GIẢI TRÌNH TỰ DNA pot

GIẢI TRÌNH TỰ DNA
DNA SEQUENCING
TS. BS. Đỗ Thị Thanh Thủy
1. GIẢI TRÌNH TỰ DNA
Giải trình tự DNA là một thí nghiệm cho kết
quả thứ tự sắp xếp các nucleotide trong
đoạn DNA đó.
Vd:
5’CGGCTAGCAGTCTCGCGGGGGCACGCCCAAATCTC
CAGGCATTGAGCGGGTTTGATCCAAGAAAGGACCCGG
TCGTCCTGGCAATTCCGGTGTACTCACCGGTTCCGCA
GACCACTATGGCTCTCCCGGGAGGGGGGATCCTGGA
GGCTGCACGACACTCATACTAACGCCATGGCTAGACG
CTTAATAGAACAANAAA3’
2. HAI PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ DNA

Phương pháp hoá học giải trình tự DNA
của Maxam & Guilbert (1977)
Nobel hóa học 1980 (phương pháp giải trình tự)
Walter Gilbert

Phương pháp enzyme giải trình tự của
Frederick Sanger (1977)
Nobel hoá học 1958 (cấu trúc protein: Insulin)
Nobel hóa học 1980 (phương pháp giải trình tự)
2.1. GIẢI TRÌNH TỰ DNA BẰNG PP HÓA HỌC
1. Đánh dấu một đầu của đoạn DNA bằng gốc phospho
đồng vị phóng xạ (
32
P).
2. Xử lý các đoạn DNA đã đánh dấu

32
P bằng hóa chất làm
biến đổi đặc hiệu một hoặc hai loại base của nucleotide
trên đoạn DNA
3. Điện di mẫu DNA đã xử lý trong 4 ống nghiệm này trên 4
hàng của một gel polyacrylamide biến tính
Autoradiography
Dựa trên nguyên tắc dùng enzyme polymerase để tạo
sợi bổ sung từ mồi cho sợi khuôn, nhưng do trong
ống phản ứng có thêm các ddNTP, nên mỗi khi men
polymerase kéo nhầm ddNTP vào thì sợi bổ sung sẽ
bị chặn lại và kết quả là sẽ có các sợi bổ sung với độ
dài khác nhau.
2.2. GIẢI TRÌNH TỰ DNA BẰNG PP ENZYM
ddNTPdNTP
Bốn phản ứng polymer hoá
xảy ra trong 4 ống riêng biệt
Tỉ lệ dNTP và ddNTP
= 100 : 1
Mồi được đánh dấu
T
3’
C
G
C
A

G
T
C
C
T
A
G
C
T
T
A
G
C
G
G 5’
A C G
T
Áp gel điện di lên phim (mồi đánh dấu bằng phóng
xạ hay bằng hoá quang), các vạch điện di trên gel
sẽ hiện trên phim.
C
G
G
G
C
G
T
Sequence 5’ to 3’
MỒI ĐÁNH DẤU PHÓNG XẠ P
35

ĐÁNH DẤU ddNTP
Sequence-specific
primer
1. Gắn ddNTP ngẫu
nhiên, khi xẩy ra,
p/ứng ngừng.
2. Vì nhiều copy của
DNA đích được tạo
đồng thời, nên các
sản phẩm DNA
được tổng hợp mới
của tất cả các kích
thước đều hiện diện
với tận cùng là các
ddNTP
GIẢI TRÌNH TỰ BẰNG ĐIỆN DI MAO QUẢN
1. Dùng gel polyacrylamide biến
tính, có độ phân giải cao, có
thể phân biệt các đoạn DNA
khác nhau chỉ 1 nucleotid.
2. Gel polyacrylamide thường
chứa urea (tác nhân làm biến
tính DNA)
Bước 1: Tinh sạch sản phẩm PCR
PCR
+ DNA đích
+ Taq polymerase
+ Mồi và dNTPs
+ PCR buffer, etc….
On to sequencing….

Sản phẩm PCR tinh sạch
+ nước
P
C
R

c
l
e
a
n
-
u
p
3. KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ
Sản phẩm PCR
Đo nồng độ DNA bằng máy
hay ước lượng qua điện di
Bước 2: Phản ứng chu kỳ giải trình tự
(cycle sequencing reaction)
denaturation
Primer annealing
Product
extension
PCR machine
Tủa sản phẩm giải trình tự
loại bỏ chất đánh dấu thừa

Bước 3: Điện di trên máy giải trình tự
1. Mỗi ddNTP được gắn một màu khác nhau.

2. Sản phẩm PCR được phân loại dựa trên kích
thước (khác nhau 1 nt), khi chạy qua khu vực
phát hiện sẽ được phân tích nhờ chùm tia laser
và bộ phận detector.
3. Dữ liệu được ghi nhận gồm cường độ huỳnh
quang thu được và màu sắc của mỗi đoạn DNA.
4. Trình tự của đoạn DNA được đọc theo chiều 5’
đến 3’, từ trái sang phải.
Automated DNA Sequencing with Fluorescent Dyes
Mỗi ddNTP có một màu khác nhau, ddTTP đỏ, ddGTP đen,…
1. Tối ưu hóa phản ứng PCR phải thật sự hoàn chỉnh
2. Chất lượng và nồng độ DNA đích
3. Mồi đặc hiện với nồng độ thích hợp
4. Sản phẩm PCR phải tinh sạch
5. Phải xác định đúng hàm lượng mồi và sản phẩm
PCR tinh sạch cho p/ứng chu kỳ giải trình tự
4. HIỆU QUẢ P/ỨNG GIẢI TRÌNH TỰ
Hệ thống giải trình tự Trugene
Siemens Medical Solutions Diagnostics
CEQ 8000 (Beckman Coulter)
ABI 3130 ABI 3130 XL
4 Cappilaries 16 Cappilaries
CÁC HỆ THỐNG GIẢI TRÌNH TỰ TỰ ĐỘNG
ABI 3730
5. PYROSEQUENCING
Giải trình tự bằng phương pháp tổng hợp, không điện di
= pyrophosphate
=pyrophosphate
Peaks in pyrogram reflect nucleotide sequence
Mostafa Ronaghi và Pal Nyrén tại Royal Institute of Techology ở Stockholm 1990s.

~500 MB on one plate, in just a few hours.
PYROSEQUENCING
Step 1: DNA đích, Primer, ủ với enzym DNA polymerase,
ATP sulfurylase, luciferase, apyrase, và cơ chất là APS
(adenosine 5’phosphosulphat) và luciferin
Step 2: 4 dNTP được đưa vào phản ứng. DNA
polymerase xúc tác gắn dNTP vào sợi DNA tiếp theo
primer nếu nó bổ xung với DNA đích. Mỗi khi 1 dNTP gắn
vào, sẽ phóng thích 1 pyrophosphat (PPi)