Thí nghiệm công nghệ sinh học dược báo cáo CUỐI kì sản xuất enzyme amylase bằng e coli tái tổ hợp

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TƠN ĐỨC THẮNG
Khoa Dược

Thí nghiệm Cơng nghệ Sinh học Dược
BÁO CÁO CUỐI KÌ
GVHD: TS. Lê Bảo
TS. Lê Thùy Hương
Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thúy Thanh – H1900167
Nguyễn Quốc Tựu – H1800350
Lê Kim Nhi – H1900126
Cù Thị Hoàng Yến – H1900222
Bùi Nguyễn Thanh Ngân - H1900289
Nguyễn Ngọc Kim Ngân - H1900290
Lê Ngọc Phương Linh - H1900282
Phạm Thị Ngọc Mỹ - H1900233

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 12, năm 2021

1


Mục lục
Tóm tắt............................................................................................................................................3
Giới thiệu........................................................................................................................................ 4
1. Chọn lọc giống vi sinh vật..........................................................................................................4
1.1. Phân lập và phát hiện vi sinh vật có khả năng sinh enzyme..........................................................4
1.1.1. Vật liệu.....................................................................................................................................4
1.1.2. Thực hiện.................................................................................................................................5
1.1.3. Kết quả thí nghiệm...................................................................................................................5
Nhận xét............................................................................................................................................... 11
1.2. Kháng sinh.................................................................................................................................... 11

1.2.1. Vật liệu.................................................................................................................................... 11
1.2.2. Thực hiện................................................................................................................................... 12
1.2.3. Kết quả thí nghiệm................................................................................................................. 12

2. Tinh chế enzym Amylase bằng Alginat....................................................................................13
2.1 Nguyên vật liệu............................................................................................................................... 13
2.2. Tiến hành...................................................................................................................................... 13
2.2.1. Thu enzym thô........................................................................................................................ 13
2.2.2. Tinh chế enzym thô................................................................................................................ 14
2.2.3. Xác định hàm lượng protein bằng OD280............................................................................. 14

3. Tạo dòng biểu hiện protein tái tổ hợp trong E. coli................................................................15
3.1. Tách Plasmid dùng Spin Column................................................................................................. 15
3.1.1. Vật liệu.................................................................................................................................... 15
3.1.2. Thực hiện............................................................................................................................... 15
3.2. Biến nạp plasmid vào E. coli......................................................................................................... 16
3.2.1. Vật liệu.................................................................................................................................... 16

2


3.2.2. Thực hiện............................................................................................................................... 16
3.2.3. Nhận xét................................................................................................................................. 21
3.3. Lưu dòng tế bào có mang plasmid tái tổ hợp................................................................................ 21
3.3.1. Vật liệu.................................................................................................................................... 21
3.3.2. Thực hiện............................................................................................................................... 21
3.3.3. Nhận xét................................................................................................................................. 22
3.4. Nuôi cấy và cảm ứng biểu hiện protein mục tiêu......................................................................... 22
3.4.1. Vật liệu.................................................................................................................................... 22
3.4.2. Thực hiện............................................................................................................................... 23

3.4.3. Nhận xét................................................................................................................................. 25

4. Tinh chế protein tái tổ hợp.......................................................................................................25
4.1. Khái quát về nguyên tắc của sắc ký ái lực.................................................................................... 25
4.2. Sắc ký ái lực ion kim loại – IMAC................................................................................................ 25
4.2.1. Vật liệu chuẩn bị.................................................................................................................... 25
4.2.2. Chuẩn bị cột........................................................................................................................... 26
4.2.3. Phá tế bào............................................................................................................................... 26
4.2.4. Tinh chế protein His-tag........................................................................................................ 27
4.2.5. Xác định hàm lượng protein.................................................................................................. 27

5. Kết luận.....................................................................................................................................29

Tóm tắt
Vấn đề nghiên cứu: “Sản xuất enzyme amylase bằng E. coli tái tổ hợp”, thực hiện tại
phịng thí nghiệm vi sinh Đại học Tôn Đức Thắng TP.HCM 18/12/2021- 19/12/2021. Với mục
3


tiêu nghiên cứu: nắm rõ các giai đoạn của quá trình chọn lọc giống vi sinh vật, các bước tiến
hành tạo dịng biểu hiện protein, quy trình tinh chế amylase, biết cách tính tốn các thơng số
trong q trình tinh chế protein, hiểu nguyên tắc sắc ký ái lực và quá trình thực hành tinh chế
protein bằng sắc ký ái lực với Ni-sepharose, GST-sepharose.
Giới thiệu
Chọn lọc giống vi sinh vật là phương pháp phân lập và phát hiện chủng vi sinh vật có đặc
tính mong muốn từ các mẫu vi sinh vật hỗn hợp, sau đó cải tạo chủng và ni cấy bảo quản
chúng trong mơi trường thích hợp. Việc chọn lọc giống vi sinh vật bao gồm các bước: phân lập
từ tự nhiên, gây đột biến, phát hiện dòng vi sinh vật có đặc tính mong muốn, bảo quản giống. Để
phát hiện dịng vi sinh vật có đặc tính mong muốn, ta có thể dựa vào chất chuyển hố tạo ra như
tạo kháng sinh hay tiết sắc tố enzyme ngoại bào tác động lên cơ chất trong môi trường: amylase

– tinh bột, protease – gelatin. Chỉ có những chất nào trong đất sinh chất đối kháng với chủng
kiểm định, có tính chất kháng sinh thì sau khi ni sẽ tạo ra vùng ức chế đặc hiệu trên đĩa thạch.
Tinh chế enzyme amylase bằng alginate được thực hiện bằng gel alginate. Phương pháp
tinh chế là phương pháp cố định enzyme, theo cơ chế hấp phụ, amylase xem alginat cơ chất nên
bám lên bề mặt các hạt gel, do đó có thể lọc lấy amylase dễ dàng. Xác định hàm lượng protein
(cơ chất của enzyme) bằng cách đo độ hấp thu OD 280. Xác định hoạt tính amylase được thực hiện
bằng phương pháp Heinkel. Hoạt độ của amylase được tính bằng lượng tinh bột bị phân giải dựa
trên mức giảm cường độ màu của hỗn hợp phản ứng với thuốc thử Iod. Sau đó tinh chế protein
bằng sắc ký ái lực theo nguyên tắc dựa vào sự gắn thuận nghịch của một nhóm chức năng trên
protein với một nhóm chức năng trên pha tĩnh sắc ký. Chỉ protein đích mang nhóm chức năng
đặc hiệu mới gắn vào pha tĩnh.
1. Chọn lọc giống vi sinh vật
1.1. Phân lập và phát hiện vi sinh vật có khả năng sinh enzyme
1.1.1. Vật liệu
Thuốc thử TCA 50%
Dung dịch Lugol
Thạch tinh bột
4


Thạch Gelatin
Đệm PBS

1.1.2. Thực hiện
Cho vào 1g mẫu đất 10 μL đệm PBS
Vortex để phân tán vi sinh vật vào đệm. Để khoảng 15 phút cho đất lắng xuống đáy.
Pha loãng dịch huyền phù vi sinh vật cấp 10, đánh số ống từ 1 đến 6.
Hút 100 μL huyền phù vi sinh vật đã pha lỗng, trải lên mơi trường phát hiện ống 4, 5 và
6. Ủ ở nhiệt độ 37oC/ 24 giờ nhằm phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng sinh enzyme
amylase, protease trên 3 đĩa thạch tinh bột và 3 đĩa thạch gelatin.

Phân lập và phát hiện vi sinh vật trong mẫu đất có khả năng tiết amylase ngoại bào.
Môi trường phân lập: tinh bột
Thuốc thử: dung dịch Lugol
Phân lập và phát hiện vi sinh vật trong mẫu đất có khả năng tiết protease ngoại bào.
Mơi trường phân lập: thạch gelatin
Thuốc thử: TCA 50%
1.1.3. Kết quả thí nghiệm
1.1.3.1 Phân lập và phát hiện vi sinh vật có khả năng sinh enzyme Protease ngoại bào

5


(a)

(b)

(c)

Hình 1.1 (a) Đĩa phân lập và phát hiện khả năng sinh protease ngoại bào trước khi nhỏ TCA
50% ở ống 4; (b) Đĩa phân lập và phát hiện khả năng sinh protease ngoại bào trước khi nhỏ TCA
50% ở ống 5; (c) Đĩa phân lập và phát hiện khả năng sinh protease ngoại bào trước khi nhỏ TCA
50% ở ống 6.

6


(a)

(b)

(c)

Hình 1.2 (a) Đĩa phân lập và phát hiện khả năng sinh protease ngoại bào sau khi nhỏ TCA 50%
ở ống 4; (b) Đĩa phân lập và phát hiện khả năng sinh protease ngoại bào sau khi nhỏ TCA 50% ở
ống 5; (c) Đĩa phân lập và phát hiện khả năng sinh protease ngoại bào sau khi nhỏ TCA 50% ở
ống 6.

7


Bảng 1 Kết quả phân lập và phát hiện vi sinh vật có khả năng tiết protease ngoại bào

TT

Mơ tả

1
2
3

Nhận xét
Chủng vi sinh vật trong mẫu đất sau khi phân lập trên môi trường thạch gelatin và ủ ở 37 oC trong
24 giờ có khả năng tiết protease ngoại bào ở ống 4 (xung quanh chỗ vi sinh vật mọc có vịng
sáng, trong do gelatin đã bị thuỷ phân nên khơng bị tủa). Sau khi nhỏ TCA 50% thì chỉ có 1 mơi
trường tạo vịng sáng quanh chỗ vi sinh vật mọc.

1.1.3.2 Phân lập và phát hiện vi sinh vật có khả năng sinh enzyme Amylase ngoại bào

8

(a)

(b)

(c)

Hình 1.3 (a) Đĩa phân lập và phát hiện khả năng sinh amylase ngoại bào trước khi nhỏ dung
dịch Lugol ở ống 4; (b) Đĩa phân lập và phát hiện khả năng sinh amylase ngoại bào trước khi
nhỏ dung dịch Lugol ở ống 5; (c) Đĩa phân lập và phát hiện khả năng sinh amylase ngoại bào
trước khi nhỏ dung dịch Lugol ở ống 6.

9


(a)

(b)

(c)

Hình 1.3 (a) Đĩa phân lập và phát hiện khả năng sinh amylase ngoại bào sau khi nhỏ dung dịch
Lugol ở ống 4; (b) Đĩa phân lập và phát hiện khả năng sinh amylase ngoại bào sau khi nhỏ
dung dịch Lugol ở ống 5; (c) Đĩa phân lập và phát hiện khả năng sinh amylase ngoại bào sau
khi nhỏ dung dịch Lugol ở ống 6.
10


Bảng 2 Kết quả phân lập và phát hiện vi sinh vật có khả năng tiết amylase ngoại bào

TT

1

Mơ tả

Khóm màu vàng nhạt, trịn, bìa khơng răng cưa, đường kính
khoảng 3mm

2

Không thấy vi sinh vật tiết amylase ngoại bào

3

Không thấy vi sinh vật tiết amylase ngoại bào

Nhận xét
Chủng vi sinh vật trong mẫu đất sau khi phân lập trên môi trường tinh bột và ủ ở 37 oC trong 24
giờ có khả năng tiết amylase ngoại bào trong ống 4 (xung quanh chỗ vi sinh vật mọc có vịng
sáng nhỏ, trong do tinh bột đã bị thuỷ phân nên không tạo màu với iod).
Tại môi trường phát hiện ống 5 hầu như khơng có vịng sáng, mơi trường phát hiện ống 6 cũng
khơng có vịng sáng.
1.2. Kháng sinh
Phát hiện vi sinh vật sinh kháng sinh dựa vào khả năng ức chế sự tăng trưởng của nó đối với các
sinh vật khác.
1.2.1. Vật liệu
Chủng kiểm tra: chủng Bacillus có khả năng sinh kháng sinh
Chủng thử nghiệm: E. coli vs Shigella
Dung dịch PBS dùng làm mẫu chứng

11


2 đĩa thạch TSA
1.2.2. Thực hiện
Đốt đèn cồn sát khuẩn tay và khu vực xung quanh
Tất cả các thao tác đều phải thực hiện gần đèn cồn để đảm bảo vô khuẩn
Mở nắp ống nghiệm chứa vi khuẩn, dùng que bông vô trùng nhúng vào ống nghiệm
chứa vi khuẩn, ép que trên thành ống để ráo nước, rút que bông ra khỏi ống nghiệm,
Trải đều vi khuẩn trên mặt thạch, lặp lại 3 lần, mỗi lần xoay đĩa 60 độ
Thực hiện trên 2 đĩa,1 đĩa chứa vi khuẩn E. coli,1 đĩa chứa vi khuẩn Shigella
Để yên trong khoảng 3-5p
Dùng dụng cụ đục lỗ đục ít nhất 3 lỗ trên đĩa thạch
Cho khoảng 0,1 µl dịch ni cấy chứa vi khuẩn Bacillus vào 2 lỗ trống
Lỗ trống cịn lại cho 0,1µl dung dịch PPS làm mẫu đối chứng
Nuôi cấy ở 37°C trong 24h, thu kết quả
1.2.3. Kết quả thí nghiệm

12


Hình 1: Thao tác đục lỗ trên đĩa thạch

Hình 2: Kết quả thu được trên đĩa thạch E. coli

Hình 3: Kết quả thu được trên đĩa thạch Shigella

2. Tinh chế enzym Amylase bằng Alginat
2.1 Nguyên vật liệu
Khoai lang

2.2. Tiến hành
2.2.1. Thu enzym thô
Bỏ vỏ khoai lang, cắt nhỏ thành từng miếng
Cân 30g khoai lang cho vào chày cối để ghiền nát với 30ml đệm phosphate
Lấy 20ml có được từ việc nghiền chung với PBS và tiến hành ly tâm để thu dịch
lỏng Lọc qua giấy lọc thu dịch lỏng chứa enzyme amylase thô

13


2.2.2. Tinh chế enzym thô
Lấy 10ml dịch enzyme thô từ bước trước, cho dung dịch 30mL sodium alginate 2%, dùng
đũa thủy tinh khuấy đều, ủ trong 1 giờ
Cho 20ml dung dịch CaCl2 0.7M vào dung dịch alginat + enzyme, khuấy đều. Đem đi ly
tâm và thu tủa
Cho 20ml dung dịch glucose 2% 4°C và ủ 12 giờ. Sau 12 giờ, lấy dịch ủ đi ly tâm thu
dịch lỏng chứa enzyme amylase tinh
2.2.3. Xác định hàm lượng protein bằng OD280
Lấy 2 eppendorf chứa 1.5ml enzym amylase thô và 1.5ml enzym amylase tinh, ly tâm
10000 vòng/phút trong 1 phút
Sau ly tâm: enzym amylase thơ pha lỗng 20 lần (50 uL Amylase thơ + 950 uL nước),
enzym amylase tinh khơng pha lỗng (1000 uL Amylase tinh) => cho vào cuvet
Cho cuvet vào máy đo OD ở bước sóng 280 nm

14

Amylase tinh

0.328

2.2.4. Xác định hoạt tính enzyme phương pháp Heinkel
Nguyên tắc: xác định hoạt độ nhờ mức độ giảm màu của hỗn hợp phản ứng với
dung dịch iode.
Tiến hành:
-

Đối với enzyme thơ, pha lỗng 100 lần với đệm phosphate.

-

Đối với enzyme tinh chế, pha loãng 10 lần với đệm phosphate.

Xác định hoạt tính enyme thơ và enzyme tinh chế, mỗi mẫu thực hiện 2 eppendorf (ống thử
và ống chứng).

Cách tính kết quả:
Tính hiệu số đọc được trên máy giữ mẫu chứng và mẫu thử thô:
∆OD = ODC – ODT = 3.122 – 1.500 = 1.622A
Tính hiệu số đọc được trên máy giữ mẫu chứng và mẫu thử tinh:
∆OD = ODC – ODT = 1.780 – 0.923 = 0.857A

15


Từ ∆OD đưa vào đồ thị chuẩn tính được số mg tinh bột thủy phân tương ứng từ đó tính hoạt
độ enzyme (HTE).
HTE thô = (3.122- 1.500) / (0.8388 x 15 x 0.1) = 1.289 (U/ml)
HTE tinh = (1.780 – 0.923) / (0.8388 x 15 x 0.1) = 0.681 (U/ml)
Lập đồ thị chuẩn:

Ống thử nghiệm
Tinh bột 1% (mL)
Nước cất
Hút 0.1 mL từ các ống sang eppendorf mới
Dung dịch đệm (mL)
A. Sulfosalicylic
Hút 0,1 mL từ các ống sang eppendorf mới
TT Iode
Đo OD 560 nm
Cơng thức tính tốn:
Hoạt tính chung của enzyme thô: HTCenzyme thô = HTE thô x N x Venzyme thơ
= 1.289 x 100 x 10 = 1289 (U/ml)
Hoạt tính chung của enzyme tinh: HTCenzyme tinh = HTE tinh x N x Venzyme tinh (N là hệ số
pha loãng của enzyme).

= 0.681 x 10 x 20 = 136.2 (U/ml)

Hoạt tính riêng của enzyme thô: HTR = HTC / lượng protein (U/A280nm)
16


= 1289
Hoạt tính riêng của enzyme tinh: HTR = HTC / lượng protein (U/A280nm)
= 136.2
Hiệu suất cố định: HS = HTCenzyme tinh/HTCenzyme thô.
Mức tinh chế: HTRenzyme tinh/HTRenzyme thô
HT (U/ml) = (Acontrol-Asample) / (A/mgStarch x 15 phút x 0.1 ml)
3. Tạo dòng biểu hiện protein tái tổ hợp trong E. coli.
3.1. Tách Plasmid dùng Spin Column
3.1.1. Vật liệu

Chủng tạo dòng E. coli đã được chèn vector có mang gen mục tiêu
Kit tách plasmid (solution I, solution II, solution III, RNase, Washing buffer).
Máy ly tâm
3.1.2. Thực hiện
Cho 1.5 mL dịch nuôi cấy vào eppendorf -> ly tâm thu tế bào
Thêm 100 μL solution I, trộn đều và ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút.
Thêm 200 μL solution II, trộn bằng cách đảo eppendorf lên xuống 4-6 lần, ủ ở nhiệt
độ phòng 1 phút.
Thêm 300 μL solution III, trộn đều, ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút.
Ly tâm 12,000 rpm/min, trong 5 phút. Thu dịch nổi.
Cho dịch nổi vào spin column. Ly tâm 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua.
Cho 500 μL washing buffer, ly tâm 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua. Lặp lại bước trên
1 lần nữa.
Ly tâm 1 phút để làm khô màng.
Đặt cột vào eppendorf mới. Cho TE buffer vào giữa cột, ủ 2 phút. Ly tâm trong 2
phút để thu plasmid.
17


Bảo quản Plasmid ở - 20°C

Hình 1: Spin Column trước khi ly tâm

Hình 2: Spin Column sau khi ly tâm

3.2. Biến nạp plasmid vào E. coli
3.2.1. Vật liệu
Plasmid biểu hiện có gen mục tiêu.
Tế bào khả nạp E. coli BL21 (DE3).

Hộp thạch LB có sẵn kháng sinh chọn lọc tương ứng.
3.2.2. Thực hiện
Mọi hoạt động đều phải tiến hành trong đá lạnh và DNA được sử dụng cho quá trình
biến nạp phải làm lạnh trước.
Tiến hành biến nạp cho mẫu nước cất là phản ứng chứng âm, và plasmid chứa amyE mục
tiêu vào E. coli BL21 (DE3).
18


Để tube chứa plasmid trong đá. Lấy 50 µl tế bào khả nạp cần thiết.

Hình 1. Tiến hành thao tác trong đá lạnh.
Lấy đủ số tube tế bào khả nạp cần thiết, làm đông trong đá khoảng 5 phút, không làm
đơng trên tay vì sẽ giết chết tế bào.
Chuyển tồn bộ plasmid vào tube chứa tế bào khả nạp tương ứng. Dùng ngón tay khẩy
nhẹ vào đáy ống để trộn, khơng hút lên xuống vì sẽ giết chết tế bào và làm giảm hiệu quả
biến nạp. Chuẩn bị hộp thạch LB chọn lọc: môi trường LB Agar Ampicillin 30 μL / mL.

19


Hình 2. Chuẩn bị mơi trường LB Agar Ampicillin 30 μL / mL.
Gây sốc nhiệt bằng cách đặt các tube trên bể cách thuỷ ở nhiệt độ chính xác 42°C trong
30 giây và sau đó làm lạnh trong đá 10 phút.
Cho thêm 1 mL LB vào mỗi tube, ủ tế bảo ở 37°C trong 1 giờ để làm ổn định tế bào và
gen đề kháng kháng sinh trên plasmid có thời gian biểu hiện.

20

Hình 3. Ủ tế bào ở 37°C trong 1 giờ.
Ly tâm 13,000 vòng/ phút trong 15 giây, thu tế bào.
Đổ bỏ phần môi trường bên trên, chỉ chừa lại khoảng 100μL ở đáy tube.
Nhẹ nhàng phân tán tế bào vào phần mơi trường cịn lại, chuyển tồn bộ sang hộp thạch
chứa mơi trường có kháng sinh Ampicillin.

21


Hình 4. Thạch chứa mơi trường có kháng sinh Ampicillin.
Dùng que gạt vô trùng để trải vi khuẩn trên mặt thạch. Que gạt được tiệt trùng bằng cách
nhúng trong cồn tuyệt đối và chỉ đốt que trước khi sử dụng.

a)

b)

22


Hình 5. Quá trình trải vi khuẩn. a) Tiệt trùng que trải; b) Trải vi khuẩn lên mặt thạch.
Ủ các hộp thạch đã cấy qua đêm ở 37ºC, phải lật ngược hộp thạch để tránh sự ngưng
đọng hơi nước trên mặt thạch.

Hình 6. Ủ các hộp thạch đã cấy qua đêm ở 37ºC.
3.2.3. Nhận xét
Sau khi ủ các hộp thạch ở 37ºC trong 24 giờ, thấy đĩa thành xuất hiện các khuẩn lạc, có nghĩa là
các tế bào nhận được plasmid pET28b (+) có mang gen đề kháng kháng sinh Ampicillin.
3.3. Lưu dịng tế bào có mang plasmid tái tổ hợp
3.3.1. Vật liệu

Hộp thạch chứa các tế bào nhận được plasmid pET28b(+) có mang gen đề kháng Ampi
Ống mơi trường chứa 3mL LB lỏng có bổ sung kháng sinh Ampi.
3.3.2. Thực hiện
Sau khi ủ đủ thời gian, các tế bào nào nhận được plasmid pET28b(+) có mang gen đề
kháng Ampi sẽ mọc thành khuẩn lạc.
Chọn 2-5 khuẩn lạc có kích thước lớn để lưu chủng.
23


Dùng que cấy vô trùng hay đều tip vô trùng, chấm vào đỉnh khuẩn lạc.
Cấy que vào ống môi trường chứa 3 mL LB lỏng có bổ sung kháng sinh Ampi (nghiêng
ống để môi trường tràn lên gần miệng ống, nhúng que vào để phân tán vi khuẩn trên vào
môi trường).
Ủ 37oC trong 18 giờ.

Hình 1. Ống chứa mơi trường LB có bổ sung kháng sinh Ampi đã được cấy que và ủ 37oC sau 18
giờ.
Lưu chủng:
Cho vào 2 eppendorf có nắp đậy 250 μL glycerol 80% và 1 mL huyền dịch vi khuẩn đã
nuôi 18 giờ, trộn đều, đậy chặt nắp.
Ghi nhãn và bảo quản ở -80oC hoặc -20oC.
3.3.3. Nhận xét
Sau khi ủ 37oC trong 18 giờ, tiến hành cho và 2 eppendorf và 250 μL glycerol 80% thì tiến hành
ghi nhãn và bảo quản khi cần sử dụng hoặc ni cấy chỉ cần lấy ra kích hoạt trở lại.
3.4. Nuôi cấy và cảm ứng biểu hiện protein mục tiêu
3.4.1. Vật liệu
24


LB Ampi 30 μg/mL

IPTG 100 mM

Chủng E. coli BL21(DE3) có gen mục tiêu
3.4.2. Thực hiện
Lấy một khuẩn lạc E. coli cấy vào 2 mL LB + Ampi 30μg/mL, ủ qua đêm 37oC trên máy
lắc.
Cấy pha lỗng 1:100 vào bình tam giác chứa 20mL LB + Ampi 30 μg/mL. Lắc 37oC 200
rpm đến khi đạt OD600 khoảng 0,5-0,6.
Chia môi trường đang nuôi cấy E. coli thành 2 chai, mỗi chai 10 mL: một chai thêm
IPTG 100mM để có nồng độ cuối cùng là 1 mM IPTG, chai thứ 2 dùng làm chứng khơng
cảm ứng.

Hình 2. Thao tác chia mơi trường ni cấy.

25