Khảo sát tính chất enzyme glucoamylasr cố định trên màng nấm kombucha

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
NGÀNH CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM

KHẢO SÁT TÍNH CHẤT ENZYME GLUCOAMYLASE CỐ
ĐỊNH TRÊN MÀNG NẤM KOMBUCHA

GVHD: VŨ TRẦN KHÁNH LINH
SVTH: NGUYỄN HOÀNG VŨ
MSSV: 15116158
SVTH: PHẠM THỊ KIỀU NGA
MSSV: 15116107

SKL006128

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 8/2019


TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP.HCM
KHOA CÔNG NGHỆ HĨA HỌC VÀ THỰC PHẨM
BỘ MƠN CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Mã số đồ án: 2019-15116158

KHẢO SÁT TÍNH CHẤT ENZYME
GLUCOAMYLASE CỐ ĐỊNH TRÊN
MÀNG NẤM KOMBUCHA

GVHD:
SVTH:

Thành phố Hồ Chí Minh – 8/2019

1


TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP.HCM
KHOA CÔNG NGHỆ HĨA HỌC VÀ THỰC PHẨM
BỘ MƠN CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Mã số đồ án: 2019-15116158

KHẢO SÁT TÍNH CHẤT ENZYME
GLUCOAMYLASE CỐ ĐỊNH TRÊN
MÀNG NẤM KOMBUCHA

GVHD:
SVTH:

Thành phố Hồ Chí Minh – 8/2019

2


Khóa luận tốt nghiệp

ii

Khóa luận tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN
Trong suốt bốn năm học tại trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Thành phố Hồ Chí
Minh, chúng em đã nhận được sự dạy dỗ ân cần và khơng quản ngại khó khăn của các
Thầy Cô giáo trong trường, đặc biệt là các Thầy Cô giáo trong bộ môn Công nghệ
Thực phẩm. Chúng em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến:

➢

Toàn thể giảng viên trường Đại học Sư phạm Kỹ Thuật Thành phố Hồ Chí Minh

đã tạo điều kiện tốt nhất cho chúng em học tập và rèn luyện.

➢

Tồn thể Thầy Cơ bộ mơn Công nghệ Thực phẩm đã cung cấp cho chúng em những kiến

thức bổ ích và kĩ năng cần thiết trong suốt quá trình học tập.

➢

Gia đình và bạn bè đã ln cổ vũ, động viên và khích lệ chúng em khi gặp những

khó khăn trong suốt bốn năm ngồi trên giảng đường đại học.
Đặc biệt, chúng em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới cô Vũ Trần Khánh Linh
đã định hướng đề tài, tận tình chỉ bảo và đưa ra những chỉ dẫn kịp thời để giúp đỡ
chúng em có thể hồn thành tốt đồ án tốt nghiệp của mình.

Trong q trình thực hiện các thí nghiệm và tính tốn chắc chắn khơng tránh khỏi
những thiếu sót. Chúng em rất mong nhận được sự chỉ bảo và góp ý của các Thầy, các
Cô để chúng em rút kinh nghiệm và có thêm những kiến thức bổ ích làm hành trang
bước vào đời.

TP.HCM, ngày 01 tháng 08 năm 2019

iii


Khóa luận tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN
Chúng tơi cam đoan tồn bộ nội dung được trình bày trong khóa luận tốt nghiệp
này là của chúng tôi. Chúng tôi xin cam đoan tồn bộ các nội dung tham khảo trong
khóa luận tốt nghiệp này được trích dẫn chính xác và đầy đủ theo quy định.
Ngày 01 tháng 08 năm 2019
Ký tên

iv


Khóa luận tốt nghiệp

v


Khóa luận tốt nghiệp

vi

Khóa luận tốt nghiệp

vii


Khóa luận tốt nghiệp

viii


Khóa luận tốt nghiệp

8. Những thiếu sót của khóa luận
-

Những lỗi văn phạm cần hồn chỉnh, trình bày số liệu

-

Các danh pháp khơng có chứ S sau khi Viết hóa như calories …

-

Trang 27: Bảng 2.2: Cột “định lượng” thay bằng khối lượng/thể tích

-

Bảng 3.2: Các số liệu SD: biểu diễn CSCN không hợp lý.

9. Một số nội dung cần bổ sung
-

Danh mục chữ cái viết tắt: Rất nhiều chữ chưa được đưa vào

-

Tóm tắt khóa luận: Viết thêm

-

Phụ lục về xác định thông số động học

-

Nội dung tổng quan: rút gọn lại, tạo bố cục cân đối

-

Tài liệu tham khảo tới 140. Sinh viên kiểm tra lại, trích dẫn phù họp

10. Câu hỏi của GV phản biện:

 Trình bày 2 điều kiện để nghiên cứu động học phản ứng enzyme theo mơ hình Michaelis –
Menten.

 Phương trình động học (mà sinh viên đã xác định được các thông số: là gì? Ý nghĩa của
phương trình động học.

 Theo em, để minh giải sự tạo liên kết ngang của enzyme với glutaraldehyde, cần sử dụng các kỹ
thuật phân tích hiện đại nào.

ix


Khóa luận tốt nghiệp

x


Khóa luận tốt nghiệp

xi


Khóa luận tốt nghiệp

xii


Khóa luận tốt nghiệp

xiii


Khóa luận tốt nghiệp

xiv

Khóa luận tốt nghiệp

xv


Khóa luận tốt nghiệp

MỤC LỤC
NHIỆM VỤ KHĨA LUẬN………………………………………..……...……..ii

LỜI CẢM ƠN......................................................................................................ii
LỜI CAM ĐOAN............................................................................................... iv
ĐÁNH GIÁ CỦA NGƯỜI HƯỚNG DẪN…………………………………..….v
ĐÁNH GIÁ CỦA NGƯỜI PHẢN BIỆN…………………………………..…..vii
ĐÁNH GIÁ CỦA HỘI ĐỒNG………………………..…………………………x

MỤC LỤC.........................................................................................................xvi
DANH MỤC HÌNH........................................................................................xixx
DANH MỤC BẢNG BIỂU................................................................................ xx
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT........................................................................xxi
TÓM TẮT KHÓA LUẬN..............................................................................xxiii
LỜI MỞ ĐẦU......................................................................................................1
1.

Đặt vấn đề...............................................................................................1

2.

Mục tiêu đề tài........................................................................................2

3.

Nội dung nghiên cứu...............................................................................2

4.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn.................................................................3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.............................................................4
1.1.

Tổng quan về nấm trà Kombucha...........................................................4

1.1.1. Giới thiệu...........................................................................................4
1.1.2. Hệ vi sinh vật trong nấm trà...............................................................5
1.1.3. Thành phần hóa học và tính chất vật lí của màng nấm......................6
1.1.4. Ứng dụng của nấm trà........................................................................9
1.2.

Enzyme glucoamylase........................................................................... 11

1.2.1. Giới thiệu......................................................................................... 11
1.2.2. Cấu trúc khơng gian và cấu tạo hóa học của glucoamylase..............12
1.2.3. Các nguồn thu nhận glucoamylase................................................... 13
xvi


Khóa luận tốt nghiệp

1.2.4. Ứng dụng của glucoamylase............................................................ 13
1.3.

Các kỹ thuật cố định enzyme................................................................. 14

1.3.1. Định nghĩa....................................................................................... 14
1.3.2. Vật liệu cố định................................................................................ 15
1.3.3. Các phương pháp cố định................................................................ 16
1.3.4. Vai trò của kĩ thuật cố định.............................................................. 19
1.4.

Glutaraldehyde...................................................................................... 19

1.4.1. Giới thiệu......................................................................................... 19
1.4.2. Cơ chế tác dụng với enzyme của glutaraldehyde.............................20
1.4.3.

Các yếu tố

tác

động

tới quá trình cố

định enzyme
bằng
glutaraldehyde……………………………………………………………………21
1.4.4. Các ứng dụng khác của glutaraldehyde............................................ 22

1.5. Các nghiên cứu trong và ngoài nước về glucoamylase và vật liệu màng
nấm……………....................................................................................................... 23
1.5.1. Các nghiên cứu trong nước.............................................................. 23
1.5.2. Các nghiên cứu ở nước ngoài........................................................... 23
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................25
2.1.

Nguyên liệu, hóa chất............................................................................ 25

2.1.1. Ngun liệu...................................................................................... 25
2.1.2. Hóa chất........................................................................................... 25
2.2.

Quy trình ni cấy và thu nhận nấm trà Kombucha..............................25

2.2.1. Sơ đồ quy trình thực hiện................................................................. 25
2.2.2. Thuyết minh quy trình..................................................................... 26
2.3.

Nội dung nghiên cứu............................................................................ 28

2.3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát phương pháp tiền xử lý FM.......................28
2.3.2. Thí nghiệm 2: Xác định hoạt độ của enzyme tự do và cố định........32
2.3.3.

Thí nghiệm 3: Khảo sát
ảnh hưởng của nồng độ glutaraldehyde tới quá
trình cố định enzyme............................................................................................ 33

xvii


Khóa luận tốt nghiệp

2.3.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt tính xúc tác
của glucoamylase cố định..................................................................................... 34
2.3.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của pH tới hoạt tính xúc tác của
glucoamylase cố định........................................................................................... 35
2.3.6. Thí nghiệm 6: Khảo sát khả năng tái sử dụng của enzyme cố định. 36
2.3.7. Thí nghiệm 7: Xác định thông số động học của enzyme tự do và cố
định………………............................................................................................... 37
2.4.

Phương pháp phân tích.......................................................................... 38

2.4.1. Phương pháp xác định đường khử................................................... 38
2.4.2. Phương pháp xác định độ ẩm........................................................... 39
2.4.3. Phương pháp xử lý số liệu............................................................... 39
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN....................................................... 40
3.1.

Khảo sát phương pháp tiền xử lý FM................................................... 40

3.2.

Xác định hoạt độ của enzyme glucoamylase tự do và cố định...............41

3.3. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ glutaraldehyde tới quá trình cố định
enzyme……………….............................................................................................. 42

3.4. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt tính xúc tác của
glucoamylase…........................................................................................................ 44
3.5.

Khảo sát ảnh hưởng của pH tới hoạt tính xúc tác của glucoamylase.....47

3.6.

Khảo sát khả năng tái sử dụng của enzyme cố định..............................49

3.7.

Xác định thông số động học của enzyme tự do và cố định....................50

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.................................................... 53
4.1.

Kết luận................................................................................................. 53

4.2.

Đề xuất ý kiến....................................................................................... 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................. 54
PHỤ LỤC........................................................................................................... 68

xviii


Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Thành phần nấm trà và chất lỏng lên men của trà Kombucha...............4
Hình 1.2: Vi khuẩn Gluconacetobacter hình thành các vi sợi cellulose................8
Hình 1.3: Cấu trúc hóa học của cellulose vi khuẩn...............................................8
Hình 1.4: Cấu trúc khơng gian của glucoamylase............................................... 12
Hình 1.5: Cơng thức cấu tạo của glutaraldehyde................................................ 19
Hình 1.6: Cơ chế tạo liên kết giữa glutaraldehyde và amino acid thơng qua phản
ứng Michael......................................................................................................... 20
Hình 1.7: Cơ chế tạo liên kết giữa glutaraldehyde và amino acid thơng qua ngưng
tụ aldol................................................................................................................. 21
Hình 2.1: Sơ đồ quy trình cơng nghệ ni cấy và thu nhận nấm trà trà Kombucha
sử dụng trong nghiên cứu........................................................................ ………26
Hình 2.2: Sơ đồ nghiên cứu................................................................................ 28
Hình 2.3: Quy trình cố định enzyme glucoamylase lên FM................................30
Hình 2.4: FM sau khi cố định enzyme glucoamylase.........................................31
Hình 2.5: Cơ chế tạo màu giữa DNS và đường khử............................................ 38
Hình 3.1: Nồng độ đường khử sinh ra sau khi thuỷ phân tinh bột bằng
glucoamylase cố định lên FM được xử lý bằng các phương pháp tiệt trùng (GFM1)
và xử lý với NaOH (GFM2) và các mẫu đối chứng (FM1 và FM2) tương ứng. . 40
Hình 3.2: Ảnh hưởng của nồng độ glutaraldehyde tới quá trình cố định enzyme lên
FM....................................................................................................................... 42
Hình 3.3: Sơ đồ phản ứng quá trình aldol ngưng tụ............................................ 43
Hình 3.4: Cơng thức cấu tạo poly-glutaraldehyde I (trái) và poly-glutaraldehyde II
(phải)................................................................................................................... 44
Hình 3.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt độ của enzyme glucoamylase tự do và
cố định................................................................................................................. 45
Hình 3.6: Ảnh hưởng của pH đến glucoamylase tự do và cố định......................47
Hình 3.7: Cơ chế tác động của glutaraldehyde đến các nhóm acid amin của enzyme
48

Hình 3.8: Khảo sát khả năng tái sử dụng của enzyme glucoamylase cố định.....49
Hình 3.9: Đồ thị đường biểu diễn Lineweaver-Burk của glucoamylase cố định trên
FM và glucoamylase tự do.................................................................................. 51
xix


Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1: Các lồi vi sinh vật có trong hệ cộng sinh Kombucha..........................6
Bảng 1.2: Thành phần hóa học của màng nấm Kombucha...................................7
Bảng 1.3: Tỉ lệ thành phần các amino acid cấu thành enzyme glucoamylase.....13
Bảng 1.4: Các giai đoạn phát triển của kĩ thuật cố định enzyme.........................15
Bảng 2.1: Các nguyên liệu sử dụng cho việc nuôi cấy nấm trà Kombucha……...25
Bảng 2.2: Khối lượng các thành phần nguyên liệu sử dụng trong nuôi cấy nấm trà
Kombucha........................................................................................................... 27
Bảng 2.3: Mẫu chuẩn bị thí nghiệm 3................................................................. 34
Bảng 2.4: Mẫu chuẩn bị thí nghiệm 4................................................................. 35
Bảng 2.5: Mẫu chuẩn bị thí nghiệm 5................................................................. 36
Bảng 2.6: Mẫu chuẩn bị thí nghiệm 7................................................................. 37
Bảng 3.1: Hoạt độ của enzyme glucoamylase tự do và cố định trên FM……... .41
Bảng 3.2: Thông số động học Km và Vmax của enzyme glucoamylase tự do và cố
định...................................................................................................................... 51

xx


Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

BC: Cellulose vi khuẩn.
CD: Vị trí xúc tác phản ứng thủy phân.
CMC: Carboxymethyl Cellulose.
DNS: 3,5-Dinitrosalicylic acid.
FDA: Food and Drug Administration - Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ.
FM: Nấm trà Kombucha.
FM1, FM2: Lần lượt là các mẫu nấm trà Kombucha đối chứng của phương pháp tiền xử lý tiệt
trùng và xử lý NaOH không được cố định enzyme.
G0, G0.5, G1.0, G1.5, G2.0, G2.5: Là các mẫu nấm trà Kombucha được hoạt hóa với
glutaraldehyde với các nồng độ lần lượt là 0%, 0.5%, 1.0%, 1.5%, 2.0%, 2.5%.
GAF: Glucoamylase tự do.
GFM: Glucoamylase đã được cố định lên nấm trà.
HFS: High Fructose Syrup – Syrup có hàm lượng cao fructose
Km: Hằng số Michaelis-Menten.
pH4.0, pH4.5, pH 5.0, pH5.5, pH 6.0, pH6.5, pH7.0: Là các mẫu glucoamylase cố định trên
nấm trà Kombucha được cho thủy phân ở các pH lần lượt là 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0.
SBD: Vị trí tiếp xúc tinh bột của enzyme.
T55, T60, T65, T70, T75, T80: Là các mẫu glucoamylase cố định lên nấm trà Kombucha được
o

o

o

o

o

o

cho thủy phân ở các nhiệt độ lần lượt là 55 C, 60 C, 65 C, 70 C, 75 C, 80 C.
Vmax: Tốc độ phản ứng cực đại.
Vo: Tốc độ phản ứng ban đầu.

xxi


Khóa luận tốt nghiệp

TĨM TẮT KHĨA LUẬN
Màng nấm Kombucha (FM) – một loại polymer sinh học được sử dụng làm chất mang
cho quá trình cố định enzyme trong nghiên cứu này. Enzyme được đưa vào khảo sát là
glucoamylase thường được sử dụng trong quá trình sản xuất đường syrup, bia và các sản phẩm
thực phẩm khác. Quá trình cố định sử dụng glutaraldehyde là hợp chất tạo liên kết ngang giữa
enzyme và cơ chất. Màng nấm Kombucha trước khi cố định sẽ được tiền xử lý theo 2 phương
pháp là tiệt trùng và xử lý bằng dung dịch NaOH. Kết quả cố định cho thấy chất mang được
tiền xử lý bằng tiệt trùng cho kết quả tốt hơn. Sau đó nhóm nghiên cứu tiếp tục khảo sát yếu tố
ảnh hưởng tới quá trình xúc tác thủy phân hồ tinh bột của enzyme cố định như nhiệt độ, pH,
nồng độ cơ chất,… để lựa chọn ra các thông số phù hợp với quá trình thủy phân cũng như
đánh giá tác động của glutaraldehyde tới quá trình cố định enzyme.
Kết quả khảo sát cho thấy glucoamylase cố định (GFM) có nhiều tính chất nổi trội hơn
enzyme tự do. Về khả năng chịu nhiệt, GFM vẫn duy trì hoạt tính tương đối trên 60% ở
o

khoảng nhiệt độ cao 75 – 80 C. Khi khảo sát khả năng thủy phân hồ tinh bột ở pH trung tính,
GFM (66.91 %) có hoạt tính tương đối cao hơn so với enzyme tự do (15.61 %). Về khả năng
tái sử dụng, GFM duy trì 82.86 % hoạt tính ban đầu sau 10 mẻ thủy phân hồ tinh bột 1 %. Bên
cạnh đó, các thơng số động học như hằng số Michaelis (K m) và tốc độ cực đại (Vmax) của GFM
cho thấy quá trình cố định bằng glutaraldehyde không ảnh hưởng đến cấu trúc và khả năng
xúc tác của glucoamylase. Glucoamylase cố định trên màng nấm Kombucha thơng qua hợp

chất glutarldehyde có nhiềm tiềm năng ứng dụng trong sản xuất công nghiệp.

xxii