Nghiên cứu cải tiến quy trình và ứng dụng phân tích độc tố acrylamide trong cà phê bằng sắc ký lỏng ghép khối phổ LC MS MS

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN THỊ BÍCH PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN QUY TRÌNH VÀ ỨNG
DỤNG PHÂN TÍCH ĐỘC TỐ ACRYLAMIDE
TRONG CÀ PHÊ BẰNG SẮC KÝ LỎNG GHÉP
KHỐI PHỔ LC-MS/MS

Ngành: HỐ PHÂN TÍCH
Mã ngành: 8440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022


Cơng trình được hồn thành tại Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm Thành phố
Hồ Chí Minh.
Người hướng dẫn khoa học: TS. Lê Đình Vũ
Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Hội đồng chấm bảo vệ Luận văn thạc sĩ Trường
Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh
Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:
1. ......................................................................... - Chủ tịch Hội đồng
2. ......................................................................... - Phản biện 1
3. ......................................................................... - Phản biện 2
4. ......................................................................... - Ủy viên
5. ......................................................................... - Thư ký
(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ)

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

GS.TS. Lê Văn Tán

TRƯỞNG KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

PGS.TS. Nguyễn Văn Cường


BỘ CƠNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHIỆP
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ tên học viên: Nguyễn Thị Bích Phương ................... MSHV: 20000231
Ngày, tháng, năm sinh: 03/12/1983 ............................... Nơi sinh: Tp. Hồ Chí Minh
Ngành: Hố phân tích..................................................... Mã ngành: 8440118
I. TÊN ĐỀ TÀI:
Nghiên cứu cải tiến quy trình và ứng dụng phân tích độc tố acrylamide trong cà phê
bằng sắc ký lỏng ghép khối phổ LC-MS/MS.
NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:
(1) Nghiên cứu cải tiến quy trình phân tích đợc tố acrylamide trên nền mẫu cà phê
với kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ LC-MS/MS đáp ứng đầy đủ các thông số
thẩm định đáp ứng được tiêu chuẩn hóa Châu Âu CEN và ISO/IEC 17025:2017.
(2) Ứng dụng quy trình phân tích để đánh giá thực trạng nhiễm acrylamide trong
sản phẩm cà phê hạt rang xay, cà phê hòa tan thương phẩm trên thị trường Thành

phố Hồ Chí Minh.
II. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: Theo Quyết định số 622/QĐ-ĐHCN ngày
10/03/2022 của Hiệu trưởng Trường Đại học Cơng Nghiệp Thành phố Hồ Chí
Minh.
III. NGÀY HỒN THÀNH NHIỆM VỤ: 10/09/2022
IV. NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Lê Đình Vũ
Tp. Hồ Chí Minh, ngày … tháng … năm 20 …
NGƯỜI HƯỚNG DẪN

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

(Họ tên và chữ ký)

(Họ tên và chữ ký)

TRƯỞNG KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC
(Họ tên và chữ ký)


LỜI CẢM ƠN
Luận văn Thạc sĩ ngành Hóa phân tích với đề tài “Nghiên cứu cải tiến quy trình và
ứng dụng nghiên cứu độc tố acrylamide trong sản phẩm cà phê bằng sắc ký lỏng
ghép khối phổ LC-MS/MS” là kết quả của q trình cố gắng, nỗ lực khơng ngừng
của bản thân và được sự động viên, giúp đỡ hỗ trợ, khích lệ của các q Thầy Cơ,
bạn bè đồng nghiệp và người thân trong gia đình trong suốt quá trình học tập và
nghiên cứu khoa học.
Tơi xin chân thành cảm ơn đối với TS Lê Đình Vũ đã trực tiếp hướng dẫn tôi thực
hiện đề tài và đã chỉ dạy tận tình trong q trình học tập tại trường.
Tơi chân thành cảm ơn Ban giám đốc Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm Tp
Hồ Chí Minh, các anh chị em đồng nghiệp ở phịng Phân tích sắc ký và bạn Võ Thị

Mọng Trinh, anh Lý Tuấn Kiệt, anh Nguyễn Thành Duy, chị Nguyễn Lâm Kiều
Diễm, anh Trần Văn Huệ, chị Đặng Thị Kim Hằng, anh Nguyễn Thanh Phong, anh
Trương Văn Nhân, các anh chị ở Trường The Coffaholic Roastery và các bạn lớp
cao học đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi, khích lệ Tơi trong suốt q trình học tập
và thực hiện đề tài.
Tơi xin được gửi lời cảm ơn các thầy cơ phịng sau đại học đã hỗ trợ, hướng dẫn tôi
rất nhiều khi học tại trường.

i


TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép hai lần khối phổ (LC-MS/MS) đã
được thẩm định và áp dụng để phân tích hàm lượng độc tố acrylamide trong mẫu cà
phê. Dưới điều kiện tối ưu của thực nghiệm, khoảng tuyến tính phân tích
acrylamide từ 50-1000µg/L với giới hạn phát hiện của phương pháp 30 µg/L. Hiệu
suất thu hồi đạt từ 85,15% tới 97,30%. Ở các mức nồng độ khác nhau của
acrylamide, độ lặp lại của phương pháp cao thể hiện qua độ lệch chuẩn tương đối
(RSD%) từ sáu lần thí nghiệm lặp lại nhỏ hơn 3,55%, độ không đảm bảo đo là
12,3%. Phương pháp đáp ứng được những nỗ lực về tiêu chuẩn hóa phương pháp
được sử dụng để phát hiện độc tố acrylamide trong thực phẩm. Thực tế được áp
dụng để phân tích một số mẫu cà phê hạt rang trên thị trường Thành phố Hồ Chí
Minh. Kết quả phân tích thu được cho thấy 51,47% có chứa acrylamide với nồng đợ
từ 50,99-560,48 µg/kg trong đó mẫu vượt ngưỡng tối đa cho phép chiếm 10,29%.
Kết quả cịn cho thấy mức đợ ơ nhiễm acrylamide của cà phê có mức đợ rang vừa
hơn nhiều so với rang nhạt và rang đậm vừa. Điều này cho thấy mức độ ô nhiễm
acrylamide trong cà phê rang xay trên thị trường là đáng báo động và cần có các
biện pháp kiểm sốt an tồn vệ sinh thực phẩm đối với cà phê.

ii

ABSTRACT
High-performance liquid chromatography-coupled mass spectrometry (LC-MS/MS)
has been validated and applied to analyze acrylamide in coffee samples. Under
optimal experimental conditions, the linear range quantitation for acrylamide was
from 50-1000 µg/L with the method detection limit of 30 µg/L. At different
concentrations of acrylamide, the high repeatability of the method expressed in the
relative standard deviation (RSD%) from six replicates is less than 3.55%, and the
measurement uncertainty is 12.3%. The recovery efficiency ranged from 85.15% to
97.30%. The method responds to efforts to standardize the method used for the
detection of acrylamide toxins in foods. The method is practically applied to
analyze some samples of roasted coffee beans on the market in Ho Chi Minh City.
The analytical results showed that 51.47% of samples contained acrylamide with
concentrations from 50.99-560.48 µg/kg, exceeding the maximum allowable
threshold, accounting for 10.29%. The results also showed that the acrylamide
contamination level of coffee with a medium roast level was much higher than that
of light roast and medium dark roast. This indicates that the level of acrylamide
contamination in roasted coffee in the market is alarming, and there is a need for
food safety and hygiene control measures for coffee.

iii


LỜI CAM ĐOAN
Tơi tên là: Nguyễn Thị Bích Phương, học viên cao học chun ngành Hóa Phân
tích, lớp CHHOPT10A, Trường Đại học Cơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh.
Tơi cam đoan những kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là cơng trình
của tơi với sự hướng dẫn của giảng viên hướng dẫn của TS. Lê Đình Vũ, Trường
Đại học Cơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh.

Những kết quả nghiên cứu của các tác giả khác được sử dụng trong luận văn đều có
trích dẫn đầy đủ.
Học viên

Nguyễn Thị Bích Phương

iv


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. i
TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ ............................................................................ ii
ABSTRACT .............................................................................................................. iii
LỜI CAM ĐOAN ..................................................................................................... iv
DANH MỤC HÌNH ẢNH ........................................................................................ iv
DANH MỤC BẢNG BIỂU ...................................................................................... vi
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ................................................................................... vii
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
1. Đặt vấn đề ...............................................................................................................1
2. Mục tiêu nghiên cứu................................................................................................3
3. Đối tượng và nhiệm vụ nghiên cứu .........................................................................3
3.1 Đối tượng nghiên cứu ...........................................................................................3
3.2 Phạm vi nghiên cứu ...............................................................................................3
4. Phương pháp nghiên cứu.........................................................................................4
4.1 Phương pháp luận..................................................................................................4
4.2 Phương pháp thực hiện .........................................................................................5
4.2.1 Phương pháp tổng hợp và biên hội tài liệu ........................................................5
4.2.2 Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu ............................................................5
5. Ý nghĩa của đề tài ....................................................................................................6
5.1 Ý nghĩa khoa học ..................................................................................................6

5.2 Ý nghĩa thực tiễn ...................................................................................................7
CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN ..................................................................................8

1.1.1 Cấu tạo, tính chất của Acrylamide ....................................................................8
1.1.2 Cơ chế hóa học hình thành acrylamide trong cà phê .........................................9
1.1.3 Hàm lượng acrylamide trong chế độ rang........................................................11
1.1.4 Sức khỏe và tính chất gây hại của acrylamide .................................................13
1.1.5 Quy định về acrylamide ...................................................................................16
1.2 Phương pháp phân tích acrylamide ..................................................................17

i


1.2.1 Các phương pháp xử lý mẫu ............................................................................17
1.2.2 Phương pháp phân tích .....................................................................................19
1.2.3 Kết quả các phương pháp phân tích .................................................................20
1.2.4 Ưu điểm và hạn chế của các phương pháp ......................................................22
1.2.5 Kết luận ............................................................................................................22
CHƯƠNG 2

THỰC NGHIỆM............................................................................23

2.1 Hoá chất, thiết bị ..............................................................................................23
2.1.1 Hệ sắc ký lỏng ghép khối phổ ..........................................................................23
2.1.2 Thiết bị, dụng cụ dùng trong thí nghiệm ..........................................................23
2.1.3 Hố chất, chất chuẩn ........................................................................................24
2.2 Chuẩn bị hóa chất, pha đợng, dung dịch chuẩn ................................................25
2.2.1 Chuẩn bị pha động ...........................................................................................25

2.2.2 Chuẩn bị hóa chất .............................................................................................25
2.2.3 Chuẩn bị các dung dịch chuẩn .........................................................................26
2.3 Đồng nhất, chuẩn bị mẫu khảo sát ...................................................................27
2.3.1 Đồng nhất mẫu ................................................................................................27
2.3.2 Chuẩn bị mẫu khảo sát .....................................................................................28
2.4 Nội dung nghiên cứu thực nghiệm ...................................................................28
2.4.1 Xây dựng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ .........................................28
2.4.1 Xây dựng phương pháp cho hệ sắc ký hiệu năng cao ......................................29
2.5 Xây dựng phương pháp xử lý mẫu ...................................................................30
2.5.1 Chọn khối lượng mẫu xử lý ............................................................................30
2.5.2 Xây dựng phương pháp xử lý mẫu ...................................................................31
2.6 Thẩm định quy trình phân tích acrylamide ......................................................37
2.6.1 Tính phù hợp hệ thống ....................................................................................37
2.6.2 Tính đặc hiệu, đợ chọn lọc ..............................................................................37
2.6.3 Xác định khoảng tuyến tính và đường chuẩn..................................................38
2.6.4 Xác định giới hạn phát hiện .............................................................................38
2.6.5 Giới hạn định lượng ........................................................................................39
2.6.6 Độ lập lại và độ tái lập ....................................................................................39

ii


2.6.7 Độ đúng của phương pháp ...............................................................................40
2.6.8 Độ không đảm bảo đo ......................................................................................41
2.7 Ứng dụng quy trình định lượng acrylamide trong nền mẫu cà phê hạt và cà phê
hòa tan trên thị trường ...............................................................................................41
CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................43

3.1 Kết quả phương pháp sắc lỏng hiệu năng cao ..................................................43
3.1.1 Kết quả tối ưu hóa điều kiện khối phổ ............................................................43
3.1.2 Xây dựng điều kiện sắc ký lỏng ......................................................................44
3.2 Kết quả khảo sát quy trình xử lý mẫu ..............................................................51
3.2.1 Kết quả của ảnh hưởng nhiệt đợ trong q trình chiết rắn – lỏng...................51
3.2.2 Xử lý mẫu với Carrez ......................................................................................53
3.2.3 Dung môi chiết mẫu ........................................................................................55
3.2.4 Q trình làm sạch với cợt chiết pha rắn..........................................................56
3.2.5 Kết quả khảo sát dung môi rửa giải ................................................................59
3.2.6 Ảnh hưởng của dung môi định mức................................................................61
3.2.7 Ảnh hưởng nền mẫu .........................................................................................62
3.3 Kết quả thẩm định phương pháp phân tích ......................................................63
3.3.1 Tính đặc hiệu ...................................................................................................63
3.3.3 Khoảng tuyến tính ...........................................................................................66
3.3.4 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng .....................................................67
3.3.5 Xác định đợ chính xác ......................................................................................68
3.3.6 Xác định đợ đúng .............................................................................................69
3.3.7 Xác định độ không đảm bảo đo .......................................................................70
3.4 Áp dụng phương pháp đánh giá hàm lượng acrylamide trong cà phê .............71
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................76
1.

Kết luận ............................................................................................................76

2.

Kiến nghị ..........................................................................................................78

TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................79
PHỤ LỤC ..................................................................................................................88

LÝ LỊCH TRÍCH NGANG CỦA HỌC VIÊN .......................................................124

iii


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo.........................................................................................9
Hình 1.2 Cơ chế hình thành acrylamide trong q trình có gia nhiệt .......................10
Hình 1.3 Ảnh hưởng của quá trình rang lên hàm lượng acrylamide ........................12
Hình 1.4 Cơ chế gây đợc thần kinh của acrylamide .................................................14
Hình 1.5 Giản đồ chung cho việc phân tích acrylamide ...........................................18
Hình 2.1 Các bước thẩm định phương pháp .............................................................37
Hình 2.2 Giấy chứng nhận mẫu vật liệu chuẩn .........................................................40
Hình 3.1 HPLC- MS/MS Agilent Triple Quad 6410 ................................................44
Hình 3.2 Sắc ký đồ tối ưu cợt sắc ký.........................................................................45
Hình 3.3 Đợ phân giải các cợt sắc ký ........................................................................45
Hình 3.4 Sắc ký đồ các pha đợng khảo sát................................................................46
Hình 3.5 Ảnh hưởng của nồng đợ acid formic trong hệ pha đợng HCOOH/MeOH 47
Hình 3.6 Độ nhạy khi thay đổi nồng độ acid formic ................................................48
Hình 3.7 Thời gian lưu và đợ nhạy của chuẩn arcrylamide nồng đợ 500 µg/kg ở các
gradient khác nhau ...................................................................................49
Hình 3.8 Thời gian lưu và độ nhảy của IS - AAD3 nồng đợ 500 µg/kg ở các
gradient khác nhau ...................................................................................49
Hình 3.9 Biểu đồ thể hiện hiệu suất thu hồi ở các mức nhiệt đợ ..............................51
Hình 3.10 Mức ảnh hưởng nền từ phương trình đường chuẩn ở các mức nhiệt đợ
phản ứng ..................................................................................................52
Hình 3.11 Hiệu suất thu hồi với Carrez ....................................................................53
Hình 3.12 Mức ảnh hưởng nền từ phương trình đường chuẩn có và khơng có Carrez
.................................................................................................................54
Hình 3.13 Biểu đồ biểu thị hiệu śt dung mơi chiết ................................................55

Hình 3.14 Biểu đồ biểu thị đường chuẩn trong khảo sát dung mơi chiết .................56
Hình 3.15 Màu sắc của dịch mẫu thu được sau khi xử lý theo bốn loại cợt SPE làm
sạch ..........................................................................................................57
Hình 3.16 Hiệu suất thu hồi từ quá trình làm sạch từ cợt SPE .................................57
Hình 3.17 Biểu đồ biểu thị đường chuẩn qua cợt SPE tinh sạch ..............................59
Hình 3.18 Biểu đồ biểu thị sự phân bố hiệu suất thu hồi của các dung mơi rửa giải60
Hình 3.19 Biểu đồ biểu thị đường chuẩn đối với khảo sát dung mơi rửa giải ..........60
Hình 3.20 Biểu đồ biểu thị diện tích chất chuẩn AA và nội chuẩn AAD3 trong khảo
sát dung môi định mức ............................................................................61
Hình 3.21 Sắc ký đồ chuẩn AA mẫu trắng, mẫu dung mơi và mẫu thêm chuẩn ......64
Hình 3.22 Sắc ký đồ nội chuẩn AAD3 trong mẫu trắng, mẫu dung môi và mẫu thêm
chuẩn ........................................................................................................65
1

1

iv


Hình 3.23 Đồ thị so sánh đường chuẩn trên dung mơi và trên dung dịch mẫu trắng
của acrylamide .........................................................................................63
Hình 3.24 Phương trình đường chuẩn trong dung mơi .............................................66

v


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1 Đặc tính hóa học của acrylamide .................................................................9
Bảng 1.2 Đợ hịa tan của acrylamide ..........................................................................9
Bảng 1.3 Lượng acrylamide trong khẩu phần ăn ......................................................15

Bảng 1.4 Hàm lượng acrylamide trong một số sản phẩm cà phê .............................15
Bảng 1.5 Mức chuẩn cho phép sự hiện diện của acrylamide trong sản phẩm cà phê
theo Ủy ban Châu Âu.................................................................................16
Bảng 1.6 Một số phương pháp phân tích acrylamide ở trong nước và quốc tế .......21
Bảng 2.1 Pha dung dịch chuẩn gốc của acrylamide và acrylamide–d3 ....................26
Bảng 2.2 Chuẩn acrylamide làm việc .......................................................................27
Bảng 2.3 Cách chuẩn bị các mẫu thêm chuẩn...........................................................28
Bảng 2.4 Quy trình xử lý mẫu ...................................................................................32
Bảng 2.5 Qui định tỷ lệ ion phụ so với ion chính theo SANCO/12495/2011 ..........38
Bảng 2.6 Mô tả mẫu nghiên cứu ...............................................................................42
Bảng 3.1 Các thông số hoạt đợng của đầu dị MS ....................................................43
Bảng 3.2 Các thơng số tối ưu cho ESI-MS/MS ........................................................43
Bảng 3.3 Chương trình gradient ................................................................................49
Bảng 3.4 Các thông số hoạt động của hệ sắc ký lỏng khối phổ ................................50
Bảng 3.5 Điều kiện khối phổ của acrylamide và IS acrylamide -d3.........................50
Bảng 3.6 Kết quả giá trị % ME trong khảo sát nhiệt độ phản ứng ...........................52
Bảng 3.7 Ảnh hưởng nền mẫu của acrylamide .........................................................63
Bảng 3.8 Tỷ lệ ion acrylamide các điểm trên đường chuẩn của chất chuẩn .............65
Bảng 3.9 Kết quả khảo sát giá trị MDL tại nồng đợ 30 µg/kg với 6 lần đo .............67
Bảng 3.10 Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi, độ lặp, độ tái lặp (TL) của MQL ở
nồng độ M+100 µg/kg (n=12) ...................................................................68
Bảng 3.11 Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi, độ lặp lại, độ tái lập ở nồng đợ M +
100 µg/kg (n =12); đợ M + 400 µg/kg (n =12); đợ M + 800 µg/kg (n =12).
....................................................................................................................69
Bảng 3.12 Kết quả thực hiện 6 lần lặp lại mẫu CRM TYG090RM ..........................69
Bảng 3.13 Độ không đảm bảo đo mở rợng tính theo đợ tái lặp phịng thí nghiệm,
theo độ lệch chuẩn bias của mẫu cà phê ....................................................70
Bảng 3.14 Tóm tắt mẫu nghiên cứu thực tế ..............................................................72
Bảng 3.15 Kết quả phân tích hàm lượng acrylamide trên mẫu cà phê thực tế .........73
1

1

vi


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Từ viết tắt
AOAC

CFIA

Tên đầy đủ
Association of Official Analytical
Communities
Atmospheric pressure chemical
ionisation
N,Obis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide
Chemical Abstracts Service
registration number
Collision energy
European Committee for
Standardization
Canadian Food Inspection Agency

CI
CONTAM

Chemical ionization
Contaminants in the Food Chain

CRM
d-SPE
EFSA

Certified reference material
Dispersive solid phase extraction
European Food Safety Authority

ECD
EI
ESI
EtAOc
EtOH
EVFTA
FAO

Electro-Chemical Devices
Electron impact
Electrospray inonization
Ethylacetate
Ethanol
European – Vietnam Free Trade
Agreement
Food and Agriculture Organization

FDA

Food and Drug Administration

APCI
BSTFA
CAS
CE
CEN

GCB
Graphitized carbon black
GC-MS/MS Gas chromatography tandem mass
spectrometry
vii

Giải nghĩa
Hiệp hội các cộng đồng phân tích
chính thức
Ion hóa hóa học ở áp śt khí
quyển
Tạo phản ứng silyl hóa
Số định danh hóa chất
Năng lượng va chạm
Ủy ban Tiêu chuẩn hóa Châu Âu
Cơ quan kiểm tra thực phẩm
Canada
Ion hóa hóa học
Hợi đồng về các chất gây ô
nhiễm
trong chuỗi thực phẩm
Vật liệu chuẩn được chứng nhận
Chiết pha rắn phân tán
Cơ quan An tồn thực phẩm

Châu Âu
Đầu dị bắt điện tử
Va chạm electron
Ion hóa bằng nguồn phun điện tử

Hiệp định thương mại tự do giữa
Việt
Tổ chức nông lương thế giới
Cơ quan Quản lý thực phẩm và
dược phẩm của Hoa Kỳ
Than hoạt tính
Sắc ký khí khối phổ hai lần


HACCP
HLB
HSDB
IARC

The Hazard Analysis and Critical
Control Point
Hydrophilic-Lipophilic-Balanced
Hazardous Substances Data Bank

LD50
LOD
LOQ
ME
MeCN
MeOH

MgSO4
MIM

International Agency for Research
on Cancer
International Trade Center
Liquid chromatography tandem
mass spectrometry
Lethal dose, 50%
Limit of Detection
Limit of Qualification
Matrix effect
Acetonitril
Methanol
Anhydrous magnesium sulfate
Multiple ion monitoring

MRM

Multiple relative monitoring

ITC
LC-MS/MS

MS
NaCl
PSA
PVDF

Phân tích các mối nguy hiểm và

điểm kiểm sốt quan trọng
Cân bằng thân nước – thân dầu
Ngân hàng dữ liệu về các chất
nguy hiểm
Cơ quan quốc tế nghiên cứu về
ung thư
Trung tâm thương mại quốc tế
Sắc ký lỏng khối phổ hai lần
Liều gây chết trung bình 50%
Giới hạn phát hiện
Giới hạn định lượng
Ma trận ảnh hưởng nền

Chế đợ chọn tín hiệu mợt số ion
đặc trưng cho chất phân tích
Chế đợ chọn tín hiệu mợt số ion
đặc trưng cho chất phân tích
bằng khối phổ kép
Phổ khối

Mass spectrometry
Sodium chloride
Primary Secondary Amine
Amine bậc 2
Polyvinylidene Florua Microporous Siêu lọc chất liệu Polyvinylidene
Florua
QuEChERS Quick, Easy, Cheap, Effective,
Nhanh, dễ, rẻ, hiệu quả, ổn định,
Rugged, Safe
an toàn

RT
Retention time
Thời gian lưu
SIM
Single ion monitoring
Chế đợ chọn mợt tín hiệu ion
SPE
Solid phase extraction
Chiết pha rắn
SPME
Solid phase microextraction
Vi chiết pha rắn
UA-LLE
Ultrasound-assisted liquid–
Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng hỗ trợ
liquid extraction
sóng siêu âm
UV-Vis
Ultraviolet visible spectroscopy
Đầu dò tử ngoại khả kiến

viii


MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Cà phê là mặt hàng nông sản được thương mại hóa nhiều nhất và đồ uống được tiêu
thụ rộng rãi nhất trên thế giới. Nhu cầu tiêu dùng cà phê trở nên phổ biến trên thế
giới vì những lợi ích sức khỏe và chất lượng cảm quan, đặc biệt là hương vị đặc
trưng [1]. Thị hiếu, xu hướng tiêu thụ cà phê hiện nay thì phân khúc rang xay tại

chỗ thay vì sử dụng cà phê đóng gói hoặc pha sẵn đang ngày càng dược ủng hộ bởi
người tiêu dùng nhằm thưởng thức hương vị cà phê riêng biệt theo gu sở thích [2].
Theo báo cáo của Bộ Công thương, Vụ thị trường Châu Âu - Châu Mỹ, Việt Nam
chủ yếu xuất khẩu cà phê nguyên liệu sang thị trường Châu Âu trong đó cà phê rang
và khử caffein là mặt hàng đứng thứ hai về kim ngạch (chiếm 17,3%) và tiêu thụ
nhiều nhất tại thị trường này [2]. Chế biến cà phê là ngành sản xuất, kinh doanh có
sức hấp dẫn và cạnh tranh cao ở Việt Nam. Trong giai đoạn 2005-2015, lượng tiêu
thụ cà phê của Việt Nam tăng trưởng từ 0,43 kg/đầu người/năm lên 1,38 kg/đầu
người/năm và dự báo tăng lên 2,6 kg/đầu người/năm vào năm 2021. Đây là mức
tăng trưởng cao nhất trong số các quốc gia đứng đầu xuất khẩu cà phê trên thế giới
[3] .
Song song với sự tăng trưởng và đa dạng hóa nhu cầu tiêu dùng cà phê, vấn đề ơ
nhiễm các đợc tố trong cà phê có thể xảy ra ở các giai đoạn khác nhau trong quá
trình chế biến cũng được quan tâm nhiều hơn. Sự xuất hiện của acrylamide trong
thực phẩm nói chung và trong cà phê nói riêng lần đầu tiên được báo cáo bởi các
nhà khoa học từ cơ quan thực phẩm quốc gia Thụy Điển và đại học Stockholm vào
tháng 4 năm 2002 [4]. Sự quan tâm đến acrylamide vì tính đợc hại của nó có trong
thực phẩm, là khả năng gây ung thư và ức chế thần kinh (IARC 1994) [5].
Acrylamide được tìm thấy trong nhiều thực phẩm chiên, nướng, rang do vậy chất
này luôn tồn tại trong cà phê rang. Hàm lượng acrylamide được tìm thấy ở mức cao
nhất trong cà phê hịa tan giá trị trung bình 1499 µg/kg, đối với cà phê hạt là
522µg/kg, theo báo cáo của EFSA năm 2015 [6]. Theo một số báo cáo của FAO và
WHO năm 2006, acrylamide cũng được phát hiện trong các sản phẩm ca cao và cà
1


phê ở mức lên đến 909 - 4948μg /kg [7]. Ở Việt Nam, hiện chưa có số liệu thống kê
về mức acrylamide trong thực phẩm nói chung và sản phẩm cà phê nói riêng. Việc
đánh giá hàm lượng đợc tố acrylamide trong sản phẩm cà phê trên thị trường cung
cấp dữ liệu quan trọng trong lĩnh vực an toàn thực phẩm, từ đó có thể đưa ra cảnh

báo trong quy trình rang xay và sản x́t cơng nghiệp nhằm đảm bảo chất lượng và
sức khỏe người tiêu dùng.
Phương pháp phân tích đầu tiên được các nhà nghiên cứu Thụy Điển sử dụng để
phân tích acrylamide trong thức ăn chăn ni dựa trên sự tạo dẫn xuất của
acrylamide bằng cách brom hóa phân tích sắc ký khí-khối phổ [8]. Sau đó có nhiều
kỹ thuật phân tích được phát triển khắc phục những khó khăn trong q trình tạo
dẫn x́t và sử dụng nhiều phương pháp nhanh chóng dành cho nhiều loại mẫu hơn.
Hội thảo ở Châu Âu về các phương pháp phân tích acrylamide trong các sản phẩm
thực phẩm kết luận rằng hiện nay phần lớn các phịng thí nghiệm sử dụng sắc ký
lỏng khối phổ và sắc ký khí khối phổ để phân tích acrylamide với ưu điểm cho đợ
chính xác cao mà không cần phải tạo dẫn xuất trong quy trình phân tích [9]. Ở Việt
Nam hiện chưa có khuyến nghị chính thức về phương pháp áp dụng để định lượng
acrylamide trong thực phẩm. Những nỗ lực về tiêu chuẩn hóa các phương pháp
được sử dụng để phát hiện và định lượng acrylamide trong các nền mẫu khác nhau
vẫn đang được tiếp tục nghiên cứu nhằm đáp ứng các đợt thử nghiệm thành thạo
trên chất chuẩn tham chiếu để đánh giá chất lượng kết quả và xác nhận phương
pháp acrylamide là một phần thiết yếu để đạt công nhận theo tiêu chuẩn ISO/IEC
17025. Từ những vấn đề trình bày trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên
cứu cải tiến quy trình và ứng dụng phân tích đợc tố acrylamide trong cà phê bằng
sắc ký lỏng ghép khối phổ LC-MS/MS”.

2


2. Mục tiêu nghiên cứu
Mục tiêu nghiên cứu của đề tài này bao gồm những nội dung như sau:
Thẩm định quy trình phân tích hàm lượng acrylamide trong các nền mẫu cà phê hạt
rang hạt, cà phê hòa tan nhằm xây dựng phương pháp phân tích đáp ứng các u
cầu:
•

Đánh giá sự ảnh hưởng của nền mẫu lên độ đúng của phương pháp phân tích.

•

Xây dựng quy trình xử lý mẫu phân tích acrylamide trong các nền mẫu cà phê
hạt rang hạt, cà phê hịa tan.

•

Xác nhận giá trị các thông số của phương pháp định lượng acrylamide trong
nền mẫu cà phê hạt: Tính chọn lọc, đợ tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn
định lượng, hiệu suất thu hồi, đợ khơng đảm bảo đo.

Ứng dụng phương pháp phân tích một số mẫu dịch vụ và mẫu thực tế trên thị
trường Thành phố Hồ Chí Minh nhằm đánh giá hàm lượng acrylamide trên sản
phẩm cà phê. Từ kết quả khảo sát đưa ra khuyến cáo về mức độ ô nhiễm của
acrylamide trong sản phẩm cà phê.
3. Đối tượng và nhiệm vụ nghiên cứu
3.1 Đối tượng nghiên cứu
•

Quy trình chiết mẫu phân tích hàm lượng acrylamide trong sản phẩm cà phê.

•

Đối tượng mẫu được lựa chọn để xác định giá trị sử dụng phương pháp và ứng
dụng phương pháp là mẫu cà phê rang hạt và cà phê hòa tan trên thị trường.

3.2 Phạm vi nghiên cứu

•

Xây dựng quy trình chiết mẫu xác định hàm lượng acrylamide trên nền cà phê.

•

Phân tích, đánh giá hàm lượng acrylamide trên 19 mẫu cà phê arabica gồm 2
dạng rang nhạt (Light) và rang đậm vừa (Medium), 23 mẫu cà phê robusta gồm
rang nhạt (Light), rang đậm vừa (Medium) và rang đậm (Medium dark), 16 mẫu
3


cà phê hỗn hợp trộn arabica và robusta hoặc arabica, robusta, culi, moka; 10
mẫu cà phê hòa tan. Các mẫu này được mua trên thị trường với các nhà sản xuất
khác nhau được đóng gói đúng quy cách sản phẩm có thơng tin như loại cà phê
rang, mức rang, kiểu sơ chế từ nhà sản xuất.
•

Trung tâm dịch vụ phân tích và thí nghiệm, Tp.HCM (CASE).

4. Phương pháp nghiên cứu
4.1 Phương pháp luận
Hiện nay có nhiều phương pháp phân tích acrylamide, tùy vào điều kiện của các
phịng thí nghiệm khác nhau. Tuy nhiên, do mức độ phức tạp của nền mẫu cà phê
thành phẩm do quá trình rang, say và chế biến ảnh hưởng trực tiếp đến đợ chính xác
của phép phân tích. Điều này thể hiện trong kết quả của công bố về thử nghiệm
thành thạo với 6 bài kiểm tra cho các nền thực phẩm, trong đó nền cà phê với 41
mẫu vật liệu thử nghiệm đồng nhất được u cầu cho các phịng thí nghiệm trên thế
giới có 31 kết quả nợp lại với khoảng giá trị thu được 193-431µg/kg, giá trị đúng là
412µg/kg. Những người tham gia được khuyến khích sử dụng phương pháp phân

tích được sử dụng thường xun trong phịng thí nghiệm và cung cấp chi tiết về thủ
tục [10]. Do vậy, đánh giá mức đợ ảnh hưởng của nền mẫu đến đợ chính xác của
phương pháp là một vấn đề cần thiết đối với phương pháp xác định acrylamide
trong cà phê.
Ở Việt Nam hiện chưa ban hành chính thức về phương pháp chuẩn để áp dụng định
lượng độc tố acrylamide trong thực phẩm nói chung và trong cà phê thành phẩm nói
riêng.
Tính đến thời điểm hiện nay, chưa có mợt cơng bố chính thức về mức độ ô nhiễm
hàm lượng độc tố acrylamide trong cà phê thành phẩm tại Việt Nam nói chung và
trên thị trường Thành phố Hồ Chí Minh nói riêng.

4


Căn cứ trên những vấn đề còn tồn tại thực tế đối với phương pháp phân tích và dữ
liệu về mức độ ô nhiễm độc tố acrylamide trong cà phê nói trên, chúng tơi thực hiện
đề tài với các nợi dung cụ thể nhằm giải quyết các vấn đề nói trên.
4.2 Phương pháp thực hiện
4.2.1 Phương pháp tổng hợp và biên hội tài liệu
Nghiên cứu, đọc các tài liệu trong nước và quốc tế công bố các nghiên cứu
acrylamide, từ đó tổng hợp, xem xét ưu nhược điểm, khả năng áp dụng các nghiên
cứu vào điều kiện thực tế ở phịng thí nghiệm. Nghiên cứu nồng đợ acrylamide là
mợt trong các chỉ tiêu có yêu cầu trong các mẫu phân tích tại Trung tâm dịch vụ
phân tích thí nghiệm (CASE), TP. HCM
Tìm hiểu các cơng trình nghiên cứu về việc phân tích acrylamide trong thực phẩm
nói chung và trong cà phê nói riêng.
Thu thập tài liệu, đánh giá rủi ro của acrylamide đến sức khỏe con người.
4.2.2 Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu
Hướng dẫn theo Tiêu chuẩn Việt Nam: TCVN 5250 -2007 [11]; TCVN 12807:2019
[12]; Thông tư 14/2011/TT-BYT [13]. Mẫu cần được bảo quản trong túi

polyethylene (hoặc có van khí mợt chiều) tránh thất thốt hàm lượng acrylamide.
Các mẫu phải được chiết trong vòng bảy ngày và dung dịch chiết phải được phân
tích trong vịng mợt ngày sau khi chiết.
4.2.3 Phương pháp thống kê và xử lý số liệu
Sử dụng toán học xử lý thống kê để xử lý số liệu sau khi phân tích nhằm đảm bảo
tính chắc chắn của số liệu nghiên cứu nhằm rút ra những nhận xét và kết luận khoa
học khách quan đối với những vấn đề nghiên cứu. Các kết quả được sử dụng phần
mềm Excel, phần mềm Masshunter của Agilent.

5


4.2.4 Phương pháp so sánh
Dùng các số liệu nghiên cứu được so sánh với các số liệu có được từ Cục quản lý
thực phẩm và dược phẩm Hoa kỳ FDA; Cơ quan an toàn thực phẩm Châu Âu EU để
đánh giá hàm lượng acrylamide trong sản phẩm cà phê.
4.2.5 Phương pháp kế thừa
Dùng các số liệu nghiên cứu và phương pháp đã được nghiên cứu trước nay để ứng
dụng trong nghiên cứu của chúng tơi
4.2.6 Phương pháp phân tích
Các phương pháp xử lý mẫu được sử dụng trong nghiên cứu: Chiết lỏng lỏng, chiết
pha rắn.
Phương pháp phân tích được sử dụng trong đề tài là phương pháp ký lỏng ghép hai
lần khối phổ (LC-MS/MS) với chất nội chuẩn acrylamide-d3 trong xây dựng đường
hiệu chuẩn của phép phân tích.
5. Ý nghĩa của đề tài
5.1 Ý nghĩa khoa học
Phương pháp phân tích acrylamide được xây dựng trên nền tảng phương pháp của
Ủy ban Tiêu chuẩn hóa Châu Âu: EN Standard 16618:2015 LC-ESI-MS/MS [14].
Xác định acrylamide trong các sản phẩm làm từ khoai tây, các sản phẩm làm từ ngũ

cốc và cà phê bằng LC-MS và phương pháp QuEChERS AOAC 2007.01 [15] được
tham khảo, chúng tơi cải tiến phân tích trên thiết bị LC-MS/MS được xử lý mẫu đơn
giản, sử dụng dung môi thân thiện với môi trường, giảm chất thải nguy hại. Việc lựa
chọn phương pháp sắc ký lỏng khối phổ do sự tối ưu và hiệu quả hơn so với sắc ký
khí khối phổ, phép đo trực tiếp, khơng cần dẫn xuất, giúp tiết kiệm thời gian, ít hư
hỏng thiết bị.
Phương pháp và số liệu của đề tài là nền tảng cho các nghiên cứu liên quan sau này
cũng như sử dụng trong công tác giảng dạy, học tập. Áp dụng phương pháp đã

6


nghiên cứu để phân tích mẫu khách hàng và tham gia các thử nghiệm thi thành thạo
tại đơn vị công tác CASE.
Nghiên cứu này một lần nữa khẳng định sự quan trọng trong việc đánh giá rủi ro
tiềm ẩn do tiếp xúc hàm lượng acrylamide trong khẩu phần ăn của những người tiêu
dùng đối với sản phẩm cà phê.
5.2 Ý nghĩa thực tiễn
Nghiên cứu góp phần cung cấp dữ liệu quan trọng về an toàn vệ sinh thực phẩm đưa
ra những cảnh báo đối với người tiêu dùng, từ đó người quản lí cần có biện pháp để
hạn chế rủi ro và những quy định giảm mức hàm lượng độc tố acrylamide trong quá
trình chế biến sản xuất và tiêu thụ sản phẩm cà phê.

7


CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN

Acrylamide là chất hóa học có khối lượng phân tử thấp, đợ phân cực cao, có khả
năng hịa tan tốt trong nước, có khả năng phản ứng cao và đợ bay hơi thấp. Chất này
được chuyển hóa trong cơ thể thành glycidamide, tác dụng độc học đã được thử
nghiệm ở invivo và invitro. Cơ quan nghiên cứu ung thư IARC đã phân loại
acrylamide tḥc nhóm 2A [5].
Cà phê là mặt hàng nơng sản được thương mại hóa nhiều nhất [1]. Nhiệt độ rang
(120 – 230ºC) và thời gian (10 - 20 phút) rang cà phê ảnh hưởng rất lớn đến chất
lượng hương vị và màu sắc. Bên cạnh các chất chống oxi hóa như acid chlorogenic,
melanoidin, caffein có lợi cho sức khỏe thì trong cà phê cũng hình thành đợc tố
khơng mong muốn là acrylamide trong q trình chế biến [16, 17]. Việc sử dụng cà
phê hàng ngày cũng đồng nghĩa với việc vơ thể có thể dung nạp một lượng
acrylamide [18]. Kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ không tạo dẫn xuất sẽ được áp
dụng để định lượng acrylamide trong cà phê, và kỹ thuật này cũng phù hợp với thực
tế phịng thí nghiệm CASE, đáp ứng được tiêu chuẩn hóa Châu Âu CEN và
ISO/IEC 17025:2017.
1.1.1 Cấu tạo, tính chất của Acrylamide
Acrylamide là chất hóa học với công thức cấu tạo C3H5NO, tên danh pháp IUPAC
là prop-2-enamide (hình 1.1), dạng tinh thể màu trắng, khơng mùi và có khả năng
tan tốt trong mợt số dung mơi theo bảng 1.1 [19].
Độ tan của acrylamide trong dung môi phân cực và không phân cực thay đổi rất lớn
ảnh hưởng đến phương pháp phân tích thể hiện trong bảng 1.2 [4].

8


Acrylamide - C3H5NO - Mw = 71.079 g/mol – CAS 79061
Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo
Bảng 1.1 Đặc tính hóa học của acrylamide
Nội dung
Phân tử lượng

Nhiệt đợ nóng chảy

Thơng số
71,08 g/mol
84,50ºC ± 0,30°C
1,13 g/cm3

Tỉ trọng
Nhiệt độ tự bốc cháy

424°C

Điểm chớp cháy

138°C

Nhiệt độ sôi

192,60°C

Áp suất hơi

0,007 mmHg ở 25°C; 0,90 Pa

Bảng 1.2 Đợ hịa tan của acrylamide
Tên dung mơi

Độ hịa tan (g/100ml) ở 30°C

Nước

215,50

Methanol
Dimethylsulphoxide
Dimethylformamide
Ethanol
Acetone
Pyridine
Acetonitrile
Ethylacetate
Chloroform
Ethylene dichloride
Benzene
n-Heptane

155
124
119
86,20
63,10
61,90
39,60
12,60
2,66
1,50
0,35
0,0068

1.1.2 Cơ chế hóa học hình thành acrylamide trong cà phê

Mối quan tâm bắt đầu vào năm 1991 khi Ủy ban khoa học về thực phẩm đã đánh
giá acrylamide ở dạng monomer được chuyển hóa trong cơ thể thành glycidamide
gây đợc tính cho người. Acrylamide có trong thực phẩm đã được công bố đầu tiên

9


bởi báo cáo bởi các nhà khoa học từ cơ quan thực phẩm quốc gia Thụy Điển và đại
học Stockholm vào tháng 4 năm 2002 [20].
Acrolein (2-propenal, CH2=CH-C(O)-H) là một aldehyde ba carbon, tương tự với
cấu trúc của acrylamide (CH2=CH-C(O)-NH2) [21], được hình thành bởi:
• Sự biến đổi của lipid.
• Thối hóa acid amin và protein.
• Suy thối carbohydrate.
Phản ứng Maillard giữa các acid amin hoặc protein và carbohydrate [21, 22].
Do đó, acrolein là mợt tiền chất rất có thể xảy ra của acrylamide. Nói chung, protein
hoặc acid amin, sau một loạt biến đổi, chẳng hạn như thủy phân, tái sắp xếp và khử
carboxyl, cuối cùng dẫn đến acrylamide được thể hiện trong hình 1.2 [22] minh họa
dưới đây.

Hình 1.2 Cơ chế hình thành acrylamide trong q trình có gia nhiệt

10