Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bảo vệ pa của vi khuẩn bacillus anthracis

Khóa
luận tốt nghiệp

mở đầu
Bệnh than là một căn bệnh nhiễm khuÈn cÊp
tÝnh do vi khuÈn Bacillus anthracis (B. anthracis) g©y
ra cho gia súc, đặc biệt là cho các động vật ăn cỏ nh
trâu, bò, dê cừu ngựa... Bệnh than có khả năng lây
nhiễm sang ngời thành dịch với tỷ lệ tử vong cao.
Bệnh có nhiều dạng biểu hiện khác nhau tuỳ theo cách
tiếp xúc với bệnh, nhng nhìn chung, bệnh than bao
gồm 4 dạng: than thể da, than thể hô hấp, than thể
tiêu hoá và than thể màng nÃo.
Bệnh than là một căn bệnh vô cùng nguy hiểm.
Nó mang một số đặc điểm đợc trung tâm kiểm soát
và ngừa bệnh Hoa Kỳ dùng để nhận biết các trờng hợp
có thể làm vũ khí sinh học nh thời gian lây nhiễm
nhanh, tỷ lệ gây chết cao, tác nhân gây bệnh có thể
chống chịu đợc với điều kiện khắc nghiệt. Chính vì
vậy, việc nghiên cứu phát hiện, chẩn đoán bệnh than
và tác nhân gây bệnh than là rất quan trọng
Kháng nguyên tái tổ hợp PA là một trong 3 loại độc
tố than của vi khuẩn Bacillus anthracis. PA là nhân tố
quyết định tính độc của vi khuẩn than. Bản thân PA
không gây độc nhng khi kết hợp với nhân tố gây chết
LF hay nhân tố gây phù thũng EF lại sinh sản độc tố
gây chết hoặc phù thũng cho tế bào vật chủ. Ngoài
ra, PA còn có chứa vùng liên kết thụ thể và có khả năng
gây đáp ứng miễn dịch chống bệnh than. Chính vì
vậy, hiện nay có nhiều nghiên cứu sử dụng kháng
Trang 04-04

3

Lê Thu


Khóa
luận tốt nghiệp
nguyên bảo vệ PA để tạo protein tái tổ hợp làm nguyên
liệu để tạo kit chuẩn đoán bệnh than cũng nh tạo
vaccine phòng chống bệnh than.
Trên thế giới hiện nay đà có rất nhiều công trình
công bố về việc biểu hiện gan pagA mà hoá kháng
nguyên bảo vệ PA. Tuy nhiên, ở Việt Nam đây vẫn là
vấn đề mới đang đợc quan tâm. Đáp ứng những yêu
cầu cấp bách trong phòng và trừ bệnh than, chúng tôi
tiến hành nghiên cứu đề tài:
Nghiên cứu biểu hiện gen mà hóa kháng nguyên bảo
vệ PA của vi khuẩn Bacillus anthracis
Mục tiêu của đề tài:

Biểu hiện protein PA của vi khuẩn B. anthracis
trong E . coli BL21,
 Thu nhËn protein PA với lợng lớn để tinh sạch.
Nhiệm vụ của đề tài:
ThiÕt kÕ vector biĨu hiƯn pET-TRX-FUS mang gen
pagA,
 Nghiªn cøu tạo chủng E. coli BL21 tái tổ hợp mang
gen pagA,
Tìm ra điều kiện thích hợp cho quá trình biểu

hiện về nhiệt độ, nồng độ IPTG, thời gian,

Tinh sạch đợc protein trên cột sắc kí ái lực
Probond Nikel Resin .

Trang 04-04

4

Lª Thu


Khóa
luận tốt nghiệp

Chơng I
Tổng quan tài liệu
I. Sơ lợc về bệnh than
1. Lịch sử xuất hiện và phát triển của bệnh
than
Bệnh than hay còn gọi là bệnh nhiệt thán, đà gây ra
những thiệt hại vô cùng to lớn cho ngành chăn nuôi gia súc
cũng nh làm ảnh hởng tới sức khoẻ con ngời. Vì thế mà nó đợc đặt tên là Black Bane nghĩa là thảm hoạ đen, vì khi bị
nhiễm bệnh, vết thơng có màu đen [1]. Bệnh Than bắt
nguồn từ Hy Lạp Anthrakos nghĩa là than, do vết thơng
trên da có màu đen. Bệnh than đợc tìm ra bởi John Bell vào
cuối thế kỷ 15.
Năm 1876, Robert Kock đà tìm ra nguốn gốc của bệnh
than và quả trình hình thành bào tử của vi khuẩn Bacillus
anthracis (B. anthracis).

Bệnh than thờng xuất hiện ở những trang trại vào một
thời điểm nhất định, đặc biệt là những vùng nông nghiệp
phía Nam Châu Mỹ và Châu Phi. Bệnh thờng gặp ở những
động vật ăn cỏ nh: cừu, dê, ngựa, trâu bò. Đặc biệt bệnh có
thể lây nhiễm sang ngời nên đợc coi là mối hiểm hoạ đe doạ
cho sức khoẻ cộng đồng.
Trận dịch Than đợc biết đến đầu tiên trong Lịch sử
xảy ra năm 1500 Trớc Công Nguyên làm chết nhiều vật nuôi
của ngời Ai Cập.

Trang 04-04

5

Lê Thu


Khóa
luận tốt nghiệp
Năm 1491 Trớc Công Nguyên, tiếp tục một cơn lốc bệnh
Than ở Ai Cập làm chết nhiều gia súc, và làm nóng lên sự
kiện bệnh Than.
Những năm 1960, bệnh than đà làm chết khoảng
60.000 gia súc ở Châu Âu.
Năm 1789, một trận dịch bệnh than lan tràn ở vùng
Tresnobin (Nga).
Tháng 4/1979, ở Sverdlovsk, Liên Xô nay là Ekatarinbua,
xảy ra một trận dịch than thể hô hấp làm chết 66 ngời [20].
Sau đó vài năm, một trận dịch tơng tự xảy ra ở Paraguay.
Năm 1989, ở miền Bắc xứ Wales xảy ra một trận dịch

than lớn. Ngời ta phải giết 4492 con gia súc bị nhiễm than và
áp dụng các biện pháp sát trùng chất thải, nhà cửa, thiết bị,
đờng xá, đất đai bằng fomalin.
Năm 1978- 1980, một trận dịch than ở Zimbabwe làm
hơn 6000 ngời bị nhiễm bệnh vµ 100 ngêi chÕt.
Sau sù kiƯn ngµy 11/9/2001, bän khđng bố sinh học đÃ
dùng bào tử của vi khuẩn B. anthracis tấn công một số bu
điện của Mỹ bằng các phong bì th làm 5 ngời chết và 17
ngời bị nhiễm bệnh [1]
Trận dịch Than gần đây nhất là ngày 14/6/2005 xảy ra
ở một quốc gia nhỏ ở Châu Phi làm chết 4 ngời và hơn 80
ngời bị nhiễm bệnh [27].
ë ViƯt Nam, bƯnh Than cịng ®· xt hiƯn tõ lâu nhng
ít đợc thông báo. Theo số liệu thống kê của Viện Vệ sinh
Dịch tễ Trung ơng, năm 1997 có 30 ngời mắc bệnh Than,
năm 1998 có 59 ngời, năm 1999 có 58 ngời. Riêng năm 2000
có 27 ngời mắc bƯnh than, trong ®ã cã 12 ca ë Cao B»ng,
Trang 04-04

6

Lª Thu


Khãa
ln tèt nghiƯp
11 ca ë Lai Ch©u, 4 ca ë Đồng Nai, tuy nhiên không có ca nào
bị tử vong. Hầu hết các ca mắc phải đều tập trung ở miền
núi chăn nuôi gia súc lớn nh Thanh Hoá, Tuyên Quang, Nghệ
An, Lai Châu, Đắk Lăk [1, 2]. Đối với các trờng hợp mắc bệnh

than ở nớc ta hầu hết do tiếp xúc với động vật ăn cỏ nh trâu,
bò, những ngời làm nghề thuộc da chế biến xơng [28].

2. Các dạng bệnh than
Bệnh Than thờng xuất hiện ở các loài động vật hoang
dà cũng nh động vật nuôi, đặc biệt là các loại gia súc ăn cỏ
nh trâu, bò cừu, la, ngựa, dê do chúng hít phải hoặc nhiễm
phải bào tử than trong đất. ở ngời, nguy cơ mắc bệnh than
là do tiếp xúc với động vật ăn cỏ [29].
Bệnh than có thể nhiễm vào cơ thể vật chủ theo ba
con đờng: qua da, qua đờng tiêu hoá và đờng hô hấp. Bệnh
than có thể biến chứng thành thể than mµng n·o nÕu hÝt
vµo bµo tư than. T theo cách thức lây nhiễm mà ngời ta
chia bệnh than thành 4 các thể than khác nhau: Than da,
than tiêu hoá, than hô hấp, than màng nÃo [19].
2.1. Bệnh than thể da
Đây là hình thức thức than phổ biến nhất chiếm hơn
90% và loại bệnh có khả năng điều trị. Bệnh thờng gặp ở
những nhóm đối tợng nguy cơ lây nhiễm cao, thờng xuyên
tiếp xúc với động vật và các sản phẩm từ gia súc đà bị
nhiễm than, thờng là những ngời nông dân, bác sỹ thú y, ngời giết mổ gia súc hay thịt. Từ các vết thơng hở trên da, vi
khuẩn hay bào tử B. anthracis có thể xâm nhập vào.
Trang 04-04

7

Lê Thu


Khãa

ln tèt nghiƯp

H×nh 1.1: BƯnh than thĨ da
TriƯu chøng cđa bệnh: Sau 1-2 ngày đầu thấy xuất
hiện các vết sẩn ngứa nh côn trùng đốt, dần dần xuất hiện
các dấu hiệu ngoại tử trong vùng tâm. Sau 2-3 ngày sẽ xuất
hiện các mụn nhỏ hay nốt nhú tại vị tri nhiễm, xung quanh
xuất hiện các mụn nớc. Vài ngày sau, tại vùng trung tâm vết
loét sẽ xuất hiện các nốt đen, khô bắt đầu bong vẩy. Trong
khoảng 1-2 tuần kể từ khi nhiễm bệnh sẽ xuất hiện các mủ
và các hiện tợng đau nhức, mệt mỏi, sốt, bạch cầu tăng, các
hạch bạch huyết tăng lên. Sau đó vùng thơng tổn sẽ chuyển
sang dạng tự phát. Nếu bệnh nặng thêm vết loét sẽ lan rộng
và ăn sâu làm nhiễm trùng máu dẫn đến không thể chữa
khỏi. Than da gây tử vong khoảng 20% các trờng hợp không
đợc điều trị.
2.2. Bệnh than thể tiêu hoá
Nguyên nhân của bệnh than thể tiêu hoá là do ăn phải
thịt gia súc đà bị nhiễm bào tử than mà không đợc nấu
Trang 04-04

8

Lê Thu


Khóa
luận tốt nghiệp
chín, thậm chí cả khi đợc nấu chín thì khả năng gây bệnh
vẫn cao [2]. Ngời ta tìm thấy vi khuẩn than trong dịch ruột

của bệnh nhân mắc bệnh than. Đầu tiên vi khuẩn sẽ tấn
công vào những vị trí thơng tổn của màng ngày ruột và dạ
dày. Từ những vị trí này sẽ xuất hiện những vết loét, lan
rộng và lan vào hệ bạch huyết. Bệnh than tiêu hoá thờng ít
gặp nhng lại có tỷ lệ tử vong khá cao. Bệnh thờng có hai thể
lâm sàng [11]:
Thể bụng: dấu hiệu đầu tiên và rất dễ nhận là có thơng tổn xuất huyết hoại tử ở manh tràng và các vùng lân
cận. Triệu chứng ban đầu không đặc biệt với những cảm
giác buồn nôn, biếng ăn, sốt cao. Sau đó là các triệu chứng
đau bụng, tiêu chảy, sốc do nhiễm trùng và tử vong. Bệnh
nhân có thể viêm phúc mạc hoặc viêm lá lách do vi khuẩn
tấn công vào khu bạch huyết. Sau 2-3 ngày kể từ khi xt
hiƯn dÊu hiƯu cđa bƯnh sÏ g©y tư vong.
ThĨ häng, miệng: Tại vùng thơng tổn thấy xuất hiện
hoại tử ở vùng vòm họng, cổ họng cứng, sng amidan. Bệnh
nhân sốt cao, khó nuốt, hạch vùng cổ sng to, nhiễm độc máu
và đa số dẫn đến tử vong. Dạng than này cã tû lƯ tư vong
cao chiÕm 50% mỈc dï cã đợc điều trị.

Trang 04-04

9

Lê Thu


Khóa
luận tốt nghiệp
Hình 1.2: Manh tràng đà bị nhiễm vi khuẩn
than

2.3. Bệnh than hô hấp
Nguyên nhân gây than hô hấp là do hít phải bào tử
than. Sau khi vào cơ thể, các bào tử than sẽ phát triển thành
thể hoạt động và di chuyển tới các phế nang, hạch lympho
phổi và trung thất gây xuất huyết hoại tử và phù thũng làm
trung thất giÃn rộng ra cả hai bên làm bệnh nhân có cảm giác
đau vùng ức, sốt cao. Các thơng tổn xuất huyết và hoại tử
lan đến màng phổi gây tràn máu màng phổi. Khí quản
cũng bị ảnh hởng với các triệu chứng nh ho khan, co thắt,
vùng phổi bị phù. Vi khuẩn sẽ theo đờng máu lan đến phần
dới niêm mạc của ống tiêu hoá và tạo nên các vết loét ở thành
ruột làm bệnh nhân nôn ra máu, tiêu hoá ra máu hoặc cả hai
triệu chứng trên. Một số nang Lympho của đờng tiêu hoá
cũng bị phù và xung huyết, nếu bệnh nặng hơn có thể biến
chứng sang thể màng nÃo gây xuất huyết. Đa số bệnh nhân
đều tử vong trong khoản 1- 2 ngày kể từ khi phát bệnh. Tỷ
lệ tử vong của bệnh than này rÊt cao.

Trang 04-04

1
0

Lª Thu


Khãa
ln tèt nghiƯp
H×nh 1.3: Trung thÊt d·n ra do hÝt phải bào
tử than

2.4. Bệnh than thể màng nÃo
Bệnh thờng do biến chứng từ ba thể than trên. Than
màng nÃo xuất hiện khi vi khuẩn B. anthracis tấn công vào hệ
thống thần kinh trung ơng theo đờng máu và các mạch bạch
huyết. Triệu chứng của bệnh là thờng sốt cao, mệt mỏi, đau
cơ, đau đầu, buồn nôn lên cơn mê sảng khi phát bệnh và
dẫn đến hôn mê. Đa số bệnh nhân thờng dẫn đến tử vong
sau 1- 2 ngày kể từ khi mắc bệnh. Thể than này có tỷ lệ tử
vong rất cao.

Hình1. 4: NÃo của ngời bị nhiễm bệnh
than

3. Bệnh than và chiến tranh sinh học
Sức tàn phá của bệnh than là vô cùng to lớn, đồng thời
nó dễ chuẩn bị và phát tán nhanh nên đà đợc sử dụng nh một
loại vũ khí sinh học làm tê liệt cả một thành phố, thậm chí cả
một quốc gia [24].

Trang 04-04

1
1

Lª Thu


Khãa
ln tèt nghiƯp
Trong chiÕn tranh thÕ giíi thø nhÊt, bƯnh than đà đ ợc

sử dụng nh một thứ vũ khí vô cùng lợi hại. Một vài nớc nh Đức,
Nhật, Hoa Kỳ, Liên hiệp Anh, Iraq và Liên Xô cũ đà thừa nhận
là sử dụng bệnh than làm phơng tiện của chiến tranh [30].
Năm 1915, Mỹ đà tiêm vi khuẩn bệnh than vào ngựa, la,
trâu, bò, để cung cấp cho các nớc trong chiến tranh thế giới
thứ nhất.
Năm 1937, Nhật bắt đầu thử nghiệm vũ khí bệnh than
ở MÃn Châu Lý (Trung Quốc).
Năm 1942, Liên hiệp Anh cũng tiến hành thử nghiệm vũ
khí bệnh than ở Gruinard Island, vùng duyên hải Scotland.
Năm 1943, Mỹ bắt đầu phát triển vũ khí bệnh than.
Sau chiÕn tranh thÕ giíi thø hai, Mü vÉn tiÕp tơc thùc hiƯn
chiÕn tranh sinh häc ë Fort Detrick, Maryland.
MỈc dù năm 1972, quy ớc Quốc tế cấm phát triển và dự
trữ vũ khí sinh học nhng các cuộc chiến tranh và khủng bố
vẫn tiếp diễn.
Năm 1979, bào tử than đà đợc phóng thích ở quân đội
Liên Xô cũ làm chết 68 ngời.
Năm 1991, lính Mỹ đợc tiêm phòng vaccine bệnh than
để chuẩn bị cho chiến tranh vùng vịnh.
Năm 1990-1993, nhãm khđng bè Aum Shinrikyo ®·
phãng thÝch bƯnh than ë Tokyo nhng không gây tổn thơng.
Năm 1995, Iraq thừa nhận đà tạo ra 8.500 lá th có chứa
tác nhân gây bệnh than.
Ngày 22/10/2001, những lá th có chứa bào tử than đợc
chuyển đến các bu điện Mỹ làm 5 ngời chết, và 17 ngời bị
nhiễm bệnh. Sự kiện này đà làm đau đầu các nhà cầm
Trang 04-04

1

2

Lê Thu


Khóa
luận tốt nghiệp
quyền Mỹ và buộc họ phải chi trả nhiều triệu đô la cho việc
tiêm phòng vaccine.
Tháng 9/2001, sau vụ khủng bố ngày 11/9, tại Cangene
xảy ra một vụ tơng tự làm 22 ngời mắc bệnh trong đó 11
ngời mắc bệnh than da và 11 ngời mắc bệnh than hô hấp, 5
ngời trong số mắc than hô hấp đà chết [31].
Nguyên nhân mà bệnh than đợc sử dụng nh một loại vũ
khí sinh học hiệu quả là do vi khuẩn than phát tán rất nhanh
và bào tử của nó có khả năng chống chịu tốt với điều kiện
khắc nghiệt của ngoại cảnh.
Trớc tình hình chính trị bất ổn nh hiện nay thì nguy
cơ xảy ra chiến tranh sinh học luôn là mối đe doạ lớn. Vì vậy
chúng ta cần phải nghiên cứu kỹ về tác nhân và cơ chế gây
bệnh than để ngăn ngừa và chống lại chúng bất cứ lúc nào.

II. Tác nhân gây bệnh than
Năm 1849, lần đầu tiên nguồn gốc bệnh than đợc nhà
nghiên cứu ngời Đức Pallender phát hiện ra tác nhân gây
bệnh là vi khuẩn B. anthracis. Năm 1950, ông Daven, nhà
nghiên cứu ngời Pháp cũng tìm ra tác nhân gây bệnh là B.
anthracis. Nhiều năm đó, cũng có nhiều nhà khoa học nghiên
cứu kỹ hơn về loại vi khuẩn này nh Kock và céng sù (1876),
Pasteur vµ céng sù (1877), Xenkovck vµ céng sự (1883). Năm

1877, Kock đà nuôi cấy vi khuẩn B. anthracis trên môi trờng
tinh khiết và chứng minh nó có khả năng hình thành bào tử
và có thể gây chết cho động vật. Ông đà chứng minh sự có
mặt của vi khuẩn này trong máu của động vật chết bởi
bệnh than. Năm 1822 - 1905, Pasteur và cộng sự đà tìm
Trang 04-04

1
3

Lê Thu


Khóa
luận tốt nghiệp
thấy bào tử B. anthracis ở nơi chôn xác động vật bị chết bởi
bệnh than.

1.Đặc điểm vi khuẩn B. anthracis.
Vi khuÈn B. anthracis thuéc nhãm I, chi Bacillus. Nó tồn
tại trong đất, trong nớc và không khí. Vi khuẩn B. anthracis là
vi khuẩn gram dơng sinh bào tử (trong điều kiện kị khí hay
kị khí bắt bắt buộc) không có lông roi nên không có khả
năng di động. KÝch thíc tÕ bµo tõ 3-5 m, réng tõ 1-2 m. Tế
bào hình que, vuông đầu, sắp xếp với nhau thành chuỗi dài
nh sợi rơm hoặc chỉ vài tế bào nối với nhau [19].

Hình 1.5: Hình thái tế bào của vi khuẩn Bacillus
anthracis
Bào tử B. anthracis có hình elip nằm ở trung tâm tế

bào, kích thớc khoảng từ 1- 1,5 m, nang bào tử không
phồng, bào tử đợc hình thành vào thời kỳ cuối của pha sinh
trởng Logarit [15].

Trang 04-04

1
4

Lê Thu


Khóa
luận tốt nghiệp

Hình 1.6: Bào tử của vi khuẩn Bacillus
anthracis
Khuẩn lạc B. anthracis có màu trắng sữa hoặc trắng
xám tới xám, bề mặt sần sùi, dính, ớt, đờng kính 3-5mm [5].
Điều kiện thích hợp cho B. anthracis phát triển là ở điều
kiện nhiệt độ 28-320C, pH=7, thời gian nuôi cấy từ 3 - 5
ngày. Khi gặp điều kiện bất lợi tế bào sinh dỡng sẽ hình
thành nội bào tử. Các nội bào tử nằm bên trong tế bào mẹ,
khi tế bào mẹ phân giải, thì các nội tử sẽ đợc giải phóng,
chúng có thể tồn tại và phát triển độc lập trong một thời gian
dài. Các nội bào tử khá bền vững, chúng có thể chịu đựng
đợc các điều kiện khắc nghiệt của môi trờng bên ngoài nh
tia tử ngoại, sự ăn mòn, nhiệt độ môi trờng (quá nóng hay quá
lạnh), thiếu hụt chất dinh dỡng hoặc nớc. Khi gặp điều kiện
thuận lợi, các nội bào tử sẽ nảy mầm và phát triển thành tế

bào sinh dỡng. Các tế bào sinh dỡng lại tiếp tục phát triển nếu
gặp điều kiện thuận lợi và ngợc lại nếu gặp điều kiện bất lợi
nó lại hình thành nên các nội bào tử.

Trang 04-04

1
5

Lê Thu


Khóa
luận tốt nghiệp
Bào tử B. anthracis đợc hình thành trong điều kiện
nhiệt độ 12- 420C và có khả năng chống chịu tốt với các
điều kiện khắc nghiệt. Bào tử B. anthracis đà đợc tìm thấy
ở rất nhiều nơi trên thế giới. Nó vùi sâu trong lòng đất và có
thể tồn tại ở đó hàng chục năm. Sau những cơn ma rào
hoặc hạn hán, bào tử sẽ nảy mầm trên bề mặt đất, khi động
vật ăn phải sẽ bị nhiễm bệnh và chết. Bào tử B. anthracis có
khả năng chống chịu với điều kiện khắc nghiệt của ngoại
cảnh rất tốt, vì vậy nó đợc sử dụng nh một thứ vũ khí lợi hại
trong chiến tranh và khủng bố [8].

2. Độc tố của vi khuẩn B. anthracis
Các độc tố của vi khuẩn B. anthracis bao gồm độc tố
vỏ nhày và các độc tố than. Độc tố vỏ nhày bản chất là acid
poly - - D- glutamic, đà đợc mà hoá bởi các gen capA, capB,
capC nằm trên plasmid pXO2 (95kb). Các độc tố than bao

gồm kháng nguyên bảo vệ PA, nhân tố gây chết LF, nhân tố
gây phù nhũng EF. Các độc tố than lần lợt đợc mà hoá bởi các
gen pagA, lef và cya, các gen này nằm trên plasmid pX01
(185kb) [6, 15].
2.1. Độc tố vỏ nhày
Độc tố vỏ nhày hay vỏ capsule có bản chất là acid poly -
- D -glutamic, có trọng lợng phân tử là 215 kDa ë trong tÕ bµo
vµ ë ngoµi tÕ bµo lµ 20- 55 kDa. Nó đợc mà hoá bởi các gen
cap nằm trên plasmid pXO2 có trọng lợng phân tử là 95kb [19,
22].

Trang 04-04

1
6

Lª Thu


Khóa
luận tốt nghiệp
Tất cả các dòng độc của B. anthracis đều tạo ra vỏ
nhày. Vỏ nhày giúp cho vi khuẩn B. anthracis tránh đợc sự
bảo vệ của hệ thống miễn dịch vật chủ và kích thích gây
nhiễm trùng. Vỏ nhày ức chế đại thực bào và gây ra đáp ứng
miễn dịch yếu. Ngoài ra vỏ nhày còn có tác dụng bảo vệ làm
tăng tính độc của vi khuẩn bệnh than. Thông thờng các
khuẩn lạc xù xì sẽ độc hơn các khuẩn lạc nhẵn [19].
Vỏ nhày không đợc hình thành khi nuôi cấy vi khuẩn
trên môi trờng dinh dỡng thông thờng. Nó chỉ hình thành

trong môi trờng thạch huyết ngựa hoặc m«i trêng cã bỉ
sung 0,7 % Na2CO3, đ ë 370C, trong điều kiện bị khí [11].
Bản thân chuỗi Poly - - D- glutamic không gây độc nhng
có chức năng bảo vệ vi khuẩn chống lại thành phần diệt
khuẩn của huyết thanh và bạch huyết, chống lại hiện tợng
thực bào. Vì vậy, vỏ nhày có vai trò trong suốt quá trình
xâm nhiễm và có vai trò nhất định trong giai đoạn cuối của
bệnh [11].
2.2. Độc tố than
Các độc tố than đóng vai trò quan trọng trong quá
trình gây bệnh ở cả giai đoạn đầu của bệnh cũng nh trong
suốt quá trình phát triển của bệnh [7]. Độc tố than bao gồm
3 thành phần: Kháng nguyên bảo vệ PA (Protective antigen),
nhân tố gây phù thũng EF (Edema Factor) và nhân tố gây
chết LF (Lethal Factor).
2.2.1.

Kháng

nguyên

bảo

vệ

PA

(Protective

Antigen-PA)

Trang 04-04

1
7

Lê Thu


Khóa
luận tốt nghiệp
Protein độc tố PA hoàn chỉnh có trọng lợng phân tử là
83kDa, bao gồm 735 acid amin (Mr82,684), 394 phân tử nớc
và 2 nguyên tử canxi. Phân tử PA hoàn chỉnh có 4 vùng chức
năng, mỗi vùng có vai trò khác nhau trong quá trình nhiễm
bệnh [19, 22].
Kháng nguyên bảo vệ PA đợc mà hoá bởi gen pagA nằm
trên plasmid XO1. Bản thân PA không gây độc nhng khi kết
hợp với nhân tố gây chết LF hay nhân tố gây phù thũng EF lại
sinh sản độc tố gây chết hoặc phù thũng cho tế bào vật
chủ. Do đặc tính này mà kháng nguyên bảo vệ PA đợc xem
là một kênh dẫn truyền gián tiếp cho các nhân tố EF và LF
để chúng phát huy độc lực.
2.2.2. Tác nhân gây phù thũng (Edema Factor EF)
EF đợc coi nh một enzym Adenylate Cyclase (AC), có
trọng lợng phân tử 89 kDa, chứa 767 gốc axid amin. Nó có
chức năng chuyển hoá ATP nội bào thành cAMP, quá trình
này đợc thực hiện khi EF kết hợp với Calmodulin (CaM- là một
thụ quan canxi lớn trong tế bào nhân chuẩn [19, 22]. EF phụ
thuộc calmodulin có 3 trình tự đợc duy trì chặt chẽ, gồm 24
acidamin (303-339) mang vị trí gắn ATP. Trình tự này có

liên quan đến quá trình xúc tác. EF có thể tơng tác với màng
kép lipid mà không phụ thuộc vào pH, không giống nh LF, EF
còn liên kết với các lỗ màng sau khi đợc chuyển vào trong tế
bào chất [19].
Khi EF đợc kháng nguyên bảo vệ PA dẫn vào trong tế
bào vật chủ độc tố EF sẽ gây nên hiện tợng mất cân bằng
Trang 04-04

1
8

Lê Thu


Khóa
luận tốt nghiệp
enzym và dẫn đến làm mất tính thấm của tế bào vật chủ.
Dịch tế bào bị dồn ứ và gây nên hiện tợng trơng bào, màng
tế bào căng ra mọng nớc, đây chính là nguyên nhân gây
phù thũng ở tế bào vật chủ [18].

Hình 1.7: Tác nhân gây phù
thũng EF
Nhân tố gây phù thũng EF đợc tạo bởi ít nhất 3 vùng
chức năng riêng biệt, trong đó có vùng EF3 (là phức tạp bởi
phần enzym của EF với CaM vµ adennosine 5’-  - β Methylene – triphosphat, đây là vùng quan trọng nhất, nó
kết hợp với CaM để gây phù thũng cho tế bào vật chủ.

2.2.3. Nhân tố gây chết (Lethal Factor- LF)

Trang 04-04

1
9

Lê Thu


Khóa
luận tốt nghiệp
Nhân tố gây chết LF là một protein gồm 776 acid amin,
trọng lợng phân từ 90kDa. Nó đợc coi là một nhân tố quan
trọng do vi khuẩn B. anthracis tiết ra [19].
LF chứa một loạt 4 trình tự lặp lại không hoàn toàn
trong phần trung tâm, sự mất đoạn trong vùng này làm
protein bị bất hoạt hoặc không hoạt động. Sự đột biến ở
những gốc có tính chất quyết định sẽ tiêu huỷ hoạt tính
độc tố gây chết và gắn Zn 2+ với LF [19]. Vì thế, LF đợc coi
là một metalloprotease kẽm [9]. Gần đây, các nghiên cứu đÃ
chỉ ra rằng LF phân giải các acid amin đầu N của protein
kinase hoạt hoá quá trình phân bào (Mitogen Activated
Protein Kinase- MAPKs) [19]. Sù ®ét biÕn ë vïng xúc tác của
LF sẽ làm mất độc tính của đại thực bào và ảnh hởng đến
sự phân bào [6].

Hình 1.8: Nhân tố gây chết LF

Trang 04-04

2

0

Lê Thu


Khãa
ln tèt nghiƯp
Khi LF kÕt hỵp víi Zn 2+ sÏ làm tăng quá trình sản xuất
cytokin trong đại thực bào và tế bào bạch huyết [18]. Đây
chính là nguyên nhân gây phá huỷ đại thực bào và là thủ
phạm chính dẫn đến hiện tợng sốc và tử vong. Sau khi đợc
vận chuyển vào trong tế bào, độc tố LF sẽ làm tăng tính
thấm của các ion Na+ và K+, sau đó là quá trình thuỷ phân
ATP. Quá trình này ức chế sự tổng hợp các đại phân tử liên
quan đến đáp ứng miễn dịch [10]. LF phong toả hệ thống
báo động của cơ thể bằng cách gắn với một cấu trúc protein
đặc biệt của tế bào, vùng metallo- protease của LF sẽ nhằm
tới các kênh dẫn truyền tín hiệu nội bào làm cho những thông
tin mà tế bào cần thông báo cho hệ miễn dịch về sự xuất
hiện của yếu tố lạ bị đình chỉ, từ đó các protease sẽ phá
huỷ cấu trúc nội bào gây chết cho tế bào vật chủ.

3. Điều khiển sự biểu hiện của các gen gây
độc trong vi khuẩn B. anthracis
Ngời ta đà xác định đợc rằng có hai nhân tố chính
điều hoà sự dịch m· vµ biĨu hiƯn cđa gen lµ atxA vµ acpA.
Gen acpA nằm trên plasmind pXO2 hoạt hoá sự biểu hiện cđa
gen capB (mét trong c¸c gen m· ho¸ vá capsule). Gen atxA
nằm trên plasmind pXO1 hoạt hoá sự biểu hiện của các gen
capB và các gen mà hoá protein độc tố pagA, lef và cya. Gen

atxA là nhân tố điều hoà dơng cho sự hoạt hoá quá trình
dịch mà của các gen độc tố. Sự hoạt hoá này phải thực hiện
trong môi trờng có nồng độ CO2/bicacbonat cao. Ngoài ra
atxA còn thực hiện một vai trò khác là điều chỉnh sù biĨu

Trang 04-04

2
1

Lª Thu


Khóa
luận tốt nghiệp
hiện của các gen độc tố khi nó xâm nhiễm vào tế bào vật
chủ để gây độc [19, 26].
Để hiểu rõ vai trò của nhân tố điều hoà atxA, ngời ta
tiến hành gây đột biến để tạo một thể đột biến atxA. Khi
nuôi cấy trong môi trờng giàu dinh dỡng, thể đột biến atxA
và chủng gốc có sự phát triển nh nhau. Nhng trên môi trờng
nghèo dinh dỡng nh môi trờng tổng hợp XO hoặc các môi trờng tơng tự khác thì thể đột biến không gây độc chủng
Steme (pXO1+ pXO2) rất khó phát triển. Thể đột biến này tạo
ra những đám khuẩn lạc nhỏ hơn so với chđng gèc. Nh vËy
gen atxA cã liªn quan trùc tiÕp đến sự tổng hợp vỏ capsule
có nghĩa là nó liên quan đến gen mà hoá vỏ capsule. Đồng
thời sự có mặt của atxA còn có tác dụng rõ rệt đến sự hình
thành bào tử. Thể đột biến atxA của chủng Sterne tạo nhiều
bào tử hơn khi phát triển trong môi trờng giàu dinh dỡng, còn
các chủ Sterne ban đầu mang đột biến atxA nhng đà loại bỏ

các gen độc tố thì không có đặc tiònh trên. Điều đó thể
hiện sự liên quan chặt chẽ của atxA và các gen độc tố [26].
Cùng với hai nhân tố điều hoà acpA và atxA, ngêi ta
cịng t×m thÊy mét gen pag kÝch thíc 300bp, nó cùng đợc
dịch mÃc xuôi chiều với gen pagA. Gen pagR mà hoá cho một
protein có trình tự acid amin giống các tác nhân điều hoà
dịch mà trong các sinh vËt kh¸c. Gen pagR øc chÕ sù biĨu
hiƯn cđa gen acpA và atxA. Ngoài ra, gen pagR còn điều
khiển sự biểu hiện của một vài tổ hợp phiên mà promoterlacZ đợc hoạt hoá bởi CO2/atxA. Sự điều hoà những tổ hợp
này cùng với gen pagA và pagR có thể phụ thuộc vào sự thay

Trang 04-04

2
2

Lê Thu


Khóa
luận tốt nghiệp
đổi mức độ AtxA hoặc không phụ thuộc vào sự biểu hiện
của atxA [26].
Sự dịch mà các gen độc tố và gen mà hoá vỏ capsule
tăng lên khi tế bào phát triển trong môi trờng có nồng độ
CO2/bicacbonat cao và ngợc lại, nếu nồng độ này thấp sẽ ức
chế quá trình dịch mà [15].
Hai nhân tố là CO2/bicacbonat và nhiệt độ cũng đóng
vai trò quan trọng trong sự biểu hiện của 3 gen độc tố. Sự
tổng hợp độc tố thu đợc nhiều nhất khi ủ canh trờng có nồng

độ CO2>>5% hoặc bổ sung khí bicacbonat vào môi trờng
đà ®ỵc ®Ëy kÝn. Sù tỉng hỵp ®éc tè khi đ canh trờng ở nhiệt
độ 370C cũng nhiều hơn khi ủ ở 280C [15].
Nh vậy quá trình dịch mà và biểu hiện của gen độc tố
và gen mà hoá vỏ capsule trong vi khuẩn B. Anthracis đợc
điều khiển bởi ba nhân tố điều hoà là acpA, atxA và pagR.
Đồng thời 2 yếu tố CO2/ bicacbonat và nhiệt độ cũng chi phối
sự biểu hiện của các gen độc tố [22, 24].

III. Kháng nguyên bảo vệ PA
1. Vai trò của kháng nguyên bảo vệ PA
Kháng nguyên bảo vệ PA là thành phần quan trọng trong
quá trình gây độc của vi khuẩn B. anthracis. Phân tử PA
hoàn chỉnh có trọng lợng 83 kDa, gồm 735 acid amin, kích
thớc không gian 3 chiều là 100 x 50 x 30A 0. Kháng nguyên bảo
vệ PA do gen pagA mà hoá, gen này nằm trên plasmid pXO1
(185kb) [19, 24].

Trang 04-04

2
3

Lª Thu


Khóa
luận tốt nghiệp
Mặc dù bản thân PA không gây độc nhng nó lại có khả
năng truyền dẫn các độc tố vào bên trong tế bào vật chủ.

PA83 có khả năng kết hợp cụ thể trên bề mặt tế bào. Dới tác
dụng của protease nội bào họ furin, PA83 sẽ bị phân tách
thành 2 phần là PA20 và PA63, để lộ ra vị trí liên kết với LF
và EF [19, 24]. Đây là bớc rất nguy hiểm trong quá trình gây
độc của PA. Các nghiên cứu gần đây cho thấy nếu trên
phân tử PA83 không chứa vị trí phân cắt này thì không có
khă năng gây độc. Sau đó, các mảnh PA63 sẽ liên kết với
nhau để tạo thành vòng heptam có 7 nhánh. Khi vòng
heptam kết hợp với nhân tố LF sẽ gây chết và kết hợp với
nhân tố EF sẽ gây phù nhũng cho tế bào vật chủ. Vì vậy,
kháng nguyên bảo vệ PA đợc coi là tác nhân gián tiếp gây ra
hiệu quả độc tố của nhân tố gây chết và phù thũng.
Bên cạnh đó PA còn có vai trò chính trong miễn dịch
bệnh than. Ngời ta đà nghiên cứu khả năng kích thích miễn
dịch của nhiều kháng nguyªn vi khuÈn B. anthracis

nh vá

capsule, S - layer hay cá protein khác, kết quả cho thấy chỉ
có các protein hình thành độc tố than mới có khả năng kích
thích miễn dịch sinh kháng thể nhờ khả năng trung hoà ®éc
tè than [9]. Kh¸ng thĨ PA sÏ ph¸ hủ protein PA ở vị trí liên
kết với thụ thể trên tế bào vật chủ hoặc phá huỷ vị trí phân
cắt trên vïng I cđa PA83. ChÝnh nhê vai trß dÉn trun quan
trọng của PA cũng nh khả năng kích thích cơ thể sản sinh
kháng thể chống bệnh than nên PA đà trở thành tâm điểm
chú ý của nhiều nghiên cứu chẩn đoán, phòng ngừa bệnh
than cũng nh các nghiên cứu sản xuất vaccine sử dụng nguyên
liệu là protein kháng nguyên bảo vệ tái tổ hợp.
Trang 04-04

2
4

Lê Thu


Khóa
luận tốt nghiệp

2.Cấu trúc kháng nguyên bảo vệ PA

Hình 1.9: Cấu trúc đơn phân kháng nguyên
bảo vệ PA
Phân tử PA hoàn chỉnh gồm 735 acid anim (83 kDa). Nó
có trình tự tơng đồng với một họ các độc tố nhị nguyên ADP


ribosyltransferase

nh:

thể

nhân

B

của

Clostridium

botulinum C2 (33% tơng đồng), Clostridium difficile cdt (35%
tơng ®ång), Clostridium perfingens iota-toxin-1b (34% t¬ng
®ång), Clostridium spiroforme Sb (33% tơng đồng) và
protein VIP1 của Bacillus cereus (27% đồng nhất). Các con số
này nhằm giải thích cấu trúc bậc 2, 3, 4 của phân tử PA. NhTrang 04-04

2
5

Lê Thu


Khóa
luận tốt nghiệp
ng trình tự tơng đồng giữa PA và họ độc tố nhị nguyên
ADP - ribosyltransferase không bao gồm vùng IV, điều này
chỉ ra sự khác biệt giữa các thụ thể của các độc tố.
Kháng nguyên bảo vệ PA đợc tạo thành bởi các cấu trúc
đối song song [17]. Phân tử PA83 hoàn chỉnh gồm 4 phần
chức năng:
Vùng 1 (1 - 249): Cấu trúc xoắn , vùng này chứa 2 ion
Ca2+ và một vị trí hoạt hoá phân giải của các protease. Sau
khi PA đợc hoạt hoá bởi protease nội bào, nó sẽ giải phóng ra
mảnh PA20 có chứa đầu N và mảnh PA63. Mảnh PA20 sau
khi giải phóng sẽ bị phân giải trong môi trờng, 7 mảnh PA63
sẽ liên kết lại với nhau tạo nên vòng heptam có 7 nhánh (PA63) 7,
cấu trúc này tan trong nớc và xâm nhiễm vào trong tế bào
vật chủ [22].

Vùng II (250 487): là một rỗng chứa một cấu trúc
nh cái móc lớn và linh hoạt. Vùng này liên quan đến sự hình
thành vòng heptam [19]. Nó chứa một vòng xoắn lớn linh hoạt
(302-325) liên quan đến sự hình thành lỗ màng. ở pH thấp,
heptam sẽ biến đổi và chuyển từ dạng tiền lỗ thành lỗ. Ngoài
ra, vùng này còn có liên quan đến sự sắp xếp lại 7 vòng
xoắn của heptam để tạo thành một lõi gồm 14 chuỗi liên
kết với màng. Vòng này có điểm cắt cho chymotrysin
(Phe313- Phe314) hai gốc này còn có liên quan tới sù vËn chun
EF vµ LF vµo trong tÕ bµo chÊt. Vòng hep tam hình thành
nên kênh chọn lọc trong màng nhân tạo và màng tế bào [19].
Vùng III (488 594): lµ vïng nhá nhÊt cã cÊu tróc 
kiĨu gÊp nếp [22]. Vùng này chứa một lõi kị nớc (282- 328)
gồm 101 acid amin của 5 trình tự nhắc lại nối đuôi nhau và
Trang 04-04

2
6

Lê Thu


Khóa
luận tốt nghiệp
dờng nh đợc tạo ra thông qua quá trình sao chép. Vùng này
bao gồm 4 tấm bện chặt hỗn độn và 4 vòng xoắn ốc nhỏ
và 1 khe tơng tự nh ở ferredoxins và vùng A của độ tố gây
hội chứng shock độc 1 [22]. Vùng này liên quan đến sự tơng
tác giữa các Protein với nhau. Có nghiên cứu cho rằng vùng III
liên quan đến quá trình oligomerization tạo thành heptam

(PA63), một nửa liên kết với thụ thể và một nửa gắn với enzym
thuỷ phân [19].
Vùng IV (595 - 735): đây là vùng liên kết với thụ thể và
chứa vị trí epitop quyết định kháng nguyên của PA [22, 24].
Vùng này đà đợc chứng minh là có khả năng gây đáp ứng
miễn dịch. Nó gồm hai vùng là vòng xoắn lớn (704- 723) và
vòng xoắn nhỏ (679-693), trong đó chỉ có vòng xoắn nhỏ
là có trình tự liên kết với thụ thể. Ngoài ra còn có các gốc ở
cuối đầu C tham gia hỗ trợ cho việc liên kết. Nếu loại bỏ 2
phần là đầu C và vòng xoắn nhỏ sẽ làm giảm tính độc bằng
cách øc chÕ sù liªn kÕt cđa PA víi thơ thĨ [24].
Mảnh PA20 sau khi giải phóng sẽ bị phân giải trong môi
trờng, 7 mảnh PA63 sẽ liên kết lại với nhau tạo nên vòng
heptam có 7 nhánh. Cấu trúc (PA63) 7 có khả năng liên kết với
nhân tố gây chết LF hoặc nhân tố gây phù thũng EF để
gây chết hoặc phù thũng cho tễ bào vật chủ.

Trang 04-04

2
7

Lê Thu