Tuyển chọn một số chủng vi khuẩn có khả năng ức chế tác nhân gây bệnh xơ đen trên mít.pdf

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
VIỆN CƠNG NGHỆ SINH HỌC & THỰC PHẨM

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC
KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI
NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

Tên đề tài: TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ
NĂNG ỨC CHẾ TÁC NHÂN GÂY BỆNH XƠ ĐEN TRÊN MÍT
Mã số đề tài: 21.2 SHTPSV 08
Chủ nhiệm đề tài: Hồng Đình Huy
Đơn vị thực hiện: Viện Công nghệ Sinh học và Thực Phẩm

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022


LỜI CẢM ƠN
Đề tài “Tuyển chọn một số chủng vi khuẩn có khả năng ức chế tác nhân gây bệnh xơ đen
trên mít” là nội dung chúng em chọn để thực hiện đề tài nghiên cứu cấp trường của mình.
Để thực hiện tốt đề tài nghiên cứu này, chúng em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban
giám hiệu, phịng Quản lí Khoa học và Hợp tác Quốc tế trường Đại học Công nghiệp
TP.HCM đã tạo một môi trường học tập và nghiên cứu thân thiện cũng như những hỗ trợ
về mặt kinh phí để cho chúng em phát huy khả năng nghiên cứu khoa học của mình.
Chúng em xin gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm
đã luôn hỗ trợ, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi về cơ sở trang thiết bị cho chúng em trong
quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu.
Chúng em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Ngọc Ẩn. Cảm ơn Thầy vì đã chỉ
bảo, hướng dẫn em tận tình, cung cấp cho chúng em những kiến thức sâu rộng trong suốt
quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu này.
Chúng em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS. Phạm Tấn Việt, TS. Nguyễn Thị Diệu

Hạnh đã luôn cho em những lời khun, lời góp ý hữu ích, giúp cho chúng em tích lũy
thêm nhiều kiến thức, có cái nhìn sâu sắc hơn về các vấn đề trong nghiên cứu cũng như
trong cuộc sống, giúp chúng em hoàn thành tốt nghiên cứu của mình.
Chúng em xin gửi lời cảm ơn ba mẹ vì đã ln u thương, quan tâm chăm sóc và tạo
động lực tiếp bước cho con trên đường học vấn.
Chúng em xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị, bạn bè trong tập thể Lab vi sinh đã ủng hộ,
giúp đỡ chúng em trong suốt khoảng thời gian thực hiện đề tài nghiên cứu này.
Mặc dù đã cố gắng hoàn thành nghiên cứu trong phạm vi cho phép nhưng khả năng và
kinh nghiệm của bản thân có hạn, nên bài nghiên cứu chắc chắn sẽ không tránh khỏi
những tồn tại, hạn chế và thiếu sót. Chúng em rất mong nhận được sự thơng cảm, góp ý
và tận tình chỉ bảo của quý thầy cô và các bạn.

i


PHẦN I. THƠNG TIN CHUNG
Thơng tin tổng qt

I.
1.1.

Tên đề tài: Tuyển chọn một số chủng vi khuẩn có khả năng ức chế tác nhân
gây bệnh xơ đen trên mít

1.2.

Mã số: 21.2 SHTPSV 08

1.3.

Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực hiện đề tài

STT

1

2

3
4

Họ và tên
(học hàm, học vị)

Đơn vị công tác
Viện Công nghệ
Sinh học và Thực phẩm

TS. Nguyễn Ngọc Ẩn

Vai trị thực hiện
đề tài

Cố vấn khoa học

Hồng Đình Huy

ĐHSH14B, Viện Công nghệ
Sinh học và Thực phẩm
Chủ nhiệm đề tài

Nguyễn Thị Yến Vân

ĐHSH14A, Viện Công nghệ
Thành viên tham
Sinh học và Thực phẩm
gia

ĐHSH14B, Viện Công nghệ
Nguyễn Thị Mỹ Nguyệt
Sinh học và Thực phẩm

1.4.

Đơn vị chủ trì: Viện Cơng nghệ Sinh học & Thực phẩm

1.5.

Thời gian thực hiện: 12 tháng

Thành viên tham
gia

1.5.1. Theo hợp đồng: từ tháng 03 năm 2022 đến tháng 03 năm 2023
1.5.2. Gia hạn (nếu có): Khơng có
1.5.3. Thực hiện thực tế: từ tháng 03 năm 2022 đến tháng 12 năm 2022
1.6.

Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu (nếu có): Khơng có
ii

1.7.
II.

Tổng kinh phí được phê duyệt của đề tài: 10 triệu đồng (Mười triệu đồng).
Kết quả nghiên cứu

1. Đặt vấn đề
Mít (Artocarpus heterophyllus) là lồi thực vật ăn quả nhiệt đới thuộc họ Dâu tằm
(Moraceae) xuất xứ của loài cây này hiện được cho là có nguồn gốc từ Ấn Độ [1].
Là một lồi cây ăn quả có giá trị dinh dưỡng và kinh tế cao trên toàn thế giới nói
chung và Việt Nam nói riêng. Nhìn chung, nhu cầu tiêu thụ và xuất khẩu mít ở Việt
Nam khá cao. Việt Nam là một trong những nước có diện tích trồng mít khơng
ngừng mở rộng. Theo số liệu báo cáo của tổng cục thống kê tháng 10 năm 2019 của
Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn cho thấy đến nay, Tiền Giang là địa phương
có diện tích cây mít lớn nhất khu vực Đồng bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) với tổng
diện tích hơn 6.000 ha. Ngồi Tiền Giang, một số địa phương tại Đồng Tháp cũng
đang lên tiếp trồng mít trên đất ruộng hoặc chuyển đổi loại hoa màu, cây ăn trái khác
để trồng mít.
Bệnh xơ đen trên mít là một loại bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng về kinh tế ảnh
hưởng đến giá trị và chất lượng của quả, một khi quả bị ảnh hưởng có thể ngăn cản
quá trình tiêu thụ và chế biến [2]. Hiện nay, những quả mít bị xơ đen khơng mang lại
giá trị kinh tế được một số nhà vườn sử dụng làm thức ăn cho vật nuôi (cá, gia
súc,..). Tuy nhiên, bệnh xơ đen lại khơng có triệu chứng rõ rệt thể hiện qua bên ngồi
quả, gây khó khăn cho việc kiểm soát bệnh [2]. Phương pháp kiểm tra và phân biệt
phổ biến của nhà vườn hiện nay là cắt một góc đầu quả mít để quan sát phần mít bên
trong. Theo các nghiên cứu về bệnh học trên mít, vi khuẩn Pantoea stewartii là tác
nhân chính gây ra bệnh xơ đen ở quả mít [3, 4]. Pantoea stewartii là trực khuẩn
Gram âm, kích thước nhỏ, khơng sinh nội bào tử. Chủng vi khuẩn này cũng đã được

nghiên cứu xác định là tác nhân gây ra bệnh héo vi khuẩn và bệnh bạc lá trên bắp [5].
Hoạt tính kháng khuẩn được cho là một phương thức quan trọng để một loài vi khuẩn
cạnh tranh, ức chế hoặc loại trừ các chủng vi khuẩn khác. Cơ chế kháng khuẩn của vi
khuẩn là rất đa dạng một số chủng vi khuẩn tiết ra các chất kháng khuẩn không đặc
iii


hiệu, chẳng hạn như axit béo chuỗi ngắn hoặc hydrogen peroxide [6, 7]. Một số khác
tạo ra hợp chất với phạm vi tiêu diệt hẹp, chẳng hạn như các loại bacteriocins, các
chất ức chế giống bacteriocin (BLIS) [8, 9]. Ngoài ra cịn có một số chủng vi khuẩn
có thể kết hợp các đặc tính kháng khuẩn trên.
Việc sử dụng các biện pháp kiểm sốt sinh học trong phịng trừ bệnh hại thực vật
đang là xu hướng của thế giới. Hướng đi này nhằm hạn chế tối đa tác hại, ảnh hưởng
xấu đến mơi trường do thuốc hóa học gây ra, từ đó góp phần xây dựng một nền nơng
nghiệp xanh và bền vững.
Thuốc bảo vệ thực vật hóa học được sử dụng để phịng ngừa, việc lạm dụng nó gây
ảnh hưởng tiêu cực đến môi trường. Hậu quả của việc lạm dụng thuốc bảo vệ thực
vật hóa học làm dẫn đến mất cân bằng trong quần thể vi sinh vật, tạo mơi trường bất
lợi đối với các sinh vật có ích, tiêu diệt các loài thiên địch tạo điều kiện để vi khuẩn,
nấm và các loại cơn trùng có hại phát triển.
Hiện nay, đã có nhiều nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của vi
khuẩn. Nhưng những cơng trình nghiên cứu về khả năng đối kháng tác nhân gây
bệnh xơ đen trên mít thì chưa có cơng trình nghiên cứu nào trước đó. Vi khuẩn đối
kháng đang là xu thế của nơng nghiệp, tìm kiếm các chủng vi khuẩn có khả năng ức
chế tác nhân gây bệnh mít xơ đen nhằm cải thiện giá trị thương phẩm cũng như kinh
tế cho người nơng dân.
Chính vì vậy, việc nghiên cứu ‘‘Tuyển chọn một số chủng vi khuẩn có khả năng ức
chế tác nhân gây bệnh xơ đen trên mít” là một đề tài cấp thiết cần được thực hiện.
Đặc biệt kết quả của nghiên cứu này là nền tảng để sản xuất chế phẩm sinh học có
khả năng ức chế sự sinh trưởng và phát triển của tác nhân gây bệnh xơ đen trên trái

mít giảm thiểu rủi ro và thiệt hại kinh tế cho nhà vườn. Đồng thời hưởng ứng theo xu
hướng phát triển một nền nông nghiệp sạch, bền vững hạn chế những tác động xấu
của thuốc bảo vệ thực vật hóa học.
2. Mục tiêu của đề tài
iv


Tuyển chọn được chủng vi khuẩn có khả năng ức chế tác nhân gây bệnh xơ đen trên mít.
Để đạt được mục tiêu này, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu với các nội dung sau:
Nội dung 1: Phân lập tác nhân gây bệnh xơ đen trên trái mít
Nội dung 2: Tái nhiễm tác nhân gây bệnh lên trái mít
Nội dung 3: Định danh chủng tác nhân gây bệnh
Nội dung 4: Tuyển chọn chủng vi khuẩn thuộc bộ sưu tập giống Phịng thí nghiệm Cơng
nghệ vi sinh, Trường Đại học Cơng Nghiệp thành phố Hồ Chí Minh có khả năng đối
kháng với tác nhân gây bệnh xơ đen trên trái
Nội dung 5: Định danh chủng vi khuẩn tuyển chọn được
Nội dung 6: Khảo sát mơi trường thích hợp cho khả năng sinh tổng hợp hợp chất ức chế
tác nhân gây bệnh của chủng vi khuẩn chọn được
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
Vi khuẩn gây bệnh xơ đen trên mít được phân lập từ mẫu mít bệnh tại nhà vườn ở
huyện Châu Thành, tỉnh Tây Ninh, Việt Nam.
Các chủng vi khuẩn có khả năng đối kháng tác nhân gây bệnh được phân lập từ các
mẫu đất thu thập tại vườn mít thuộc khu vực huyện Châu Thành, tỉnh Tây Ninh và
các chủng thuộc bộ sưu tập của phịng Cơng nghệ Vi sinh, Viện Công nghệ Sinh
học và Thực phẩm, Trường Đại học Cơng Nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh.
4. Phương pháp nghiên cứu:
4.1.

Phương pháp thu thập dữ liệu

Thu thập tài liệu và các nghiên cứu ở Việt Nam và Quốc tế.
Thu thập, tổng hợp tài liệu liên quan đến đề tài và khả năng đối kháng của vi khuẩn đối
với vi khuẩn gây bệnh
4.2.

Phương pháp thu thập các mẫu quả mít bị bệnh xơ đen
v


Quả mít bệnh xơ đen được thu thập ngẫu nhiên từ nhà vườn ở huyện Châu Thành, tỉnh
Tây Ninh, thu thập ở 3 địa điểm trong vườn (tổng số 3 quả). Những quả bị nhiễm bệnh sau
khi hái xuống đã bọc trong túi ni lơng riêng và đưa đến phịng thí nghiệm để quan sát và
phân lập mầm bệnh. Quy trình phân lập được tiến hành trong 24 giờ sau khi các mẫu thu
thập được hái xuống khỏi cây.
4.3.

Phương pháp phân lập tác nhân vi khuẩn gây bệnh xơ đen

Quả mít bị xơ đen được thu nhận và quan sát biểu hiện bệnh. Tác nhân gây bệnh xơ đen
được phân lập từ mẫu trộn 3 quả mít nhiễm bệnh, thực hiện thao tác bằng kỹ thuật phân lập
vi sinh cơ bản được hướng dẫn trong tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN 12371-1:2019) về
quy trình giám định vi khuẩn gây bệnh thực vật [27]. Tác nhân gây bệnh được nuôi cấy
trên môi trường Luria Bertani (LB), định danh sơ bộ tác nhân gây bệnh dựa trên đặc điểm
hình thái đại thể, vi thể. Sau khi thu thập các quả mít bệnh tiến hành khử trùng bề mặt
mẫu bệnh bằng dunng dịch Natri hipoclorit 10% trong 2 phút sau đó rửa lại 3 lần bằng
nước. Các mẫu mô thịt bên trong được khử trùng bằng cách nhúng cồn 70°.
Tách chiết vi khuẩn bằng biện pháp nghiền mẫu trong nước muối sinh lý vô trùng. Phân
lập bằng phương pháp cấy trải dịch chiết vi khuẩn từ mẫu đã được huyền phù lên các đĩa
môi trường Luria Bertani Agar. Làm thuần và giữ giống các khuẩn lạc vi khuẩn phân lập
được từ mẫu bệnh và tiến hành nội dung tiếp theo.

Hình thái đại thể được quan sát bằng cách cấy ria chủng vi khuẩn tác nhân gây bệnh lên
môi trường LB agar nuôi ủ ở 37℃ trong 2 ngày. Sau 2 ngày khuẩn lạc vi khuẩn đã phát
triển trên môi trường thạch, quan sát và ghi nhận đặc điểm đại thể dựa trên các yếu tố chủ
yếu: độ lớn, màu sắc, độ khô/ướt và độ nhăn/trơn bề mặt, đặc điểm bờ/rìa/trung tâm của
khuẩn lạc.
4.4.

Phương pháp lấy mẫu và phân lập các chủng vi khuẩn

Phương pháp lấy mẫu được thực hiện theo TCVN 4046:1985 về đất trồng trọt - Do Ủy
ban Khoa học và Kỹ thuật Nhà nước ban hành [28]
Lấy mẫu đất: Các mẫu đất được thu thập tại vườn mít thuộc địa bàn huyện Châu Thành,
tỉnh Tây Ninh. Mẫu đất được cho vào túi nilon đã khử trùng, buộc kín, phía ngồi ghi
vi


ngày và vị trí lấy mẫu sau đó được đưa về phịng thí nghiệm và phân lập khơng q 24
giờ.
Phân lập vi khuẩn: Mẫu đất được pha loãng đến nồng độ thích hợp bằng nước muối sinh
lý vơ trùng. Từ mỗi nồng độ pha loãng, hút 0.1 ml dịch mẫu đã pha lỗng chuyển sang
đĩa petri chứa mơi trường LB. Dùng que trang trải cho đến khi bề mặt thạch khơ, và ủ ở
nhiệt độ phịng trong 48 giờ. Sau đó nhận diện khuẩn lạc riêng lẻ. Từ các khuẩn lạc đã
nhận diện, tiến hành làm thuần chúng bằng cách cấy ria trên môi trường LB. Giống được
bảo quản trong glycerol 50% ở -80°C cho các thí nghiệm tiếp theo [24, 29].
4.5.

Xác định đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn.
❖ Quan sát đặc điểm khuẩn lạc

Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường LB, ủ ở 37°C trong 48 giờ. Sau đó

tiến hành quan sát đặc điểm hình thái đại thể dựa trên các yếu tố: màu sắc khuẩn lạc, độ
khô/ướt và độ nhăn/trơn bề mặt, đặc điểm bờ/rìa/trung tâm của khuẩn lạc [28, 30].
❖ Phương pháp nhuộm Gram
Các chủng vi khuẩn được nuôi ủ trên môi trường LB agar ở 37°C trong 14-16 giờ. Đặc
điểm vi thể được quan sát trên tiêu bản nhuộm Gram:
(1) Chọn khuẩn lạc đặc trưng
(2) Tạo vết bôi bằng cách dùng que cấy lấy một ít vi khuẩn hịa vào giọt nước ở giữa lam
kính sau đó hơng khơ bằng ngọn lửa đèn cồn.
(3) Nhuộm tiêu bản theo thứ tự thuốc nhuộm tím kết tinh trong 60 giây - rửa nước Lugol trong 60 giây- rửa nhanh bằng cồn 96° - rửa nước - safanin trong 60 giây - rửa
nước.
(4) Quan sát và ghi nhận hình ảnh dưới độ phóng đại X1000 với dầu. Sau khi kiểm tra
giống, tiến hành giữ giống cho các thí nghiệm tiếp theo [29].
❖ Phương pháp nhuộm nội bào tử
vii


Chuẩn bị vết bơi trên phiến kính sạch và hơ nóng nhẹ.
Thêm một ít nước vào chậu nhơm và đun sơi.
Đặt giá nhuộm lên chậu nhơm rồi đặt phiến kính lên nó.
Đặt nhẹ mẫu giấy thấm (nhỏ hơn phiến kính một chút) lên trên phiến kính. Mẫu giấy này
sẽ giúp giữ thuốc nhuộm lại trên phiến kính.
Phủ phiến kính với thuốc nhuộm lục malachite và hơ hơi nước trong vòng 5 phút. Mẫu
giấy này sẽ giúp thuốc nhuộm lại trên phiến kính.
Tiếp tục thêm thuốc nhuộm để tránh tình trạng thuốc nhuộm bị khơ trên phiến kính.
Khử màu với nước trong nước 30 giây bằng cách cho nước chảy lên phiến kính. Các tế
bào sinh dưỡng sẽ bị mất màu, còn bào tử sẽ giữ màu lại.
Nhuộm lại với safranin trong 30 giây rồi rửa lại với nước trong 30 giây nữa. Thấm khơ
cẩn thận. Quan sát dưới kính hiển vi với vật kính dầu (x100). Bào tử sẽ có màu xanh cịn
tế bào sinh dưỡng sẽ có màu hồng. Ghi lại kết quả.
❖ Phương pháp giữ giống

Chọn một khuẩn lạc riêng lẻ tăng sinh trong 3 ml môi trường LB, hút 10% giống vào 10
ml môi trường LB lỏng và ni cấy lắc ở 150 vịng/phút đến OD600nm khoảng 0.6 - 0.8.
Sau đó, phân phối vào eppendorf dịch khuẩn và glycerol 50% với tỷ lệ 1:1, tiến hành trữ
đông ở -60 ºC [31].
4.6.

Phương pháp khảo sát đường cong tăng trưởng

Giống được hoạt hóa bằng cách cho một khuẩn lạc vi khuẩn vào 5 ml môi trường LB
lỏng, lắc 150 vòng/phút ở 37 ℃ qua đêm.
Xây dựng đường cong tăng trưởng bằng cách cấy 1 ml giống đã hoạt hóa với mật độ tế
bào tương đương với giá trị OD600nm là 0,6-0,8 vào 100 ml môi trường LB lỏng, lắc 150
vòng/phút. Sau mỗi 2 giờ, dịch huyền phù được lấy ra và xác định giá trị OD ở bước sóng
600 nm. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Phần mềm Graphpad prism 8.0.2 được sử dụng
viii


để xây dựng đường cong tăng trưởng theo mơ hình Gompert
4.7.

Phương pháp kiểm tra khả năng gây bệnh

Tiến hành kiểm tra khả năng gây bệnh theo nguyên tắc Koch [33]. Tiêm dịch nuôi cấy
của chủng vi khuẩn gây bệnh được phân lập lên mẫu mít khỏe mạnh, xác định khả năng
gây bệnh trên quả của tác nhân gây bệnh [34]:
Nuôi tăng sinh chủng vi khuẩn đã làm thuần ở nội dung 2 trong môi trường LB;
Tiêm dịch nuôi cấy vi khuẩn vào quả mít khơng bệnh; (3) Quan sát tình trang vết tiêm và
biểu hiện bệnh; (4) Tái phân lập chủng vi khuẩn có khả năng biểu hiện bệnh xơ đen trên
mẫu mít; (5) Định danh sơ bộ chủng vi khuẩn tái phân lập và chủng vi khuẩn tiêm ban
đầu.

Giống được hoạt hóa bằng cách cho một khuẩn lạc vi khuẩn vào 5 ml mơi trường LB
lỏng, lắc 150 vịng/phút ở nhiệt độ phòng qua đêm, Bổ sung 1 % giống hoạt hóa vào bình
chứa 100 mL mơi trường LB lỏng, ni lắc ở 150 vịng/phút ở nhiệt độ phịng, 16 giờ
(giống tăng sinh). Sử dụng giống tăng sinh cho các thí nghiệm tiếp theo.
4.7.1. Phương pháp gây nhiễm bệnh trên múi mít
Mẫu múi mít tách ra từ quả mít không nhiễm bệnh được khử trùng bằng dung dịch
ethanol 70% trong 10 giây sau đó rửa qua nước cất vơ trùng 3 lần. Múi mít sau khi khử
trùng đặt lên đĩa petri có lót sẳn giấy thấm vơ trùng.
Thử nghiệm khả năng gây bệnh bằng cách tiêm 5 ml dịch giống tăng sinh có mật độ tế
bào 108 CFU/ml (xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc) vào múi mít đã vô trùng.
Mẫu đối chứng tiêm môi trường LB vô trùng [35]. Bao kín miệng đĩa petri ủ ở nhiệt độ
phòng và chờ quan sát biểu hiện. Thử nghiệm lặp lại 5 lần.
4.7.2. Phương pháp gây nhiễm bệnh trên quả mít
Quả mít khỏe mạnh cung cấp từ nhà vườn ở huyện Châu Thành tỉnh Tây Ninh, rửa sạch
phần vỏ quả mít bằng xà phịng, xả lại bằng nước và ngâm trong dung dịch Natri hipoclorit
10% trong 1 phút. Rửa lại bằng nước cất vô trùng và để khô trong tủ hút.
Đánh dấu vị trí tiêm trên quả theo mặt cắt dọc có ba vị trí tiêm, một vị trí tiêm 5 ml môi
ix


trường LB vô trùng làm đối chứng âm, hai vị trí cịn lại mỗi vị trí tiêm 5 ml dịch giống
tăng sinh có mật độ tế bào 108 CFU/ml (xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc), độ
sâu vết tiêm là 3 cm chỉ tiến hành tiêm trên một nửa quả mít, nửa quả cịn lại giữ ngun.
Thử nghiệm lặp lại 4 lần
4.8.

Phương pháp tái phân lập chủng gây bệnh

Phân lập chủng vi khuẩn gây bệnh từ mẫu mít gây bệnh lại thành cơng, quan sát hình thái
đại thể, vi thể và thực hiện các test sinh hóa như phản ứng oxidase, kiểm tra tính di động,

khả năng sản xuất indole, khả năng phân giải esculine, khả năng sản sinh manolase, khả
năng phân giải đường glucose và lactose và thử nghiệm VP. So sánh kết quả định danh sơ
bộ với chủng vi khuẩn tiêm ban đầu.
4.9.

Phương pháp định danh phân tử
❖ Phương pháp tách chiết DNA tổng số của chủng vi khuẩn

Chủng vi khuẩn tuyển chọn được nuôi cấy trên môi trường LB, 37°C, 18-20 giờ. Dịch
nuôi cấy được ly tâm ở 6000 vòng/phút trong 15 phút để thu nhận tế bào, sau đó rửa tế
bào 3 lần với nước muối sinh lí (0,9%). Tiến hành bổ sung 100µL đệm (10mM Tris,
0.1mM EDTA, pH 8.0), vortex và đun sôi ở 100°C trong 15 phút để phá vỡ tế bào. Dịch
nổi chứa DNA tổng số được thu nhận bằng cách ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút
và được bảo quản -20°C.
❖ Phương pháp khếch đại gen 16S-rRNA bằng phản ứng PCR
DNA tổng số sau khi tách chiết (mục 2.2.9.1) được khếch đại vùng gen 16S-rRNA bằng
kỹ thuật phân tử PCR với cặp mồi: 27F: 5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’, 1540R:
5'-GAGGTGATCCAACCGCA-3' ( hãng IDT nước Mỹ)
Thành phần của phản ứng PCR gồm: 3µL DNA tồng số, 1µL mồi xi ,1µL mồi ngược (
nồng độ cuối 2µM), 25 µL Master mix (2X) và bổ sung nước cất đạt đến thể tích cuối
cùng là 50µL. Thực hiện phản ứng PCR (Mastercycler nexus, Đức) với chu trình nhiệt:
94oC/10 phút, tiếp đến (94oC/30 giây, 55oC/45 giây. 72oC/2 phút) lặp lại 30 chu kì, cuối
cùng là 72oC/10 phút, bảo quản sản phẩm PCR ở 4oC.
x


Sản phẩm PCR khoảng 1500 bp được kiểm tra bằng phương pháp điện di gel agarose
1.5%, 110V, 20 phút và quan sát hình ảnh điện di dưới ánh sáng tử ngoại ( thang chuẩn
hãng ABM, 1kb Opti-DNA Marker G106, nước Mỹ )
❖ Giải trình tự và xây dựng cây phả hệ

Sản phẩm PCR được giải trình tự gen tại Cơng ty TNHH Dịch vụ và Thương mại Nam
Khoa Biotek (Quận 7, Thành phố Hồ Chí Minh).
Sau khi có kết quả giải trình tự của chủng vi khuẩn tuyển chọn, tiến hành tìm kiếm các
trình tự tương đồng trên ngân hàng dữ diệu NCBI bằng công cụ BLASTn. Tiếp theo sử
dụng các phần mềm tin sinh học như Seaview, ClustalW và phần mềm MEGA 5.0 để xây
dựng cây phả hệ dựa trên thuật toán Neighbor-Joining và thuật toán Maximum likelihood
với giá trị bootstrap 1.000 lần.
❖ PCR mẫu
Cho vào tube PCR tổng thể tích 50 μl:

Thành phần

Thể tích (μl)

Master mix 2X

25

Mồi 27 F

1

Mồi 1540 R

1

DNA mẫu

3

dH2O

20

Cặp mồi khuếch đại vùng trình tự 16-rRNA:
F: 5’ - AGAGTTTGATCMTGGCTCAG -3’
1540-R: 5’ - AAGGAGGTGATCCAACCGCA- 3’
xi


Chu trình nhiệt PCR:
94 °C trong 10 phút
94 °C trong 30 giây
55 °C trong 45 giây

Lặp lại 30 chu kì

72 °C trong 1 phút 30 giây
72 °C trong 10 phút
4 °C đến khi lấy mẫu ra
4.10. Phương pháp thu nhận dịch vô bào
Chủng vi khuẩn được nuôi tăng sinh trong mơi trường LB với tốc độ lắc 120 vịng/phút ở
37°C, sau mỗi 12 giờ (0-60 giờ) thu nhận dịch nuôi cấy vào các eppendorf 1.5 ml, tiến
hành ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 10 phút. Phần dịch nổi sau ly tâm được lọc qua
màng lọc 0.22 μm trong điều kiện vơ trùng để loại bỏ các tế bào cịn sót lại.
4.11.

Phương pháp khuếch tán giếng thạch

Mục đích: Xác định hoạt tính đối kháng của vi khuẩn đối với tác nhân gây bệnh được

thực hiện bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch.
Chủng vi khuẩn chỉ thị Pantoea sp. HVN được nuôi cấy trong mơi trường LB lỏng ở 120
vịng/phút , 37°C trong 12 giờ sau đó dịch vi khuẩn được pha loãng tương đương với giá
trị OD600nm= 0.08-0.1 để sử dụng làm khuẩn chỉ thị đối kháng.
Vi khuẩn chỉ thị được trải đều trên bề mặt đĩa petri chứa môi trường LB rắn bằng tăm
bông vô trùng. Tiến hành tạo các giếng thạch với đường kính 9 mm trên đĩa thạch. Hút 50
μl dịch ni cấy cho vào các giếng thí nghiệm, giếng cịn lại là đối chứng mơi trường.
Sau đó, các đĩa đã nhỏ dịch được giữ ở 4°C trong 2 giờ để giúp dịch khuếch tán đều vào
thạch. Tiếp tục nuôi ủ các đĩa ở 37°C và đọc kết quả sau 12 giờ.
Khả năng kháng khuẩn của dịch nuôi cấy được xác định bằng sự hiện diện của vòng vơ
khuẩn xung quanh giếng thạch, đường kính vịng kháng khuẩn được tính bằng cơng thức
xii


[1]:
H = D-d
Trong đó:

H: độ lớn vịng kháng khuẩn xung quanh lỗ thạch (mm)
D: độ lớn vòng ức chế (bao gồm đường kính lỗ) (mm)
d: đường kính lỗ thạch (mm)

Đường kính vịng kháng càng lớn thì khả năng ức chế càng mạnh. Thí nghiệm được lặp
lại 3 lần
4.12. Khảo sát mơi trường ni cấy thích hợp cho khả năng sinh tổng hợp chất
kháng khuẩn Pantoea sp. HVN
Chủng vi khuẩn tuyển chọn được cấy ria trên đĩa môi trường LB ở 37℃ trong 24-36 giờ.
Lấy sinh khối tế bào vi khuẩn cho vào 10 ml môi trường LB, nuôi lắc 120 vịng/phút ,
37°C, 16 vịng/phút (giống hoạt hóa). Sau đó hút 1% giống vào 30 ml môi trường LB
nuôi lắc ở 120 vòng/phút , 37°C (giống tăng sinh), cho đến khi đạt được tuổi giống đã

khảo sát
Sau đó, dùng micropipet hút 300 µl (1% giống) giống tăng sinh cho vào các bình chứa 30
ml 6 loại mơi trường khác nhau: LB, TY, TSB, MRS, BHI, MHB. Các bình được ni
lắc ở 120 vòng/phút, 37℃. Tiến hành thu dịch sau mỗi 12 giờ ni cấy và xử lí. Đánh giá
khả năng kháng khuẩn gây bệnh xơ mít đen bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch để
lựa chọn mơi trường thích hợp.
4.13.

Phương pháp xử lí số liệu

Sử dụng phần mềm Excel để tổng hợp tính tốn các số liệu từ kết quả thu nhận được
trong q trình thực hiện thí nghiệm. Sử dụng phương pháp phân tích phương sai
(ANOVA) bằng phần mềm thống kê Statgraphic XV để đánh giá sự khác biệt giữa yếu tố
và điều kiện khảo sát. Đường cong tăng trưởng của chủng vi khuẩn được tính tốn và xây
dựng theo mơ hình Gompert bằng phần mềm GraphPad Prism 8.0.2.
5. Tổng kết về kết quả nghiên cứu
xiii


Đề tài “Tuyển chọn một số chủng vi khuẩn có khả năng ức chế tác nhân gây bệnh xơ đen
trên mít” đã được một số kết quả như sau:
• Phân lập và định danh thành công chủng vi khuẩn tác nhân gây bệnh xơ đen trên
mít
• 17/70 chủng vi khuẩn có khả năng đối kháng với vi khuẩn Pantoea sp. HVN gây
bệnh mít xơ đen
• Chủng vi khuẩn LH8 đã thể hiện đường kính vịng vơ khuẩn lớn nhất so với 17
chủng cịn lại. Điều kiện thích hợp cho chủng vi khuẩn LH8 có khả năng đối
kháng cao là mơi trường TSB, ở mốc thời gian từ 24 cho đến 36 giờ và vẫn giữ
được khả năng đối kháng đến 60 giờ.
6. Đánh giá các kết quả đã đạt được và kết luận:

Nghiên cứu tuyển chọn vi khuẩn có khả năng ức chế vi khuẩn Pantoea sp. HVN tác nhân
gây bệnh mít xơ đen có ý nghĩa là cơ sở để phát triển các chế phẩm sinh học kháng tác
nhân gây bệnh xơ đen trên mít, giúp nâng cao năng suất cây trồng. Các chế phẩm này sẽ
góp phần giảm việc sử dụng hóa chất trong nơng nghiệp, cải thiện môi trường sống.

xiv


7. Tóm tắt kết quả
Tóm tắt: Mít (Artocarpus heterophyllus) là loài cây ăn quả nhiệt đới thuộc họ Dâu tằm
(Moraceae) có giá trị dinh dưỡng và kinh tế cao. Tuy nhiên, sản lượng mít bị thiệt hại
đáng kể bởi bệnh xơ đen do vi khuẩn Pantoea stewartii gây ra trong quá trình trồng trọt.
Nghiên cứu này đã phân lập, định danh và chứng minh chủng vi khuẩn Pantoea sp. HVN
là tác nhân chính gây ra bệnh mít xơ đen. Để kiểm tra khả năng đối kháng của các chủng
vi đối với Pantoea sp. HVN, 13 chủng vi khuẩn được phân lập từ đất và khảo sát sơ bộ
khả năng đối kháng của 70 chủng vi khuẩn cho thấy 17 chủng có khả năng ức chế
Pantoea sp. HVN với các mức độ khác nhau. Trong đó, có 4 chủng D5, D19, TH7, LH8
là khả năng đối kháng mạnh nhất, đặc biệt chủng LH8 đã thể hiện đường kính vịng vơ
khuẩn lên đến 17 mm. Điều kiện thích hợp cho chủng vi khuẩn LH8 có khả năng đối
kháng cao là mơi trường TSB, ở mốc thời gian từ 24 cho đến 36 giờ và vẫn giữ được khả
năng đối kháng đến 60 giờ. Ngoài ra, Các kết quả thu được từ nghiên cứu này sẽ là tiền
đề cho những nghiên cứu tiếp theo nhằm phát triển các chế phẩm sinh học phòng trừ
bệnh hại xơ đen trên mít, góp phần phát triển nền nông nghiệp xanh và bền vững.
Abstract: Jackfruit (Artocarpus heterophyllus) is a tropical fruit belonging to the
Moraceae family which has high nutrition and economic value. However, jackfruit
production is significantly affected by microbial pathogens during cultivation, especially
by those causing bronzing disease. In this study the bacterial strain Pantoea stewartii was
successfully isolated and proved to be responsible for bronzing disease in jackfruits based
on Koch’s postulates. In addition, preliminary results from antagonistic tests have shown
that 17 out of 70 isolated bacterial strains had the ability to inhibit Pantoea stewartii at

various levels. In particular, the 4 strains D5, D19, TH7, LH8 are among the strongest
antagonists, in which the LH8 strain has shown the highest zone of inhibition up to 17
mm. The suitable conditions for LH8 strain are highly inhibited pathogens that is TSB
medium, at a time point of 24 to 36 hours and still retain resistance up to 60 hours. In
conclusion, the obtained results will set the stage for further research in order to develop
bioproducts to fight bronzing disease in jackfruit, contributing to the development of
green and sustainable agriculture.
xv


III.

Sản phẩm đề tài, công bố và kết quả đào tạo
3.1.

Kết quả nghiên cứu
Yêu cầu khoa học hoặc/và chỉ tiêu
kinh tế - kỹ thuật

Tên sản phẩm

TT

Giống
1

tác

nhân vi khuẩn
gây bệnh

Đăng ký
Giống thuần chủng với các

Đã phân lập, làm thuần

hình thái đại thể vi thể được

và định danh được 1 chủng

ghi nhận và đã được giải

vi khuẩn gây bệnh như đã

trình tự 16S-rRNA.

đăng kí.

Giống thuần chủng với các
hình thái đại thể vi thể được
Giống vi khuẩn
2

ghi nhận và đã được giải
trình tự 16S-rRNA.

kháng tác nhân
gây bệnh

Đạt được

Môi trường nuôi cấy và thời
gian ni cấy thích hợp cho
sự sinh tổng hợp chất kháng
khuẩn.

Đã sàng lọc, tuyển chọn
được 17 chủng vi khuẩn
kháng tác nhân gây bệnh
mạnh
Đã khảo sát môi trường và
thời gian nuôi cấy thích
hợp cho khả năng kháng
tác nhân gây bệnh của 1
chủng vi khuẩn.

Ghi chú:
- Các ấn phẩm khoa học (bài báo, báo cáo KH, sách chuyên khảo…) chỉ được chấp
nhận nếu có ghi nhận địa chỉ và cảm ơn trường ĐH Cơng Nghiệp Tp. HCM đã cấp kính
phí thực hiện nghiên cứu theo đúng quy định.
- Các ấn phẩm (bản photo) đính kèm trong phần phụ lục minh chứng ở cuối báo
cáo. (đối với ấn phẩm là sách, giáo trình cần có bản photo trang bìa, trang chính và trang
cuối kèm thông tin quyết định và số hiệu xuất bản)

xvi


3.2. Kết quả đào tạo
TT Họ và tên

Tên đề tài
Thời gian
Tên chuyên đề nếu là NCS
thực hiện đề tài
Tên luận văn nếu là Cao học

Đã bảo vệ

Nghiên cứu sinh
Học viên cao học
Sinh viên Đại học
Hồng Đình Huy
Nguyễn Thị Yến Vân
Nguyễn Thị Mỹ Nguyệt

12 Tháng

Tuyển chọn một số chủng vi
khuẩn có khả năng ức chế tác
nhân gây bệnh xơ đen trên mít

Ghi chú:
- Kèm bản photo trang bìa chun đề nghiên cứu sinh/ luận văn/ khóa luận và bằng/giấy
chứng nhận nghiên cứu sinh/thạc sỹ nếu học viên đã bảo vệ thành công luận án/ luận
văn;( thể hiện tại phần cuối trong báo cáo khoa học)

xvii


IV.

Tình hình sử dụng kinh phí

TT

Nội dung chi

A

Chi phí trực tiếp

1

Th khốn chun mơn

Kinh phí

Kinh phí

được duyệt

thực hiện

(triệu đồng)

(triệu đồng)

7.017.900

7.017.900

982.100

982.100

0

0

Ngun liệu
+ Tinh bột
+ Khoai tây
+ Agar
+ KNO3
+ MgSO4.7H2O
2

+ FeSO4.7H2O
+ NaCl
+ TCA (Triclo acetic acid)
+ Cồn
+ Yeast extract
+ Meat extract
+ Peptone
+ Glucose
Thiết bị, dụng cụ
+ Ống nghiệm
+ Đĩa Petri
+ Bơng gịn khơng thấm / thấm

3

+ Curvet nhựa
+ Đầu típ xanh 1ml
+ Đầu típ vàng 0,1ml
+ Chai thủy tinh
+ Syringe lọc nylon 0.2μm
xviii

Ghi
chú


+ bơm tiêm 5ml vơ trùng
4

Cơng tác phí

5

Dịch vụ th ngoài

6

1.000.000

1.000.000

1.000.000

1.000.000

10.000.000

10.000.000

Hội nghị, hội thảo,thù lao nghiệm thu
giữa kỳ

7

In ấn, Văn phịng phẩm

8

Chi phí khác

B

Chi phí gián tiếp

1

Quản lý phí

2

Chi phí điện, nước
Tổng số

V. Kiến nghị
Nghiên cứu này được thực hiện ở quy mơ phịng thí nghiệm nên cịn tồn tại nhiều giời
hạn về điều kiện thực nghiệm cũng như bị hạn chế về mặt thời gian. Do vậy, để mở rộng
hướng nghiên cứu nhằm khai thác tối đa tiềm năng của đề tài, em xin được đưa ra một số
kiến nghị như sau:
• Cần được giải trình tự các vùng gen khác ngoài 16S-rRNA để xác định rõ hơn đến
cấp lồi của chủng Pantoea sp. HVN.
• Nên khảo sát thêm các ngưỡng giới hạn môi trường phù hợp cho chủng
Pantoea sp. HVN sinh trưởng và phát triển.
• Mở rộng phạm vi nghiên cứu, thu thập các mẫu mít bệnh từ nhiều vùng miền trên
cả nước để phân lập thêm nhiều chủng gây bệnh và tiến hành đánh giá mức độ gây
bệnh.
• Nghiên cứu thêm về cơ chế xâm nhiễm và gây bệnh trên trái mít
• Nghiêm cứu các phương pháp phát hiện sớm mít xơ đen.
xix


• Nghiên cứu thêm vê các phương pháp phòng ngừa bệnh
VI. Phụ lục sản phẩm
Phụ lục 1: Hình ảnh đại thể, vi thể của chủng vi khuẩn HVN

a. Đặc điểm khuẩn lạc sau 48 giờ nuôi cấy trong môi trường LB agar nhiệt độ 37

°C
b. Kết quả nhuộm Gram ở độ phóng đại 1000X

Phụ lục 2: Hình thái chủng vi khuẩn phân lập lại từ mẫu gây nhiễm

a. Đặc điểm khuẩn lạc sau 48h nuôi trên LB agar ở 37 °C, b. Kết quả nhuộm

Gram ở độ phóng đại 1000X

xx


Phụ lục 3: Hình ảnh định danh phân tử chủng vi khuẩn HVN

Phụ lục 4: Hình ảnh đại thể và vi thể của chủng LH8

a, b.
c.

Đặc điểm đại thể sau 48 giờ nuôi cấy trên môi trường LB ở 37°C
Kết quả nhuộm Gram ở độ phóng đại 1000X

Phụ lục 5: Hình ảnh kháng Pantoea sp. HVN của dịch ni cấy chứa tế bào theo thời
gian và sáu loại môi trường nuôi cấy

xxi


Mốc 0 giờ:

xxii


Mốc 12 giờ

xxiii

Mốc 24 giờ:

xxiv