Nghiên cứu cố định tế bào nấm men (Saccharomyces cerevisiae) bằng Ca-alginate ứng dụng lên men ethanol từ dịch nước mía

NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH TẾ BÀO NẤM MEN
(SACCHAROMYCES CEREVISIAE) BẰNG CA-ALGINATE
ỨNG DỤNG LÊN MEN ETHANOL TỪ DỊCH NƯỚC MÍA
Nguyễn Bằng Phi1
1. Viện Phát Triển Ứng Dụng
TĨM TẮT
Cơng nghệ cố định tế bào từ lâu đã được nghiên cứu và ứng dụng mạnh mẽ trong các
ngành công nghiệp liên quan đến thực phẩm và nhiên liệu sinh học. Trong nghiên cứu này, các
tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae được cố định theo phương pháp nhốt trong các hạt
gel Ca-alginate, sau đó được tiến hành lên men tạo ethanol với dịch nước mía tiệt trùng nhằm
đánh giá hiệu quả của các tế bào cố định này đến quá trình lên men. Kết quả nghiên cứu cho
thấy các tế bào nấm men cố định đạt hiệu quả lên men rượu ở dịch nước mía cao hơn gấp 2,6
lần về sản lượng cũng như 1,4 lần về nồng độ ethanol so với lên men rượu từ các tế bào nấm
men tự do. Kết quả này cho thấy hoạt lực cao của tế bào cố định bằng Ca-alginate trong lên
men rượu từ dịch nước mía, và vẫn cịn hoạt tính sau 4 lần lên men.
Từ khóa: Ca-Alginate, dịch nước mía, ethanol, lên men, tế bào cố định.
1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Rượu và các đồ uống có chứa ethanol từ lâu đã là một loại đồ uống được u thích trên
tồn thế giới. Nhiều loại hình sản xuất lên men rượu truyền thống và công nghiệp vẫn ln được
duy trì, phát triển và mở rộng cho đến hiện tại. Cùng với đó là việc ứng dụng khoa học - công
nghệ để cải tiến và nâng cao hiệu quả q trình lên men vẫn ln là một chủ đề nghiên cứu hấp
dẫn kể cả hàn lâm và ứng dụng. Bên cạnh việc cải thiện các chủng nấm men Saccharomyces
cerevisiae bằng chủng Spathaspora passalidarum, Scheffersomyces stipites (Nakanishi và nnk.,
2017) hoặc thay đổi cơ chất thì việc cố định tế bào cũng là một kỹ thuật cho thấy hiệu quả cao
trong việc lên men ethanol. Cố định tế bào được định nghĩa là việc bao bọc, lưu trữ hay gắn các
tế bào nấm men lên một chất mang thông qua nhiều phương pháp như nhốt trong gel, hấp phụ,
liên kết ion hay liên kết nguyên tử mà không ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học của tế bào
(Bayrock và Michael Ingledew, 2001; Hương và nnk., 2012). Việc cố định này giúp làm tăng
mật độ tế bào nấm men trong một diện tích hạt xác định, hạn chế ảnh hưởng của các tác nhân
gây độc và sự di chuyển tự do của tế bào trong quá trình lên men, qua đó nâng cao hiệu quả của
quá trình lên men đồng thời lượng tế bào cố định có thể được tái sử dụng cho các lần sau với

hoạt tính ổn định. Hiện nay, phương pháp cố định được áp dụng phổ biến và rộng rãi nhất là
bọc các tế bào cố định trong gel Ca-alginate và k-carrageenan vốn là các polyme tự nhiên,
không gây độc cho tế bào và dễ tạo gel (Mater và nnk., 1995). Mía là loại thực vật có khả năng
chuyển hóa bức xạ mặt trời thành sinh khối cao với tổng hàm lượng đường lên men chiếm
khoảng 12-17% với 90% là saccarose và 10% là glucose và fructose (Zabed và nnk., 2014).
Đây cũng là loại cơ chất chính cho sản xuất ethanol ở Brazil (Ghosh và nnk., 2003).
205


Tại Việt Nam, diện tích mía cả nước là 298.200 ha với năng suất mía bình quân đạt 63,9
tấn/ha (Phong và nnk., 2019). Dịch nước mía là một loại cơ chất có khả năng lên men rượu với
hàm lượng đường khử cao trong điều kiện tối ưu có thể sinh ra lượng ethanol đạt 10,58%. Do
đó, việc ứng dụng các tế bào nấm men cố định trong việc lên men ethanol với nguồn dịch ép
mía hứa hẹn là một kỹ thuật giúp nâng cao năng suất tạo ethanol và tạo thêm giá trị gia tăng
cho nơng sản mía của Việt Nam.
2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện với dòng tế bào nấm men Saccharomyces cerevisae (Công ty
AB Mauri Việt Nam) và dịch ép mía được mua ở các tiệm ép nước mía trên địa bàn Thành phố
Thủ Dầu Một, Tỉnh Bình Dương.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp cố định tế bào nấm men
Tế bào nấm men được cố định theo phương pháp của Yu và nnk., 2007 như sau: 0,5g
Nấm men được nhân giống trên mơi trường có chứa 60 g/l glucose, 3 g/l (NH4)2SO4, 0,5 g/l
Mg2SO4.7H2O, 0,6 g/l K2HPO4, và 5 g/l cao nấm men ở nhiệt độ phòng. Sau đó, tiến hành ly
tâm thu sinh khối nấm men và rửa nhanh trong dung dịch nước muối sinh lý 0,85% trong 10
giây. Sinh khối tế bào sau đó được khuấy đều trong hỡn hợp gel Na-Alginate 2% đến khi sinh
khối tan hồn tồn và đi qua dung dịch CaCl2 2% trong vịng 30 phút. Các hạt gel chứa tế bào
cố định được thu hồi và bảo quản lạnh trong dung dịch CaCl2 0,5%.
2.2.2. Phương pháp lên men

100ml dịch ép mía sau khi được xử lí tách cặn và khử trùng được cho vào các bình lên men
500ml. Bổ sung lần lượt vào các bình lên men lượng nấm men theo các nghiệm thức: 0,5g nấm
men; 0,5g nấm men + 5g hạt tế bào cố định; 10g hạt tế bào cố định. Quá trình lên men được
diễn ra ở nhiệt độ từ 28-30 0C trong 2 ngày. Tiến hành chưng cất để xác định và đánh giá hiệu
quả lên men thông qua sản lượng và nồng độ ethanol thu được.
2.2.3. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu thu thập được xử lý thống kê bằng phần mềm Graphpad Prism phiên bản 8.636
(Graphpad software, Inc., San Diego, CA)
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Kết quả phân tích sau lên men cho thấy có sự khác biệt trong hiệu suất lên men rượu từ
dịch nước mía giữa nấm men tự do và nấm men cố định trong gel Ca-alginate.
Sản lượng rượu thu được sau khi chưng cất dịch lên men từ nấm men tự do chỉ đạt 4,33
ml trong khi đối với tế bào cố định là 11,37 ml, hiệu quả lên men tăng gấp 2,6 lần so với lên
men bằng nấm men tự do. Sự khác biệt này còn thể hiện khi kết hợp giữa nấm men tự do và tế
bào cố định làm cho hiệu quả cố định tăng gấp 2,9 lần so với dùng tế bào riêng lẻ (Hình 1, Bảng
1). Tuy nhiên khơng có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê nào giữa nấm men cố định với
sự kết hợp cả hai loại nấm men cố định và tự do mặc dù sự kết hợp này làm cho hiệu quả lên
men tăng thêm 11 % so với tế bào cố định.
206


✱✱✱✱

Sản lượng rượu

20

Nấm men

✱✱✱

ns

Tế bào c ố định và n ấm men

15

Tế bào c ố định
10
5

h
in
d
co

ao

T
e

b
ao

co

d

in

T
e

h

b

và

N
am

n
am

m

m

en

en

0

Hình 1. Kết quả phân tích khác biệt sản lượng rượu sau lên men.
(ns: khơng ý nghĩa; ***: p<0,001; ****: p<0,0001)
Bảng 1. Kết quả phân tích thống kê khác biệt cố định tế bào trong lên men rượu.
Kiểm tra Fisher's LSD
Trung bình khác biệt Khoảng tin cậy khác biệt Mức độ khác biệt

Sản Lượng Rượu
Nấm men vs. Gel/Nấm men
-8.263
-11.38 đến -5.145
****
Nấm men vs. Gel
-7.030
-10.15 đến -3.911
***
Gel/Nấm men vs. Gel
1.233
-1.885 đến 4.352
ns
Nồng độ rượu
Nấm men vs. Gel/Nấm men
-5.000
-8.119 đến -1.881
**
Nấm men vs. Gel
-5.333
-8.452 đến -2.215
**
Gel/Nấm men vs. Gel
-0.3333
-3.452 đến 2.785
ns

Giá trị P
<0.0001
0.0004

0.4058
0.0044
0.0029
0.8198

Chú thích: vs: so với
Đối với nồng độ ethanol, kết quả cũng cho thấy các tế bào cố định cho hiệu quả lên men cao
hơn nấm men tự do. Nồng độ ethanol thu được trong rượu từ nấm men cố định là 19 % thể tích trong
khi ở nấm men tự do chỉ đạt 13,6 %, thấp hơn 1,4 lần. Khi kết hợp giữa nấm men cố định với nấm
men tự do thì nồng độ rượu giảm xuống còn 18,67 % tuy vậy vẫn gấp 1,37 lần so với nấm men tự
do song khơng có sự khác biệt có ý nghĩa nào được ghi nhận giữa nấm men cố định và sự kết hợp
giữa nấm men cố định và nấm men tự do đến hiệu quả lên men rượu từ dịch nước mía (Hình 2).
✱✱

Nồng độ rượu

25

✱✱

ns

Nấm men
Tế bào cố đ ịnh và nấm men

20

Tế bào cố đ ịnh

15

10
5

h
in
d
co

ao
b
T
e

T
e

b
ao

co

d

in

h

và

N

am

n
am

m

m

en

en

0

Hình 2. Kết quả phân tích khác biệt nồng độ rượu sau lên men (ns: không ý nghĩa; **: p<0,01).
207


Hoạt lực của tế bào cố định qua 4 lần lên men cho thấy trong giai đoạn đầu sau khi cố định,
khả năng lên men của các tế bào nấm men bên trong hạt gel vẫn chưa ổn định, các tế bào vẫn chưa
tăng sinh mạnh bên trong các hạt gel. Do đó hiệu quả lên men tăng dần trong hai lần lên men đầu
với đỉnh là giai đoạn thứ hai tăng 45% về cả sản lượng và nồng độ và bắt đầu giảm dần ở hai lần
tiếp theo song vẫn cao hơn 18.4% về nồng độ và 38,01% về sản lượng so với lần đầu tiên (Hình
3). Kết quả phân tích thống kê cho thấy có sự khác biệt về mặt ý nghĩa thống kê ở lần đầu lên men
so với các lần tiếp theo (p < 0.05), tuy nhiên mặc dù hiệu quả lên men ở các giai đoạn sau bị giảm
đi nhưng không có sự khác biệt thống kê nào giữa các lần lên men sau (Bảng 2).

Hình 3. Biểu đồ thể hiện hoạt lực của tế bào cố định qua 4 lần lên men.
Bảng 2. Kết quả phân tích thống kê hoạt lực của tế bào cố định.

Chi tiết thống kê
Sản lượng rượu
Lần 1 vs. Lần 2
Lần 1 vs. Lần 3
Lần 1 vs. Lần 4
Lần 2 vs. Lần 3
Lần 2 vs. Lần 4
Lần 3 vs. Lần 4
Nồng độ rượu
Lần 1 vs. Lần 2
Lần 1 vs. Lần 3
Lần 1 vs. Lần 4
Lần 2 vs. Lần 3
Lần 2 vs. Lần 4
Lần 3 vs. Lần 4

Trung
bình 1

Trung
bình 2

Khác biệt
trung bình

Sai số khác
biệt

Mô tả

P Value

11.37
11.37
11.37
16
16
16.02

16
16.02
15.07
16.02
15.07
15.07

-4.633
-4.65
-3.7
-0.01667
0.9333
0.95

1.248
1.248
1.248
1.248
1.248
1.248

**
**
*
ns
ns
ns

0.0092
0.0089
0.0409
>0.9999
0.8762
0.8705

19
19
19
27.67
27.67
25.33

27.67
25.33
22.5
25.33
22.5
22.5

-8.667
-6.333

-3.5
2.333
5.167
2.833

1.248
1.248
1.248
1.248
1.248
1.248

****
***
ns
ns
**
ns

<0.0001
0.0006
0.0557
0.2791
0.0038
0.1468

Chú thích: vs: so với
Các kết quả trên cũng tương đồng với các nghiên cứu ứng dụng tế bào cố định trong lên
men rượu đã được công bố trước đây như nghiên cứu lên men với nguồn dịch ép mía và các
chủng nấm men chịu nhiệt tự do (Phong và nnk., 2019) thu được lượng ethanol khá thấp với

10,58% thể tích; và ứng dụng các tế bào cố định vào quá trình lên men cũng mang lại hiệu quả
cao hơn so với lên men bằng nấm men tự do truyền thống đối với lên men cồn từ rỉ đường
208


(Hương và nnk., 2012). Kết quả của nghiên cứu này cho thấy ứng dụng tế bào nấm men cố định
bằng gel Ca-alginate đối với lên men từ dịch nước mía so với tế bào nấm men tự do, cũng như
hoạt lực của tế bào cố định sau các lần lên men tiếp theo là phù hợp để trở thành một kỹ thuật
bổ trợ cho việc mở rộng quy mô lên men các sản phẩm từ mía và các loại nơng sản khác.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Bayrock, D. P., & Michael Ingledew, W. (2001). Application of multistage continuous fermentation
for production of fuel alcohol by very-high-gravity fermentation technology. Journal of Industrial
Microbiology and Biotechnology, 27(2), 87–93.
2. Ghosh, P., & Ghose, T. K. (2003). Bioethanol in India: recent past and emerging future. Advances
in biochemical engineering/biotechnology, 85, 1–27.
3. Hương, N. T., Ánh, Đ. H., Vân, N. T., Việt, G. T., Bách, N. X., & Bích, T. N. (2012). Nghiên cứu
cố định tế bào nấm men ứng dụng trong lên men cồn từ rỉ đường. Vietnam Journal of Science and
Technology, 50(5), 621.
4. Mater, D. D. G., Jean-Noël, B., José Edmundo, N. S., Nicole, T., & Daniel, T. (1995). Effect of
gelation temperature and gel-dissolving solution on cell viability and recovery of two Pseudomonas
putida strains co-immobilized within calcium alginate or κ-carrageenan gel beads. Biotechnology
Techniques, 9(10), 747–752.
5. Nakanishi, S. C., Soares, L. B., Biazi, L. E., Nascimento, V. M., Costa, A. C., Rocha, G., & Ienczak,
J. L. (2017). Fermentation strategy for second generation ethanol production from sugarcane
bagasse hydrolyzate by Spathaspora passalidarum and Scheffersomyces stipitis. Biotechnology and
bioengineering, 114(10), 2211–2221.
6. Phong, H. X., Quý, H. P., Thạnh, N. N., Long, B. H. Đ., & Dung, N. T. P. (2019). Lên men ethanol
từ dịch ép mía sử dụng nấm men chịu nhiệt. Tạp Chí Khoa Học và Cơng Nghệ Đại Học Thái Nguyên,
202(09), 185–192.
7. Yu, J., Zhang, X., & Tan, T. (2007). An novel immobilization method of Saccharomyces cerevisiae

to sorghum bagasse for ethanol production. Journal of Biotechnology, 129(3), 415–420.
8. Zabed, H., Faruq, G., Sahu, J. N., Azirun, M. S., Hashim, R., & Boyce, A. N. (2014). Bioethanol
production from fermentable sugar juice. TheScientificWorldJournal, 2014, 957102.

209