(Đồ án hcmute) khảo sát tính chất enzyme glucoamylasr cố định trên màng nấm kombucha

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
NGÀNH CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM

KHẢO SÁT TÍNH CHẤT ENZYME GLUCOAMYLASE CỐ
ĐỊNH TRÊN MÀNG NẤM KOMBUCHA

GVHD: VŨ TRẦN KHÁNH LINH
SVTH: NGUYỄN HOÀNG VŨ
MSSV: 15116158
SVTH: PHẠM THỊ KIỀU NGA
MSSV: 15116107

SKL 0 0 6 1 2 8

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 8/2019

do an


TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP.HCM
KHOA CÔNG NGHỆ HĨA HỌC VÀ THỰC PHẨM
BỘ MƠN CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Mã số đồ án: 2019-15116158

KHẢO SÁT TÍNH CHẤT ENZYME

GLUCOAMYLASE CỐ ĐỊNH
TRÊN MÀNG NẤM KOMBUCHA

GVHD: T.S VŨ TRẦN KHÁNH LINH
SVTH:

NGUYỄN HỒNG VŨ

15116158

PHẠM THỊ KIỀU NGA

15116107

Thành phố Hồ Chí Minh – 8/2019

1

do an


TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP.HCM
KHOA CÔNG NGHỆ HĨA HỌC VÀ THỰC PHẨM
BỘ MƠN CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Mã số đồ án: 2019-15116158

KHẢO SÁT TÍNH CHẤT ENZYME
GLUCOAMYLASE CỐ ĐỊNH

TRÊN MÀNG NẤM KOMBUCHA

GVHD: T.S VŨ TRẦN KHÁNH LINH
SVTH:

NGUYỄN HỒNG VŨ

15116158

PHẠM THỊ KIỀU NGA

15116107

Thành phố Hồ Chí Minh – 8/2019

2

do an


Khóa luận tốt nghiệp

ii

do an


Khóa luận tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt bốn năm học tại trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Thành phố Hồ Chí
Minh, chúng em đã nhận được sự dạy dỗ ân cần và khơng quản ngại khó khăn của các
Thầy Cô giáo trong trường, đặc biệt là các Thầy Cô giáo trong bộ môn Công nghệ Thực
phẩm. Chúng em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến:
➢ Toàn thể giảng viên trường Đại học Sư phạm Kỹ Thuật Thành phố Hồ Chí Minh
đã tạo điều kiện tốt nhất cho chúng em học tập và rèn luyện.
➢ Tồn thể Thầy Cơ bộ môn Công nghệ Thực phẩm đã cung cấp cho chúng em
những kiến thức bổ ích và kĩ năng cần thiết trong suốt quá trình học tập.
➢ Gia đình và bạn bè đã ln cổ vũ, động viên và khích lệ chúng em khi gặp những
khó khăn trong suốt bốn năm ngồi trên giảng đường đại học.
Đặc biệt, chúng em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới cô Vũ Trần Khánh Linh
đã định hướng đề tài, tận tình chỉ bảo và đưa ra những chỉ dẫn kịp thời để giúp đỡ chúng
em có thể hồn thành tốt đồ án tốt nghiệp của mình.
Trong quá trình thực hiện các thí nghiệm và tính tốn chắc chắn khơng tránh khỏi
những thiếu sót. Chúng em rất mong nhận được sự chỉ bảo và góp ý của các Thầy, các
Cơ để chúng em rút kinh nghiệm và có thêm những kiến thức bổ ích làm hành trang bước
vào đời.

TP.HCM, ngày 01 tháng 08 năm 2019

iii

do an


Khóa luận tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN
Chúng tơi cam đoan tồn bộ nội dung được trình bày trong khóa luận tốt nghiệp này
là của chúng tôi. Chúng tôi xin cam đoan tồn bộ các nội dung tham khảo trong khóa

luận tốt nghiệp này được trích dẫn chính xác và đầy đủ theo quy định.
Ngày 01 tháng 08 năm 2019
Ký tên

iv

do an


Khóa luận tốt nghiệp

v

do an


Khóa luận tốt nghiệp

vi

do an


Khóa luận tốt nghiệp

vii

do an

Khóa luận tốt nghiệp

viii

do an


Khóa luận tốt nghiệp

8. Những thiếu sót của khóa luận
- Những lỗi văn phạm cần hồn chỉnh, trình bày số liệu
- Các danh pháp khơng có chứ S sau khi Viết hóa như calories …
- Trang 27: Bảng 2.2: Cột “định lượng” thay bằng khối lượng/thể tích
- Bảng 3.2: Các số liệu  SD: biểu diễn CSCN không hợp lý.
9. Một số nội dung cần bổ sung
- Danh mục chữ cái viết tắt: Rất nhiều chữ chưa được đưa vào
- Tóm tắt khóa luận: Viết thêm
- Phụ lục về xác định thông số động học
- Nội dung tổng quan: rút gọn lại, tạo bố cục cân đối
- Tài liệu tham khảo tới 140. Sinh viên kiểm tra lại, trích dẫn phù họp
10. Câu hỏi của GV phản biện:
 Trình bày 2 điều kiện để nghiên cứu động học phản ứng enzyme theo mơ hình Michaelis –
Menten.
 Phương trình động học (mà sinh viên đã xác định được các thông số: là gì? Ý nghĩa của
phương trình động học.
 Theo em, để minh giải sự tạo liên kết ngang của enzyme với glutaraldehyde, cần sử dụng
các kỹ thuật phân tích hiện đại nào.

ix

do an


Khóa luận tốt nghiệp

x

do an


Khóa luận tốt nghiệp

xi

do an


Khóa luận tốt nghiệp

xii

do an


Khóa luận tốt nghiệp

xiii

do an

Khóa luận tốt nghiệp

xiv

do an


Khóa luận tốt nghiệp

xv

do an


Khóa luận tốt nghiệp

MỤC LỤC
NHIỆM VỤ KHĨA LUẬN………………………………………..……...……..ii
LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................... .ii
LỜI CAM ĐOAN .................................................................................................iv
ĐÁNH GIÁ CỦA NGƯỜI HƯỚNG DẪN…………………………………..….v
ĐÁNH GIÁ CỦA NGƯỜI PHẢN BIỆN…………………………………..…..vii
ĐÁNH GIÁ CỦA HỘI ĐỒNG………………………..…………………………x
MỤC LỤC ...........................................................................................................xvi
DANH MỤC HÌNH ..........................................................................................xixx
DANH MỤC BẢNG BIỂU ................................................................................. xx
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .........................................................................xxi
TÓM TẮT KHÓA LUẬN ............................................................................... xxiii
LỜI MỞ ĐẦU ........................................................................................................ 1

1.

Đặt vấn đề ................................................................................................. 1

2.

Mục tiêu đề tài .......................................................................................... 2

3.

Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 2

4.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn .................................................................. 3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................. 4
1.1.

Tổng quan về nấm trà Kombucha ............................................................ 4

1.1.1. Giới thiệu ............................................................................................ 4
1.1.2. Hệ vi sinh vật trong nấm trà ................................................................ 5
1.1.3. Thành phần hóa học và tính chất vật lí của màng nấm ....................... 6
1.1.4. Ứng dụng của nấm trà ......................................................................... 9
1.2.

Enzyme glucoamylase ............................................................................ 11

1.2.1. Giới thiệu .......................................................................................... 11

1.2.2. Cấu trúc khơng gian và cấu tạo hóa học của glucoamylase.............. 12
1.2.3. Các nguồn thu nhận glucoamylase ................................................... 13
xvi

do an


Khóa luận tốt nghiệp

1.2.4. Ứng dụng của glucoamylase ............................................................. 13
1.3.

Các kỹ thuật cố định enzyme ................................................................. 14

1.3.1. Định nghĩa ......................................................................................... 14
1.3.2. Vật liệu cố định ................................................................................. 15
1.3.3. Các phương pháp cố định ................................................................. 16
1.3.4. Vai trò của kĩ thuật cố định ............................................................... 19
1.4.

Glutaraldehyde ....................................................................................... 19

1.4.1. Giới thiệu .......................................................................................... 19
1.4.2. Cơ chế tác dụng với enzyme của glutaraldehyde ............................. 20
1.4.3. Các yếu tố tác động tới quá trình cố định enzyme bằng
glutaraldehyde……………………………………………………………………21
1.4.4. Các ứng dụng khác của glutaraldehyde ............................................ 22
1.5. Các nghiên cứu trong và ngoài nước về glucoamylase và vật liệu màng
nấm…………….. ....................................................................................................... 23
1.5.1. Các nghiên cứu trong nước ............................................................... 23

1.5.2. Các nghiên cứu ở nước ngoài ........................................................... 23
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 25
2.1.

Nguyên liệu, hóa chất ............................................................................. 25

2.1.1. Nguyên liệu ....................................................................................... 25
2.1.2. Hóa chất ............................................................................................ 25
2.2.

Quy trình ni cấy và thu nhận nấm trà Kombucha .............................. 25

2.2.1. Sơ đồ quy trình thực hiện .................................................................. 25
2.2.2. Thuyết minh quy trình ...................................................................... 26
2.3.

Nội dung nghiên cứu ............................................................................. 28

2.3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát phương pháp tiền xử lý FM........................ 28
2.3.2. Thí nghiệm 2: Xác định hoạt độ của enzyme tự do và cố định ........ 32
2.3.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ glutaraldehyde tới quá
trình cố định enzyme .............................................................................................. 33
xvii

do an


Khóa luận tốt nghiệp

2.3.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt tính xúc tác

của glucoamylase cố định. ..................................................................................... 34
2.3.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của pH tới hoạt tính xúc tác của
glucoamylase cố định. ............................................................................................ 35
2.3.6. Thí nghiệm 6: Khảo sát khả năng tái sử dụng của enzyme cố định. 36
2.3.7. Thí nghiệm 7: Xác định thông số động học của enzyme tự do và cố
định………………. ................................................................................................ 37
2.4.

Phương pháp phân tích ........................................................................... 38

2.4.1. Phương pháp xác định đường khử .................................................... 38
2.4.2. Phương pháp xác định độ ẩm ............................................................ 39
2.4.3. Phương pháp xử lý số liệu ................................................................ 39
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ........................................................ 40
3.1.

Khảo sát phương pháp tiền xử lý FM .................................................... 40

3.2.

Xác định hoạt độ của enzyme glucoamylase tự do và cố định. ............. 41

3.3. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ glutaraldehyde tới quá trình cố định
enzyme………………. .............................................................................................. 42
3.4. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt tính xúc tác của
glucoamylase….. ........................................................................................................ 44
3.5.

Khảo sát ảnh hưởng của pH tới hoạt tính xúc tác của glucoamylase ..... 47

3.6.

Khảo sát khả năng tái sử dụng của enzyme cố định............................... 49

3.7.

Xác định thông số động học của enzyme tự do và cố định .................... 50

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................... 53
4.1.

Kết luận .................................................................................................. 53

4.2.

Đề xuất ý kiến......................................................................................... 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................. 54
PHỤ LỤC ............................................................................................................. 68

xviii

do an


Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Thành phần nấm trà và chất lỏng lên men của trà Kombucha. .............. 4
Hình 1.2: Vi khuẩn Gluconacetobacter hình thành các vi sợi cellulose................. 8

Hình 1.3: Cấu trúc hóa học của cellulose vi khuẩn. ............................................... 8
Hình 1.4: Cấu trúc khơng gian của glucoamylase. ............................................... 12
Hình 1.5: Cơng thức cấu tạo của glutaraldehyde ................................................ 19
Hình 1.6: Cơ chế tạo liên kết giữa glutaraldehyde và amino acid thơng qua phản
ứng Michael. .......................................................................................................... 20
Hình 1.7: Cơ chế tạo liên kết giữa glutaraldehyde và amino acid thông qua ngưng
tụ aldol. .................................................................................................................. 21
Hình 2.1: Sơ đồ quy trình công nghệ nuôi cấy và thu nhận nấm trà trà Kombucha
sử dụng trong nghiên cứu. ........................................................................ ………26
Hình 2.2: Sơ đồ nghiên cứu .................................................................................. 28
Hình 2.3: Quy trình cố định enzyme glucoamylase lên FM. ............................... 30
Hình 2.4: FM sau khi cố định enzyme glucoamylase. ......................................... 31
Hình 2.5: Cơ chế tạo màu giữa DNS và đường khử. ........................................... 38
Hình 3.1: Nồng độ đường khử sinh ra sau khi thuỷ phân tinh bột bằng
glucoamylase cố định lên FM được xử lý bằng các phương pháp tiệt trùng (GFM1)
và xử lý với NaOH (GFM2) và các mẫu đối chứng (FM1 và FM2) tương ứng. . 40
Hình 3.2: Ảnh hưởng của nồng độ glutaraldehyde tới quá trình cố định enzyme lên
FM ......................................................................................................................... 42
Hình 3.3: Sơ đồ phản ứng quá trình aldol ngưng tụ ............................................. 43
Hình 3.4: Công thức cấu tạo poly-glutaraldehyde I (trái) và poly-glutaraldehyde II
(phải)...................................................................................................................... 44
Hình 3.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt độ của enzyme glucoamylase tự do và
cố định. .................................................................................................................. 45
Hình 3.6: Ảnh hưởng của pH đến glucoamylase tự do và cố định. ..................... 47
Hình 3.7: Cơ chế tác động của glutaraldehyde đến các nhóm acid amin của enzyme
............................................................................................................................... 48
Hình 3.8: Khảo sát khả năng tái sử dụng của enzyme glucoamylase cố định...... 49
Hình 3.9: Đồ thị đường biểu diễn Lineweaver-Burk của glucoamylase cố định trên
FM và glucoamylase tự do. ................................................................................... 51
xix

do an


Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1: Các lồi vi sinh vật có trong hệ cộng sinh Kombucha ........................... 6
Bảng 1.2: Thành phần hóa học của màng nấm Kombucha. ................................... 7
Bảng 1.3: Tỉ lệ thành phần các amino acid cấu thành enzyme glucoamylase...... 13
Bảng 1.4: Các giai đoạn phát triển của kĩ thuật cố định enzyme. ........................ 15
Bảng 2.1: Các nguyên liệu sử dụng cho việc nuôi cấy nấm trà Kombucha……...25
Bảng 2.2: Khối lượng các thành phần nguyên liệu sử dụng trong nuôi cấy nấm trà
Kombucha.............................................................................................................. 27
Bảng 2.3: Mẫu chuẩn bị thí nghiệm 3................................................................... 34
Bảng 2.4: Mẫu chuẩn bị thí nghiệm 4................................................................... 35
Bảng 2.5: Mẫu chuẩn bị thí nghiệm 5................................................................... 36
Bảng 2.6: Mẫu chuẩn bị thí nghiệm 7................................................................... 37
Bảng 3.1: Hoạt độ của enzyme glucoamylase tự do và cố định trên FM…….. ...41
Bảng 3.2: Thông số động học Km và Vmax của enzyme glucoamylase tự do và cố
định. ....................................................................................................................... 51

xx

do an


Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

BC: Cellulose vi khuẩn.
CD: Vị trí xúc tác phản ứng thủy phân.
CMC: Carboxymethyl Cellulose.
DNS: 3,5-Dinitrosalicylic acid.
FDA: Food and Drug Administration - Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ.
FM: Nấm trà Kombucha.
FM1, FM2: Lần lượt là các mẫu nấm trà Kombucha đối chứng của phương pháp tiền xử lý tiệt
trùng và xử lý NaOH không được cố định enzyme.
G0, G0.5, G1.0, G1.5, G2.0, G2.5: Là các mẫu nấm trà Kombucha được hoạt hóa với
glutaraldehyde với các nồng độ lần lượt là 0%, 0.5%, 1.0%, 1.5%, 2.0%, 2.5%.
GAF: Glucoamylase tự do.
GFM: Glucoamylase đã được cố định lên nấm trà.
HFS: High Fructose Syrup – Syrup có hàm lượng cao fructose
Km: Hằng số Michaelis-Menten.
pH4.0, pH4.5, pH 5.0, pH5.5, pH 6.0, pH6.5, pH7.0: Là các mẫu glucoamylase cố định trên nấm
trà Kombucha được cho thủy phân ở các pH lần lượt là 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0.
SBD: Vị trí tiếp xúc tinh bột của enzyme.
T55, T60, T65, T70, T75, T80: Là các mẫu glucoamylase cố định lên nấm trà Kombucha được
cho thủy phân ở các nhiệt độ lần lượt là 55 oC, 60 oC, 65 oC, 70 oC, 75 oC, 80 oC.
Vmax: Tốc độ phản ứng cực đại.
Vo: Tốc độ phản ứng ban đầu.

xxi

do an


Khóa luận tốt nghiệp

TĨM TẮT KHĨA LUẬN

Màng nấm Kombucha (FM) – một loại polymer sinh học được sử dụng làm chất mang
cho quá trình cố định enzyme trong nghiên cứu này. Enzyme được đưa vào khảo sát là
glucoamylase thường được sử dụng trong quá trình sản xuất đường syrup, bia và các sản phẩm
thực phẩm khác. Quá trình cố định sử dụng glutaraldehyde là hợp chất tạo liên kết ngang giữa
enzyme và cơ chất. Màng nấm Kombucha trước khi cố định sẽ được tiền xử lý theo 2 phương
pháp là tiệt trùng và xử lý bằng dung dịch NaOH. Kết quả cố định cho thấy chất mang được tiền
xử lý bằng tiệt trùng cho kết quả tốt hơn. Sau đó nhóm nghiên cứu tiếp tục khảo sát yếu tố ảnh
hưởng tới quá trình xúc tác thủy phân hồ tinh bột của enzyme cố định như nhiệt độ, pH, nồng
độ cơ chất,… để lựa chọn ra các thông số phù hợp với quá trình thủy phân cũng như đánh giá
tác động của glutaraldehyde tới quá trình cố định enzyme.
Kết quả khảo sát cho thấy glucoamylase cố định (GFM) có nhiều tính chất nổi trội hơn
enzyme tự do. Về khả năng chịu nhiệt, GFM vẫn duy trì hoạt tính tương đối trên 60% ở khoảng
nhiệt độ cao 75 – 80 oC. Khi khảo sát khả năng thủy phân hồ tinh bột ở pH trung tính, GFM
(66.91 %) có hoạt tính tương đối cao hơn so với enzyme tự do (15.61 %). Về khả năng tái sử
dụng, GFM duy trì 82.86 % hoạt tính ban đầu sau 10 mẻ thủy phân hồ tinh bột 1 %. Bên cạnh
đó, các thơng số động học như hằng số Michaelis (Km) và tốc độ cực đại (Vmax) của GFM cho
thấy quá trình cố định bằng glutaraldehyde không ảnh hưởng đến cấu trúc và khả năng xúc tác
của glucoamylase. Glucoamylase cố định trên màng nấm Kombucha thông qua hợp chất
glutarldehyde có nhiềm tiềm năng ứng dụng trong sản xuất công nghiệp.

xxii

do an


Khóa luận tốt nghiệp

LỜI MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Enzyme là một hợp chất xúc tác sinh học đóng vai trị quan trọng trong nhiều ngành

công nghiệp như thực phẩm, năng lượng, hóa chất,… Cố định enzyme là một trong những kỹ
thuật không những làm tăng khả năng hoạt động ổn định của enzyme trong điều kiện phản ứng
khắc nghiệt mà cịn giúp tiết kiệm chi phí sản xuất nhờ vào khả năng tái sử dụng nhiều lần (Wu
và cộng sự, 2008). Có nhiều phương pháp cố định enzyme khác nhau đã được nghiên cứu và
ứng dụng. Mỗi phương pháp đều có ưu nhược điểm riêng, tuy nhiên đối với cơ chất có kích
thước lớn, cồng kềnh như carbonhydrate, lipid, protein,… thì phương pháp gắn enzyme lên chất
mang là phù hợp hơn cả (Back và cộng sự, 2003). Trong kĩ thuật cố định này, chất mang có bản
chất cellulose vi khuẩn (Bacterial cellulose, BC) đang được quan tâm nghiên cứu rộng rãi vì
những ưu điểm nổi trội như có nguồn gốc tự nhiên, khả năng giữ nước tốt (Chawla và cộng sự,
2009); chứa ít thành phần hemicellulose, lignin,… (Ruka và cộng sự, 2014; Czaja và cộng sự,
2006); cấu trúc xốp do các vi sợi của BC nhỏ hơn 100 lần so với cellulose thực vật (Czaja và
cộng sự, 2006), chứa nhiều nhóm hydroxyl phù hợp với các phản ứng hóa học (Keshk và Nada,
2003).
BC thường được thu nhận thông qua quá trình ni cấy chủng Acetobacter xylinum
(Chao và cộng sự, 1997; Fontana và cộng sự, 1997; Wu và Lia, 2008; Wu và cộng sự, 2017).
Quá trình này yêu cầu phải sử dụng nhiều hóa chất khác nhau và điều kiện ni cấy nghiêm
ngặt. Tuy nhiên, có một nguồn sinh khối BC tiềm năng có thể sử dụng để cố định enzyme đó
chính là nấm trà Kombucha (tea fungus, fungal mat) thu nhận từ quá trình sản xuất thức uống
lên men Kombucha. Việc thu nhận nấm trà Kombucha có thể thực hiện tại nhà với nguồn cơ
chất đơn giản là dịch trích trà xanh và đường (Dufresne và Farnworth, 2000). Theo những tài
liệu mà chúng tơi tổng hợp được thì chưa có một cơng bố trong và ngồi nước nào sử dụng nấm
trà Kombucha để cố định enzyme. Vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi sẽ tiến hành khảo
sát khả năng sử dụng sinh khối nấm trà làm chất mang để cố định glucoamylase, từ đó đánh giá
hiệu quả cố định thơng qua q trình thủy phân tinh bột. Glucoamylase được lựa chọn là vì: (1)
cơ chất của glucoamylase là tinh bột, có kích thước cồng kềnh (Back và cộng sự, 2003); (2)

1

do an