Phân lập và tuyển chọn các chủng vi nấm có khả năng chịu mặn thu thập tại Cần Giờ

Tuyển tập Hội nghị Nấm học Toàn quốc lần thứ 4
doi: 10.15625/vap.2022.0137

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI NẤM CÓ
KHẢ NĂNG CHỊU MẶN THU THẬP TẠI CẦN GIỜ
Nguyễn Thị Thùy Dương1*, Phạm Thị Anh Thư2, Trần Chí Hiếu1, Đạo Nữ Diệu Hồng1,
Lê Thị Huỳnh Trâm1, Nguyễn Đăng Quân1, Hà Thị Loan1
1

Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh

2

*Email:
TĨM TẮT
Tình hình xâm nhập mặn đang có chiều hướng gia tăng và việc nghiên cứu về những chủng nấm có khả
năng chịu mặn là rất cần thiết. Từ 12 mẫu đất thu thập, phân lập trên môi trường thạch dichloran rose bengal
chloramphenicol (DRBC) được 22 chủng vi nấm, tiến hành phân loại sơ bộ có 21 chủng được phân loại đến
chi gồm (Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, Pythium, Geotrichum) và 01 chủng được định danh đến loài
là Rhizoctonia solani. Khảo sát khả năng chịu mặn ở nồng độ 3 % và 5 %, ở nồng độ 7 % (NaCl) và lựa
chọn chủng chịu mặn tốt phục vụ các nghiên cứu tiếp theo, kết quả khảo sát tất cả chủng phân lập đều chịu
được độ mặn 3 % và 5 %, ở nồng độ 7 % (NaCl) có 03 chủng chịu được độ mặn (NaCl) tốt là CG1.1.2,
CG4.2.3 và CG5.1.1. Sau quá trình định danh hình thái và sinh học phân tử ghi nhận 2 chủng CG1.1.2,
CG4.2.3 tương đồng với loài Trichoderma caribbaeum và CG5.1.1 tương đồng Rhizoctonia solani. Chi
Trichoderma được ứng dụng rất phổ biến trong sản xuất chế phẩm sinh học, hai chủng CG1.1.2, CG4.2.3 có
thể được xem xét cho những nghiên cứu ứng dụng trong lĩnh vực nơng nghiệp.
Từ khố: Vi nấm, chịu mặn, Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, Cần Giờ.

1. GIỚI THIỆU

Trong điều kiện biến đổi khí hậu, sự nóng lên tồn cầu và tình trạng thiếu nước trên khu vực
thượng nguồn sơng Mekong làm cho tình hình xâm nhập mặn rất nghiêm trọng ở các tỉnh Đồng
bằng sông Cửu Long. Xâm nhập mặn làm đất trồng nhiễm mặn, diện tích sản xuất nơng nghiệp
ngày càng thu hẹp. Trước tình hình xâm nhiễm mặn vào đất trồng trọt làm tăng độ mặn trong đất,
cần có những biện pháp sống chung với điều kiện này. Ngoài việc chọn giống cây trồng có khả
năng chịu mặn thì việc phân lập các vi sinh có khả năng chịu mặn để tiến đến sản xuất chế phẩm
sinh học ứng dụng làm giảm độ mặn trong đất là một hướng đi cần thiết. Các nghiên cứu từ 2017
đến nay đa số tập trung vào các chủng vi khuẩn bản địa và loại cây trồng cụ thể như: phân lập dòng
vi khuẩn Burkholderia sp. BL1-10 chịu mặn từ nền đất lúa [1], nhận diện Bacillus megaterium và
dòng Bukholderia cenocepacia chịu được độ mặn muối 10 ‰ [2], phân lập chủng vi khuẩn
Pseudomonas oryzihabitans có khả năng chịu được mặn với nồng độ NaCl >5 % và Burkholderia
sp. chịu được NaCl 3 % [3], phân lập 7 chủng vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas từ Bến Tre, có khả
năng sống trong điều kiện mặn [4]; có rất ít nghiên cứu về các chủng nấm mốc có khả năng chịu
mặn. Nghiên cứu này tập trung vào mục tiêu phân lập và chọn lựa những chủng vi nấm có khả
năng chịu mặn cao tạo tiền đề cho những nghiên cứu tiếp theo.

69


Nguyễn Thị Thùy Dương và cs.

2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vị trí mẫu thu
Rừng ngập mặn Cần Giờ có điều kiện môi trường rất đặc biệt, là hệ sinh thái trung gian giữa
hệ sinh thái thủy vực với hệ sinh thái trên cạn, hệ sinh thái nước ngọt và hệ sinh thái nước mặn. Ở
đây có hệ sinh thái đa dạng phong phú, điều kiện khí hậu khắc nghiệt đã làm cho sinh vật cũng như
nấm sợi có tính thích nghi cao và tạo ra sản phẩm trao đổi chất đặc biệt hơn so với điều kiện khác
là một nơi lý tưởng để thu mẫu và phân lập các chủng nấm mốc. Tiến hành thu 12 mẫu đất tại 6 vị
trí thuộc huyện Cần Giờ, Thành phố Hồ Chí Minh. Địa điểm thu mẫu được ghi lại bằng định vị
GPS.

Hình 1. Vị trí các điểm thu mẫu

Cách thu mẫu: Tiến hành 1 kg đất ở độ sâu 5 cm so với mặt đất, thu mẫu nơi có cây cối sinh
trưởng. Ký hiệu mẫu từng vị trí lấy mẫu, lưu ở 4 oC đến khi phân lập.
2.2. Phương pháp phân lập
Cân 10 g đất cho vào bình tam giác chứa 90 mL dung dịch nước muối sinh lý (9 o/oo) đã được
thanh trùng. Đặt bình tam giác chứa mẫu và máy lắc, điều chỉnh thơng số 150 vịng/ phút, lắc trong
1 giờ và để yên 30 phút. Tiến hành pha loãng dãy các nồng độ 100, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4,… Hút
100 µL dịch ở từng nồng độ pha lỗng trải đều lên đĩa Petri chứa môi trường thạch dichloran rose
bengal chloramphenicol (DRBC) (TCVN 11039-8:2015) [5]. Các đĩa này được ủ ở nhiệt độ phòng
2 - 5 ngày, quan sát và tách từng loại khuẩn lạc nấm sang môi trường PDA.
2.3. Phương pháp định danh bằng hình thái
Các mẫu phân lập được tiến hành khảo sát hình thái khuẩn lạc 5 - 10 ngày tuổi ghi nhận màu
sắc, hình thái đại thể, vi thể.
Phương pháp làm tiêu bản quan sát vi thể: hấp khử trùng đĩa petri có chứa giấy thấm, lame,
lamelle ở 121 oC, 20 phút. Cắt miếng thạch môi trường PDA có thể tích 1 cm3 đặt lên miếng lame,
cấy vi nấm xung quanh miếng thạch đậy lamelle, nhỏ nước cất vô trùng vào giấy thấm, đậy nắp đĩa
petri lại và ủ trong 72 giờ. Sau khi ủ, dùng kẹp vô trùng gắp nhẹ lamelle đặt lên một miếng lame

70


Phân lập và tuyển chọn các chủng vi nấm có khả năng chịu mặn thu thập tại Cần Giờ

khác có chứa 1 giọt nước cất thanh trùng và xem hình thái vi thể dưới kính hiển vi (độ phóng đại
40X, 63X, 100X). Dựa vào các khóa phân loại nấm tiến hành phân loại dựa vào vi thể và đại thể.
2.4. Khảo sát khả năng chịu mặn của mẫu phân lập
Cấy 3 điểm theo hình tam giác đều tương ứng với ba lần lặp lại của nghiệm thức thí nghiệm
[6] trên đĩa môi trường PDA bổ sung thêm NaCl theo ba tỷ lệ khác nhau 3 %, 5 %, 7 % [7]. Đem ủ

ở nhiệt độ phòng sau 7 ngày sẽ đo đường kính phát triển theo cơng thức D - d (mm), trong đó: D là
đường kính khuẩn lạc, d là đường kính tản nấm cấy vào.
Kết quả ghi nhận sẽ được phân tích ANOVA bằng phần mềm SAS để chọn ra 3 chủng có khả
năng chịu mặn tốt nhất.
2.5. Phương pháp định danh bằng kỹ thuật sinh học học phân tử đối với các mẫu phân lập có
khả năng chịu mặn cao
Ly trích DNA theo phương pháp Kosuke (2012) [8]. Khuyết đại vùng ITS-rDNA của các
dòng nấm phân lập được. Sử dụng cặp mồi ITS5 (GGA AGT AAAAGTCGTAACAAGG) và LR5
(TCCTGAGGGAAACTTCG). Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 0,8 % để kiểm tra kết
quả. Sau đó, tinh sạch sản phẩm PCR bằng kit Isolate II PCR và gel Kit của Bioline. Sản phẩm sau
khi tinh sạch được giải trình tự.
Phân tích phả hệ: Dựa vào trình tự nucleotide thu được, tìm kiếm các trình tự gần gũi bằng
cơng cụ BLAST tại NCBI (National Center for Biotechnology Information). Phương pháp phân
tích trình tự và phả hệ được thực hiện với các phần mềm MEGA 6.0.
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả phân lập các mẫu đất thu ở Cần Giờ
Từ 12 mẫu đất (CG1.1, CG1.2, CG2.1, CG2.2, CG3.1, CG3.2, CG4.1, CG4.2, CG5.1, CG5.2,
CG6.1, CG6.2) thu được 6 vị trí thuộc huyện Cần Giờ, TP. HCM phân lập được 22 mẫu phân lập
(MPL) nghi ngờ là nấm mốc ký hiệu ở Bảng 1.
Bảng 1. Các mẫu nấm mốc phân lập từ đất thu ở Cần Giờ
STT
1
2
3
4
5
6
7
8

MPL
CG6.1.2
CG1.1.2
CG4.2.1
CG4.2.3
CG5.1.2
CG6.2.2
CG2.1.2
CG2.1.1

STT
9
10
11
12
13
14
15
16

MPL
CG4.2.2
CG1.1.1
CG2.2.1
CG5.2
CG1.2.2
CG6.1.1
CG6.2.1
CG5.1.1

STT
17
18
19
20
21
22

MPL
CG3.2.2
CG3.1.2
CG1.2.1
CG4.1
CG2.2.2
CG3.1.1

3.2. Kết quả định danh các mẫu phân lập bằng đặc điểm hình thái
Dựa vào khóa phân loại Barnet & Hunter (1998) [9], quan sát sự phát triển của các khuẩn
lạc, màu sắc, hình thái bào tử, cành bào đài dưới kính hiển vi, phân loại 22 chủng ở Bảng 1 như

71


Nguyễn Thị Thùy Dương và cs.

sau: 21 chủng được phân loại đến chi gồm (Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, Pythium,
Geotrichum) và 1 chủng được định danh đến loài là Rhizoctonia solani [10].
Bảng 2. Hình ảnh đại thể, vi thể của các chủng phân lập

STT

72

Nhóm

1

Aspergillus sp.

2

Penicillium sp.1

3

Penicillium sp.2

4

Penicillium sp.3

5

Penicillium sp.4

6

Penicillium sp.5

7

Pythium sp.1

8

Pythium sp.2

Khuẩn lạc

Vi thể


Phân lập và tuyển chọn các chủng vi nấm có khả năng chịu mặn thu thập tại Cần Giờ

9

Trichoderma sp.

10

Geotrichum sp.

11

Rhizoctonia
solani
Bảng 3. Bảng phân nhóm các chủng nấm mốc từ 6 mẫu đất
Vị trí

STT

1

2

1

1
1

3

4

1
2

1

5

6

1

4

Tổng

Phân nhóm

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11

Aspergillus sp.
Penicillium sp.1
Penicillium sp.2
Penicillium sp.3
Penicillium sp.4
Penicillium sp.5
Pythium sp.1
Pythium sp.2
Trichoderma sp.
Geotrichum sp.
Rhizoctonia solani

1
1
1
1
1
2

1
1
1

2
9
1
1
1
1
1
1
3
1
1

Hình 2. Biểu đồ phần trăm các chủng nấm mốc phân lập

73


Nguyễn Thị Thùy Dương và cs.

Theo ghi nhận tổng hợp về phân loại thì nhóm Penicillium chiếm ưu thế (59 %) xuất hiện phổ
biến trong các mẫu đất thu thập, tiếp theo là Trichoderma và Aspergillus.
3.3. Kết quả khảo sát khả năng chịu mặn của mẫu phân lập
Sau khi nuôi cấy và ghi nhận đường kính phát triển của khuẩn lạc nấm trên đĩa môi trường
PDA bổ sung NaCl theo ba tỷ lệ 3 %, 5 %, 7 %, chúng tôi quan sát thấy rằng ở nồng độ muối càng
cao thì hạn chế khả năng phát triển của nấm mốc. Các chủng nấm mốc có những biến đổi về đặc

điểm hình thái như đặc điểm sợi nấm thay đổi, tạo nhiều bào tử hơn khi nồng độ muối tăng. Quá
trình quan sát sự phát triển của khuẩn lạc trên đĩa mơi trường và phân tích số liệu về đường kính
phát triển của khuẩn lạc cho thấy ở nồng độ 3 % các chủng nấm vẫn phát triển chưa ảnh hưởng
nhiều. Ở nồng độ muối 7 % sự phát triển của các chủng nấm phân lập khác biệt rõ rệt, có chủng
(CG2.1.2) khuẩn lạc khơng phát triển, trong đó 3 chủng (CG1.1.2, CG4.2.3, CG5.1.1) có khả năng
phát triển tốt hơn những chủng còn lại từ kết quả phân hạng (Bảng 4). Tiến hành định danh đến loài
03 chủng CG1.1.2, CG4.2.3, CG5.1.1 bằng phương pháp sinh học phân tử.
Bảng 4. Đường kính phát triển của các chủng phân lập trên những nồng độ mặn khác nhau

74

STT

MPL

Độ mặn 3 %

Độ mặn 5 %

Độ mặn 7 %

1

CG6.1.2

8,54jk

6,87ji

6,69ghij

2

CG1.1.2

61,99a

34,61cd

31 ,15a

3

CG4.2.1

11,64hij

9,26ijh

9,11defg

4

CG4.2.3

59,99ab

50,21a

27,74ab

5

CG5.1.2

27,09ef

15,81fg

11,15d

6

CG6.2.2

6,41k

8,26ijh

5,5eijk

7

CG2.1.2

28,25e

10,58ij

0,00l

8

CG2.1.1

13,18hi

12,78gh

10,83de

9

CG4.2.2

38,55d

32,14d

9,57def

10

CG1.1.1

7,31k

6,07j

3,96k

11

CG2.2.1

14,51h

11,98gh

8,33efg

12

CG5.2

10,06ijk

6,66j

5,62hijk

13

CG1.2.2

23,67fg

20,89e

18,82c

14

CG6.1.1

10,4ijk

7,68hij

7,19fghi

15

CG6.2.1

8,33ij

6,54j

4,78jk

16

CG5.1.1

56,24bc

39,07bc

32,26a

17

CG3.2.2

13,87hi

9,71hij

7,63fghi

18

CG3.1.2

20,84g

16,83efg

7,74fgh

19

CG1.2.1

57,51bc

35,79cd

32,00a

20

CG4.1

21,54g

19,10ef

25,03b

21

CG2.2.2

54,30c

40,59b

24,23b

22

CG3.1.1

10,42ijk

9,59hij

7,61fghi

CV (%)

8,60

14,67

6,61

P

<0,0001

<0,0001

<0,0001


Phân lập và tuyển chọn các chủng vi nấm có khả năng chịu mặn thu thập tại Cần Giờ

Bảng 5. Hình thái khuẩn lạc của ba chủng chịu mặn tốt nhất

MPL

Độ mặn 3 %

Độ mặn 5 %

Độ mặn 7 %

CG1.1.2

CG4.2.3

CG5.1.1

3.4. Kết quả định danh các mẫu phân lập có khả năng chịu mặn cao
Dựa vào các trình tự tương đồng sau BLAST trên Ngân hàng gen NCBI (National Center for
Biotechnology Information) và vẽ cây phát sinh loài ghi nhận chủng CG1.1.2 và CG4.2.3 có mối
tương đồng và có quan hệ gần với Trichoderma caribbaeum, chủng CG 5.1.1 có mối tương đồng
và có quan hệ gần Rhizoctonia solani.
Nhiều chủng từ chi Trichoderma đã được nghiên cứu ứng dụng đối kháng với những loài nấm
gây hại cây trồng. Trichoderma atroviride cũng được nhóm tác giả Trung Quốc phân lập từ bùn lấy
từ ở biển và chứng minh có thể giảm được ảnh hưởng nồng độ muối (200 mM NaCl) đến sự phát
triển của rễ cây dưa leo [7]. Việc sàng lọc và phân lập được 2 chủng Trichoderma caribbaeum tạo
tiền đề khả quan cho những nghiên cứu tiếp theo.

75


Nguyễn Thị Thùy Dương và cs.

Hình 3. Cây phát sinh loài của chủng nấm CG 1.1.2, CG 4.2.3 và CG5.1.1 với các lồi có quan hệ
họ hàng dựa trên phân tích trình tự

4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Từ 12 mẫu đất thu thập phân lập được 22 chủng vi nấm và tiến hành phân loại sơ bộ có 21
chủng được phân loại đến chi gồm (Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, Pythium, Geotrichum)
và 01 chủng được định danh đến loài là Rhizoctonia solani. Từ kết quả khảo sát về độ chịu mặn của
các chủng nấm phân lập tất cả chủng phân lập đều chịu được độ mặn 3 % và 5 %, ở nồng độ 7 %

(NaCl) có 03 chủng chịu được độ mặn (NaCl) tốt là CG1.1.2, CG4.2.3 và CG5.1.1. Sau quá trình
định danh hình thái và sinh học phân tử ghi nhận 2 chủng CG1.1.2, CG4.2.3 tương đồng với loài
Trichoderma caribbaeum và CG5.1.1 tương đồng Rhizoctonia solani.

76


Phân lập và tuyển chọn các chủng vi nấm có khả năng chịu mặn thu thập tại Cần Giờ

Chi Trichoderma được ứng dụng rất phổ biến trong sản xuất chế phẩm sinh học phục vụ nông
nghiệp. Tiếp tục nghiên cứu đánh giá về các chủng được lựa chọn hướng tới sản xuất chế phẩm làm
giảm độ mặn trong đất.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1]. Nguyễn Khởi Nghĩa & Nguyễn Thị Kiều Oanh (2017). Phân lập và tuyển chọn dòng vi khuẩn
chịu mặn có khả năng hịa tan lân từ nền đất lúa trong mơ hình canh tác lúa - tơm tại một số
tỉnh đồng bằng sơng Cửu Long. Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 15(1), 121-131.
[2]. Nguyễn Anh Huy & Nguyễn Hữu Hiệp (2018). Phân lập và nhận diện các dòng vi khuẩn chịu
mặn có khả năng cố định đạm và tổng hợp IAA từ đất sản xuất lúa - tôm ở Bạc Liêu, Sóc
Trăng và Kiên Giang. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 54(1B), 7-12.
[3]. Nguyễn Đức Thành, Nguyễn Thế Quyết, Hà Viết Cường & Phạm Xuân Hội (2020). Phân lập,
định danh chủng vi khuẩn chịu mặn, có hoạt tính phân giải lân vơ cơ cho Đồng bằng sơng
Cửu Long. Tạp chí Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam, 62(2), 49-53.
[4]. Chu Nguyên Thanh, Phạm Văn Nhựt Tiếng, Bùi Văn Lệ & Hoàng Thị Thanh Minh (2020).
Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Pseudomonas có khả năng kích thích tăng trưởng cây đậu
phộng (Arachis hypogaea L.) ở điều kiện mặn. Sci. Tech. Dev. J. - Nat. Sci., 4(1), 347-356.
[5]. Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 11039-8:2015. Phụ gia thực phẩm-Phương pháp phân tích vi sinh
vật-Phần 8: Định lượng nấm men và nấm mốc.
[6]. Jiang. H., Qi, P., Wang, T., Wang, M., Chen, M., Chen, N., Pan, L., Chi, X. (2018). Isolation
and characterization of halotolerant phosphate-solubilizing microorganisms from saline soils.
3 Biotech, 8(11), 461

[7]. Zhang, C., Wang, W., Hu, Y., Peng, Z., Ren, S., Xue, M., Liu, Z., Hou, J., Xing, M., Lui, T.
(2022). A novel salt-tolerant strain Trichoderma atroviride HN082102.1 isolated from marine
habitat alleviates salt stress and diminishes cucumber root rot caused by Fusarium oxysporum,
BMC Microbiolog 22, 67.
[8]. Kosuke, I., Kanako, H., Takuya, S., Yuki, K., Atsushi, M., Abdul, G., … & Chihiro, T.
(2012). Rapid and simple preparation of mushroom DNA directly from colonies and fruiting
bodies for PCR, Mycoscience 53, 396-401.
[9]. Barnett, H. L., & Hunter, B. B. (1972). Illustrated genera of imperfect fungi. Illustrated genera
of imperfect fungi, (3rd ed).
[10]. Lakshman, D. K., Jambhulkar, P. P, Singh, V., Sharma, P., Mitra, A. (2016). Molecular
identification, genetic diversity, population genetics and genomics of Rhizoctonia solani.
Perspectives of Plant Pathology in genomic era, 55-89.

77


Nguyễn Thị Thùy Dương và cs.

ABSTRACT

ISOLATION AND SELECTION OF FUNGUS SPECIES ABLE TO BE
SALT-TOLERANT COLLECTED IN CAN GIO DISTRICT
Nguyen Thi Thuy Duong1*, Pham Thi Anh Thu2, Tran Chi Hieu1, Dao Nu Dieu Hong1,
Le Thi Huynh Tram1, Nguyen Dang Quan1, Ha Thi Loan1
1

Biotechnology Center of Ho Chi Minh City

2

University of Science, Vietnam National University Ho Chi Minh City
*Email:

The situation of saltwater intrusion is on the increasing trend and the study of salt tolerance fungus
strains is necessary. From 12 collected soil samples, 22 fungus strains were isolated in dichloran rose bengal
chloramphenicol medium (DRBC), having preliminarily classified, 21 fungus species classified to genus
were Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, Pythium, Geotrichum and 1 fungus strains classified to species
was Rhizotonia solani. Surveying on salt tolerance at 3 %, 5 % and 7 % concentration (NaCl) and selecting
well salt-tolerant strains for following studies, the result of surveying showed that all of the isolated species
could tolerate 3 % and 5 % salinity, at 7 % salinity (NaCl), 03 strains well salt-tolerant (NaCl) were CG1.1.2,
CG4.2.3 and CG5.1.1. After morphological and molecular identification process, 02 strains CG1.1.2,
CG4.2.3 were similar with Trichoderma caribbaeum and CG5.1.1 was similar with Rhizoctonia solani. The
genus Trichoderma is widely used in the bio-product, two strains CG1.1.2, CG4.2.3 can be considered
surveying for application in the agricultural field.
Keywords: Fungi, salt-tolerant, Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, Can Gio.

78