Báo cáo hóa sinh xác định khảo sát hoạt tính

Bài 1: Định tính Amino acid bằng phản ứng Ninhydrin
1. Lý thuyết:
Tất cả các α-amino acid đều tạo được phwucs màu với thuốc thử Ninhydrin theo cơ
thế sau: Khi đun nóng, các acid tác dụng với Ninhydrin để tạo thành cacbonic,
ammoniac, aldehyde tương ứng có mạch carbon ngắn hơn amino acid một Carbon
và Ninhydrin bị khử. Sau đó Ninhydrin bị khử kết hợp với NH3 mới vừa được tạo
thành tiếp tục phản ứng với một phân tử Ninhydrin thứ hai tạo thành một hợp chất
màu xanh tím có độ hấp thu quang học ở bước sóng 57nm. Các α-amino acid đều
tạo phức màu xanh tím với Ninhydrin, trong khi các amino acid khác cũng tạo
thành màu xanh tím với Ninhydrin nhưng không tạo ra CO2. Các Prolin và
Oxyprolin khi tác dụng với Ninhydrin lại tạo ra phức màu vàng và không tạo ra
NH3.
Các protein, peptide, muối ammonium và ammoniac cũng tạo thành màu xanh tím
với thuốc thử ninhydrin, do đó muốn xác định riêng amino acid thì cần phải loại bỏ
các hợp chất này ra khỏi dung dịch.
2. Chuẩn bị:
1.1. Dụng cụ:
 Ống nghiệm
 Đèn cồn
 Pipettete 1ml
1.2. Hóa chất
 Dung dịch Glycine 0.02 %
 Dung dịch Protein trứng
 Thuốc thử Ninhydrin 0.1%
1.3 Tiến hành:
Lấy hai ống nghiệm đánh số thứ tự 1 và 2:
Ống
Glycine 0,02% (ml)
Protein trứng (ml) Ninhydrin 0,1% (giọt)
1
1

5
2
1
5
Đun nóng cả hai ống nghiệm trong 1 phút bằng đèn cồn hoặc đun cách thủy ở nhiệt
độ 700C trong 5 phút.
2. Kết quả:
Cả hai ống nghiệm đều có màu xanh tím


3. Giải thích:
 Có màu xanh tím là do Ninhydrin đã phản ứng với Glycine và albumin có
trong protein trứng. Ninhydrin là chất dùng để nhận biết α-amino acid nhờ
tạo phức màu xanh tím với ninhydrin .


Bài 2: Xác định amino acid bằng phương pháp sắc khí bản mỏng
1. Lý thuyết:
Tùy thuộc vào cấu tạo hóa học mà các amino acid có khả năng hịa tan trong
các dung môi khác nhau, cũng như chịu lực tác động trọng trường khác nhau.
Dựa theo tính chất này chúng ta có thể tách được hỗn hợp amino acid tùy
theo hệ số phân bố của chúng giữa hai pha lỏng và pha rắn của hệ thống sắc
ký.
Dung môi hữu cơ (pha động) dưới tác động của lực mao quản khi chạy qua
giá mang là cellulose hoặc silica gel (pha tĩnh) có chứa hỗn hợp amino acid
có thể hịa tan các amino acid phụ thuộc vào tính hịa tan của mỗi loại amino
acid đối với mỗi loại dung môi hữu cơ đó. Như vậy, khi dung mơi hữu cơ di
chuyển liên tục qua chất mang (có cấu trúc rỗng tạo nên lực mao quản) làm
cho các amino acid di chuyển từ vạch xuất phát cho đến điểm kết thúc với
các vận tốc khác nhau. Cùng một thời gian di chuyển trên giá mang trong

dung môi hữu cơ, những acid amino khác nhau sẽ có chiều dài khoảng cách
khác nhau.
2. Chuẩn bị:
1.1. Dụng cụ:
 Sắc khí giấy
 Bồn sắc khí
 Micropipettete
 Bình phun ninhydrin
 Máy sấy tóc
1.2. Hóa chất
 Dung mơi TLC
 Dung dịch Ninhydrin
 Mẫu acid amino chuẩn
 Mẫu acid amino thí nghiệm
2. Tiến hành:
Dung bút chì vẽ một đường thẳng làm vạch xuất phát cách mép của bản sắc
ký trên giá mang 1,5cm và một vạch đích đến cách mép 10cm. Tiếp tục vẽ 4
đầu chấm tròn lên vạch xuất phát đánh dấu vị trí tướng ứng của 3 mẫu amino
acid.


Dùng micropipette chấm dung dịch amino acid lên giấy sắc ký ngay vị trí đã
được đánh dấu trên vạch phát. Dùng máy sấy tóc sấy ngay giọt dung dịch
acid amino vừa chấm, khơng cho dung dịch loang ra khỏi vịng trịn. Chấm
khoảng 7 lần cho mỗi mẫu.
Cho dung mơi chạy sắc ký vào bồn sao cho ngập qua mép bản sắc ký khoảng
1cm. đậy bản sắc ký vào bồn, đậy nắp kín lại và để yên trong 20 phút.
Lấy bản sắc ký ra, đặt vào tủ hotte 15 phút để đuổi hết dung môi. Phun đều
Ninhydrin lên bản sắc ký. Dùng máy sấy tóc sấy khơ và quan sát các vệt màu
xuất hiện trên giaaysy sắc ký.

Xác định các acid amino có trong mẫu bằng cách so sánh vị trí các vệt màu
trên sắc ký đồ của mẫu với sắc ký đồ của dung dịch amino acid chuẩn.
3. Kết quả:

Công thức tính quãng đường mà acid amino đã di chuyển:


Trong đó:
l là khoảng cách từ tuyến xuất phát đến tâm vệt sắc k
í
lo là khoảng cách từ tuyến xuất phát tới tuyến dung môi
Quãng đường các amino acid đã di chuyển:
Lycine:
Rf = 0,73 (cm)
Thyrocine:
Rf = 0,79 (cm)
Amino acid chuẩn:
Rf = 0,69 (cm)
 Khi di chuyển dựa theo lực mao quản, Lycine và Thyrocine đều di
chuyển nhanh hơn amino acid chuẩn, nên có thể đốn rằng Lycine và
Thyrocine có trọng lượng nhẹ hơn amino acid chuẩn


Bài 3: Tìm điểm đẳng điện của protein bằng phương pháp tạo pH khác
nhau


1. Giới thiệu.

- Phương pháp tạo pH khác nhau dựa trên phản ứng kết tủa của protein tại
một pH nào đó của môi trường làm cho các acid amio và protein trong dung
dịch ở dạng ion lưỡng cực. Điểm đặc trưng của điểm đẳng điệm là khiến cho
protein bị kết tủa do đó tìm điểm đẳng điệm của protein giúp ta biết được
điều kiện kết tủa của protein và ngược lại tránh gây kết tủa.
2. Vật liệu và phương pháp tiến hành.
2.1 Vật liệu:
-Dung dịch protein trứng 5% ở bài thí nghiệm này sử dụng protein là
Alumine trứng trên lý thuyết điểm đẳng điện của protein này là 4,6.
-Dung dịch Sodium phosphate dibasic 0.2M ( Na2HPO4 0.2M ) và dung dịch
Acid citric 0,1 M (C6H8O7 0.1M) là hỗn hợp đệm cho cho một khoảng đệm
dài từ pH 3 đến 8. Ở thí nghiệm này ta dùng hỗn hợp đệm này để tạo ra các
dung dịch có pH lần lượt là 3.7, 4.7, 5.7 .
-Cồn 960 là dung môi hữu cơ giúp protein dễ dàng kết tủa khi ở điểm đẳng
điện.
2.2 Phương pháp tiến hành:
-Lấy 3 ống nghiệm đánh số thứ từ 1-3
STT
Dung dịch NA2HPO4 0.2M (mL)
Dung dịch C6H8O7 0.1M (mL)
pH đạt được
1
0.34


0.66
3.7
2
0.48
0.52

4.7
3
0.66
0.34
5.7
-Lắc đều các ống để dung dịch đệm có được độ pH tương ứng.
-Thêm vào mỗi ống 1 mL dung dịch protein trứng 5%, lắc nhẹ.
-Thêm vào mỗi ống 1 mL cồn 960, lắc nhẹ, để yên 5 phút.
3. Kết quả và giải thích.


3.1 Kết quả quan sát:
-Ống nghiệm 1: xuất hiện lớp kết tủa phía trên, lớp kết tủa mỏn
-Ống nghiệm 2: xuất hiện kết tủa nằm ở giữa ống nghiệm, lớp kết tủa dày.
-Ống nghiệm 3: không thấy xuất hiện kết tủa.
3.2 Giải thích kết quả và kết luận:
-Ở ống nghiệm 3 ta khơng thấy xuất hiện kết tủa do đó có thể kết luận ở pH
5.7 khơng phải là điểm đẳng điện của Albumine trứng.
-Ở ống nghiệm 1 lớp kết tủa mỏng cho thấy pH trong dung dịch là 3.7 khiến
cho protein kết tủa nhưng không nhiều chứng tỏ đây vẫn chưa là điểm đẳng
điện của Albumine trứng.
-Ở ống nghiệm 2 lớp kết tủa dày cho thấy ở pH 4.7 khiến cho Albumin trứng
có tổng điện tích bằng 0 nên chúng không dễ dàng di chuyển trong điện
trường và kết tủa lại với nhau tạo thành tủa protein. Từ đó cho thấy ở pH 4.7
là điểm đẳng điện của Albumine trứng.


Bài 4: Xác định hàm lượng protein thô
1. Lý thuyết:
Protein được hình thành từ nhiều nguyên tố như Carbon, Hydrogen, Nitrogen,

Oxygen… trong đó nitrogen chiếm tỷ lệ tương đối cao và khá ổn định (chiếm
khoảng 15-17% khối lượng phân tử protein). Hàm lượng Protein thô trong nguyên
liệu được định lượng gián tiếp bằng cách xác định hàm lượng Nitrogen toàn phần
có trong mẫu. Từ lượng nitrogen tồn phần có được nhân với hệ số trong bảng quy
đổi theo FAO/WHO-1973, chúng ta có được lượng protein tương ứng. thực tế
trong nguyên liệu, bên cạnh Protein cịn có những chất hữu cơ khác có chứa
Nitrogen như Amid, Alkaloid, Ammoniac (thí dụ như những thực phẩm lên men)…
Do đó hàm lượng nitrogen tồn phần chính thức thường cao hơn lượng Nitrogen có
trong Protein.
Tùy theo nguồn gốc protein mà người ta sử dụng các hệ số trung bình protein để
tính khối lượng protein. Hệ số protein động vật trung bình là 6,25 và ở thực vật là
5,96. Theo tiêu chuẩn FAO/WHO-1973, ta có bảng hệ số trong tính tốn như sau:
Chất xác định
Hệ số protein (F)
Ngũ cốc – lúa mì
5,7
Gạo
5,95
Sữa và các sản phẩm chế biến
6,38
Thực phẩm khác
6,25
Nguyên tắc: Phương pháp Kjeldahl là phương pháp định lượng nitrogen toàn phần
đơn giản và tương đối chính xác dựa trên ngun tắc là khi vơ cơ hóa nguyên liệu
bằng H2SO4 đậm đặc và chất xúc tác. Lấy sản phẩm đem kiềm hóa bằng NaOH
hoặc KOH để thu được muối amoni tương ứng. Dùng hệ thống chưng cất đạm
Kjeldahl để thu khí NH3. Định lượng NH3 bằng acid H2SO4, từ đó suy ra được
lượng nitrogen tồn phần có trong mẫu.
2. Thực hành:
a) Dụng cụ:

Hệ thống Microkjeldahl:

1 cái

Bình định mức 100ml:

1 cái

Giá đỡ burette 25ml:

1 cái

Burette 25ml:

1 cái


Pippette 10ml:

1 cái

Erlen 250ml:

3 cái

Cốc 250 ml:

3 cái

Cốc 100ml:

1 cái

Đũa thủy tinh:

1 cái

b) Hóa chất
- H2SO4 đđ (98,72% có d=1,84)
- Chất xúc tác, có thể dùng 1 trong các hỗn hợp xúc tác sau đây:
1) K2SO4: 50g

CuSO4: 3,5g

2) K2SO4: 100g

CuSO4: 10g

3) K2SO4: 100g

CuSO4: 10g

4) Seleni bột: 1g HgO: 10g (giải phóng hơi Hg độc)
- Dung dịch Sodium hydroxide NaOH 0,01N
- Dung dịch Sodium hydroxide NaOH 30%
- Chỉ thị màu: có thể dùng Alizarin natri sunfonat, phenolphatalein hoặc chỉ
màu Tashiro.
Cách pha chỉ thị mày Tashiro: Dung dịch A: metyl đỏ 0,001g + cồn 96o vừa
đủ 100ml, hòa tan ở nồi cách thủy sôi. Dung dịch B: dung dịch Metylen
xanh 1% trong nước 4ml + cồn 960 vừa đủ 100ml. Tỷ lệ pha trộn khi sử dụng

là 1:1 với dung dịch a và B. hỗn hợp này chỉ thị mày này có màu xanh lục ở
pH = 5,5, chuyển thành màu tím ở pH>5,5. Chuyển màu ở gian đoạn màu
xám bẩn pH = 5,5. Trong trường hợp chuyển màu không rõ ràng có thể thay
đổi tỷ lệ pha chế giữa hai dung dịch sao cho khi chuyển màu khơng rõ ràng
có thể thay đổi tỉ lệ pha chế giữa hai dung dịch sao cho khi chuyển màu thì
màu xanh lục giảm từ từ, thêm một giọt dung dịch chuẩn NaOH 0,1N làm
màu chuyển sang xám bẩn đột ngột và thêm 1 giọt nữa màu chuyển sang
tím.


- Dung dịch acid boric bão hịa có pH=5,5: hịa tan 40g acid boric vào trong 1
lít nước nóng, sau khi để nguội, cho thêm nước vừa đủ 1 lít. Điều chỉnh pH:
5,5 bằng NaOH 0,1N (khoảng 13ml) với hỗn hợp chỉ thị màu Tashiro cho
đến màu xanh bẩn.
- Dung dịch chuẩn H2SO4 0,1N
c) Phương pháp tiến hành:
*Vơ cơ hóa mẫu:
- Cân thật chính xác khoảng 1g thực phaamrtrong bài thí nghiệm sử dụng
2ml nước mắm) cho vào bình Kjeldahl với H2SO4 đậm đặc và khoảng 5g
chất xúc tác.
- Để nghiêng bình Kjeldahl trên bếp có lưới Amiăng và đun từ từ trên bếp
điện.
- Nếu thực phẩm chứa nhiều nước, đun cho đến khi nước bốc hơi và hình
thành khói trắng SO2. Khi tan bọt, đun sôi cho đến khi dung dịch trong suốt
khơng màu hoặc có màu xanh lơ của CuSO4, để nguội.
d) Chưng cất:
Chuẩn bị bình hứng : hút 25ml H2SO4 0,1N cho vào erlen 100ml. Lắp eerlen vào
dưới ống sinh hàn sao cho đầu ống sinh hàn ngập vào trong dung dịch. Chuyển
dung dịch đã vô cơ hóa vào bình định mức, rửa bình Kjeldahl hai lần với nước
cất, nước rửa chuyển vào bình định mức, định mức đến 100ml, hút 10ml

Sunfonat làm chỉ thị màu (hoặc với chỉ thị màu Tashiro). Sau đó cho thêm 10-15
ml NaOH 30%.
Cất kéo hơi nước và định lượng trực tiếp NH3 bay sang hịa tan trong bình hứng
bằng dung dịch H2SO4 0,1N.
3. Kết quả và biện luận:
Hàm lượng nitrogen toàn phần (g/100ml):

Trong đó: N: số ml H2SO4 0,1N cho vào erlen trước để kết hợp với NH3
n: Số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ H2SO4 thừa.


P: thể tích mẫu thứ tính bằng ml
K: Vđm/Vm với Vđm: thể tích bình định mức.
Vm: thể tích dung dịch cho vào bộ Kendal
Hàm lượng nitrogen tồn phần có trong mẫu là 48,36g/100ml, vậy lượng nitrogen
tồn phần có trong 1ml mẫu là 0,4836g/ml. Hàm lượng protein thơ có trong mẫu
là: 0,4836 x 6,25 = 3,0225 (g/ml)


Bài 5: Ảnh hưởng của pH môi trường đến hoạt lực enzyme α-amylase
1.Lý thuyết
Mỗi enzyme hoạt động tốt nhất ở một pH môi trường xác định (pHop), ở các pH
thấp hoặc cao hơn pHop của enzyme sẽ làm giảm hoạt lưc của các enzyme đó.
Trong điều kiện khơng có chất ức chế và chất kích hoạt, pHop của α-amylase đại
mạch là 5.8. trong bài này chúng ta khảo sát khả năng hoạt động của α-amylase ở
các pH khác nhau.
2.Thực hành
2.1 Dụng cụ và hóa chất
2.1.1 Dụng cụ
Ống nghiệm =25mm: 7 cái

Pipettete 10ml: 2 cái
Pipettete 5ml: 1cái
Pipettete 1ml: 1 cái
Ống nhỏ giọt: 1 cái
Mặt kính đồng hồ: 1 cái
2.1.2 Hóa chất:
Dịch chiết α-amylase đại mạch (malt).
Dung dịch sodium photphate dibasic 0,2M (Na2 HPO4.12H2O hoặc Na2
HPO4.2H2O 0.2M).
Dung dịch acid citric 0,1M (C6H7O8.H2O 0,1M).
Dung dich tinh bottj 0,2% trong dung dịch muối NaCl 0,1%.
Thuốc thử Liugol.
Phương pháp tiến hành:
Lấy 7 ống nghiệm đánh số từ 1 tới 7. Tiến hành thêm hóa chất theo bảng sau:
Ống nghiệm

Na2HPO4
0,2M (ml)

C6H8O7 0,1M
(ml)

pH đạt được

Tinh bột
0,2% (ml)

Dịch chiết
enzyme (ml)

1
9,34
10,66
4,6
5
1
2
10,30
9,70
5,0
5
1
3
11,14
8.86
5,4
5
1
4
12,08
7,92
5,8
5
1
5
13,22
6,78
6,2
5

1
6
14,54
5.46
6,6
5
1
7
16,46
3,54
7,0
5
1
Nhỏ 7 giọt liugol lên mặt kính đồng hị, cứ 5 phút nhỏ dung dịch trong cả 7 ống
lên giọt thuốc thử liu gol. Dùng đũy thủy tinh khuấy đều và quan sát màu của
chúng. Khi một trong các dung dịch của các ống âm tính với liugol (tức là khơng
cịn hiện màu xanh) thì khi đó nhỏ 3 giọt liugol vào tất cả 7 ống nghiệm.
1. Kết quả và biện luận:

Ống
nghiệm

Màu với
liugol

Kết quả

1

Xanh tím

Enzyme khơng
hoạt động

2

Xanh mực

3

Xanh nhạt

4

Màu vàng

5

Xanh nhạt

Giải thích

pH khơng thích hợp làm enzyme bị bất
hoạt, tinh bột cịn nên phản ứng màu với
liugol
Enzyme gần
pH khơng thích hợp nhưng enzyme vẫn
như khơng hoạt
có thể hoạt động nhưng vơ cùng yếu
động

Enzyme hoạt
pH chưa thích hợp, enzyme có thể hoạt
động mạnh hơn
động nhưng không ở mức tối đa
ống nghiệm 2
Enzyme hoạt
pH thích hợp của enzyme, enzyme hoạt
động mạnh
động ở mức tối đa, tinh bột bị phân giải
hoàn toàn khiến khơng có phản ứng màu
với liugol
Enzyme hoạt
Giống ống nghiệm 3
động yếu hơn


ông nghiệm 4
6
Xanh mực
Enzyme gần
Giống ống nghiệm 2
như không hoạt
động
7
Xanh tím
Enzyme khơng
Giống ống nghiệm 1
hoạt động
Như vậy, pH có ảnh hưởng tới hoạt lực của enzyme, độ pH = 5,8 là mức pH mà
enzyme α-amylase hoạt động tốt nhất, càng về xa điểm pH này, hoạt lực của

enzyme yếu dần, cuối cùng là hồn tồn khơng hoạt động.


Bài 6
KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ENZYME PROTEASE
1. Lý thuyết
Cho protease tác dụng với casein hoặc hemoglobin, sao đó ức chế enzyme bằng
Tricloacetic Acid (TCA) để dừng phản ứng, xác định sản phẩm được tạo thành
bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin.
Biểu diễn hoạt tính bằng đơn vị hoạt độ là lượng enzyme trong 1 phút ở 30ºC phân
giải được một lượng protein tương ứng với 1 mol tyrosin.
2. Thực hành
2.1. Dụng cụ- hóa chất
2.1.1. Dụng cụ
- Ống nghiệm:
15 cái
- Phểu lọc:
3 cái
- Bồn ổn nhiệt
- Máy so màu
2.1.2. Hóa chất
- Thuốc thử Folin (pha loãng 3 lần)
- TCA 5%
- Casein 1% trong dung dịch đệm phosphate 1/15M pH 8.0
- Dung dịch Tyrosin chuẩn 1 mol (0.09g tyrosin trong 500mL dd HCl 0.2N).
2.1.3. Nguyên liệu
Chọn quả thơm xanh tươi, gọt bỏ lớp ngoài, cắt nhỏ và xay nát. Lọc qua vải
màn và vắt nước. Nước thơm đem ly tâm ở 6000 vịng/phút trong 10 phút. Lấy
dịch trong bên trên có chứa enzyme Bromeline.
2.2. Thực hành

2.2.1. Dựng đường chuẩn Tyrosin
Thực hiện theo bảng sau:
Ống nghiệm
1
2
3
4
5
Dung dịch Tyrosin chuẩn(mL)
0.2
0.4
0.6
0.8
1
Dung dịch HCl 0,2N (mL)
4.8
4.6
4.4
4.2 4.0
Dung dịch NaOH 0,5N (mL)
10
10
10
10
10
Thuốc thử Folin pha loãng (mL)
3
3
3
3

3
Lắc mạnh, sau 10 phút đo OD ở bước sóng 660nm hoặc 720nm
Dung dịch hóa chất

6
0
5.0
10
3


2.2.2. Xác định lượng Tyrosin trong dung dịch nghiên cứu

Ống nghiệm

Hóa chất

Ống thử (1)
5

Dung dịch Casein 1%
(mL)
Dung dịch TCA 5% (mL)
0
Dung dịch enzyme mẫu
1
(mL)
Lắc đều và giữ ở 35.5ºC trong 10 phút
Dung dịch TCA 5% (mL)
10

Để yên 30 phút, lọc lấy dịch bên dưới

Ống thử (2)
5
10
1
0

Lấy 2 ống nghiệm mới, sạch đánh dấu A, B. Cho vào ống A 5mL dịch lọc từ ống
nghiệm 1 và cho vào ống B 5mL dịch lọc từ ống nghiệm 2.
Thêm vào mỗi ống 10mL NaOH 0,5N và 3mL thuốc thử Folin, lắc mạnh, sau 10
phút, đo OD ở bước sóng 660nm hoặc 720nm.
Tính ΔOD= ODT – OD0. Dựa vào đồ thị chuẩn suy ra được µM Tyrosin.
2.2.3. Kết quả
ΔOD= 0.538- 0.284= 0.254
Đồ thị đường chuẩn biểu diễn lượng Tyrosin (mL) ở bước sóng 660nm trong các ống nghiệm
0.18

f(x) = 0.19x
0.16 R² = 0.98
0.14
0.12
0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2


y= 0.1874x → x= = = 1.355 (mL)
Vậy hoạt tính enzyme Bromeline là:
Hoạt độ P = = = 2.168×10-3 (UI)
Với:
V: thể tích hỗn hợp 5 mL Casein 1% + 10 mL TCA 5% + 1mL enzyme
v: thể tích dịch lọc đem đi phân tích (mL)
t: thời gian thủy phân (phút)
m: khối lượng mẫu enzyme đem xác định hoạt tính (g)
3. Giải thích:
Dung dịch Casein trong thí nghiệm đóng vai trị như một chất nền. Protease tác
dụng với casein để tạo ra tyrosin và các amino acid khác. Càng nhiều tyrosin được
tạo ra thì chứng tỏ hoạt tính của protease càng mạnh.
Thuốc thử Folin là một thuốc thử hoá học dùng để đo nồng độ của các amino acid,
màu càng đậm thì nồng độ các amino acid càng cao.

Bài 7 : ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ BẰNG PHƯƠNG PHÁP DNS

I/ LÝ THUYẾT
Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử
DNS. Cường độ màu của hỗn hợp phản tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử trong
một phạm vi nhất định
II/ DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ
1. Dụng cụ:
Ống nghiệm có nắp: 7 cái


Becker 250ml: 3 cái
Pipet 10ml: 2 cái
Đũa thủy tinh: 1 cái
Pipet 1ml: 1 cái
Chén cân: 1 cái
Bình định mức 100ml: 2 cái
Cuvet: 2 cái
Bóp cao su: 1 cái
Máy đo màu
2. Hóa chất
Thuốc thử Acid ditrosalisylic (DNS)
Dung dịch Glucose mẫu (500ppm)
III/ TIẾN HÀNH
Cân 4-6 gram táo, giã nhuyễn, tiến hành trích ly bằng 40ml cồn 90o bằng cách
chưng cách thủy khoảng 10 phút trong becher 250ml. Chuyển dịch trích ly sang
40ml cồn 80o, thực hành 3 lần để đảm bảo lượng đường được trích ly hồn tồn.
Làm khơ dịch trích ly trong 1 becher khác và chưng cách thủy đến khi dịch khơ
đến 30ml, cho vào một bình khác rồi thêm vào để đạt được 100ml, lắc đều. Cho
các dung dịch vào các ống nghiệm tương ứng, chưng cách thủy đến khi dung dịch
trong bình chuyển sang màu nâu đỏ
Ống nghiệm

0

1

2

3

4

Chuẩn Glucose 500ppm

0

1

2

3

4

Dịch xác định
Dung dịch DNS

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

M1

M2

2

2

0.5

0.5

7.5

7.5

Đậy nắp ống nghiệm, chưng cất thủy sơi
Nước cất

9.5

8.5

Sau đó đo hấp thu ở bước sóng 530nm

7.5

6.5

5.5


IV/ KẾT QUẢ
Đường chuẩn nồng độ đường khử (mg/ml) ở bước sóng 530nm
0.6
f(x) = 0.19x
R² = 0.97

0.5

OD 530 nm

0.4
0.3
0.2
0.1
0

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

Glucose 500ppm (ml)

y= 0,1942x  Cx = = = 4,56ml
Hàm lượng đường trong nguyên liệu Cx x n = 4,56 x 50 = 228
+ n: hệ số pha loãng
+ Cx (ml): chuẩn Glucose 500ppm của dịch xác định
V/ BIỆN LUẬN:
Do thao tác trong lúc thực hành khơng được chính xác hoặc sự sai xót khi đo nên
sai số lớn dẫn đến kết quả bị chênh lệch. Lượng đường Glucose càng nhiều thì màu
của dịch càng đậm.

3.5


Bài 8: Xác định Lipide tổng


1. Giới thiệu.
-Xác định lipide tổng có trong các nguyên liệu giàu lipide để xác định được hàm
lượng lipide có trong mỗi loại nguyên liệu để ứng dụng vào tạo nên các chế phẩm
sinh học cũng như cấu thành nên những lời khuyên về dinh dưỡng.
-Ở thí nghiệm này sử dụng thiết bị Soxhlet để xác định lipide. Dựa vào tính tan

hồn tồn của chất béo vào dung mơi hữu cơ. Dùng dung mơi hữu cơ trích ly chất
béo có trong sản phẩm thực phẩm. Sau đó làm bay hơi hết dung mơi, chất béo cịn
lại đem cân, tính ra hàm lượng chất béo có trong sản phẩm thực phẩm.
2. Vật liệu và phương pháp tiến hành.
2.1 Vật liệu:
-Nguyên liệu là đậu phộng chứa hàm lượng lớn lipide, chủ yếu là các acid khơn
bão hịa đơn và các acid khơng bão hòa đa. Thường được sử dụng làm dầu đậu
phộng.
-Cồn 960 dung mơi hữu cơ để hịa tan lipide.
-Thiết bị Soxhlet dung để trích dẫn lipide ra khỏi nguyên liệu.
2.2 Phương pháp tiến hành:
-Chuẩn bị mẫu: Cân chính xác khoảng 5g nguyên liệu đã nghiền nhỏ. Ở thí nghiệm
khối lượng mẫu như bảng sau:

Đậu
Đậu và giấy lọc

Mẫu 1
5,045
5,73

Mẫu 2
5,091
6,142


-Làm khô nguyên liệu bằng cách sấy nguyên liệu trong tủ sấy ở nhiệt độ 700C đến
khối lượng không đổi, để nguội trong bình hút ẩm. Ghi nhận khối lượng ngun
liệu đã sấy khơ hồn tồn.
- Cho gói mẫu vào ống trụ.

-Bật bếp cách thủy ở nhiệt độ 45-500C.
-Mở nước của hệ thống ống sinh hàn.
-Ether sôi, chuyển thành dạng hơi, theo siphon được dẫn lên bình chiết, bay vào
ống dẫn sinh hàn, gặp lạnh, ngưng tụ lại và rơi vào bình chiết, hịa tan lipide trong
ngun liệu trong bình chiết.
- Khi mức ether có chứa lipide trong bình chiết dâng lên, ngập siphon dẫn dung
mơi xuống bình đun, ether sẽ chảy xuống bình đun. Tại đây ether được đun sôi,
chuyển thành dạng hơi, theo siphon dẫn dung môi lên bình chiết, bay vào ống sinh
hàn, ngưng tụ lại và rơi vào bình chiết. Quá trình được lặp đi lặp lại.
3. Kết quả và nhận xét
3.1. Xác định lipide đồng thời trong nhiều mẫu nguyên liệu:
- Tháo bình chiết, gấp mẫu ra bằng đũa thủy tinh, đặt lên becher, để trong tủ hút
cho bay hơi hết ether. Để trong tủ sấy, sấy ở nhiệt độ 1050 C trong 1 giờ, để nguội
trong bình hút ẩm, cân bao giấy có chứa mẫu được kết quả như sau:

Đậu đã được sấy

Mẫu 1
5,76

Tính kết quả:
Hàm lượng lipide có trong nguyên liệu:

Mẫu 2
5,846