Bước đầu nghiên cứu công nghệ sản xuất vacxin tại Việt Nam qui mô phòng thí nghiệm pptx

Bộ khoa học và công nghệ - Bộ Y tế

Trung tâm khoa học sản xuất văcxin sabin
=================================================


Đề tài độc lập cấp nhà nớc






Bớc đầu nghiên cứu công nghệ sản xuất
văcxin sởi tại việt nam qui mô
phòng thí nghiệm

5836
20/7/2006


Hà nội 2002



2
Đề tài độc lập cấp Nhà Nớc



Bớc đầu nghiên cứu công nghệ sản xuất văcxin sởi tại việt nam qui mô
phòng thí nghiệm


Chủ nhiệm đề tài: GS.TSKH. Nguyễn Văn Mẫn
Phó chủ nhiệm đề tài: GS.TS. Huỳnh Phơng Liên
Cố vấn khoa học:
GS.TSKH. Hoàng Thuỷ Nguyên
GS.TS KH. Đặng Đức Trạch

Cán bộ tham gia:

TS. Nguyễn Đăng Hiền
ThS. Cao Xuân Thịnh
ThS. Hoàng Thanh Hơng

CN. Đặng Mai Dung
BS. Đoàn Văn Lu
TS. Nguyễn Thị Quỳ
BS. Nguyễn Anh Thu
CN. Trần văn Dụ
CN. Nguyễn Thanh Thuỷ
BS. Nguyễn Thị Thờng
BS. Nguyễn Thị Thắng

Các cơ quan tham gia:
Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ơng



3
Chữ viết tắt


ADN Deoxyribonucleic Acid
(Axit deoxyribonucleic)
ARN Ribonucleic Acid
(Axit ribonucleic)
Bộ KHCN&MT Bộ Khoa học Công nghệ và Môi trờng
BTP Bán thành phẩm
CCID
50
Cell Culture Infective Dose 50%
(Liều gây nhiễm 50% tế bào nuôi cấy)
CEC Chicken Embryonate Cell
(Tế bào phôi gà)

CGI Cell Growth Index
(Chỉ số phát triển tế bào)
CMF Hanks Ca and Mg Free Hanks
(Hanks không có ion Ca và Mg)
CPE Cytopathic Effects
(Tác dụng huỷ hoại tế bào)
FBS Fetal Bovine Serum
HA Hemagglutinin
HAM Human Amniotic Membrane
(Tế bào màng ối ngời)
HK Human Kidney Cell
(Tế bào thận ngời)
KB Human rhinopharyngeal cancer epithelial cells
(Tế bào ung th biểu mô mũi hầu ngời)
KHT Kháng huyết thanh
KN Kháng nguyên
MMR Văcxin phối hợp Sởi, Quai bị, Rubella
MT Môi trờng

4
PCR Polymerase Chain Reaction
(Phản ứng chuỗi polymeraza)
SCD Soybean Casein Digest
SPF Specific Pathogen Free
(Không có tác nhân gây bệnh đặc hiệu)
SSPE Hội chứng viêm não sơ cứng bán cấp
TB Tế bào
TCMR Tiêm chủng mở rộng
TCYTTG Tổ chức Y tế Thế giới
WHO World Health Organization

(Tổ chức Y tế Thế giới)














5

mục lục


Trang
Chơng 1: Mở đầu
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục tiêu của đề tài 2
1.3. Nội dung nghiên cứu 2
1.3.1. Sản xuất vắcxin sởi qui mô phòng thí nghiệm 2
1.3.2. Đánh giá chất lợng vắcxin 2

Chơng 2: Tổng quan tài liệu
2.1. Virút học 3

2.2. Lâm sàng bệnh sởi 5
2.2.1. Đặc điểm của ban sởi 5
2.2.2. Tiến triển điển hình của bệnh sởi 5
2.2.3. Triệu chứng xuất tiết của bệnh sởi 6
2.3. Quá trình nhân lên của virút sởi 6
2.4. Đáp ứng miễn dịch 7
2.5. Sinh bệnh học 8
2.6. Dịch tễ học bệnh sởi 9
2.6.1. Đặc điểm dịch tễ của bệnh sởi 9
2.6.2. Tình hình mắc bệnh sởi ở Việt Nam 11
2.7. Vắcxin sởi 12
2.7.1. Lịch sử của vắcxin sởi 12
2.7.2. Tình hình sản xuất vắc xin sởi trên thế giới 12
2.8. Sử dụng vắcxin sởi 14
Chơng 3: Vật liệu và phơng pháp
3.1. Qui trình sản xuất vắcxin sởi 16

6
3.2. Vật liệu và phơng pháp sản xuất 16
3.2.1. Chủng virút Hu-191 16
3.2.2. Trứng gà SPF 17
3.2.3. Trang thiết bị và dụng cụ cần thiết 18
3.2.4. Các loại môi trờng cần thiết 18
3.2.5. Phơng pháp thực nghiệm 20
3.3. Phơng pháp kiểm tra chất lợng vắcxin sởi 24
3.3.1. Kiểm tra vô trùng 25
3.3.2. Thử nghiệm nhận dạng virút sởi 25
3.3.3. Thử nghiệm chuẩn độ hiệu giá 26
3.3.4. Thử nghiệm an toàn chung cho vắcxin thành phẩm trên súc vật 27
3.3.5. Thử nghiệm an toàn trên súc vật cho mẻ gặt đơn sau lọc 28

3.3.6. Thử nghiệm quan sát tế bào chứng 28
3.3.7. Thử nghiệm hấp phụ hồng cầu 29
3.3.8. Thử nghiệm tìm virút ngoại lai của mẻ gặt trên nuôi cấy tế bào 29
3.3.9. Thử nghiệm tìm virút ngoại lai của nớc nổi trên nuôi cấy tế bào.30
3.3.10. Thử nghiệm xác định hàm lợng Albumin bò tồn d 31
3.3.11. Thử nghiệm phát hiện Mycoplasma 31

Chơng 4: Kết quả và bàn luận
4.1. Kết quả sản xuất 33
4.1.1. Kết quả quá trình ấp trứng gà 33
4.1.2. Kết quả của quá trình tách và nuôi cấy tế bào 34
4.1.3. Kết quả quan sát tế bào 35
4.1.4. Kết quả đếm tế bào 36
4.1.5. Kết quả sử dụng tế bào 37
4.1.6. Kết quả tìm hiểu yếu tố ảnh hởng tới gây nhiễm virút 37
4.1.7. Vắcxin bán thành phẩm 39
4.1.8. Kết quả sản xuất vắcxin thành phẩm 41
4.2. Kết quả kiểm tra chất lợng 42
4.2.1. Kết quả kiểm tra nuôi cấy tế bào 42
4.2.2. Kết quả kiểm tra mẻ gặt đơn trớc lọc 44

7
4.2.3. KiÓm tra v¾cxin b¸n thµnh phÈm 46
4.2.4. KiÓm tra v¾cxin thµnh phÈm 49
Ch−¬ng 5: KÕt luËn

8
Chơng 1: Mở đầu
1.1 Đặt vấn đề
Bệnh sởi là một bệnh truyền nhiễm cấp tính lây qua đờng hô hấp, tốc độ lan
truyền nhanh và dễ gây dịch, thờng 100% ngời bị nhiễm virút sẽ phát bệnh nếu nh
cha có miễn dịch với sởi. Thể nhẹ là sốt, phát ban sau khoảng 1 tuần ban hết, trẻ có
thể hồi phục hoàn toàn. Bệnh có thể trở thành ác tính. Bệnh tiến triển nhanh và gây tử
vong do suy hô hấp, viêm cơ tim cấp, giảm tiểu cầu gây xuất huyết nội tạng Do
điều kiện kinh tế xã hội của nớc ta còn khó khăn, các phơng tiện và thuốc men điều
trị còn hạn chế đặc biệt là các vùng sâu vùng xa do đó tỷ lệ tử vong do sởi còn cao và
tỷ lệ biến chứng do sởi lớn. Những biến chứng do sởi nh ỉa chảy, viêm phổi, viêm tai
giữa, cam tẩu mã, nặng hơn có thể viêm não cấp, viêm não xơ cứng lan toả gây tử
vong và để lại các di chứng về thần kinh.
Theo số liệu của chơng trình Tiêm chủng mở rộng năm 1999 tỷ lệ mắc bệnh
sởi trong cả nớc ở mức 18,84/100.000 dân. ở vùng núi phía bắc, miền Trung, Tây
Nguyên tỷ lệ này còn cao hơn, có nơi từ 50-409/100.000 dân. Bệnh sởi là một trong

10 bệnh truyền nhiễm có tỷ lệ tử vong cao ở nớc ta.
Bệnh sởi phòng ngừa đợc bằng văcxin. Hiệu lực bảo vệ của văcxin sởi đạt trên
90%. Nhiều nớc trên thế giới đã khống chế đợc bệnh sởi nhờ sử dụng văcxin. ở
Việt Nam nhờ thực hiện tiêm phòng sởi cho trẻ dới một tuổi mà tỷ lệ mắc đã giảm đi
rõ rệt từ 30,9 trờng hợp/100.000 dân năm 1987 xuống còn 18,84/100.000 dân năm
1999. Văcxin sởi bất hoạt, kể từ khi ra đời những năm đầu thập kỷ 60 đã nhanh
chóng bị loại bỏ vì khả năng bảo vệ kém. Hiện nay tất cả các nhà sản xuất trên thế
giới đều sản xuất văcxin sởi sống giảm độc lực. Có nhiều chủng virut nổi tiếng đợc
sử dụng hiện nay nh AIK-C, CAM, Schwarz, TD97 đợc sử dụng ở Mỹ, Nhật, Pháp,
Bỉ; chủng L-16 đợc sử dụng ở Nga, Đức; chủng Hu191 đợc sử dụng ở Trung
Quốc Tất cả các chủng này đều có độ an toàn cao và khả năng bảo vệ tốt.

9
Việt Nam đã sản xuất đợc nhiều loại văcxin phục vụ cho công tác phòng bệnh.
Trong 10 loại vắcxin thiết yếu đợc dùng trong chơng trình TCMR hiện nay chúng
ta đã tự sản xuất đợc 9 trừ vắcxin sởi. Nhu cầu về văcxin sởi ở nớc ta rất cao, đặc
biệt khi thực hiện chơng trình khống chế bệnh sởi. Theo khuyến cáo của TCYTTG,
mỗi trẻ cần đợc tiêm 2 mũi văcxin sởi thay cho 1 mũi trớc đây. Nh vậy nhu cầu về
vắcxin sởi sẽ lên tới 6 - 7 triệu liều một năm. Để đáp ứng đợc nhu cầu này chúng ta
sẽ phải hoàn toàn nhập ngoại. Nh vậy là sẽ tốn kém và thụ động. Chính vì vậy mà
Bộ KH CN&MT và Bộ Y tế đã giao cho chúng tôi thực hiện đề tài này với nội dung
"Bớc đầu nghiên cứu công nghệ sản xuất vắcxin sởi tại Việt Nam qui mô phòng
thí nghiệm" để dần từng bớc chúng ta sẽ sản xuất đợc vắcxin và cung cấp đủ cho
nhu cầu trong nớc.
1.2. Mục tiêu của đề tài
1.2.1. Xây dựng qui trình và sản xuất ra vắcxin sởi qui mô phòng thí nghiệm
1.2.2. Thử nghiệm, đánh giá chất lợng vắcxin sởi ở mức độ phòng thí nghiệm.
1.3. Nội dung nghiên cứu
1.3.1. Sản xuất vắcxin sởi qui mô phòng thí nghiệm
- Nuôi cấy tế bào phôi gà một lớp

- Tiến hành gây nhiễm virút : Xác định nồng độ gây nhiễm, qui trình gây
nhiễm, thời điểm thích hợp để thu hoạch vắcxin cho có hiệu quả cao
- Đông khô vắcxin
1.3.2. Đánh giá chất lợng vắcxin
- Kiểm tra tác nhân ngoại lai có trong tế bào
- Kiểm định mẻ gặt đơn
- Kiểm định vắcxin bán thành phẩm trớc lọc
- Kiểm định vắcxin bán thành phẩm cuối cùng
- Kiểm định vắcxin thành phẩm.

10
Chơng 2: Tổng quan tài liệu
2.1. Virút học
Virút sởi thuộc giống Morbillivirus họ Paramyxoviridae phân họ
Pneumovirinae. Vật liệu di truyền là ARN một sợi âm. Virút có hình cầu không đồng
nhất với kích thớc từ 150-200nm. Vỏ virút bao gồm 2 lớp Lipit. Trên bề mặt có 2
glycoprotein H và F chúng tạo nên những gai nhô lên trên bề mặt virút. Protein H
(hemagglutinin) có chức năng hấp phụ hồng cầu và bám dính lên bề mặt tế bào trong
khi đó protein F (fusion) tạo ra các cầu nối liên kết các tế bào với nhau. Protein M
(matrix) tạo nên một lớp nền ở bên trong vỏ. Protein NP tạo nên các nucleocapsit bao
quanh ARN hình xoắn ốc. Protein P (photphorynate) và L (large) cũng đợc chứa
trong nucleocapsit và liên quan đến quá trình sao chép của ARN.

Hình 2-1: Sơ đồ cấu tạo của hạt virút sởi
H: Hemagglutinin protein ; F: Fusion protein; M: Matrix protein;
L: Large protein: NP: Nucleoprotein, P: Photphorynate protein
Lớ
p
Li
p
it
kép
H &F
M
ARN
L
P
N
P


11

3' N P M F H L 5'



1688 1657 1473 2377 1949 6639


2 4 6 8 10 12 14
Kilobazơ

Hình 2-2: Sơ đồ gen của virút sởi
(theo D.W.Kingsbury, "Field Virology", 2nd Ed.,p.948. Raven, New York, 1990)
Bảng 2-1: Sản phẩm và chức năng của gen
Đặc tính của protein
Trọng lợng pt
Gen
(tính
từ
đầu
3')
Số lợng
nucleotit
của
ARNtt trừ
poly A

Axit
amin
Không
hoạt
động

SDS-
PAGE

Vị trí trong
hạt virút


Chức năng

Các tính chất
khác
N 1688 523 58111 60000 Nucleo-
cápsit
Protein cấu
trúc của
nucleo-capsit
photpho
protein, nằm
sâu trong
ARN, chiếm
25% tổng số Pr
của hạt virút
P 1657 507 53900 68000 Nucleo-
cápsit
Thành phần
cấu trúc của
phức hợp men
polymeraza
Photpho
protein, có tính
axit, chiếm
10% tổng số Pr
của hạt virút
M 1473 335 37714 39000 Trong vỏ Liên kết giữa
vỏ và
nucleocapsit
có tính bazơ,

không a nớc,
chiếm 25%
tổng số protein

12
của hạt virút
F 2377 550 59510 62000 trên bề mặt
của vỏ
liên kết giữa
vỏ virút với
màng tế bào
chiếm 15%
tổng protein
của virút
H 1949 617 69250 78000 trên bề mặt
của vỏ
virút
vùi trong thụ
thể của tế bào
chủ
chiếm 25%
protein virút
L 6639 2183
247611
>200000
nucleocaps
it
men
polymeraza
2% tổng

protein virút
2.2. Lâm sàng bệnh sởi
2.2.1. Đặc điểm của ban sởi
- Ban xuất hiện tuần tự từ sau tai lan ra đầu mặt cổ sau đó lan xuống thân mình
và tứ chi.
- Ban màu đỏ, một số có thể kết hợp lại xen kẽ với những nốt ban là các khoảng
da khoẻ mạnh.
- Ban mất đi cũng tuần tự theo nh lúc xuất hiện.
- Sau khi ban lặn xuất hiện các nốt thâm thẫm mầu trên da tạo nên hình vằn da
hổ.
2.2.2. Tiến triển điển hình của bệnh sởi
Ngày của bệnh 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
40
39
38
37
36
Nhiệt độ cơ thể
(
o
C)


Giai đoạn tiền
triệu (xuất tiết)

Giai đoạn ngoại ban

Giai đoạn lui bệnh
Hạt Koplik

Phát ban Để lại vết thâm
Viêm kết mạc
Chảy nớc mũi
Ho
Hình 2-3: Tiến triển của bệnh sởi

13
2.2.3. Triệu chứng xuất tiết của bệnh sởi
Mắt
Viêm kết mạc Chảy nớc mắt
Mũi
Chảy nớc mũi Nghẹt mũi
Khoang miệng
Hạt Koplik
Viêm hầu họng

Hầu họng
Viêm thanh quản Ho
Đờng hô hấp
Viêm phế quản Ho
Đờng tiêu hoá
Xuất tiết đờng ruột ỉa chảy
2.3 Quá trình nhân lên của virút sởi
Nhìn chung, quá trình nhân lên của virút sởi đợc tóm tắt nh sau : Virút hấp
phụ lên Receptor của tế bào vật chủ, xâm nhập vào bên trong tế bào, cởi vỏ Tổng
hợp các thành phần của virút (gen và protein) Lắp giáp các thành phần đã tổng hợp
đợc Giải phóng hạt virút ra khỏi tế bào. Sự lan truyền virút từ tế bào này sang tế
bào khác theo 2 cách: 1) virút đợc giải phóng ra từ tế bào bị nhiễm đợc truyền trực
tiếp đến tế bào lành và 2) virút đợc truyền từ tế bào này sang tế bào khác nhờ vào sự
liên kết của tế bào. Khi virút giải phóng ra khỏi tế bào theo cách 1) thì protein màng

(M) sẽ có ái lực với vỏ và nucleocapsit để hình thành nên hạt virút. Còn theo cách thứ
2) khi các tế bào đã liên kết với nhau thì virút không cần phải giải phóng ra ngoài.
Các loại tế bào nhạy cảm với virút sởi nh tế bào thận khỉ, thận ngời, thận
chuột lang, thận cừu, tế bào phôi gà tiên phát, các loại tế bào thờng trực nh : Vero,
KB (tế bào ung th biểu mô hầu họng) và Hela. Tế bào B95a đợc chuyển thể bởi
virút Epstein-Barr từ nguyên bào lympho của khỉ đuôi sóc gần đây đợc xem là nhạy
cảm nhất với virút sởi. Tỷ lệ nhân lên của virút sởi là thấp. Chúng bắt đầu nhân lên
trong tế bào cả Vero và KB 20 giờ sau khi thâm nhiễm và chúng đạt đỉnh cao vào
ngày thứ 4-6. Sau đó tế bào giữ đợc tốc độ sản sinh virút. Số lợng virút tạo ra trên tế
bào KB vẫn giữ ở tỷ lệ cao cho đến ngày thứ 12. Trong thời gian đó tế bào chủ dần
dần thoái hoá. Số lợng virút giải phóng ra

14
ngoài chỉ bằng 1/10 đến 1/100 số lợng virút tổng hợp đợc và chúng đợc xem là
hầu hết virút tổng hợp đợc đều dính chặt vào tế bào chủ. Hiệu giá HA bắt đầu tăng 4
ngày sau khi thâm nhiễm. Điều đó chứng tỏ rằng số lợng hạt virút làm tăng hiệu giá
HA. Đối với tế bào Vero hiệu giá HA và sự thâm nhiễm giảm kể từ ngày thứ 12. Tế
bào khổng lồ đợc hình thành đối với tế bào Vero lớn hơn rất nhiều so với tế bào KB.
Cuối cùng tế bào khổng lồ bị dung giải liên quan đến các bớc của quá trình nhân lên
của virút. Một lý do mà virút sởi nhân lên trong tế bào KB lâu hơn có thể là do chúng
ít tạo thành tế bào khổng lồ.
Mặt khác virút rất dễ bị bất hoạt bởi nhiệt và tia cực tím. Hiệu giá thâm nhiễm
giảm 1/2 khi hỗn dịch virút đợc giữ ở 4
o
C trong 12 giờ. Chúng chỉ còn 1/10 khi giữ ở
33
o
C trong 15 giờ và 37
o
C trong 5 giờ, và chỉ còn 1/100 khi ở 37

o
C trong 15 giờ.
Những kết quả trên cho thấy virút sởi không đợc tạo ra với số lợng lớn trong
cùng một lúc và những hạt virút mới tạo ra rất dễ bị bất hoạt. Do đó số lợng virút
đợc bài tiết ra ở đờng hô hấp trên và trong nớc bọt là những virút đã thắng đợc
những yếu tố bất lợi trên chúng có khả năng thâm nhiễm rất mạnh. Điều này giúp cho
chúng ta phải xác định đợc thời gian thu hoạch văcxin tối u và tìm ra phơng pháp
bảo quản tốt trong quá trình sản xuất.
2.4. Đáp ứng miễn dịch
Kháng thể xuất hiện ngay khi ban xuất hiện. Xuất hiện sớm nhất là IgM, tiếp theo
là IgG và IgA trong huyết thanh và trong dịch tiết. Cả IgM và IgG đợc sản sinh ra
trớc tiên nhng IgM đạt đỉnh cao vào ngày thứ 7 đến ngày thứ 10 sau khi xuất hiện
ban, sau đó giảm nhanh và không tồn tại sau 4 tuần. Sự có mặt của IgM
chứng tỏ bệnh nhân bị nhiễm sởi tiên phát hoặc tiêm vắcxin. Còn IgG đợc tồn tại lâu.
Cấu trúc vỏ bao ngoài của hạt virut có các hemaglutinin. Có vai trò giúp virút
bám vào receptor của tế bào cảm thụ. Sau đó protein hoà màng xâm nhập phức hợp tái
tổ hợp, thực hiện sự nhân lên của virút trong tế bào cảm thụ. Sau khi virút đợc nhân
lên, giai đoạn giải phóng của virút thực hiện theo phơng thức nẩy chồi. Virút sởi là

15
virút đồng nhất, không có sự biến dị mọi cấu trúc của virút, do vậy sau khi nhiễm
virút sởi, kháng thể sởi sẽ duy trì suốt đời. Virút sởi chỉ gây bệnh cho ngời.
Tuy nhiên việc trung hoà virut sởi trong phòng thí nghiệm có thể bị ảnh hởng
bởi kháng thể kháng HA. Do đó để ngăn ngừa sự lan truyền virut trong cộng đồng cần
có cả kháng thể kháng kháng nguyên F. Kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên F
là đặc hiệu cho từng chủng. Vai trò quan trọng của kháng thể này đợc phỏng đoán
từ khi ngời ta nhận ra rằng văcxin sởi bất hoạt không mang lại miễn dịch đầy đủ.
Văcxin này không tạo ra đợc kháng thể kháng kháng nguyên F.
Thành phần M của virut sởi cũng đã đợc nghiên cứu, đặc biệt trong những
bệnh nhân bị bệnh viêm não sơ cứng bán cấp (SSPE). Ngời ta nhận thấy rằng những

bệnh nhân SSPE có kháng thể kháng thành phần M rất thấp. So sánh 9 chủng virut
khác nhau bằng kháng thể đơn dòng đã phát hiện ra rằng protein M thay đổi trong
các quyết định kháng nguyên.
Đánh giá hiệu quả sau khi tiêm chủng bằng xác định kháng thể trong máu và so
sánh trớc khi tiêm vắc xin với sau khi tiêm vắcxin ít nhất 4 tuần. Thờng sử dụng
phản ứng ức chế ngăn ngng kết hồng cầu (HI) để xác định hiệu giá kháng thể. Hiệu
giá kháng thể cao ở giai đoạn đầu, nó vẫn tồn tại kéo dài từ 1 1,5 năm sau tiêm.
Sau đó giảm dần từ 1/2 1/3 trong vòng 5 năm.
2.5.Sinh bệnh học
Con ngời bị nhiễm bệnh qua đờng hô hấp. Virút xâm nhập vào hệ thống bạch
huyết, có thể ở thể tự do hoặc liên kết với các đại thực bào, và đi tới các hạch bạch
huyết. Tại đây virút nhân lên mạnh mẽ nhng không gây huỷ hoại nhiều tế bào, và có
một số lan truyền sang các hạch bạch huyết khác, tới lách. Những tế bào đơn nhân bị
nhiễm sẽ tạo thành tế bào đa nhân khổng lồ, tế bào lympho T nhạy cảm với virút sởi
khi chúng đang hoạt động. Khoảng 6 ngày sau khi bị nhiễm xuất hiện virút trong máu
và các hạt virút lan truyền khắp cơ thể. Vì biểu mô liên kết chỉ có 1 hoặc 2 lớp tế bào
nên chúng bị huỷ hoại trớc tiên, chỉ 9-10 ngày sau khi bị nhiễm. Sau đó các triệu
chứng bệnh cấp tính xảy ra nh ho, chảy nớc mũi, phù nề mô liên kết, sốt cao, xuất

16
hiện hạt Koplik. Các triệu chứng này giảm đi khi ban xuất hiện. Cũng trong giai đoạn
này, trong máu ngoại vi xuất hiện kháng thể kháng virút sởi.
2.6. Dịch tễ học bệnh sởi
2.6.1. Đặc điểm dịch tễ của bệnh sởi
Virút sởi có khả năng lây nhiễm rất mạnh so với các tác nhân gây bệnh đợc
biết cho đến nay. Bệnh có triệu chứng lâm sàng điển hình. Khi ngời không có kháng
thể kháng lại virút sởi bị nhiễm virút sởi thì sẽ bị bệnh, chỉ một số rất ít không có
triệu chứng. Tuy nhiên, có một số trờng hợp mà trẻ bị phơi nhiễm với virút trong khi
kháng thể do mẹ truyền sang đã giảm nhng vẫn không có biểu hiện lâm sàng. Sởi
đợc biết đến nh là một bệnh của trẻ nhỏ, tất cả mọi ngời nhạy cảm với virút đều có

thể bị nhiễm bất kể lứa tuổi nào. Bởi vì chúng có khả năng lây nhiễm mạnh, những
đứa trẻ trở nên nhạy cảm với virút sởi vào lúc 6 tháng tuổi có thể bị nhiễm bệnh ngay
sau khi chúng bị tiếp xúc với virút. Do đó tuổi mắc bệnh chủ yếu là trẻ nhỏ. Sau khi
khỏi bệnh ngời ta có đợc miễn dịch cao chúng có thể tồn tại suốt cuộc đời. Do đó
sởi còn đợc gọi là bệnh không ai mắc lần thứ 2.
Vì các đặc tính đó nên dịch sởi thờng có tính chu kỳ. Những ngời nhạy cảm
luôn luôn đợc bổ sung bằng những đứa trẻ mới sinh và những đứa trẻ di c đến và cơ
hội của chúng khi tiếp xúc với ngời bệnh. Khi các yếu tố này vợt quá một ngỡng
nhất định thì một vụ dịch sẽ xảy ra. Sau khi khỏi bệnh những ngời này đợc loại
khỏi nhóm có nguy cơ. Do đó chỉ còn những ngời có nguy cơ mới là vấn đề cần
quan tâm. Chu kỳ của dịch sởi trong cộng đồng rộng lớn thờng là 2 năm.
Bartlett (1960) đã phát hiện ra mối liên hệ giữa dịch sởi và độ lớn của cộng
đồng tại Mỹ và Anh. Ông cho rằng từ 4000 - 5000 ca xảy ra trong một năm trong một
cộng đồng có từ 250 - 300 ngàn dân mới có thể làm cho dịch xảy ra thờng xuyên,
bởi vì virút không thể tồn tại lâu trong một cộng đồng nhỏ và nó không thể tồn tại nếu
không có những ngời mang mầm bệnh từ những nơi dịch xảy ra.
Black (1966) đã phân tích các báo cáo hàng tháng của bệnh sởi ở một số thành
phố và ở 19 hòn đảo trong 15 năm. Kết quả cho thấy 1) dịch sởi đôi khi không tồn tại

17
ở một hòn đảo với dân số dới 500 ngàn ngời và 2) độ dài của dịch tỷ lệ nghịch với
mật độ dân số. Do đó ông đã khẳng định rằng với một cộng đồng khoảng 350 ngàn
dân với mật độ dân số cao nh các thành phố lớn là cần thiết cho bệnh sởi lu hành
trong cộng đồng dân c.
Cliff và Haggett (1984) đã phân tích các yếu tố địa lý dựa vào kết quả của Blak
về dịch tễ học bệnh sởi và đã chia cộng đồng ngời thành 3 nhóm. Mỗi nhóm có một
đặc điểm về dịch sởi liên quan đến độ lớn của cộng đồng. Những cộng đồng dân c
lớn có đặc điểm dịch sởi theo kiểu I, trong đó dịch xảy ra liên tục và giữa các vụ dịch
luôn có các bệnh nhân bị bệnh. Những cộng đồng vừa có kiểu thứ II. Kiểu này cho
thấy dịch xảy ra theo chu kỳ nhng không liên tục bởi vì dân số quá ít để có thể lu

giữ đợc virút sởi sau mỗi vụ dịch. Virút biến mất trong giai đoạn giữa 2 vụ dịch và
nguồn lây chủ yếu là do những bệnh nhân từ cộng đồng lớn mang tới trong thời gian ở
đó xảy ra dịch. Trong cộng đồng dân c nhỏ dịch xảy ra theo kiểu thứ III. Dịch xảy
ra không liên tục và không theo một qui tắc nào cả.






Kiểu I






Kiểu II







Kiểu III

18

2.6.2. Tình hình mắc bệnh sởi ở Việt Nam

Bệnh sởi đã giảm đáng kể kể từ khi chơng trình TCMR đợc thực hiện ở nớc
ta. Tuy nhiên, trong những năm gần đây các vụ dịch sởi vẫn xảy ra rải rác tại nhiều
địa phơng trong cả nớc. Bệnh sởi xảy ra quanh năm, xuất hiện nhiều trong mùa
xuân, thấp nhất vào mùa hè - thu.
Trong năm 1999, cả nớc có 13.475 trờng hợp mắc sởi, số ca dới 5 tuổi
chiếm 18,93%. Số chết do bệnh sởi trong những năm gần đây dao dộng thấp trong
khoảng 8 - 9 trờng hợp/năm. Theo số liệu của chơng trình TCMR phía Bắc cho thấy
30,4% trẻ mắc sởi dới 5 tuổi là do không đợc tiêm chủng hoặc tiêm không đúng
lịch. Đó cũng chính là một trong những nguyên nhân làm cho bệnh sởi gia tăng trong
những năm qua.
Do tăng cờng công tác tiêm chủng, tỷ lệ tiêm phòng sởi đợc tăng lên từ 42%
năm 1987 lên 89% năm 1992 và duy trì ở mức trên 90% cho đến năm 1999. Đồng
thời với sự tăng tỷ lệ tiêm chủng, tỷ lệ mắc giảm đi rõ rệt từ 30,9 trờng hợp trên
100.000 dân năm 1987 giảm xuống 18,84% năm 1999. Đối với một số vùng núi phía
Bắc, miền Trung và Tây nguyên tỷ lệ mắc vẫn cao (từ 50 tới 409/100.000 dân).
Trong 5 tháng đầu năm 2000, trên 14 tỉnh, 34 huyện ở miền Bắc đã có 7172
trờng hợp nghi mắc sởi, tỷ lệ trẻ dới 5 tuổi chiếm 18%, từ 5 - 9 tuổi là 36%, 10-15
tuổi chiếm 39% và trên 15 tuổi chiếm 39%. Qua theo dõi thấy rằng tuổi mắc bệnh đã
chuyển dịch lên lứa tuổi cao hơn, chủ yếu những trẻ cha tiêm chủng và những trẻ
mới tiêm một mũi vắcxin sởi.
2.7. Vắcxin Sởi
2.7.1. Lịch sử của vắcxin sởi.
Vắc xin sởi chết đã đợc sử dụng ở Mỹ từ năm 1963 1967, nhng do hiệu
quả bảo vệ ngắn đã khuyến cáo tiêm vắcxin sống giảm độc lực. Vắcxin sống giảm
độc lực lần đầu tiên đợc giới thiệu cũng vào năm 1963, 1967, 1969. Đến năm 1971

19
vắcxin sởi sống giảm độc lực kết hợp với quai bị, Rubella đợc chính thức đa vào sử
dụng.
2.7.2. Tình hình sản xuất vắc xin sởi trên thế giới

2.7.2.1. ở Nhật Bản
Trớc kia sử dụng vắcxin sởi chết, nhng sau đó huỷ bỏ vì có phản ứng phụ và
xuất hiện thể sởi không điển hình.
Hiện nay đang sản xuất và sử dụng vắcxin sởi sống giảm độc lực, có 4 chủng
virút sởi : Schwarz, CAM, AIK - C, TD - 97 đang đợc sử dụng để sản xuất vắc xin
này. Mỗi chủng đều thích nghi ở nhiệt độ thấp, nhng độ nhậy cảm nhiệt độ của
vắcxin phụ thuộc vào chủng virút dùng để sản xuất.
1970 1975 1980 1985 1990

Schwarz Schwarz FF8

CAM - 70

AIK - C

TD 97

Chủng AIK - C và Schwarz FF8 có nguồn gốc từ chủng Edmonston. Chủng
CAM - 70 và TD - 97 có nguồn gốc từ chủng Tanabe là chủng đợc phân lập ở Nhật.
Lịch sử các chủng gốc đang đợc sử dụng để sản xuất vắcxin sởi sống giảm
độc lực ở Nhật.

20




HK/24
HA/28

HA/12 CE/6
SK (33
0
C)/17 CEF(37
0
C)/14
CEF (33
0
C)/12


CEF(32
0
C)/85

AIK-C
Kitasato institute
CEF(31
0
C)/31
CEF(31
0
C)/4




Takeda Chemical Industry Co., Ltd

MK/1 MK(32
0
C)/1
HK/3 GPK(32
0
C)/37
MK/1 GPK(32
0
C)/5
HK/5 CEF(32
0
C)/7
MK/1 MK(32
0
C)/1
CE/90 CEF(32
0
C)/2
HK/2 MK(32
0
C)/2
CE/4
CAM/35
CEF (26
0
C)/12

osaka University
Chiba Serum Institue

CAM : Embryonated egg chorioallantoic cavity, CE : Embryonated egg
amniotic cavity, CEC : Chick embryo cells, GPK : guiea-pig kidney cells, HA :
Human amniotic cells, HK : Human kidney cells, MK : Monkey kidney cells, SK :
Sheep kidney cells.
Từ tháng 4 năm 1998 bên cạnh việc tiêm chủng vắcxin đơn giá, sử dụng
vắcxin phối hợp MMR : sởi, quai bị, Rubella.

2.7.2.2. ở Trung quốc
ở Trung quốc sử dụng chủng Hu191 (Thợng Hải 191) để sản xuất vắcxin Sởi
sống giảm độc lực, phục vụ cho nhu cầu tiêm chủng trong nớc.
Chủng Hu191 đợc phân lập từ một bé trai 2 tuổi mắc thể sởi điển hình năm
1960 ở Thợng Hải. Virút sởi này đợc nhân lên trên tế bào thận ngời tiên phát 33
lần, tiếp tục đợc nhân lên trên tế bào màng ối ngời 39 lần, sau đó chuyển sang tế
bào phôi gà 16 lần và đợc chính phủ Trung quốc cấp giấy phép sử dụng làm chủng
edmonston
Edmonston A
Schwarz
Schwarz FF8
Tanabe strain
CAM-70
TD97

21
gốc năm 1965. Văcxin dùng cho ngời đợc sản xuất từ đời cấy truyền thứ 22 đến đời

thứ 32.
Chủng này hiện nay đợc dùng ở viện văcxin và huyết thanh Bắc Kinh và viện
văcxin và sinh phẩm Vũ Hán Trung Quốc. Trong một nghiên cứu về huyết thanh học
và dịch tễ học sau khi tiêm văcxin sởi đợc sản xuất từ chủng Hu191 trên 503 trẻ từ 6
đến 15 tháng tuổi, từ năm 1991 đến 1998 thấy rằng: tỷ lệ đáp ứng miễn dịch đạt
91,65%, hiệu giá kháng thể trung bình nhân đạt 1:266,74. Tuổi gây miễn dịch là một
yếu tố rất quan trọng quyết định tỷ lệ đáp ứng miễn dịch. Qua nghiên cứu cho thấy trẻ
dới 6 tháng tuổi có tỷ lệ đáp ứng thấp hơn rõ rệt so với trẻ trên 8 tháng tuổi.
2.8. Sử dụng vắcxin sởi
Trình bày vắcxin dới dạng đông khô, có chất bảo quản và kháng sinh. Nó có
mầu đỏ trong suốt khi hoàn nguyên. Vắcxin đông khô đợc bảo quản dới 5
0
C trong
điều kiện không có ánh sáng. Hiệu giá của vắcxin không dới 1.000 CCID
50
/ 1 liều.
Vắc xin đợc tiêm dới da, tiêm cho trẻ từ 9 tháng tuổi .
Trong vùng dịch sởi khuyến cáo phải tiêm cho trẻ từ 18 tháng đến 36 tháng
tuổi. Vắcxin này có thể tiêm quanh năm, nhng tốt nhất nên tránh vào thời điểm giữa
mùa hè hoặc đang giai đoạn có dịch sởi lu hành.
Chống chỉ định : Những ngời nhiễm HIV nên tránh không tiêm chủng vắcxin
Sởi.
Hiện tại có hai loại vắcxin sởi : vắcxin sởi sống giảm độc và vắcxin sởi chết.
Vắcxin sống giảm độc rất có hiệu quả phòng bệnh sởi, do vậy nó đợc tiêm cho trẻ
em 9 tháng tuổi để phòng bệnh sởi ở mọi hình thái lâm sàng.
Vắcxin chết, trong quá trình sản xuất đã phá huỷ protein kháng nguyên hoà
màng, do vậy kháng thể hình thành sau khi tiêm vắcxin không đủ để kháng lại mọi
kháng nguyên của virút sởi. Vì vậy nếu nhiễm virút sởi hoang dại, ngời đã tiêm có
thể bị sởi không điển hình, đó là nguồn lây không biết rõ nên khó phòng.

22
Chơng 3
Vật liệu và phơng pháp

3.1. Qui trình sản xuất vắcxin sởi

Trứng gà SPF

ấp tại 38
o
C/9 ngày

Trypsin hoá phôi gà

Nuôi cấy tế bào một lớp

Sau 2 ngày tế bào phát triển kín một lớp

Gây nhiễm virút/33
o
C
Sau 3 ngày
Rửa tế bào đã nhiễm virút

Thay bằng môi trờng duy trì/33
o
C
Sau 3-4 ngày
Khi CPE đạt 3+. Giữ 5

o
C/ qua đêm

Gặt, Lọc, Cho chất bảo quản

Đóng lọ, Đông khô

3.2. Vật liệu và phơng pháp sản xuất
3.2.1. Chủng virút Hu-191
Chủng do Viện vắcxin và huyết thanh Bắc Kinh, Trung Quốc cung cấp


23
Lịch sử của chủng Hu-191
Virút Sởi
(Phân lập từ một bệnh nhân nam 2 tuổi ở Thợng Hải năm 1960)

HK/33 lần cấy truyền

HAM/39 lần cấy truyền

CEC/16 lần cấy truyền Đợc cấp phép năm 1965

CEC/P22 Từ đây cho đến P32 dùng cho ngời

CEC/P30 Việt Nam

Sơ đồ 3-1: Lịch sử chủng virút sởi Hu-191.

3.2.2. Trứng gà SPF

Trứng gà không có tác nhân gây bệnh đợc nhập từ công ty MERIAL
Trung Quốc (Giấy chứng nhận - Phụ Lục 1)











a) )

a) b)
ảnh 3-1: Trứng gà SPF a) và hình ảnh trứng gà 9 ngày tuổi phát triển bình
thờng.

24
3.2.3.Trang thiết bị và dụng cụ cần thiết
- Máy đo pH
- Tủ ấp trứng 39
o
C
- Máy kiểm tra trứng
- Pank, kéo
- Chai nuôi tế bào
- Các dụng cụ thuỷ tinh
- Lới lọc tế bào

- Tủ ấm 33
o
C, 37
o
C Harman - Đức
- Tủ lạnh, tủ đá
- Kính hiển vi lộn ngợc - Nhật
- Hốt vô trùng
- Lọc millipore - Mỹ
- Máy đông khô Virtis - Mỹ

3.2.4. Các loại môi trờng cần thiết.
3.2.4.1 Dung dịch trypsin
STT
Thành phần hóa học
Hng sản xuất
số g/l
1 NaCl Sigma 80
2 KCl Merck 2
3 KH
2
PO
4
Merck 2
4 Na
2
HPO
4
.12 H
2

O Merck 11,5
5 Red Phenol BDH 0,02
6 Trysine Gibco 1,25
Kháng sinh: Kanamycin
Chống nấm: Fugizon
Nớc cất 2 lần vừa đủ 1 lít




25
3.2.4.2. Môi trờng Earle.
STT Thành phần hoá học Hng sản xuất số g/l
1 NaCl Sigma 136
2 KCl Merck 8
3 CaCl
2
.2H
2
O Labosi 5,28
4 MgCl
2
.6H
2
O Merck 3,4
5 NaH
2
PO
4
.2H

2
O Merck 3,16
6 Gluco Labosi 20
7 Red Phenol BDH 0,02
Kháng sinh : Kanamycin
Chống nấm : Fugizon
Nớc cất 2 lần vừa đủ 1 lít
3.2.4.3. Môi trờng phát triển LH (0,2% Lactabumin Hydrolyzat - 3% huyết thanh
bê)
- Lactabumin Hydrolyzat : 2 g/l
- Huyết thanh bê : 30 ml/l
- Môi trờng Earle : vừa đủ 1 lít
3.2.4.4. Môi trờng duy trì: 199 (Sigma)
3.2.4.5. Môi trờng bảo quản.
STT Thành phần hoá học Hng sản xuất Số g/l
1 Sodium Glutamat Labosi 16
2 UREA Labosi 8,3
3 Arginin Merck 2,7
4 Succoze Labosi 50
5 Gelatin BDH 10
6 Albumin, Human Sigma 2
Đợc pha trong môi trờng 199