Báo cáo " SỰ PHÁT SINH PHÔI VÔ TÍNH TỪ MẪU CẤY LÁ CÂY DẦU MÈ (JATROPHA CURCAS L.) " doc

Kỷ yếu hội nghị Khoa học Môi trường và Công nghệ sinh học năm 2011
193

SỰ PHÁT SINH PHÔI VÔ TÍNH TỪ MẪU CẤY LÁ CÂY DẦU MÈ
(JATROPHA CURCAS L.)

Bùi Văn Thế Vinh
1
, Chu Thị Bích Phượng
1
, Thái Xuân Du
2
, Đỗ Đăng Giáp
2
,
Dương Tấn Nhựt
3
1
Trường Đại học Kỹ thuật Công nghệ Tp.HCM;
2
Viện Sinh học Nhiệt đới;
3
Viện sinh học Tây Nguyên

TÓM TẮT
Mẫu cấy lá cây Dầu mè đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng WPM có bổ sung Kinetin
kết hợp với IBA hoặc 2,4-D ở những nồng độ khác nhau để cảm ứng sự hình thành mô
sẹo có khả năng phát sinh phôi. Trên môi trƣờng có bổ sung 1,5 – 2,0 mg/l Kinetin kết
hợp với 0,5 mg/l 2,4-D có sự xuất hiện của khối mô sẹo mềm, dễ vỡ vụn cùng với một
số cấu trúc hình cầu giống phôi có màu kem sáng. Ảnh hƣởng của các thành phần
khoáng đa lƣợng khác nhau lên khả năng phát sinh phôi vô tính của cây Dầu mè cũng

đã đƣợc nghiên cứu. Thành phần khoáng đa lƣợng của môi trƣờng MS tỏ ra hiệu quả
hơn trong việc cảm ứng sự hình thành các khối tiền phôi hình cầu. Những khối tiền phôi
này đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng có nồng độ Kinetin và 2,4-D thấp hơn để cảm
ứng sự biệt hóa và trƣởng thành phôi. Phôi vô tính Dầu mè có thể nảy mầm và phát triển
thành cây con hoàn chỉnh trên môi trƣờng MS½ không bổ sung chất điều hòa sinh
trƣởng thực vật. Cây con có bộ rễ hoàn chỉnh và phát triển mạnh nhƣ cây con gieo từ
hạt.
Từ khóa: Jatropha curcas L., diesel sinh học, mô sẹo sinh phôi, phôi vô tính, khoáng đa
lượng

GIỚI THIỆU
Trong tình hình khủng hoảng năng lƣợng hiện nay, các nƣớc trên thế giới đều đi tìm những
nguồn năng lƣợng không truyền thống hoặc năng lƣợng có khả năng tái sinh đƣợc để trƣớc mắt thay
thế một phần năng lƣợng dầu mỏ, trong đó nhiên liệu sinh học (biodiesel) là một lĩnh vực đƣợc
nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu. Cây Dầu mè (Jatropha curcas L.) là một trong những
loại cây nhiên liệu đƣợc đầu tƣ phát triển ở rất nhiều nƣớc trên thế giới, trong đó có Việt Nam.
Cây Dầu mè thuộc họ Euphorbiaceae, có nguồn gốc từ Trung, Nam Mỹ và vùng biển Carribê.
Đây là một loại cây đa mục đích vì tất cả các phần của cây đều có giá trị sử dụng, cây có dạng thân
bụi, sống lƣu niên, có thể cao tới 5 m, nhƣng trong sản xuất thƣờng để chiều cao không quá 2 m cho
tiện việc thu hái. Dầu từ hạt đƣợc xem là nguồn nguyên liệu tiềm năng để sản xuất nhiên liệu sinh
học, đây là loại nhiên liệu sạch, không độc, thân thiện với môi trƣờng và kinh tế nhờ chi phí sản
xuất thấp. Ngoài ra, dầu cũng đƣợc sử dụng một cách truyền thống để sản xuất xà phòng, nến, sơn,
dầu nhờn và dùng trong y học để làm thuốc xổ (Sujatha, Mukta, 1996).
Ở Việt Nam, cây Dầu mè mọc hoang dại trong tự nhiên ở độ cao trên 1000 m so với mặt nƣớc
biển, chúng có mặt ở hầu hết các tỉnh thành trong cả nƣớc. Có giống có hàm lƣợng dầu đạt 40%
nhƣ ở huyện Đức Trọng, tỉnh Lâm Đồng. Năng suất hạt của cây Dầu mè, cũng nhƣ bao cây trồng
khác, phụ thuộc vào giống, lọai đất, mức độ đầu tƣ phân bón và lƣợng nƣớc tƣới. Trên vùng đất
xấu, ít đƣợc chăm sóc năng suất hạt của cây Dầu mè có thể đạt 4-5 tấn hạt/ha/năm và đạt 10-12 tấn
hạt/ha/năm ở vùng đất tốt cùng với sự đầu tƣ thích hợp. Hàm lƣợng dầu của hạt khoảng 35-40% tuỳ
theo giống. Nếu chiết ép tốt, 3-3,5 kg hạt có thể cho 01 lít dầu thô (Du và Uyển, 2006).

Hạt Dầu mè là thể dị hợp tử từ phức hợp lai giữa 2 dạng Jatropha sp. tự nhiên và nhân tạo gây
ra vấn đề khó khăn trong tính ổn định về di truyền (Prabakaran và Sujatha, 1999). Vì vậy, hàm
lƣợng dầu dao động trong khoảng 4 – 40%. Nhân giống truyền thống cây Dầu mè gặp phải vấn đề
về khả năng sống sót của hạt kém, tỉ lệ nảy mầm thấp, khả năng ra rễ của cây con gieo từ hạt và của
cành giâm ít và chậm (Heller, 1996; Openshaw, 2000). Những cây con đƣợc nhân giống bằng cành
giâm có tuổi thọ ngắn và khả năng kháng bệnh cũng nhƣ kháng hạn kém hơn so với cây con gieo từ
hạt. Cây con từ cành giâm không tạo đƣợc rễ cọc thật sự (dẫn đến khả năng kháng hạn kém), thay
Kỷ yếu hội nghị Khoa học Môi trường và Công nghệ sinh học năm 2011
194

vào đó, chúng tạo ra các rễ cọc giả chỉ có thể cắm sâu xuống đất khoảng 1/2 – 2/3 so với rễ cọc
đƣợc tạo ra từ cây con gieo từ hạt (Heller, 1996).
Xét về tiềm năng to lớn của cây Dầu mè thì cần phải có một lƣợng lớn cây giống có chất
lƣợng tốt để sử dụng trong tƣơng lai. Chính vì vậy, việc cải thiện chất lƣợng cây trồng thông qua
việc áp dụng các phƣơng pháp công nghệ sinh học thực vật là hết sức cần thiết. Trong những nghiên
cứu trƣớc đây, một số yếu tố ảnh hƣởng đến sự phát sinh hình thái của cây Dầu mè in vitro đã đƣợc
khảo sát nhƣ loại mô dùng làm mẫu cấy, vị trí lấy mẫu, tuổi sinh lý của mẫu cấy, nồng độ các chất
điều hòa sinh trƣởng thực vật, thành phần của môi trƣờng nuôi cấy,… (Sujatha và Mukta, 1996;
Sardana và cs., 2000; Rajore và Batra, 2005; Jha và cs., 2007; Shrivastava, Banerjee và 2008).
Trong đó, mẫu cấy đoạn thân có mang chồi bất định đƣợc xem là nguyên liệu tốt nhất để tái sinh
cây in vitro do có tỉ lệ nhiễm thấp, giúp giảm đáng kể những biến dị sinh dƣỡng nhƣng hệ số nhân
giống đạt đƣợc không cao.
Phƣơng pháp phát sinh phôi vô tính là một công cụ mạnh của ngành Công nghệ sinh học đƣợc
áp dụng để nhân giống đối với nhiều loại cây trồng khác nhau. Việc ứng dụng phƣơng pháp phát
sinh phôi vô tính ở cây Dầu mè hứa hẹn sẽ mang lại nhiều ƣu điểm vì có thể tạo ra một số lƣợng lớn
cây con có chất lƣợng tốt trong một thời gian ngắn. Trong bài báo này, chúng tôi nghiên cứu ảnh
hƣởng của Kinetin kết hợp với IBA và 2,4-D lên sự hình thành mô sẹo có khả năng phát sinh phôi
từ mẫu cấy lá cây Dầu mè. Ảnh hƣởng của các thành phần khoáng đa lƣợng khác nhau trong môi
trƣờng nuôi cấy lên sự phát sinh phôi vô tính ở cây Dầu mè cũng đƣợc khảo sát. Cây con in vitro
đƣợc chuyển ra vƣờn ƣơm để đánh giá khả năng sống sót và hoàn thiện quy trình nhân giống cây

Dầu mè thông qua con đƣờng phát sinh phôi vô tính từ mẫu cấy lá trƣởng thành với hệ số nhân
giống đạt đƣợc tƣơng đối cao.

VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
Vật liệu
Vật liệu thí nghiệm là lá của cây Dầu mè Ấn độ đƣợc trồng tại vƣờn giống Viện Sinh Học
Nhiệt Đới thuộc Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam.
Phƣơng pháp
Khử trùng mẫu cấy
Lá đƣợc đặt dƣới vòi nƣớc chảy trong 30 phút sau đó tiến hành rửa sạch bề mặt lá bằng xà
phòng loãng (Viso, Việt Nam) và rửa lại bằng nƣớc cất vô trùng. Sau đó, lá đƣợc khử trùng bằng
dung dịch Javel 7% trong thời gian 15 phút và rửa lại 5 lần bằng nƣớc cất vô trùng.
Ảnh hưởng của auxin và cytokinin lên sự hình thành mô sẹo có khả năng phát sinh phôi
Lá đƣợc cắt thành những mảnh nhỏ và đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng WPM (Lloyd,
McCown, 1980) có bổ sung 30 g/l sucrose, 9 g/l agar, Kinetin (0,1 – 2,0 mg/l) kết hợp với IBA (0,1
– 1,0 mg/l) hoặc 2,4-D (0,1 – 1,0 mg/l). pH môi trƣờng đƣợc điều chỉnh về 5,8 trƣớc khi hấp khử
trùng ở nhiệt độ 121ºC, áp suất 1 atm trong thời gian 30 phút. Các mảnh lá đƣợc nuôi trong điều
kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày ở nhiệt độ 22 ± 2ºC.
Ảnh hưởng của khoáng đa lượng lên sự hình thành mô sẹo có khả năng phát sinh phôi
Bảy loại môi trƣờng khác nhau có chứa thành phần khoáng đa lƣợng của MS, MS½
(Murashige và Skoog, 1962), WPM (Lloyd và McCown, 1980), B5 (Gamborg và cs., 1968), White
(White, 1963), SH (Schenk và Hildebrandt, 1972), Nitsch (Nitsch và Nitsch, 1969) đƣợc sử dụng.
Mỗi môi trƣờng đều đƣợc bổ sung thành phần vi lƣợng và vitamin của MS, 100 mg/l myo-inositol,
3% sucrose, 1,5 mg/l Kinetin và 0,5 mg/l 2,4-D.
Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên sự phát triển của mô sẹo có khả năng phát sinh phôi
Mô sẹo có khả năng phát sinh phôi đƣợc cấy chuyền sang môi trƣờng MS có bổ sung 1,5 mg/l
Kinetin và 0,5 mg/l 2,4-D với 3 điều kiện nuôi cấy khác nhau: bán rắn (bổ sung 9 g/l agar), lỏng
tĩnh (không bổ sung agar), lỏng lắc (không bổ sung agar, lắc với tốc độ 120 vòng/phút).
Bảng 1. Thành phần ion trong các môi trƣờng sử dụng (theo George và Sherrington, 1984).
Ion

Nồng độ (mM)

MS
MS ½
WPM
B5
White
SH
Nitsch
NO
3
-
39,4
19,7
9,7
24,7
3,3
24,7
18,4
H
2
PO
4
-
1,3
0,7
1,3
1,1
0,1
2,6

0,5
Kỷ yếu hội nghị Khoa học Môi trường và Công nghệ sinh học năm 2011
195

SO
4
2-
1,5
0,8
7,2
2,0
4,4
1,6
0,8
Cl
-
6,0
3,0
1,3
2,0
0,9
2,7
3,0
K
+

20,0
10,0
12,6
24,7

1,7
24,7
9,9
Ca
2+
3,0
1,5
3,0
1,0
1,2
1,4
1,5
Na
+
-
-
-
1,1
2,9
-
-
Mg
2+
1,5
0,8
1,5
1,0
2,9
1,6
0,8

NH
4
+
20,6
10,3
5,0
2,0
-
2,6
9,0
N tổng
60,0
30,0
14,7
26,7
3,3
27,3
27,4
NH
4
+
/NO
3-

0,52
0,52
0,52
0,08
-
0,11

0,49
Nồng độ ion tổng
93,3
46,7
41,5
59,6
17,4
61,9
43,9
Sự trưởng thành, biệt hóa và nảy mầm của phôi vô tính
Mô sẹo với các khối tiền phôi đƣợc tách thành những cụm nhỏ và cấy sang môi trƣờng MS có
bổ sung 1,0 mg/l Kinetin kết hợp với 2,4-D ở những nồng độ khác nhau (0 – 1,0 mg/l). Tách các
phôi ở giai đoạn lá mầm hoặc đã nảy chồi ra khỏi đám mô sẹo và cấy sang môi trƣờng tái sinh cây
(môi trƣờng MS½ không bổ sung chất điều hòa tăng trƣởng thực vật).
Xử lý thống kê
Các thí nghiệm đƣợc thiết kế theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên. Mỗi thí nghiệm đƣợc lặp lại
3 lần, số liệu đƣợc xử lý bằng phần mềm Statgraphics Centurion XV theo phƣơng pháp DMRT
(Ducan, 1995) ở mức ý nghĩa 5%.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Ảnh hưởng của auxin và cytokinin lên sự hình thành mô sẹo có khả năng phát sinh phôi
Mẫu cấy lá cây Dầu mè đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng WPM cơ bản có bổ sung Kinetin kết
hợp với IBA và 2,4-D ở những nồng độ khác nhau bắt đầu phồng lên sau 5 – 7 ngày. Trên môi
trƣờng không bổ sung chất điều hòa tăng trƣởng thực vật, mẫu cấy lá cũng phồng lên sau đó dần
hóa nâu và chết (Hình 1a
1
). Đáp ứng đầu tiên của mẫu cấy là gân chính phình ra, sự hình thành mô
sẹo chỉ đƣợc quan sát ở bề mặt cắt của mảnh lá sau 2 tuần nuôi cấy. Mô sẹo bắt đầu hình thành từ
gân chính sau đó lan rộng ra bề mặt lá. Quan sát hình thái bên ngoài và cấu trúc giải phẫu bên trong
của mẫu cấy cho thấy sau khoảng 7 – 10 ngày nuôi cấy, bắt đầu có sự tăng sinh tế bào từ vùng tế

bào nhu mô của mô thịt lá, khối mô sẹo ban đầu có màu trắng, xốp.
Jha và cộng sự (2007) cho rằng các chất điều hòa tăng trƣởng thực vật đƣợc sử dụng ở các
nồng độ khác nhau là những yếu tố chính xác định sự hình thành mô sẹo có khả năng phát sinh phôi
vô tính ở cây Jatropha curcas. Trong thí nghiệm này, kết quả đƣợc chỉ ra cho thấy Kinetin khi sử
dụng phối hợp với IBA hoặc 2,4-D ở những nồng độ khác nhau có ảnh hƣởng đến sự hình thành mô
sẹo và hình thái của mô sẹo từ mẫu cấy lá cây Dầu mè (Bảng 2).
Bảng 2. Ảnh hƣởng của Kinetin kết hợp với IBA và 2,4-D lên sự hình thành mô sẹo từ lá cây Dầu mè
Kinetin
(mg/l)
IBA
(mg/l)
2,4-D
(mg/l)
Tỉ lệ hình thành
mô sẹo (%)
Hình thái mô sẹo
-
-
-
-
Mẫu cấy phồng lên, màu nâu đen
0,1
0,1
-
37,5 e
(*)

Mềm, màu vàng sáng
0,5
0,1

-
40,8 de

Mềm, màu vàng sáng
1,0
0,1
-
42,9 de

Mềm, màu xanh sáng
0,5
0,5
-
62,1 c

Mềm, màu vàng sáng
1,0
0,5
-
70,3 bc

Đặc, chắc, màu kem sáng
1,5
0,5
-
65,4 c

Đặc, chắc, màu xanh sáng
2,0
0,5

-
43,8 d

Đặc, chắc, màu xanh sáng
0,5
1,0
-
56,1 cd

Đặc, chắc, màu xanh sáng
1,0
1,0
-
60,3 c

Đặc, chắc, màu xanh sáng
1,5
1,0
-
61,6 c

Đặc, chắc, màu nâu đen
2,0
1,0
-
49,8 d

Đặc, chắc, màu nâu đen
0,1
-

0,1
45,2 d

Mềm, dễ vỡ vụn, màu kem
0,5
-
0,1
46,7 d

Mềm, dễ vỡ vụn, màu kem
1,0
-
0,1
46,9 d

Mềm, dễ vỡ vụn, màu kem sáng
0,5
-
0,5
72,4 bc

Mềm, dễ vỡ vụn, màu kem sáng
1,0
-
0,5
89,3 a

Mềm, dễ vỡ vụn, màu kem sáng
Kỷ yếu hội nghị Khoa học Môi trường và Công nghệ sinh học năm 2011
196

1,5
-
0,5
75,1 b

Mềm, dễ vỡ vụn, có nốt hình cầu
2,0
-
0,5
53,1 d

Mềm, dễ vỡ vụn, có nốt hình cầu
0,5
-
1,0
76,1 b

Mềm, nhão, màu trắng
1,0
-
1,0
80,3 b

Mềm, nhão, màu trắng
1,5
-
1,0
63,7 c

Mềm, nhão, màu trắng
2,0
-
1,0
56,2 cd

Mềm, nhão, màu trắng
Chú thích: (*) Những chữ cái khác nhau (a,b,c,…) trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở
mức α = 0,05 trong phép thử DMRT
Kinetin (0,5 – 2,0 mg/l) kết hợp với IBA (0,5 – 1,0 mg/l) có tác dụng cảm ứng sự hình thành
mô sẹo có dạng đặc, chắc, màu từ vàng đến xanh sáng (Hình 1a
2
). Mô sẹo tăng sinh mạnh mẽ. Tuy
nhiên, sau khoảng 8 tuần nuôi cấy thì phần bên dƣới của khối mô sẹo tiếp xúc với môi trƣờng xuất
hiện vùng hóa nâu đen, phần mô sẹo phía trên mất dần màu xanh.
Tỉ lệ hình thành mô sẹo trên môi trƣờng có bổ sung Kinetin kết hợp với IBA (37,5 – 65,4%)
thấp hơn so với trên môi trƣờng có bổ sung Kinetin kết hợp với 2,4-D (45,2 – 89,3%). Mô sẹo đƣợc
tạo ra trên môi trƣờng có bổ sung Kinetin (0,5 – 2,0 mg/l) kết hợp với 2,4-D (0,1 – 0,5 mg/l) đều có
dạng mềm, dễ vỡ vụn. Đặc biệt, trên môi trƣờng có bổ sung Kinetin và 0,5 mg/l 2,4-D có sự xuất
hiện của khối mô sẹo cùng với một số cấu trúc hình cầu giống phôi có màu kem sáng (Hình 1a
3
).
Jha và cộng sự (2007) đã nhận thấy rằng những mẫu cấy lá cây Jatropha curcas đƣợc nuôi
cấy trên môi trƣờng MS có bổ sung 2,0 mg/l Kinetin có sự cảm ứng hình thành mô sẹo cao hơn
đáng kể so với các môi trƣờng khác. Môi trƣờng này cho thấy sự phát triển các mô sẹo có khả năng
phát sinh phôi có nhiều nốt nhỏ màu kem trong khoảng 4 tuần nuôi cấy.

Hình 1. Mô sẹo từ lá cây Dầu mè trên các môi trƣờng và điều kiện nuôi cấy khác nhau
a
1

. Mô sẹo trên môi trƣờng WMP không bổ sung chất điều hòa sinh trƣởng thực vật; a
2
.Mô sẹo trên môi
trƣờng WMP + 1,5 mg/l Kinetin + 0,5 mg/l IBA; a
3
.Mô sẹo trên môi trƣờng WMP + 1,5 mg/l Kinetin + 0,5
mg/l 2,4-D; b
1
.Mô sẹo trên môi trƣờng bán rắn; b
2
.Mô sẹo trong môi trƣờng lỏng tĩnh; b
3
.Mô sẹo trên môi
trƣờng lỏng lắc
Ảnh hưởng của khoáng đa lượng lên sự hình thành mô sẹo có khả năng phát sinh phôi
Bảng 3. Ảnh hƣởng của khoáng đa lƣợng lên sự hình thành mô sẹo từ lá cây Dầu mè
Thành phần
khoáng đa lƣợng
Tỉ lệ hình thành
mô sẹo (%)
Trọng lƣợng
tƣơi mô sẹo (mg)
Số cấu trúc
giống phôi
Hình thái mô sẹo
MS
100 a
(*)
28,7 a

4,5 a

Mềm, xốp, có nốt hình cầu
MS ½
74,6 b

24,0 a

2,9 b

Mềm, xốp, có nốt hình cầu
WPM
78,2 b

24,1 a

2,7 b

Mềm, xốp, có nốt hình cầu
B5
100 a

26,6 a

3,2 b

Mềm, xốp, có nốt hình cầu
White
61,9 c

23,5 a

0 c

Mềm, xốp, dễ vỡ vụn
SH
100 a

27,2 a

3,5 b

Mềm, xốp, có nốt hình cầu
Nitsch
100 a

27,8 a

3,4 b

Mềm, xốp, có nốt hình cầu
Chú thích: (*) Những chữ cái khác nhau (a,b,c,…) trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở
mức α = 0,05 trong phép thử DMRT
Sự hấp thu các nguyên tố khoáng từ môi trƣờng nuôi cấy trong quá trình cảm ứng và suốt
giai đoạn đầu phát sinh phôi vô tính đã đƣợc chứng minh (Dussert và cs., 1995; Fisichella và cs.
2000). Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng thành phần khoáng đa lƣợng của 7 loại môi trƣờng
thƣờng đƣợc sử dụng trong lĩnh vực nuôi cấy mô và tế bào thực vật: MS, MS ½, WPM, B5, White,
SH, Nitsch. Mỗi môi trƣờng đều đƣợc bổ sung thành phần vi lƣợng và vitamin của MS, đồng thời
bổ sung thêm 1,5 mg/l Kinetin và 0,5 mg/l 2,4-D. Sau 4 tuần nuôi cấy, kết quả cho thấy hầu hết các
Kỷ yếu hội nghị Khoa học Môi trường và Công nghệ sinh học năm 2011

197

môi trƣờng đều cảm ứng sự hình thành mô sẹo với tỉ lệ cao. Số lƣợng cấu trúc hình cầu giống phôi
vô tính hình thành nhiều nhất ở mẫu lá đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng có thành phần khoáng đa
lƣợng của MS. Không có sự khác biệt đáng kể nào giữa các nghiệm thức khoáng đa lƣợng khác
nhau đƣợc ghi nhận ngoại trừ trên môi trƣờng White không có sự hình thành cấu trúc hình cầu
giống phôi. Trên môi trƣờng White, tất cả các mẫu cấy đều phát triển thành mô sẹo mềm, kết cấu
xốp và dễ vỡ vụn mà không có sự hiện diện của cấu trúc giống phôi nào (Bảng 3).
Sự kết hợp các thành phần khoáng đa lƣợng cảm ứng sự phát sinh phôi vô tính hiệu quả nhất
đối với cây Cọc rào là môi trƣờng MS. Kết quả này có thể do hàm lƣợng nitơ trong môi trƣờng cao,
ít nhất là gấp hai lần so với những môi trƣờng khác; một nguyên nhân khác có thể là do sự cân bằng
giữa nitrate và ammonium trong môi trƣờng nuôi cấy. Nhƣ đƣợc chỉ ra trong Bảng 1, môi trƣờng
MS có chứa 60 mM nitơ trong đó hàm lƣợng NO
3
-
chiếm 39,4 mM và hàm lƣợng NH
4
+
chiếm 20,6
mM trong khi trong tất cả các môi trƣờng khác, hàm lƣợng nitơ không vƣợt quá 30 mM. Kết quả
phân tích tƣơng quan tuyến tính cũng chỉ ra mối quan hệ giữa hàm lƣợng nitơ trong môi trƣờng và
đáp ứng phát sinh phôi ở cây Dầu mè (Biểu đồ 1). Có một sự tƣơng quan mạnh đƣợc ghi nhận giữa
số lƣợng cấu trúc giống phôi trung bình trên mỗi mẫu lá và hàm lƣợng nitơ tổng trong các môi
trƣờng khác nhau (R
2
= 0,7284).
y = 0.0686x + 1.0291
R
2
= 0.7284

0
1
2
3
4
5
6
0 10 20 30 40 50 60 70
Hàm lượng nitơ tổng (mM)
Số cấu trúc giống phôi

Biểu đồ 1. Mối tƣơng quan giữa hàm lƣợng nitơ tổng (mM) trong các môi trƣờng nuôi cấy và sự hình thành
các cấu trúc hình cầu giống phôi
Kết quả tƣơng tự cũng đã đƣợc báo cáo trên 2 dòng sắn (Manihot esculenta), sự hình thành
cấu trúc giống phôi đạt đƣợc trên môi trƣờng MS lớn hơn so với trên môi trƣờng SH, WPM hay B
5

(Taylor và cs., 1996). Hơn nữa, việc loại bỏ NH
4
+
hay NH
4
NO
3
ra khỏi môi trƣờng MS làm giảm sự
hình thành những cấu trúc phôi. Sự phát sinh phôi vô tính trên môi trƣờng SH thấp hơn so với trên
môi trƣờng MS (Trigiano và cs., 1992) nhƣng khi bổ sung NH
4
+
vào môi trƣờng SH làm kích thích

sự phát sinh phôi ngang bằng với trên môi trƣờng MS. Môi trƣờng MS cũng hiệu quả hơn trong
việc cảm ứng phát sinh khối mô sẹo có khả năng phát sinh phôi ở cây Pistacia vera so với môi
trƣờng WPM (Onay và cs., 1995) và trong nuôi cấy bao phấn cây Helianthus annuus, môi trƣờng
MS cũng gây ra đáp ứng phát sinh phôi tốt hơn môi trƣờng Nitsch, B
5
và White (Thengane và cs.,
1994). Tác động kích thích của nguồn nitơ khử trong môi trƣờng lên sự phát sinh phôi vô tính cũng
đƣợc ghi nhận trong quá trình nuôi cấy cỏ Linh lăng trên môi trƣờng SH có bổ sung thêm muối
ammonium (Walker và Sato, 1981).
Bên cạnh hàm lƣợng nitơ tổng, có thể nhận thấy rằng sự khác biệt về khả năng hình thành mô
sẹo có khả năng phát sinh phôi còn chịu ảnh hƣởng bởi hàm lƣợng ion K
+
và Ca
2+
. Ion K
+
liên quan
đến bơm proton và trong sự vận chuyển gián tiếp các chất hòa tan (Briskin và Hanson, 1992) có thể
là yếu tố giới hạn sự phát sinh phôi vô tính. Vì vậy, trong nuôi cấy huyền phù Cà rốt, hàm lƣợng
potassium thấp trong môi trƣờng nuôi cấy làm hạn chế sự hình thành phôi vô tính mà không ảnh
hƣởng đến sự tăng trƣởng tế bào trong khi hàm lƣợng potassium cao làm tăng mạnh số lƣợng phôi
(Brown và cs., 1976). Sự phát sinh phôi vô tính cũng có thể chịu ảnh hƣởng bởi calcium. Ca
2+
hoạt
động nhƣ là một tín hiệu thứ cấp trong con đƣờng truyền tín hiệu kích thích ngoại bào bằng cách
gắn với calmodulin hay các protein gắn calcium khác để kiểm soát nhiều đáp ứng sinh lý tế bào
(Bush, 1995). Ở Cà rốt, sự phân cực hình thái của các cụm tế bào sinh phôi kết hợp với Ca
2+
nội bào
tự do (Timmers và Schel, 1991). Hơn nữa, sự gia tăng hàm lƣợng CaCl

2
trong môi trƣờng cảm ứng
hình thành số lƣợng phôi nhiều hơn (Silva và Ricardo, 1992).
Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên sự phát triển của mô sẹo có khả năng phát sinh phôi
Kỷ yếu hội nghị Khoa học Môi trường và Công nghệ sinh học năm 2011
198

Trong thí nghiệm này, chúng tôi nhận thấy rằng các nhân tố môi trƣờng nhƣ trạng thái vật lý
của môi trƣờng và điều kiện khí oxy hòa tan có những ảnh hƣởng chuyên biệt trong sự cảm ứng tạo
các cấu trúc hình cầu giống phôi và gia tăng sự phát sinh phôi từ mô sẹo.
Sinh khối mô sẹo mang đi nuôi cấy trong môi trƣờng lỏng tĩnh tăng sinh rất chậm so với trong
môi trƣờng thạch rắn và môi trƣờng lỏng lắc (Bảng 4); không những vậy, cấu trúc mô sẹo từ nuôi
cấy lỏng tĩnh cũng không có khả năng phát triển thành những khối hình cầu có cấu trúc giống phôi
(Hình 1b
2
).
Bảng 4. Ảnh hƣởng của điều kiện nuôi cấy lên sự phát triển của mô sẹo sinh phôi
Điều kiện
nuôi cấy
Trọng lƣợng
tƣơi mô sẹo (mg)
Số cấu trúc
giống phôi
Hình thái mô sẹo
Đặc
28,7 ab
(*)
4,5 b

Mềm, xốp, màu xanh nhạt, có cấu trúc hình cầu

Lỏng tĩnh
22,4 b

0 c

Mềm, màu vàng nhạt, bề mặt ƣớt, không có cấu
trúc hình cầu
Lỏng lắc
34,5 a

10,2 a

Mềm, màu kem, bề mặt ƣớt, có nhiều cấu trúc
hình cầu
Chú thích: (*) Những chữ cái khác nhau (a,b,c,…) trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở
mức α = 0,05 trong phép thử DMRT
Sự gia tăng sinh khối mạnh mẽ của cụm mô sẹo trên môi trƣờng đặc so với môi trƣờng lỏng
tĩnh trong một thời gian ngắn là rất đáng đƣợc ghi nhận (Bảng 4). Hoạt động phân chia của cụm mô
sẹo trên môi trƣờng bán rắn rất tốt, khi đƣợc nuôi cấy ngoài sáng, các tế bào mô sẹo sinh tổng hợp
diệp lục tốt, có màu xanh mƣớt và có sự hình thành những cấu trúc hình cầu từ rất sớm (sau 20 ngày
nuôi cấy) (Hình 1b
1
).
Mô sẹo đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng lỏng đặt trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút phát
triển thành các khối tế bào có màu vàng kem, hơi rời rạc, bề mặt dạng nốt, có thể nhận thấy rõ sự
xuất hiện của những cấu trúc tiền phôi hình cầu có đƣờng kính lớn khoảng 1 mm (Hình 1b
3
). Số
lƣợng cấu trúc giống phôi trong môi trƣờng lỏng tĩnh (10,2 phôi hình cầu/mẫu mô sẹo) tăng đáng kể
so với trên môi trƣờng rắn (4,5 phôi hình cầu/mẫu mô sẹo) tuy nhiên khả năng gia tăng sinh khối vẫn

không có sự khác biệt đáng kể. Sau 30 ngày, thể tích môi trƣờng giảm dần, có thể do môi trƣờng bốc
hơi và do sự hấp thu dinh dƣỡng lỏng của mẫu cấy để tiếp tục tăng sinh, do đó phải tiến hành cấy
chuyền trên cùng loại môi trƣờng. Trong suốt thời gian cấy chuyền này, các tế bào liên tục trải qua
các chu kỳ phân chia tế bào để cuối cùng có thể đạt đến trạng thái sinh phôi. Ngoài ra, việc duy trì
khối mô sẹo trong môi trƣờng cảm ứng trong một thời gian dài không chỉ có tác dụng cảm ứng tế
bào sang trạng thái sinh phôi, mà còn có thể duy trì và gia tăng khả năng sinh phôi của mẫu cấy.
Sự trưởng thành, biệt hóa và nảy mầm của phôi vô tính
Mô sẹo với các khối tiền phôi đƣợc tách thành những cụm nhỏ và cấy sang môi trƣờng có bổ
sung Kinetin và 2,4-D ở nồng độ thấp hơn cho thấy những kết quả khác nhau (Bảng 5)
Bảng 5. Ảnh hƣởng của Kinetin và 2,4-D lên sự trƣởng thành và biệt hóa phôi
Kinetin
(mg/l)
2,4-D
(mg/l)
Tỉ lệ phát
sinh phôi (%)
Số lƣợng phôi ở các giai đoạn
Hình cầu
Hình tim
Hình thủy lôi
Lá mầm
1,0
-
73
12
3
2
1
1,0
0,05

82
15
2
3
3
1,0
0,10
67
17
2
2
1
1,0
0,25
58
14
4
2
1
1,0
0,50
54
12
1
1
0
1,0
0,75
50
11

2
1
0
1,0
1,00
41
9
1
1
0

Kết quả đƣợc chỉ ra cho thấy tần suất mô sẹo phát sinh phôi vô tính hình cầu cao nhất (82%)
đƣợc ghi nhận trên môi trƣờng có sự kết hợp 1,0 mg/l Kinetin và 0,05 mg/l 2,4-D sau 4 – 6 tuần
nuôi cấy.
Kỷ yếu hội nghị Khoa học Môi trường và Công nghệ sinh học năm 2011
199


Hình 2. Sự trƣởng thành, biệt hóa và nảy mầm của phôi vô tính Dầu mè
a
1
. Phôi hình cầu; a
2
. Phôi hình tim; a
3
. Phôi hình thủy lôi; a
4
. Phôi giai đoạn lá mầm; b. Hình thái giải phẫu
phôi vô tính Dầu mè; c. Cây con nảy mầm từ phôi; d. Cây con ngoài vƣờn ƣơm
Khi chuyển mô sẹo có các khối tiền phôi sang môi trƣờng chỉ bổ sung 1,0 mg/l Kinetin, chúng

tôi nhận thấy có những thay đổi đáng kể từ phần sinh khối tiền phôi về màu sắc và kết cấu, đặc biệt
là những biểu hiện phát triển biệt hóa rất nhanh chóng của phôi vô tính trên môi trƣờng này. Kết
quả giải phẫu hình thái phôi vô tính cho thấy có sự hình thành của các cấu trúc lƣỡng cực gồm
những tế bào nhỏ, tế bào chất đậm đặc, bắt màu đậm (Hình 2b).
Vai trò của cytokinin và auxin trong các giai đoạn phát sinh phôi vô tính khác nhau đã đƣợc
báo cáo (Fujimura và Komamine, 1980; Lo Schiavo và cs., 1989; Litz và Gray, 1995). Sự kết hợp
của auxin và cytokinin trong nghiên cứu này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu phát sinh phôi
vô tính ở cây Coffea Arabica (Neuenschwnader và Baumann, 1992). Cụm phôi vô tính hình cầu có
thể đƣợc quan sát trong suốt 2 – 3 tuần đầu trên môi trƣờng tăng sinh phôi. Phôi vô tính hình cầu có
màu kem, tròn và có tổ chức cao đƣợc biệt hóa từ phần rìa của khối mô sẹo sau 4 tuần nuôi cấy.
Chúng bám vào khối mô sẹo có khả năng phát sinh phôi trong khi phần còn lại của mô sẹo vẫn
trắng và hơi mờ. Phôi vô tính hình cầu đƣợc cấy chuyền sang môi trƣờng tăng sinh phôi tƣơng tự
dần dần chuyển sang các giai đoạn phôi hình tim, hình thủy lôi và giai đoạn lá mầm với 2 cực rõ
ràng so với phôi hình cầu chiếm đa số trong quá trình nuôi cấy (Hình 2a).
Bảng 6. Hàm lƣợng hormone nội sinh trong phôi vô tính Dầu mè ở những giai đoạn phát triển khác nhau
Hormone nội sinh
Nồng độ
Phôi hình cầu
Phôi hình tim/
Thủy lôi
Phôi lá mầm
Zeatin (μg/kg)
3880,2
2784,3
26,9
IAA (mg/kg)
ND
(*)
ND
ND

GA
3
(mg/kg)
ND
ND
ND
Chú thích: (*) ND – Không phát hiện ở mức LOD (giới hạn phát hiện) = 0,1 mg/kg
Kết quả phân tích hàm lƣợng hormone nội sinh trong phôi vô tính ở những giai đoạn khác
nhau cho thấy ở giai đoạn phôi hình cầu, hàm lƣợng cytokinin nội sinh rất cao, tuy nhiên không
phát hiện thấy có sự hiện diện của auxin nội sinh (Bảng 6). Điều này có thể do trong những giai
đoạn cảm ứng mô sẹo trƣớc đó đã sử dụng 2,4-D ở nồng độ tƣơng đối cao nên các tế bào đã sử
dụng 2,4-D thay thế cho vai trò của IAA nội sinh. Khi phôi vô tính phát triển sang những giai đoạn
tiếp theo, hàm lƣợng cytokinin nội sinh giảm dần. Đến giai đoạn xuất hiện lá mầm, hàm lƣợng
Zeatin chỉ còn lại rất thấp (26,9 μg/kg).
Phôi vô tính trƣởng thành đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng nảy mầm không bổ sung chất điều
hòa tăng trƣởng trong 2 tuần để kích thích phát triển thành cây con hoàn chỉnh có chồi và rễ. Ban
đầu, cây con phát triển tốt với nhiều lá xanh. Phôi vô tính đƣợc tạo thành cũng nhƣ đã nảy mầm
xuất hiện lẫn lộn trong đám mô sẹo, do đó một động tác tách các phôi đã nảy mầm để cấy sang môi
trƣờng mới cho cây con phát triển hoàn chỉnh và mạnh khỏe là điều cần thiết. Sau khi đƣợc cấy
sang môi trƣờng mới, rễ mầm bắt đầu đƣợc kéo dài. Dần dần, cây phát triển nên một hệ thống rễ
dày đặc và khỏe, bộ rễ đâm thẳng xuống môi trƣờng thạch (Hình 2c). Hệ rễ phát triển khỏe mạnh
hút chất dinh dƣỡng trong môi trƣờng cung cấp cho cây tăng trƣởng và phát triển chồi. Thời gian
Kỷ yếu hội nghị Khoa học Môi trường và Công nghệ sinh học năm 2011
200

các phôi vô tính trong cùng một mẫu mô sẹo nảy mầm cũng khác nhau. Tuy nhiên, sau 45 ngày thì
tỷ lệ nảy mầm của các phôi vô tính là 70%. Nhƣ vậy, phôi vô tính Dầu mè đƣợc tạo thành gián tiếp
thông qua giai đoạn tạo mô sẹo dƣới sự tác động của Kinetin và 2,4-D cho thấy có sự nảy mầm tốt,
ngoài ra cây con tạo thành không có những biểu hiện gì bất thƣờng.

KẾT LUẬN
Cây Dầu mè là một trong những loại cây trồng đa mục đích mang lại hiệu quả kinh tế cao,
nhất là đối với những nƣớc đang phát triển nhƣ Việt Nam. Đã có nhiều nghiên cứu trong việc tái
sinh loài cây trồng có giá trị này. Tuy nhiên, kết quả đạt đƣợc trong nghiên cứu của chúng tôi cho
thấy mẫu cấy lá là một loại mô cấy thích hợp để nhân giống cây Dầu mè thông qua con đƣờng phát
sinh phôi vô tính. Kết quả đạt đƣợc là tiền đề cho những nghiên cứu chuyển gene trong tƣơng lai
nhằm nâng cao sản lƣợng quả và hàm lƣợng dầu trong quả phục vụ cho ngành công nghiệp năng
lƣợng.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
Briskin D, Hanson JB (1992) How does the plant plasma membrane HC-ATPase pump protons. J
Exp Bot 43: 269-289.
Brown S, Wetherell DF, Dougall DK (1976) The potassium requirement for growth and
embryogenesis in wild carrot suspension cultures. Physiol Plant 37: 73-79.
Bush DS (1995) Calcium regulation in plant cells and its role in signalling. Annu. Rev. Plant
Physiol Plant Mol Biol 46: 95-122.
Duncan DB (1995) Multiple range and Multiple F tests. Biometrics 11(1): 1-5.
Dussert S, Verdeil JL, Buffard-Morel J (1995) Specific nutrient uptake during initiation of somatic
embryogenesis in coconut calluses. Plant Sci 111: 229-236.
Fisichella M, Silvi E, Morini S (2000) Regeneration of somatic embryos and roots from quince
leaves cultured on media with different macroelement composition. Plant Cell Tis Org Cult 63:
101-107.
Fujimura T, Komamine A (1980) Mode of action of 2,4-D and zeatin on somatic embryogenesis in
carrot suspension culture. Z Pflazenphysiol 99: 1-8.
Gamborg OL, Miller RA, Ojima K (1968) Nutrient requirements of suspension cultures of soybean
root cells. Exp Cell Res 50: 151-158.
George EF, Sherrington PD (1984) Plant Propagation by Tissue Culture. Edington, UK; Exegetics
Ltd
Heller J (1996) Physic nut, Jatropha curcas L. International Plant Genetic Resource Institute,
Rome: 1-66.

Jha TB, Mukherjee P, Datta MM (2007) Somatic embryogenesis in Jatropha curcas Linn., an
important biofuel plant. Plant Biotech Rep 1: 135-140.
Litz RE, Gray DJ (1995) Somatic embryogenesis for agricultural improvement. World J Microbiol
Biotechnol 11: 416-425.
Lloyd G, McCown BH (1980) Commercially feasible micropropagation of mountain laurel (Kalmia
latifolia) by use of shoot tip culture. Int Plant Prop Soc, Comb Proc 30: 421-427.
Lo Schiavo F (1989) DNA methylation of embryogenic carrot cell cultures and its variations as
caused by mutation, differentiation, hormones and hypomethylating drugs. Theor Appl Genet 77:
325-331.
Murashige T, Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue
cultures. Physiol Plant 15: 473-479.
Neuenschwander B, Baumann TW (1992) A novel type of somatic embryogenesis in Coffea
arabica. Plant Cell Rep 10: 608-612.
Nitsch JP, Nitsch C (1969) Haploid plants from pollen grains. Science 163: 85-87.
Onay A, Jeffree CE, Yeoman MM (1995) Somatic embryogenesis in cultured immature kernels of
Pistachio (Pistacia vera L). Plant Cell Rep 15: 192-195.
Kỷ yếu hội nghị Khoa học Môi trường và Công nghệ sinh học năm 2011
201

Openshaw K (2000) A review of Jatropha curcas: an oil plant of unfulfilled promise. Biomass
Bioener 19: 1-15.
Prabakaran AJ, Sujatha M (1999) Jatropha tanjorensis Ellis and Saroja, a natural interspecific
hybrid occurring in Tamil Nadu, India. Genet Resour Crop Evol 46(3): 213-218.
Rajore S, Batra A (2005) Efficient plant regeneration via shoot tip explant in Jatropha curcas. J
Plant Biochem Biotech 14: 73-75.
Sardana J, Batra A, Ali DJ (2000) An expeditious method for regeneration of somatic embryos in
Jatropha curcas L. Phytomorphology 50: 239-242.
Schenk RU, Hildebrandt AC (1972) Medium and techniques for induction and growth of
monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures. Can J Bot 50: 199-204
Shrivastava S, Banerjee M (2008) In vitro clonal propagation of physic nut (Jatropha curcas L.):

Influence of additives. Inter J Integrative Bio 3(1): 73-79.
Silva P, Ricardo CPP (1992) Beta-fructosidases and in vitro dedifferentiation-redifferentiation of
carrot cells. Phytochem 31: 1507-1511.
Sujatha M, Makkar HPS, Becker K (2006) Shoot bud proliferation from axillary nodes and leaf
sections of non-toxic Jatropha curcas L. Plant Grow Reg 47: 83-90.
Sujatha M, Mukta N (1996) Morphogenesis and plant regeneration from tissue cultures of Jatropha
curcas. Plant Cell Tis Org Cult 44: 135-141.
Taylor NJ, Edwards M, Kiernan RJ, Davey CDM, Blakesley D, Henshaw GG (1996) Development
of friable embryogenic callus and embryogenic suspension culture systems in cassava (Manihot
esculenta Crantz). Nature Bio 14: 726-730.
Thái Xuân Du, Nguyễn Văn Uyển (2006). Triển vọng sản xuất dầu diesel từ cây Cọc rào (Jatropha
curcas L.) ở Việt Nam. Hội thảo: Nhiên liệu sinh học ở Việt Nam, tiềm năng và cơ hội phát
triển, NXB Khoa học và kỹ thuật, 88-94.
Thengane SR, Joshi MS, Khuspe SS, Mascarenhas AF (1994) Anther culture in Helianthus annuus
L., influence of genotype and culture conditions on embryo induction and plant regeneration.
Plant Cell Rep 13: 222-226.
Timmers ACJ, Schel JHN (1991) Localization of cytosolic Ca
2+
during carrot somatic
embryogenesis using confocal scanning laser microscopy. In: Karsenn CM, van Loon LC,
Vreugdenhil D (eds) Progress in Plant Growth Regulation. Dordrecht: Kluwer Academic
Publishers 347–353.
Trigiano RN, May RA, Conger BV (1992) Reduced nitrogen influences somatic embryo quality and
plant regeneration from suspension cultures of orchardgrass. In Vitro Cell Dev Biol 28: 187-191.
Walker KA, Sato SJ (1981) Morphogesis in callus tissue of Medicago sativa: the role of ammonium
ion in somatic embryogenesis. Plant Cell Tiss Org Cult 1: 109-121.
White PR (1963) The Cultivation of Animal and Plant Cells, 2
nd
edn. New York: Ronald Press.