ĐỊNH LƯỢNG TỔNG số VI KHUẨN HIẾU KHÍ

II.

ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ
TRONG SỮA ĐẬU NÀNH

1. DỤNG CỤ, THIẾT BỊ:
1.1. DỤNG CỤ:
- Đĩa petri vô trùng
- Ống đong
- Erlen
- Ống nghiệm
- Pipet và đầu tip vơ trùng
- Que cấy mẫu
- Bình hoặc lọ có nắp vặn
1.2. THIẾT BỊ:
- Tủ sấy để khử trùng khô
- Nồi hấp áp lực để khử trùng ướt
- Tủ ấm có thể duy trì nhiệt độ từ 37 °C đến 55 °C
- Tủ cấy vi sinh
- Máy đo pH, có độ chính xác đến ± 0,1 đơn vị pH ở 25 °C.
- Thiết bị đếm khuẩn lạc
- Máy khuấy cơ
- Thiết bị cấy xoắn

2. HĨA CHẤT
2.1.
CÁC DUNG DỊCH PHA LỖNG MẪU
a) Dịch muối peptone
THÀNH PHẦN

G/ML

Pepton từ casein

1,0g

Natriclorua

8,5 g

Nước

1000ml

Hòa tan các thành phần trong nước, đun nóng nếu cần.
Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng, pH là 7 ± 0,2 ở 25oC, nếu cần.
b) Dung dịch đệm peptone


THÀNH PHẦN

G/ML

Pepton từ các mô động vật

10g

Natri clorua

5g

Dinatri hydro phosphat ngậm 12 phân tử nước
(Na2HPO4.12H2O)

9g

Kali dihydro phosphat (KH2PO4)

1,5g

Nước

1000ml

Hòa tan các thành phần trong nước, đun nóng nếu cần.
Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng, pH là 7 ± 0,2 ở 25oC, nếu cần.
2.2.

MƠI TRƯỜNG THẠCH PCA
a) Thành phần mơi trường:
THÀNH PHẦN

G/ML

Sản phẩm thủy phân casein bằng enzym

5.0g

Chất chiết nấm men

2,5g

Glucose khan (C6H12O6)

1,0g

Thạch agar
Nước

9g đến 18g
1000 ml

b) Cách pha môi trường:
- Hịa tan các thành phần trên hoặc mơi trường hồn chỉnh khơ vào nước,
đun nóng nếu cần. Trộn kỹ và để yên trong vài phút.
- Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 7,0 ± 0,2 ở 25 °C, sử dụng máy đo
pH (6.5), nếu cần.
- Phân phối mơi trường vào các bình hoặc chai (6.9) có dung tích thích hợp.
Khử trùng trong nồi hấp áp lực (6.1) ở 121 °C trong 15 min.
- Nếu sử dụng ngay thì làm nguội mơi trường trong nồi cách thủy duy trì
nhiệt độ từ 47 °C đến 50 °C trước khi sử dụng. Nếu không, để môi trường


đơng đặc lại trong bình hoặc chai. Trước khi sử dụng, làm tan chảy hồn
tồn mơi trường trong nồi cách thủy đun sôi, rồi để nguội trong nồi cách
thủy duy trì nhiệt độ từ 47 °C đến 50 °C.
c) Chuẩn bị đĩa thạch:
- Rót từ 15 ml đến 20 ml môi trường vào dãy các đĩa Petri vô trùng và để
cho đơng đặc
- Các đĩa này có thể bảo quản ở nhiệt độ (5 ± 3) °C đến 4 tuần.

3. QUY TRÌNH THỰC HIỆN:
3.1. PHA LỖNG MẪU:
a. Phần mẫu thử và huyền phù ban đầu (dung dịch pha loãng ban đầu)
-

Cân một lượng m g với sai số cho phép ± 5% hoặc đong một thể tích V ml
với sai số cho phép ± 5% (tối thiểu là 10 g hoặc 10 ml, trừ khi có qui định
khác), của phần mẫu thử đại diện (xem điều 8) cho vào một chén đựng vô
trùng hoặc túi bằng chất dẻo vô trùng.

-

Cho một lượng dịch pha loãng 9 x m g hoặc 9 x V ml. Lượng thêm này có thể
được cân hoặc đong với sai số cho phép là ± 5%.

b. Các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo
- Dùng pipet vô trùng lấy 1 ml huyền phù ban đầu với sai số cho phép ± 5%
cho vào một ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha lỗng vơ trùng ở nhiệt độ
thích hợp.
Chú thích:
 Nếu cần một thể tích lớn hơn, thì có thể thêm một thể tích xác định (lớn hơn
1 ml) huyền phù ban đầu với sai số đo ± 5%, vào ống nghiệm chứa một thể
tích dịch pha lỗng vơ trùng lớn gấp chính lần.
 Để có độ chính xác tối ưu, khơng nhúng pipet vào huyền phù ban đầu sâu
hơn 1 cm.
 Không để pipet chứa chất cấy tiếp xúc với dịch pha lỗng vơ trùng.
 Trộn kỹ, tốt nhất là dùng máy khuấy cơ (6.3) để trộn trong 5 giây đến 10 giây
để thu được dung dịch pha loãng 10-2.
- Nếu cần, lặp lại các thao tác này sử dụng dung dịch pha loãng 10-2 và các
dung dịch pha lỗng tiếp theo, thì dùng một pipet vơ trùng mới ở mỗi độ pha

lỗng để thu được các dung dịch pha loãng 10-3, 10-4.v.v.. cho đến khi thu
được số lượng vi sinh vật thích hợp
c. Thời gian tiến hành pha lỗng mẫu:
- Thời gian tính từ lúc chuẩn bị xong huyền phù ban đầu cho đến khi chất cấy
tiếp xúc với môi trường không vượt quá 45 phút và thời gian kể từ khi


chuẩn bị huyền phù ban đầu đến khi bắt đầu chuẩn bị các dung dịch pha
loãng thập phân tiếp theo không được vượt quá 30 phút
3.2.









3.3.

CẤY VÀ Ủ:
Bước 1: Dùng pipet vô trùng chuyển 0,1 ml mẫu thử nếu sản phẩm dạng
lỏng hoặc huyền phù ban đầu (độ pha loãng 10-1) vào tâm của hai đĩa thạch.
Nếu chuẩn bị các đĩa từ nhiều hơn một độ pha lỗng thì có thể giảm xuống
thành một đĩa
Bước 2: Lấy một đĩa thạch khác. Dùng một pipet vô trùng khác phân phối
0,1 ml dịch pha loãng 10-1 (sản phẩm dạng lỏng) hoặc 0,1 ml dịch pha loãng
10-2 (các sản phẩm dạng khác).
Bước 3: Nếu cần, lặp lại quy trình với các dịch pha lỗng thập phân tiếp

theo, dùng pipet mới vơ trùng với mỗi độ pha loãng thập phân.
Bước 4: Cẩn thận dàn đều chất cấy càng nhanh càng tốt lên khắp bề mặt đĩa
thạch, không để bộ dàn mẫu chạm vào thành đĩa. Nếu có thể, sử dụng cùng
một bộ dàn mẫu cho tất cả các độ pha loãng từ một mẫu có độ pha lỗng cao
nhất,
Bước 5: Để các đĩa đậy nắp khoảng 15 min ở nhiệt độ môi trường để chất
cấy hấp thụ vào thạch.
Bước 6: Lật úp các đĩa đã chuẩn bị rồi đặt vào tủ ấm ở 30 °C trong (72 ±3)h.

ĐẾM KHUẨN LẠC:
- Sau giai đoạn ủ, giữ lại các đĩa có ít hơn 300 khuẩn lạc, nếu có thể. Đếm
các khuẩn lạc trên các đĩa, sử dụng thiết bị đếm khuẩn lạc, nếu cần. Phải
đếm đúng khuẩn lạc, tránh đếm nhầm các hạt thực phẩm với các khuẩn lạc
chính.
- Các khuẩn lạc mọc lan được coi là các khuẩn lạc đơn lẻ. Nếu dự kiến có các
khuẩn lạc mọc lan thì kiểm tra các đĩa sau 24 h hoặc 48 h và đánh dấu các
khuẩn lạc nhìn thấy
 Nếu các khuẩn lạc mọc lan ít hơn một phần tư đĩa, thì đếm các
khuẩn lạc trên phần đĩa cịn lại và tính số tương ứng cho cả đĩa.
 Nếu khuẩn lạc mọc lan nhiều hơn một phần tư đĩa thì loại khơng
đếm đĩa đó.
 Nếu tất cả các đĩa đều có các khuẩn lạc mọc lan thì đếm các đĩa
thích hợp nhất và ghi vào báo cáo kết quả rằng kết quả có thể
bị ảnh hưởng bởi các khuẩn lạc mọc lan.