Nghiên cứu tái sinh giống lúa DT22 và Khang dân đột biến (KDĐB) phục vụ cho kỹ thuật chuyển gen pptx

T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam

1
NGHIÊN CỨU TÁI SINH GIỐNG LÚA DT22
VÀ KHANG DÂN ĐỘT BIẾN (KDĐB)
PHỤC VỤ CHO KỸ THUẬT CHUYỂN GEN
Phí Công guyên, guyễn Thuý Điệp,

Kiều Thị Dung, Trần Minh Hoa,
Trần Duy Dương, Đặng Trọng Lương
SUMMARY
Study on the plant regeneration of DT22 and mutant Khang dan (KDĐB) rice
cultivars
from matured embryo calli for rice transformation
Two rice cultivars DT22 and KDĐB were used to induce calli and plant regeneration
from matured embryo calli. Callus induction, callus proliferation and regeneration ratio
were evaluated on MS (Murashige Skoog, 1962) and 6 (Chu et al, 1978) media
supplemented with different concentrations of phytohormon. 6D supplemented with 2
mg/l 2,4D was the most effective on callus induction and callus proliferation of both DT22
and KDĐB cultivars. DT22 cultivar was highest regenerated on MS medium supplemented
with 2 mg/l BAP (BL2 medium). Regeneration ratio equal to 74.1% and regenerated shoot
were healthy and uniform. Healthy and uniform shoot were induced as 72.6% of
regeneration ratio on MS medium supplemented with 2 mg/l BAP and 0.1 mg/l AA (A4
medium).
Keywords: Rice, Callus, Plant regeneration.
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Đã có rất nhiều loại mô khác nhau được
dùng trong nghiên cứu tái sinh ở lúa
(Bhaskaran và Smith, 1988). Tuy nhiên, các
mô phôi thường được ứng dụng nhiều trong
nuôi cấy in vitro nhờ có khả năng tái sinh

cao của các callus được tạo thành
(Maggioni và cs., 1989). Sự tái sinh từ
callus đạt được từ rất lâu đối với các giống
thuộc Japonica spp. (Nishi và cs., 1973).
Tiềm năng tạo thành callus và sự tái sinh đã
được nhiều báo cáo nhắc đến như một đặc
điểm khác biệt và hiệu quả tái sinh ở các
giống lúa Indica vẫn gặp những vấn đề khó
khăn do đặc tính di truyền của chúng (Toki,
1997). Do vậy, các chiến lược nhằm cải
thiện hiệu quả tái sinh ở lúa được tiến hành
nhiều trong những thập kỷ qua (Kyozuka và
cs., 1988; Raman và cs., 1999). Các giống
lúa Japonica thường có khả năng tái sinh
cao trong khi đó sự thành công của các
giống lúa Indica vẫn còn hạn chế, đặc biệt
là đối với nhóm 1 (Kyozuka và cs., 1988;
Raman và cs., 1994). Khả năng tái sinh liên
quan nhiều đến hiệu quả biến nạp. Vì vậy,
để nâng cao hiệu quả của quá trình biến nạp
gen vào lúa, chúng tôi tiến hành: “ghiên
cứu tái sinh giống lúa DT22 và Khang dân
đột biến (KDĐB) phục vụ cho kỹ thuật
chuyển gen”.
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam

2
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1. Vật liệu nghiên cứu

Giống lúa DT22 và giống lúa Khang
dân đột biến (KDĐB) có nguồn gốc và xuất
xứ từ Viện Di truyền Nông nghiệp.
Nuôi cấy mô tái sinh sử dụng môi
trường cơ bản MS (Murashige Skoog,
1962) và môi trường N6 (Chu và cs., 1978)
bổ sung các chất điều hoà sinh trưởng ở
nồng độ khác nhau.
2. Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp nuôi cấy mô tạo callus và
tái sinh cây sử dụng phôi trưởng thành được
kết hợp từ phương pháp của IRRI và phòng
thí nghiệm Chọn giống cây trồng, Đại học
Kyushu, Nhật Bản.
2.1. Khử trùng mẫu
Sử dụng 2 hóa chất khử trùng hạt khác
nhau là HgCl
2
1‰ trong 10 phút và NaClO
10% trong 2 lần x 20 phút.
2.2. Phát sinh và nhân callus
- Môi trường N6D: N6 + 2 mg/l 2,4D +
3000 mg/l proline + 300 mg/l Casein + 3%
đường + 0,3% phytagel).
- Sau 10 ngày các callus được tách ra
và chuyển vào các môi trường sau:
+ LD: Môi trường MS (Murashige and
Skoog, 1962) bổ sung 3% đường, 0,3%
phytagel, 100 ml/l nước dừa và các loại
vitamin, casein,

+ N6D: Môi trường N6 (Chu, 1978) bổ
sung 3% đường, 0,3% phytagel và các loại
vitamin, nước dừa, casesin,

Công thức
thí nghiệm
2,4D (mg/ml)
Casein
(mg/ml)
Thiamin
(mg/ml)
Tryptophan
(mg/ml)
Proline (mg/ml)

LD1 1,5 300 10 0 0
LD2 2 300 10 0 0
LD3 2 0 0 50 0
LD4 2 300 0 0 3000
LD5 2,5 300 10 0 0
LD6 2,5 0 0 50 0
LD7 2,5 500 0 0 500
LD8 3 300 10 0 0

Công thức
thí nghiệm

2,4D
(mg/ml)
Casein

(mg/ml)
Tryptophan
(mg/ml)
Proline
(mg/ml)
Glutamin
(mg/ml)
Asparagin
(mg/ml)
Nước dừa
(ml/l)
N6D 2 300 0 3000 0 0 0
N6D1 1,5 0 0 0 100 100 100
N6D2 2,5 0 0 0 0 0 100
N6D3 3,0 0 100 0 0 0 0
N6D4 3,5 300 0 3000 0 0 0

2.3. Tái sinh chồi và tạo cây hoàn chỉnh
Callus lúa được nuôi cấy trên môi
trường nhân callus sau 4 tuần được cấy
chuyển sang môi trường tái sinh và tạo chồi.

Công thức
thí nghiệm
BAP
(mg/ml)
Kinetin
(mg/ml)
NAA
(mg/ml)

Công thức
thí nghiệm
BAP
(mg/ml)
Kinetin
(mg/ml)
NAA
(mg/ml)
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam

3
A1 2,0 1,0 0,1 BL5 3,5 0 0
A2 2,0 0 0,5 BL6 4,0 0 0
A3 2,5 0 0,5 K1 0 1,0 0
A4 2,0 0 0,1 K2 0 1,5 0
BL1 1,5 0 0 K3 0 2,0 0
BL2 2,0 0 0 K4 0 2,5 0
BL3 2,5 0 0 K5 0 3,0 0
BL4 3,0 0 0
III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
1. Kết quả vào mẫu nuôi cấy in vitro
Trong thí nghiệm vào mẫu in vitro,
chúng tôi sử dụng 2 hóa chất khử trùng hạt
khác nhau là HgCl
2
và NaClO và đánh giá 2
chỉ tiêu là mức độ nhiễm và mức độ phát
triển callus từ hạt trưởng thành. Kết quả ở
Bảng 1 cho thấy phương pháp khử trùng
bằng HgCl

2
cho tỷ lệ nhiễm thấp hơn so với
phương pháp khử trùng bằng NaClO (2,0 ±
0,5% ở KDĐB so với 9,0 ± 1,5%; 2,5 ±
0,5% ở DT22 so với 7,0 ± 5,0%) nhưng tỷ
lệ tạo callus ở phương pháp này lại thấp
hơn so với khi khử trùng bằng NaClO (65,0
± 2,0% so với 77,0 ± 0,5% ở KDĐB; 74,0 ±
2,0% so với 86,0 ± 1,5% ở DT22. Sử dụng
HgCl
2
để khử trùng mẫu cho tỷ lệ nhiễm
thấp thích hợp khi thiết lập mẫu in vitro với
số lượng mẫu nhỏ. Tuy nhiên, khi sử dụng
số lượng mẫu lớn, chúng tôi khuyến cáo
nên sử dụng NaClO với mục đích thân thiện
hơn với môi trường.
Bảng 1. Kết quả vào mẫu in vitro
Hóa chất
khử trùng

KDĐB DT22
Số lượng mẫu Tỷ lệ nhiễm

Tỷ lệ tạo
callus
Số lượng mẫu

Tỷ lệ nhiễm
Tỷ lệ tạo

callus
HgCl2 500 2,0 ± 0,5% 65,0 ± 2,0% 500 2,5 ± 0,5% 74,0 ± 2,0%
NaClO 500 9,0 ± 1,5% 77,0 ± 0,5% 500 7,0 ± 5,0% 86,0 ± 1,5%

2. Đánh giá sự phát sinh và nhân callus
Quá trình thiết lập mẫu nuôi cấy in
vitro ban đầu sử dụng môi trường N6D
(N6D: N6 + 2 mg/l 2,4D + 3000 mg/l
proline + 300 mg/l casein + 3% đường +
0,3% phytagel). Môi trường N6 bổ sung
2 mg/l 2,4D thường được sử dụng trong
nuôi cấy mô lúa và để tạo callus từ phôi
trưởng thành. Tuy nhiên chúng tôi bổ sung
thêm casein và proline nhằm tăng cường
khả năng tạo callus và sử dụng phytagel
thay vì sử dụng agar-agar. Callus được hình
thành sau 10 ngày nuôi cấy in vitro được
tách ra và tiến hành đánh giá khả năng nhân
callus khi sử dụng các môi trường nhân
callus khác nhau. Khả năng nhân callus
được đánh giá và cho điểm theo thang (+);
(++); (+++); (++++), căn cứ vào khả năng
nhân callus tăng dần.
Bảng 2. Cho điểm và đánh giá khả năng nhân callus trên nền môi trường MS
Môi trường

Giống
LD1 LD2 LD3 LD4 LD5 LD6 LD7 LD8
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam

4
DT22 + ++ ++ +++ ++ ++ + ++
KDĐB + ++ ++ ++ ++ ++ + ++
Bảng 3. Cho điểm và đánh giá khả năng nhân callus trên nền môi trường 6
Môi trường

Giống
N6D N6D1 N6D2 N6D3 N6D4
DT22 ++++ ++ +++ ++ ++
KDĐB +++ ++ +++ ++ ++
Trong các nồng độ 2,4D được sử dụng
ở cả 2 công thức môi trường, thì nồng độ 2
mg/l 2,4D cho khả năng tạo callus cao nhất
ở cả 2 giống DT22 và KDĐB. Nồng độ này
đã được sử dụng nhiều trong các thí nghiệm
tạo callus. Điều đó gợi ý rằng, các giống lúa
có khả năng tạo callus cao nhất khi nồng độ
2,4D ngoại sinh được bổ sung trong môi
trường nuôi cấy là 2 mg/l. Do vậy, nồng độ
2 mg/l 2,4D có bổ sung các hợp chất như
casein (300 mg/l) và proline (3000 mg/l) có
thể áp dụng để tạo và nhân callus cho các
thí nghiệm tạo callus phục vụ kỹ thuật tái
sinh và chuyển gen.




Ảnh 1. Mẫu lúa DT22 và KDĐB trên môi trường phát sinh và nhân callus
Trong một số tài liệu, môi trường MS

được cho là có hiệu quả cao hơn so với N6
để tạo callus (A.S.M.T. Bayawickrama và
Toyoaki Anai, 2006). Nhưng kết quả thu
được của chúng tôi chứng minh điều ngược
lại. Trong mọi nồng độ 2,4D khác nhau, môi
trường N6 cho kết quả tạo callus cao hơn so
với MS tương ứng. Vì thế chúng tôi cho
rằng các giống lúa khác nhau có thể có phản
ứng khác nhau trong điều kiện dinh dưỡng
có nhiều khác biệt. Việc sử dụng cả 2 loại
môi trường để tạo callus ở lúa sẽ giúp các
nhà khoa học tìm ra được môi trường thích
hợp nhất trong công tác nghiên cứu này.
3. Kết quả tái sinh cây từ callus
Trong các tổ hợp các chất điều hoà sinh
trưởng được sử dụng, BAP và kinetin thuộc
nhóm cytokinin được kết hợp hoặc không
kết hợp với NAA thuộc nhóm auxin. Dựa
vào đánh giá về mặt hình thái, BAP cho khả
năng tạo chồi tái sinh ở các nồng độ khác
nhau cao hơn so với kinetin.

KDĐB
KDĐB
DT22
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam

5

Ảnh 2. Mẫu lúa tái sinh của giống DT22 và KDĐB

Ở nồng độ BAP 2 mg/l khả năng tạo
chồi và chất lượng các chồi được tạo thành
tốt nhất. Ở môi trường BL2 (2 mg/l BAP),
giống DT22 phản ứng tốt hơn so với giống
KDĐB với hình thái cụm chồi xanh, khoẻ và
đồng nhất. Tỷ lệ tạo chồi trung bình là
74,1% đối với giống DT22 và 66,1% đối với
giống KDĐB. Đây cũng là môi trường cho
tỷ lệ tạo chồi cao nhất so với các môi trường
còn lại được sử dụng để tái sinh giống
DT22. Với các tổ hợp môi trường có bổ
sung thành phần kinetin thì ở nồng độ 2 mg/l
kinetin khả năng tạo chồi và tỷ lệ tạo chồi
cũng cao nhất trong cả 2 giống được nghiên
cứu. Tuy nhiên, xét trên cả 2 tiêu chuNn là tỷ
lệ tạo chồi và chất lượng chồi được tạo thành
đều không cao bằng sử dụng môi trường với
nồng độ 2 mg/lBAP. Tỷ lệ tạo chồi chỉ đạt
cao nhất là 58,4% đối với giống DT22 ở môi
trường K3 (2 mg/l kinetin) (bảng 4). Trong
khi đó, cũng với môi trường này, tỷ lệ tạo
chồi của giống KDĐB chỉ đạt được là
53,7%. Chất lượng chồi tạo thành cũng
không cao khi chồi thường bị xoăn, yếu và
có tạo rễ. Vì vậy, trong tái sinh cây của 2
giống DT22 và KDĐB sử dụng môi trường
tái sinh với chất kích thích sinh trưởng là
BAP sẽ cho hiệu quả cao hơn môi trường có
sử dụng kinetin. Sự khác biệt là đối với môi
trường tái sinh A4 có bổ sung BAP 2 mg/l,

giống KDĐB có khả năng tạo cụm chồi
xanh, đồng nhất và khoẻ hơn khi trong môi
trường có kết hợp với NAA nồng độ
0,1 mg/l. Do vậy, môi trường thích hợp để
tái sinh giống DT22 là môi trường BL2 có
bổ sung 2 mg/l BAP còn môi trường A4 có
bổ sung 2 mg/l BAP và 0,1 mg/lNAA thích
hợp để tái sinh giống KDĐB.
Bảng 4. Đánh giá tỷ lệ tái sinh cây từ callus và hình thái chồi
Môi trường

Tỷ lệ tái sinh và tạo chồi (%)
DT22 KDĐB
(%) Hình thái chồi (%) Hình thái chồi
A1 60,3 ± 3,2 Cụm chồi xanh, khoẻ 57,1 ± 1,8 Cụm chồi xanh, khoẻ
A2 66,1 ± 2,6 Cụm chồi xanh, khoẻ,
có tạo rễ
61,4 ± 2,7 Cụm chồi xanh, vừa phải,
xuất hiện nhiều rễ
A3 67,2 ± 3,0 Cụm chồi xanh, khoẻ,
có tạo rễ
60,4 ± 2,8 Cụm chồi xanh, vừa phải,
xuất hiện nhiều rễ
A4 70,1 ± 1,8 Chồi xanh, khoẻ 72,6 ± 1,1 Cụm chồi xanh, đồng nhất, khoẻ
BL1 68,3 ± 2,0 Chồi xanh, thẳng, sức sống
trung bình
64,6 ± 1,5 Chồi xanh, thẳng, sức sống
trung bình
BL2 74,1 ± 2,5 Cụm chồi xanh, đồng nhất, 66,1 ± 3,1 Chồi xanh, thẳng, sức sống
DT22

KDĐB
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam

6
khoẻ trung bình
BL3 71,4 ± 3,3 Cụm chồi xanh, đồng nhất,
khoẻ
65,8 ± 2,3 Chồi xanh, thẳng, sức sống
trung bình
BL4 69,9 ± 2,1 Chồi xanh, nhỏ, yếu 63,7 ± 1,9 Cụm chồi xanh, kích thước vừa,
yếu
BL5 66,4 ± 1,5 Chồi xanh, xoăn, yếu 61,8 ± 2,7 Chồi xanh, kích thước vừa, yếu
BL6 64,2 ± 3,0 Chồi xanh, xoăn, yếu 60,3 ± 2,9 Chồi xanh, kích thước vừa, yếu
K1 49,7 ± 3,0 Chồi xanh, ngắn, yếu 52,7 ± 2,3 Chồi xanh, xoăn, yếu
K2 51,0 ± 2,2 Chồi xanh, ngắn, yếu 54,6 ± 1,2 Chồi xanh, ngắn, yếu
K3 53,7 ± 1,4 Chồi xanh, dài, khoẻ 58,4 ± 1,6 Chồi xanh, dài, khoẻ
K4 50,8 ± 2,2 Chồi xanh, ngắn, có rễ 54,1 ± 2,3 Chồi xanh, mảnh, yếu
K5 49,1 ± 1,6 Chồi xanh, mảnh, xoắn, có rễ

52,2 ± 3,1 Chồi xanh, mảnh yếu, có rễ

IV. KẾT LUẬN
1. Hiệu quả khử trùng tốt nhất đối với
giống DT22 và KDĐB là sử dụng
NaClO 10% trong thời gian 20 phút;
2. Môi trường tạo callus thích hợp cho 2
giống DT22 và KDĐB là: N6 + 2 mg/l
2,4D + 3000 mg/l proline + 300 mg/l
casein + 3% đường + 0,3% phytagel
3. Môi trường tái sinh giống DT22: Môi

trường cơ bản MS (đa lượng, vi lượng,
vitamin) + 2 mg/l BAP + 100 mg/l nước
dừa + 8 g/l agar + 30 g/l đường;
4. Môi trường tái sinh giống KDĐB: Môi
trường cơ bản MS (đa lượng, vi lượng,
vitamin) + 2 mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA
+ 100 mg/l nước dừa + 8 g/l agar + 30
g/l đường.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Đỗ Hữu Ất, Bùi Huy Thuỷ, Trần Duy
Quý, guyễn Minh Công, 2001. ″Cải
tiến giống lúa thuần chất lượng nhập nội
bằng phương pháp đột biến thực
nghiệm”. Kết quả nghiên cứu khoa học
(2000-2001). Viện Di Truyền Nông
nghiệp, Bộ NN & PTNT.
2 A.S.M.T. Abayawickrama and Toyoaki
Anai, 2006. Coparison of Regeneration
Efficiency of Different Genotype of
Indica Rice cultivars. Bull. Fac. Agr.,
Saga Univ. 92: 17-23.
3 Bhaskaran S, Smith RH., 1988.
Enhanced somatic embryogenesis in
Sorghum biocolor L. from shoot tip
culture. In vitro Cell Dev. Biol.
24:65-70.
4 Hossain, M.A. and M. asreen., 1997.
In vitro regeneration of six Indica rice
cultivars. Bangladesh J. Biochem., 3:
95-98.

5 Kyozuka J, Otoo E, et al., 1988. Plant
regeneration from protoplast of
Indica rice: genotype differences in
culture response. Theor. Appl. Genet.
76:887-890.
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam

7
6 Toki S., 1997. Rapid and efficient
Agrobacterium-mediated transformation
of rice. Pl. Mol. Biol. Rep. 15: 16-21.
gười phản biện: GS.TSKH. Trần Duy Quý
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam
8