kiểu gene của
virus gây bệnh và sự tƣơng đồng gene với các chủng trên thế giới nhằm xác
định đƣợc nguồn gốc tiến hóa và sự biến đổi di truyền của các chủng PEDV,
đây là công việc nghiên cứu hết sức cần thiết mang ý nghĩa khoa học và thực
tiễn nhằm góp phần quan trọng trong định hƣớng chiến lƣợc cho việc sản
xuất vaccine phòng bệnh trong tƣơng lai., đề tài “Bệnh Tiêu Chảy Cấp Trên
Heo (Porcine Epidemic Diarrhea) Tại Đồng Bằng Sông Cửu Long: Đặc
Điểm Bệnh Học và Di Truyền Virus” đƣợc tiến hành.
1.2 Mục tiêu của nghiên cứu
Đánh giá sự lƣu hành của PEDV và các yếu tố nguy cơ liên quan đến
bệnh PED trên heo tại một số tỉnh ở đồng bằng sơng Cửu Long phục vụ cơng
tác kiểm sốt bệnh.
Xác định đặc điểm bệnh học của PED tại một số tỉnh ở Đồng bằng sông
Cửu Long để làm cơ sở chẩn đoán bệnh.
Đánh giá sự biến đổi di truyền của PEDV tại một số tỉnh ở Đồng bằng
sông Cửu Long, làm cơ sở dữ liệu cho các nghiên cứu về dịch tễ và vaccine.
1.3 Nội dung nghiên cứu
Khảo sát sự lƣu hành PEDV trên heo nái tại một số tỉnh ở Đồng bằng
sông Cửu Long dựa trên kháng thể dịch thể thu đƣợc trên các đàn heo chƣa
tiêm vaccine phịng PED.
Khảo sát các yếu tố nguy cơ có liên quan đến bệnh PED tại một số tỉnh
ở Đồng bằng sông Cửu Long.
Khảo sát tỷ lệ bệnh do PEDV trên các đàn heo con theo mẹ và heo nái
mắc bệnh tiêu chảy.
Khảo sát tần suất xuất hiện các triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể,
vi thể trên các ca bệnh PED tại một số tỉnh ở Đồng bằng sông Cửu Long.
Phân tích di truyền PEDV tại một số tỉnh ở Đồng bằng sông Cửu Long
và so sánh với các chủng đã đƣợc phân lập tại Việt Nam và một số nƣớc khác

đã đƣợc công bố trên ngân hàng gene.

2

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


1.4 Ý nghĩa của luận án
- Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả của Luận án đã xác nhận sự hiện diện của
PED tại các trại chăn nuôi heo khu vực đồng bằng sông Cửu long, và những
đặc điểm lâm sàng cơ bản giúp ngƣời chăn nuôi dễ dàng hơn trong chẩn đoán
dịch bệnh và các yếu tố nguy cơ liên quan đến bệnh, góp phần xây dựng các
giải pháp kiểm sốt dịch bệnh trên heo ở đồng bằng sơng Cửu long.
- Ý nghĩa khoa học:
- Về mặt dịch tễ: Kết quả của Luận án cung cấp thơng tin về tình hình
lƣu hành PEDV và các yếu tố nguy cơ liên quan đến bệnh PED trên đàn heo
tại một số tỉnh Đồng bằng sơng Cửu Long, ngồi ra, kết quả phân tích di
truyền các chủng PEDV thu nhận đƣợc cho thấy sự biến đổi phức tạp của
PEDV trên các đàn heo ở Đồng bằng sông Cửu Long, những kết quả này là cơ
sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo về đặc điểm dịch tễ của PED và
vaccine phòng PED.
- Về mặt lâm sàng: Khẳng định các triệu chứng lâm sàng của PED,
bệnh tích vi thể, đại thể đặc trƣng khi heo mắc PED, làm cơ sở cho việc chẩn
đoán bệnh.
1.5 Những điểm mới của luận án
- Nghiên cứu đầu tiên tƣơng đối toàn diện về PED trên đàn heo ở Đồng
bằng sông Cửu Long.
- Nghiên cứu hồi cứu đầu tiên về PED trên đàn nái qua xét nghiệm kháng
thể kháng PEDV bằng kỹ thuật ELISA.
- Phân tích đƣợc tƣơng đối đầy đủ các yếu tố nguy cơ có liên quan đến

bệnh PED.
- Phân tích di truyền đầu tiên, tƣơng đối đầy đủ cả về 4 gene cấu trúc S,
E, N và M của các chủng PEDV tại một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long.

3

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


CHƢƠNG 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Tổng quan về bệnh tiêu chảy cấp do PEDV (Porcine epidemic diarrhea
virus) trên heo
2.1.1 Lịch sử
Oldham (1972), ghi nhận tại Anh, một bệnh tiêu chảy cấp mới trên heo
trong giai đoạn tăng trƣởng và vỗ béo vào năm 1971 với các biểu hiện lâm
sàng giống hệt nhƣ bị nhiễm virus gây viêm dạ dày-ruột truyền nhiễm (TGEV
- Transmissible Gastro enteritis virus), ngoại trừ một khác biệt quan trọng, đó
là heo con theo mẹ khơng mắc bệnh. TGEV và các tác nhân gây bệnh đƣờng
tiêu hóa khác đã đƣợc xác định không phải là nguyên nhân gây ra bệnh trên.
Bệnh sau đó đã lan sang các nƣớc châu Âu và đƣợc gọi là bệnh “tiêu chảy
thành dịch do virus” (Epidemic viral diarrhea - EVD). Năm 1976, bệnh tiêu
chảy cấp tính giống với bệnh TGE lại xuất hiện, nhƣng xảy ra trên heo ở tất
cả các lứa tuổi, bao gồm cả heo con đang trong giai đoạn theo mẹ (Wood,
1977). TGEV và các tác nhân gây bệnh đƣờng tiêu hóa đã biết khác cũng đã
đƣợc loại trừ. Lúc này, tên EVD loại 2 đƣợc đƣa ra để phân biệt bệnh tiêu
chảy ở thời điểm này với EVD loại 1 là bệnh bùng phát năm 1971, sự khác
nhau là heo con theo mẹ mắc bệnh EVD loại 2 mà không mắc EVD loại 1.
Năm 1978, Coronavirus đã đƣợc chứng minh là nguyên nhân gây ra các
đợt bùng phát EVD loại 2 (Chasey and Cartwright, 1978; Pensaert and

DeBouck, 1978). Kết quả gây bệnh thực nghiệm cho heo bằng chủng virus
phân lập đƣợc (CV777) cho thấy bệnh tích đƣờng tiêu hóa điển hình trên cả
heo con và heo vỗ béo (DeBouck and Pensaert, 1980). Năm 1978, bằng
nghiên cứu thực nghiệm, EVD loại 1 và EVD loại 2 đã đƣợc chứng minh do
cùng một tác nhân virus gây ra, từ đó tên bệnh đã đƣợc đổi thành “tiêu chảy
thành dịch trên heo” viết tắt theo tên tiếng Anh là PED - Porcine epidemic
diarrhea (Pensaert et al., 1982; Pensaert and Yeo, 2006).
2.1.2 Tác nhân gây bệnh
Phân loại
Dựa trên đặc điểm kháng nguyên và di truyền, PEDV đƣợc xếp vào chi
Coronavirus, họ Coronaviridae, cùng với TGEV, Coronavirus ở mèo, chó và
Coronavirus 229E ở ngƣời.
Theo phân loại về huyết thanh học, PEDV hiện mới chỉ có 1 serotype.
Các chủng PEDV phân lập từ châu Âu, Hàn Quốc và Trung Quốc đều tƣơng
đồng về mặt huyết thanh với chủng CV777 phân lập từ thực địa của Bỉ năm
1978 (Pensaert and Yeo, 2006; Song and Park, 2012).

4

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


Cấu trúc virus
PEDV là virus có vỏ bao ngồi (envelope), đƣờng kính biến đổi từ 90
đến 190 nm. Virus tái bản và thốt ra khỏi tế bào thơng qua cơ chế nẩy chồi
từ các màng bào tƣơng tế bào vật chủ (Kweon et al., 1993; Pospischil et al.,
2002).
Bộ gene của PEDV là sợi RNA đơn dƣơng, kích thƣớc khoảng 28 kb
với đầu 5‟ và đuôi là polyA 3‟. Bộ gene của virus gồm một vùng không dịch
mã (UTR) đầu 5‟, một UTR đầu 3‟và ít nhất 7 khung đọc mở (ORFs) mã hóa

cho 4 protein cấu trúc, gồm protein gai (Spike - S) với trọng lƣợng phân tử
khoảng 180-200 kDa, vỏ (Envelope - E) khoảng 7 kDa, màng (Membrane M) khoảng 27-32 kDa, và nucleocapsid (N) khoảng 57-58 kDa; và 3 protein
không cấu trúc (enzyme tái bản replicase 1a, 1b và ORF3). Những khung đọc
mở này đƣợc sắp xếp theo trình tự: 5‟-replicase (1a, 1b)-S-ORF3-E-M-N3‟(Hình 2.1). Protein cấu trúc của PEDV tƣơng tự nhƣ ở các Coronavirus
khác.
Protein gai S có bản chất glycoprotein, tƣơng tác trực tiếp với thụ thể
trong q trình xâm nhập của virus và kích thích sự khởi phát của các kháng
thể trung hòa. Protein S của các Coronavirus là một nhóm glycoprotein liên
quan đến vỏ của virus, đóng vai trị là một thụ thể bề mặt khi tƣơng tác với tế
bào chủ trong quá trình xâm nhiễm và có chứa các nhóm quyết định kháng
nguyên sinh kháng thể trung hoà. Protein S của PEDV bao gồm 1.383 aa và
có thể chia thành 2 vùng S1 (1-789 aa) và S2 (790 – 1.383 aa) (Duarte and
Laude, 1994). Protein màng M cần thiết cho quá trình lắp ráp của virus, cũng
nhƣ kích thích tạo ra các kháng thể bảo vệ với hoạt tính trung hịa virus.
Protein E đóng vai trò quan trọng trong sự nảy mầm của Coronavirus. Sự biểu
hiện của các protein M và E cho phép hình thành các hạt giả, có hoạt tính kích
thích tạo interferon (IFN) tƣơng tự nhƣ các virus hoàn chỉnh. Do đó, protein M
và E cũng đóng vai trị quan trọng trong q trình hình thành virus, khởi tạo
αIFN và kích thích tạo ra các kháng thể trung hịa virus nhƣ protein S (Song và
Park, 2012). Protein N là một phosphoprotein cơ bản gắn với RNA của virus,
tạo nên cấu trúc xoắn ốc cho nhân. Do đó, protein N có thể tham gia vào việc
sao chép bộ gene của virus, sự hình thành lõi virus và đóng gói RNA virus, giúp
virus trốn tránh khỏi hệ thống miễn dịch của vật chủ. Hơn nữa, vì protein N
đƣợc bảo tồn cao nên đƣợc xem là ứng cử viên tốt nhất để sử dụng làm kháng
nguyên cho các thuốc thử chẩn đoán sớm và phát triển vaccine (Li et al., 2013).

5

LUAN VAN CHAT LUONG download : add

Hình 2.1 Mơ phỏng cấu trúc của PEDV (Lee, 2015)

Sức đề kháng
Virus mẫn cảm với ether, chloroform và không gây ngƣng kết hồng cầu
của nhiều loài. Tỷ trọng của virus trong đƣờng sucrose là 1,18 mg/ml. PEDV
bền ở khoảng pH 5,0 – 9,0 ở 4°C và pH từ 6,5 – 7,5 ở 37°C. Với các sóng
siêu âm, nhiệt độ đơng lạnh, virus không bị phá hủy hoặc mất khả năng cảm
nhiễm. Sự nhân lên của virus bị ức chế bởi 5-iodo-2‟-deoxyuridine (Hofmann
and Wyler, 1988; Pensaert and Yeo, 2006).
PEDV mất khả năng cảm nhiễm lên các tế bào nuôi cấy ở nhiệt độ ≥
60°C trong 30 phút, nhƣng chúng khá bền ở 50°C.
Đặc tính ni cấy
Khả năng thích ứng của PEDV với tế bào ruột non trong điều kiện của
phịng thí nghiệm rất kém. Các thí nghiệm ni cấy PEDV trên các mơ ruột
non và khí quản đều khơng thành cơng. Các tế bào không đƣợc xử lý với
trypsin hoặc dịch tụy thì khơng thích hợp để virus nhân lên (Hess et al., 1980;
Witte et al., 1981; Callebaut et al., 1982). Sự sinh trƣởng của virus phụ thuộc
vào sự có mặt của men trypsin trong môi trƣờng nuôi cấy.
Trong môi trƣờng nuôi cấy tế bào Vero, virus tác động lên tế bào, hình
thành các khơng bào và thể hợp bào (có thể lên tới 100 nhân). Về khả năng
sinh trƣởng, hiệu giá nuôi cấy virus đạt cao nhất 105,5 vết tan (plaque forming
unit) sau 15 giờ gây nhiễm với tế bào Vero (Hofmann and Wyler, 1988; Lee
and Yeo, 2003).

6

LUAN VAN CHAT LUONG download : add

Hiện tại, PEDV đã đƣợc nhân lên thành công trên các tế bào thận heo và
bàng quang heo ở Nhật Bản (Shibata et al., 2000). Chủng PEDV phân lập tại
Nhật Bản (P-5V) đã đƣợc sử dụng làm chủng virus vaccine và đƣợc ni cấy
trên các dịng tế bào heo KSEK6 và IB-RS2 (Kadoi et al., 2002).
2.1.3 Dịch tễ học
Heo mọi lứa tuổi đều có thể mắc bệnh. Có thể dễ dàng nhận thấy bệnh
trên đàn heo khi bệnh xâm nhập vào đàn lần đầu, với tỷ lệ bệnh và tỷ lệ chết
rất cao ở heo con theo mẹ. Bệnh xảy ra quanh năm, nhƣng chủ yếu vào các
tháng lạnh hay lúc giao mùa tuỳ theo điều kiện thời tiết khu vực.
Từ những kết quả nghiên cứu thu đƣợc, một số ý kiến cho rằng, PED ở
châu Á mang tính dịch địa phƣơng rõ hơn khi lƣu hành trong một quần thể
nái đã phần nào có miễn dịch (Pensaert and Yeo, 2006).
Mức độ lây lan của bệnh PED chậm hơn mức độ lây lan của bệnh viêm
dạ dày-ruột truyền nhiễm (TGE).
PEDV truyền lây chủ yếu qua đƣờng tiêu hóa, qua phân. PED thể cấp
tính thƣờng xảy ra ở thời điểm 4-5 ngày sau khi heo đƣợc mua về. Virus có
thể xâm nhập vào trại thông qua heo nhiễm virus đƣợc chuyển về hoặc ngƣời,
hay các dụng cụ có mang virus nhƣ xe tải, ủng… Đƣờng truyền lây của
PEDV không khác nhiều so với TGEV, nhƣng PEDV có thể tồn tại lâu hơn
trong các trang trại sau khi dịch PED cấp tính đã qua đi. Khi dịch xảy ra ở trại
heo sinh sản, virus có thể đƣợc bài thải từ đàn mắc bệnh, hoặc trở thành dịch
địa phƣơng. Một chu kỳ dịch lƣu nhiễm có thể đƣợc hình thành nếu số lứa
heo đƣợc sinh ra và cai sữa trong trại đủ lớn để duy trì sự lƣu hành của virus
thơng qua việc lây nhiễm giữa các lứa kế tiếp nhau, khi heo con mất khả năng
miễn dịch lúc cai sữa (Pensaert and Yeo, 2006).
2.1.4 Miễn dịch
Heo con sinh ra từ heo mẹ đã có miễn dịch đối với PEDV sẽ có thể đƣợc
bảo vệ khỏi PED trong khoảng thời gian 4-13 ngày tuổi nhờ kháng thể IgG
truyền qua sữa đầu; độ dài miễn dịch phụ thuộc vào hiệu giá kháng thể của
heo mẹ.

Sau khi heo mẹ cảm nhiễm với kháng nguyên PEDV trong ruột, các tế
bào sinh IgA di chuyển tới tuyến vú, cố định và tiết ra kháng thể IgA vào sữa.
Do đó, khi chế tạo vaccine, cần lƣu ý trục miễn dịch “ruột-tuyến vú” để tạo ra
miễn dịch qua sữa hiệu quả.
Heo con thƣờng xuyên bú sữa từ heo mẹ đã có miễn dịch sẽ đƣợc bổ
sung liên tục vào đƣờng tiêu hóa của nó một lƣợng IgA, đây là quá trình tiếp
nhận miễn dịch thụ động. Lƣợng IgG chiếm hơn 60% lƣợng immunoglobulin
trong sữa đầu. Tuy nhiên, IgA hiệu quả hơn trong việc trung hòa mầm bệnh
lây nhiễm qua đƣờng miệng hơn là IgG hay IgM, bởi nó bền vững hơn trƣớc
sự phân hủy protein trong đƣờng ruột và có khả năng trung hịa virus cao hơn
IgG và IgM. Vì thế, việc truyền IgA thụ động từ những nái có miễn dịch giúp
cho việc phịng bệnh tốt hơn ở heo con trong giai đoạn bú mẹ. Tuy nhiên,
7

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


những kháng thể này không thể bảo vệ chúng khỏi lây nhiễm PEDV qua
đƣờng tiêu hóa (Song and Park, 2012).
2.1.5 Sinh bệnh học
Cơ chế sinh bệnh của PED đƣợc nghiên cứu trên heo con không đƣợc bú
sữa đầu. Cho heo con 3 ngày tuổi uống PEDV chủng CV777, sau khoảng 22
đến 36 giờ heo bắt đầu ói mữa và tiêu chảy. Vị trí và sự nhân lên của PEDV
đƣợc xác định thông qua kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang (IF) và kính hiển vi
điện tử. PEDV nhân lên trong bào tƣơng của các tế bào lông nhung, bắt đầu
với sự bám của protein S của virus lên thụ thể aminopeptidase N trên bề mặt
lông nhung ruột, dẫn đến sự phá hủy các tế bào biểu mô và làm ngắn lông
nhung niêm mạc ruột, tỷ lệ chiều cao giữa lông nhung và tuyến ruột có thể
giảm từ 7:1 xuống 3:1. Các tế bào biểu mô hấp thu ở lông nhung rất mẫn cảm
với PEDV, những tế bào biểu mô nhiễm virus có thể đƣợc quan sát sau 12-18

giờ gây nhiễm, rõ nhất sau khoảng 24 đến 36 giờ, tuy nhiên không quan sát
thấy có sự phá hủy tế bào biểu mơ ở kết tràng.
Đặc điểm sinh bệnh của PEDV ở ruột non của heo con rất giống với
TGEV. So với TGEV, sự nhân lên và lây lan trong ruột non của PEDV diễn
ra chậm hơn và thời gian nung bệnh lâu hơn. Cho tới nay, chƣa có cơng bố
nào cho thấy nó có sự nhân lên của PEDV ở tế bào ngồi đƣờng tiêu hóa
(Shibata et al., 2001; Pospischil et al., 2002, Pensaert and Yeo, 2006).
Cơ chế sinh bệnh của PEDV ở giai đoạn heo lớn hơn vẫn chƣa đƣợc
nghiên cứu chi tiết, nhƣng bằng kỹ thuật huỳnh quang có thể quan sát thấy
virus có mặt trong tế bào biểu mơ kết tràng của heo mắc bệnh tự nhiên hoặc
đƣợc gây nhiễm (DeBouck and Pensaert, 1980). Ý nghĩa của việc virus xâm
nhiễm ở kết tràng có làm cho bệnh nặng hơn hay không vẫn chƣa đƣợc rõ
(Pensaert and Yeo, 2006).
Khi tiến hành so sánh về khả năng gây bệnh của các chủng PEDV đã
thích nghi trên mơi trƣờng tế bào và các chủng hoang dại cho thấy, khi gây
nhiễm trên heo sạch bệnh (khơng nhiễm PEDV) với chủng PEDV đã thích
nghi trên môi trƣờng nuôi cấy tế bào (ca-PEDV), heo bị gây nhiễm có biểu
hiện và tiến triển lâm sàng nhẹ hơn nhiều so với heo đƣợc gây nhiễm bởi
chủng PEDV chủng hoang dại (wt-PEDV). So với chủng wt-PEDV, độc lực
của chủng ca-PEDV yếu hơn nhiều, tốc độ nhân lên của virus chậm hơn và sự
biến đổi về mặt vi thể ở các cơ quan của heo nhiễm virus cũng kém rõ ràng
hơn (Pospischil et al., 2002).
2.1.6 Triệu chứng lâm sàng
Nghiên cứu của Pensaert và Yeo (2006) cho thấy, khi heo mắc PED,
biểu hiện chủ yếu và thƣờng là duy nhất ở heo đó là tiêu chảy nặng, phân rất
nhiều nƣớc. Tỷ lệ mắc và tỷ lệ tử vong ở các trại rất khác nhau. Heo ở tất cả
các lứa tuổi đều có thể mắc bệnh với tỷ lệ mắc bệnh có thể lên tới 100%. Biểu
hiện của PED tƣơng tự nhƣ TGE, tuy rằng PED lây lan chậm hơn và có tỷ lệ
chết ở heo con thấp hơn.
8

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


2.1.6.1 Heo con theo mẹ
Heo con dƣới 1 tuần tuổi có thể chết do mất nƣớc sau khi tiêu chảy 2
đến 4 ngày. Tỷ lệ chết ở heo con trung bình khoảng 50%, nhƣng có thể cao
hơn tới 100% (Nguyễn Tất Toàn và ctv., 2012). Heo con bị tiêu chảy nặng,
phân nhiều nƣớc, màu vàng, có sữa khơng tiêu, lƣời bú, ói ra sữa. Heo rất gầy
do mất nƣớc, nằm tụm lại và chồng lên nhau và thích nằm trên bụng mẹ, có
thể do tiêu chảy mạnh nên thân nhiệt giảm nên chúng nằm tụ lại thành đống.
Đây là triệu chứng đặc trƣng và điển hình nhất của bệnh. So với các bệnh
khác nhƣ dịch tả, tiêu chảy do E. coli, phân heo mắc bệnh PED có mùi tanh ít
hơn. Heo con theo mẹ chết rất nhanh do mất nhiều nƣớc, những con cịn sống
qua 5 ngày sẽ có thể khỏi và hồi phục dần dần (Nguyễn Thị Lan và ctv.,
2015).
2.1.6.2 Heo ở các lứa tuổi khác
Ở giai đoạn lớn hơn, heo thƣờng tự hồi phục sau khi quá trình tiêu chảy
kéo dài đƣợc 1 tuần. Khi PED cấp tính ở một trại qua đi, heo con giai đoạn 23 tuần sau cai sữa vẫn có thể có biểu hiện tiêu chảy và heo mới nhập về
thƣờng phát bệnh. Vài năm gần đây, những đợt bùng phát cấp tính điển hình
với tỷ lệ chết cao trên heo sơ sinh hiếm xảy ra ở châu Âu, nhƣng lại đƣợc ghi
nhận xảy ra nhiều ở Nhật Bản và Hàn Quốc (Chae et al., 2000; Pensaert and
Yeo, 2006).
Ở trại heo thịt hoặc vỗ béo, nếu PED bùng phát ở thể cấp tính, trong
vịng một tuần, tất cả heo sẽ có biểu hiện tiêu chảy. Heo có biểu hiện chán ăn,
mệt mỏi, phân rất loãng, chứa nhiều nƣớc. Biểu hiện về mặt lâm sàng ở heo
mắc PED đang trong giai đoạn nuôi vỗ béo có thể nặng hơn so với mắc TGE.
Heo thƣờng có biểu hiện đau vùng bụng nhiều hơn. Sau khoảng 7-10 ngày,
heo sẽ hồi phục. Tỷ lệ tử vong ở heo trong giai đoạn vỗ béo thƣờng từ 1-3%,
heo chết nhanh, thƣờng ở giai đoạn mới bắt đầu tiêu chảy hoặc trƣớc khi có

biểu hiện tiêu chảy (Pospischil et al., 2002). Tỷ lệ chết cao nhất đƣợc thấy ở
những trại có heo giống mẫn cảm và chịu nhiều stress (Pensaert and Yeo,
2006).
2.1.7 Bệnh tích
2.1.7.1 Bệnh tích đại thể
Bệnh tích đại thể của heo mắc bệnh PED là dạ dày heo căng phồng, chứa
đầy dịch sữa không tiêu màu trắng đục hoặc màu vàng của dịch mật. Ruột non
màu nhợt nhạt, chứa đầy dịch lỏng màu vàng hoặc sữa khơng tiêu vón cục.
Thành ruột heo con mỏng và có thể nhìn xun qua. Pensaert và Yeo (2006),
cho rằng, bệnh tích thể hiện chủ yếu ở ruột non.
2.1.7.2 Bệnh tích vi thể
Khi quan sát các tiêu bản vi thể của các mẫu bệnh phẩm nhiễm PEDV
ghi nhận, có sự tạo khơng bào và sự tróc vẩy của các tế bào ruột ở các nhung
mao ruột non vào lúc 24 giờ sau khi cảm nhiễm virus, cũng là lúc bắt đầu tiêu
chảy. Các nhung mao ruột bị teo ngắn lại rất nhanh và sự hoạt động của các
9

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


enzyme giảm xuống đáng kể dẫn đến sự kém hấp thu ở ruột (Pensaert và Yeo,
2006)
Dƣới kính hiển vi điện tử cho thấy, có sự hiện diện rõ rệt của các hạt
virus bên trong bào tƣơng tế bào và sự thay đổi của các tế bào biểu mô ruột
non và kết tràng. Những sự thay đổi về cấu trúc vi thể đƣợc khởi đầu đặc
trƣng bằng sự mất đi của các bào quan, vi nhung, lƣới tận và phần nhô ra của
bào tƣơng tế bào hấp thu. Sau đó, các tế bào trở nên dẹt hơn, liên kết vòng bịt
giữa các tế bào biểu mô mất đi và tế bào đƣợc giải phóng vào bên trong lịng
ống ruột.

Lơng nhung ruột
bình thƣờng
Lơng nhung
ruột thối hóa

Hình 2.2 Lơng nhung ruột
non bị cùn, ngắn lại trên
heo con bệnh PED
(Puranaveja et al., 2009)

Khi đánh giá tổn thƣơng bệnh lý ở cấp độ mô bào trên heo con theo mẹ
và heo cai sữa mắc bệnh PED cho thấy, 100% heo nhiễm PEDV đều có cả tổn
thƣơng ở ruột non và ruột già. Ở ruột non, lông nhung đứt nát, ngắn lại, dồn
lẫn vào nhau, nhiều nơi chỉ còn trơ lại tuyến ruột Lieberkuhn, tế bào biểu mơ
bong tróc, thối hóa, hoại tử; thâm nhiễm tế bào viêm và xuất huyết ở lớp
đệm, lớp hạ niêm mạc, trong đó tá tràng là phần tổn thƣơng nặng nhất, chiếm
100% ở cả heo con theo mẹ và heo cai sữa. Đây là phần biến đổi vi thể đặc
trƣng nhất ở ruột. Biến đổi này cũng lý giải vì sao thành ruột mỏng đi, trong
suốt hơn và có thể nhìn thấy chất chứa màu vàng, lợn cợn bên trong. Kết quả
trên đƣợc giải thích do đích tấn cơng chủ yếu của PEDV là các tế bào biểu mô
ruột, chúng nhân lên và phá hủy các tế bào này, làm cho lông nhung ngắn,
mất đi. Theo Ducatelle et al. (1982), khi gây nhiễm thực nghiệm PEDV cho
heo con theo mẹ, tỷ lệ chiều cao giữa tuyến lông nhung và tuyến ruột giảm
cịn 3:1. Trong khi đó, tỷ lệ này ở heo khỏe là 7:1.
Ở ruột già, các tổn thƣơng nhẹ hơn, biểu mơ và tế bào thành tuyến
Lieberkuln bong tróc ít hơn, tuy nhiên có thể gặp những tổn thƣơng nặng hơn
ở kết tràng nhƣ xuất huyết, kèm theo hoại tử bã đậu.
Ở dạ dày, khi quan sát tiêu bản vi thể cho thấy, tế bào niêm mạc bong
tróc, viêm xuất huyết phần tuyến. Xuất hiện quá trình viêm ở biểu mô và lớp
đệm từ thƣợng vị đến hạ vị. Các tế bào biểu mô phủ và tế bào phần cổ tuyến

dạ dày bong tróc, xen kẽ là các tế bào viêm dày đặc, có thể có cả hồng cầu.
Bao quanh các tuyến dạ dày là những mạch máu sung huyết, chứa đầy hồng
cầu trong lòng mạch. Hiện tƣợng sung huyết, phù, thâm nhiễm tế bào viêm
cũng phổ biến ở lớp hạ niêm mạc. Những biểu hiện này góp phần lý giải triệu
chứng nôn mửa khá phổ biến ở heo mắc bệnh.
10

LUAN VAN CHAT LUONG download : add