XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG AZITHROMYCIN TRONG HUYẾT TƯƠNG.DOC

Website: Email : Tel (: 0918.775.368
bộ GIáO DụC Và ĐàO TạO Bộ Y Tế
TRƯờNG ĐạI HọC DƯợC Hà NộI
Dơng Hải Thuận
xây dựng phơng pháp định lợng
azithromycin trong huyết tơng
luận văn thạc sĩ dợc học
Hà nội - 2008



bộ GIáO DụC Và ĐàO TạO Bộ Y Tế
TRƯờNG ĐạI HọC DƯợC Hà NộI
Dơng Hải Thuận
xây dựng phơng pháp định lợng
azithromycin trong huyết tơng
Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc - độc chất
Mã số: 607315
luận văn thạc sĩ dợc học
Ngời hớng dẫn: TS. Nguyễn Thị Kiều Anh
TS. Phạm Thị Thanh Hà
Hà nội - 2008

Lời cảm ơn
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Thị Kiều Anh, TS.
Phạm Thị Thanh Hà đã tận tình hớng dẫn chỉ bảo, và tạo điều kiện thuận lợi
cho tôi trong suốt quá trìmh học tập và nghiên cứu thực hiện đề tài.
Tôi xin trân trọng cám ơn Ban giám hiệu nhà trờng, trân trọng cám ơn
các thầy giáo, cô giáo Phòng Đào tạo sau đại học, Bộ môn Phân tích cùng
các Bộ môn khác của trờng Đại học Dợc Hà Nội đã giảng dạy tận tình và
tạo điều kiện tốt cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trờng.

Tôi xin chân thành cám ơn Ban lãnh đạo Viện Kiểm nghiệm thuốc
trung ơng, Ban lãnh đạo Viện dinh dỡng, phòng Vật lý đo lờng-viện kiểm
nghiệm thuốc trung ơng, Trung tâm kiểm nghiệm vệ sinh an toàn thực phẩm-
Viện dinh dỡng nơi tôi thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cám ơn Ban lãnh đạo Trung tâm y tế dự phòng tỉnh
Thái Nguyên nơi tôi công tác đã quan tâm tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn
thành nhiệm vụ học tập và nghiên cứu trong thời gian qua.
Cuối cùng xin cám ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, chia sẻ,
khích lệ và giúp đỡ tôi tận tình để có kết quả ngày hôm nay.
Dơng Hải Thuận
Học viên cao học khóa 11 chuyên ngành
Kiểm nghiệm thuốc và độc chất


Mục lục
Lời cảm ơn.
Mục lục.
Danh mục các từ viết tắt.
Danh mục các bảng.
Danh mục các hình.

Trang
Đặt vấn đề
1
Chơng 1: Tổng quan
3
1.1. Vài nét về azithromycin 3
1.2. Một số phơng pháp định lợng AZI trong dịch sinh học. 5
1.3. Nguyên tắc chung về phơng pháp phân tích bằng HPLC 7
1.3.1. Phân tích định tính. 7

1.3.2. Phân tích định lợng: 8
1.4. Vài nét về HPLC với detector huỳnh quang. 9
1.5. V i nét về LC-MS. 10
Chơng 2: Đối tợng, nội dung và phơng pháp nghiên cứu.
13
2.1. Đối tợng nghiên cứu. 13
2.2. Hoá chất và thiết bị 13
2.3. Phơng pháp nghiên cứu: 14
2.3.1. Khảo sát xây dựng quy trình định lợng AZI trong dung môi
bằng HPLC detector huỳnh quang
15
2.3.2. Khảo sát xây dựng quy trình định lợng AZI trong HT bằng
LC-MS.
15
2.3.2.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn. 15
2.3.2.2. Xử lý mẫu 16
2.3.2.3. Khảo sát điều kiện để định lợng AZI. 16
2.3.2.4 Thẩm định phơng pháp phân tích 16
2.3.2.5. Xác định hiệu suất chiết 18
2.3.3. Định lợng thăm dò AZI trong HT ngời uống AZI 18
2.3.4. Phân tích số liệu thực nghiệm 18
Chơng 3: Kết quả
19
3.1. Xây dựng quy trình xử lý mẫu 19
3.2. Khảo sát xây dựng quy trình định lợng AZI trong dung môi bằng
HPLC detector huỳnh quang.
21
3.2.1.Điều kiện chạy sắc ký để định lợng AZI 21
3.2.2. Khảo sát điều kiện tạo dẫn xuất huỳnh quang 22

3.2.3. Kết quả đánh giá một số chỉ tiêu thẩm định. 24
3.3. Khảo sát xây dựng chơng trình sắc ký lỏng khối phổ để định lợng
AZI trong HT.
30
3.3.1. Khảo sát lựa chọn chất chuẩn nội 30
3.3.2. Xác định điều kiện khối phổ. 32
3.3.3. Xác định chơng trình sắc ký. 33
3.3.4. Kết quả thẩm định phơng pháp phân tích. 36
3.3.4.1. Đánh giá tính chọn lọc. 36
3.3.4.2. Đánh giá tính phù hợp của hệ thống. 37
3.3.4.3. Xác định khoảng nồng độ tuyến tính. 38
3.3.4.4. Xác định LOD và LOQ 40
3.3.4.5. Độ đúng 40
3.3.4.6. Độ chính xác 41
3.4. Xác định hiệu suất chiết 42
3.5. Định lợng thăm dò AZI trong HT ngời tình nguyện. 43
Chơng 4. Bàn luận.
45
4.1. Về xây dựng và thẩm định phơng pháp định lợng AZI. 45
4.1.1.Về xây dựng và thẩm định phơng pháp định lợng AZI trong
dung dịch bằng HPLC với dertecter huỳnh quang.
45
4.1.2. Về xây dựng và thẩm định phơng pháp định lợng AZI trong
HT bằng LC-MS.
46
4.2. Về kết quả định lợng thăm dò AZI trong HT ngời tình nguyện. 48
Kết luận và kiến nghị
49
Kết luận 49

Kiến nghị 51
Tài liệu tham khảo
Phụ lục


BẢNG CH TH CH C CÚ Í Á CHỮ VIẾT TẮT
APCI :
Ion hóa học ở áp xuất thường (Atmospheric pressure
chemical ionization)
AZI : Azithromycin
CLA : Clarithromycin
C
max
:
Nồng độ thuốc tối đa
ESI
Ion hóa bằng phun điện tử (Electronsray Ionization)
FMOC-Cl 9-fluorenylmethyloxycarbonyl chlorid
HPLC :
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid
Chromatography)
HT :
Huyết tương
IS :
Nội chuẩn (Internal standard)
LC-MS :
Sắc ký lỏng ghép khối phổ (Liquid Chromatography-Mass
Spectrometry)
LOD :
Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

LOQ :
Giíi h¹n ®Þnh lîng (Limit of Quantification)
MS :
Khối phổ (Mass Spectrometry)
PĐ
:
Pha động
PA :
Tinh khiết phân tích (Pure for Analysis)
RSD :
Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)
ROXI : Roxithromycin
SD :
Độ lệch chuẩn (Standard Deviation)
S/N :
Tín hiệu/nhiễu đường nền (Signal/Noise)
TB : Trung bình
TƯ
:
Trung ương
UV :
Tử ngoại (Ultra Violet)
VN :
Việt Nam


DANH MC C C B NG TRONG LUN VN
Bn
g
Ni dung

Trang
1.1
Một số nghiên cứu định lợng AZI trong dịch sinh học bằng HPLC
6
2.1
Danh mục hóa chất- thuốc thử-chất chuẩn
13
3.1
Quy trình tạo dãy mẫu chuẩn và dẫn xuất hóa
22
3.2
Kt qu kho sỏt tớnh phự hp ca h thng HPLC.
27
3.3
S ph thuc gia t s din tớch pic v n ng AZI
28
3.4
Kt qu kho sỏt tớnh phự hp ca h thng LC-MS
38
3.5
S ph thuc gia t s din tớch pic v n ng AZI trong HT
39
3.6
Kt qu xỏc nh ỳng ca phng phõn tớch
41
3.7
Kt qu xỏc nh lp trong ng y c a phộp phõn tớch
42
3.8
Kt qu xỏc nh hiu sut chit

43
3.9
Kt qu nh lng thm dũ AZI trong HT ngi tỡnh nguyn
43


DANH MC CC HèNH TRONG LUN VN
Hỡn
h
Ni dung
Trang
3.1
S quy trình chit AZI trong HT
20
3.2.
Kết quả khảo sát nhiệt độ phản ứng tạo dẫn xuất huỳnh quang
23
3.3
Kết quả khảo sát thời gian phản ứng tạo dẫn xuất huỳnh quang
24
3.4
Sắc ký đồ mẫu trắng
25
3.5
Sắc ký đồ mẫu có AZI
25
3.6
Sắc ký đồ mẫu có CLA
26
3.7

Sắc ký đồ mẫu có AZI và CLA
26
3.8
Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa tỷ số diên tích pic và nồng độ
AZI
28
3.9
Sắc ký đồ AZI 0,5
à
g/ml và CLA 5
à
g/ml
29
3.10
Phổ khối AZI
30
3.11
Phổ khối CLA
31
3.12
Phổ khối ROXI
31
3.13
Sắc ký đồ AZI và ROXI chạy cột Thermo C18(50x2,1mm; 5
à
m)
34
3.14
Sắc ký đồ AZI và ROXI chạy cột Zorbax C18 SB (150x4,6; 5
à

m)
34
3.15
Sắc ký đồ AZI và ROXI chạy chạy chế độ dẳng dòng 0,5ml/phút
hệ dung môi acetonitril : amoni acetat 0,05M(6:4)
35
3.16
Các sắc ký đồ thể hiện sự chon lọc của phơng pháp.
37
3.17
Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa tỷ số diên tích pic(AZI/ROXI) và
nồng độ AZI trong HT
39
3.18
Sắc ký đồ mẫu HT xác định LOQ
40
3.19
Các sắc ký đồ định lợng AZI trong HT 2 ngời tình nguyện T
1
và T
2
44


Đặt vấn đề
Cùng với sự phát triển của ngành công nghiệp dợc phẩm, lĩnh vực phân
tích và đảm bảo chất lợng thuốc cũng không ngừng lớn mạnh, gắn bó chặt chẽ
với nhau và có quan hệ tơng hỗ để cùng nhau phát triển. Vào những năm 60
của thế kỷ 20, vấn đề sinh khả dụng của thuốc đợc đề cập tới và nhanh chóng
trở thành vấn đề đợc hầu hết các hãng dợc phẩm lớn quan tâm và phát triển. Nó

trở thành một động lực thúc đẩy các nhà bào chế tìm ra công thức thuốc tốt
nhất, an toàn nhất cho một loại hoạt chất
Từ cuối năm 2003, Viện Kiểm nghiệm đã triển khai một mô hình thử
nghiệm để đánh giá tơng đơng sinh học của thuốc nhằm xây dựng nên một qui
chế cho đánh giá tơng đơng sinh học [7]. Những quy chế này sẽ làm tiền đề
cho các nghiên cứu sinh khả dụng, tơng đơng sinh học và dợc động học của
thuốc, góp phần quản lý chặt chẽ, nâng cao chất lợng thuốc sản xuất trong nớc.
Chúng ta đã có một số nghiên cứu về lĩnh vực này [1], [3], [7]. Tuy nhiên, con
ngời đợc đào tạo về lĩnh vực phân tích sinh học này rất ít do đó để triển khai và
phát triển nghiên cứu sinh khả dụng và tơng đơng sinh học của thuốc không
những phải đầu t vào trang thiết bị mà còn phải chú trọng vào đào tạo con ngời.
Phơng pháp phân tích để định lợng thuốc và chất chuyển hóa của nó
trong dịch sinh học đóng vai trò quyết định trong đánh giá và diễn giải các số
liệu nghiên cứu sinh khả dụng, tơng đơng sinh học và dợc động học của thuốc.
Để làm đợc điều này, các phơng pháp phân tích sinh học dựa trên kỹ thuật hóa
lý và sinh học hiện đại đợc phát triển và ứng dụng rộng rãi trong đó có phơng
pháp HPLC đợc sử dụng rất phổ biến. Các phơng pháp phân tích sinh học phải
đợc thẩm định trớc để đảm bảo kết quả thu đợc là chính xác, đáng tin cậy. Qui
định một qui trình và các tiêu chí thẩm định phơng pháp phân tích sinh học đã
đợc thảo luận ở rất nhiều hội nghị quốc tế lớn về công nghiệp dợc phẩm.
Trong thực tế chúng tôi nhận thấy thuốc của Việt Nam sản xuất không
thua kém về sinh khả dụng so với chế phẩm nổi tiếng cùng loại của nớc ngoài
(các chế phẩm nghiên cứu đều có tơng đơng sinh học với chế phẩm đối chiếu)
1

nhng giá thành chênh lệch nhau gấp 10 lần thậm chí 30 40 lần. Về giá
bán cũng đúng với trờng hợp chế phẩm azithromycin, trong khi viên Azithrin
250 của Pfizer giá khoảng 80.000 90.000 đ/ viên, viên Usmax 250 của
Dong In Dang Pharmaco (Hàn Quốc) giá khoảng 34.000 đ/ viên, ... thì viên
Azithromycin 250 của Traphaco hoặc Azimax 250 của Imexpharm giá chỉ

khoảng 3.000 đ/ viên. Do đó, đánh giá sinh khả dụng và tơng đơng sinh học
của chế phẩm chứa Azithromycin nói riêng và các thuốc của Việt Nam sản
xuất nói chung là một việc làm hết sức cần thiết nhằm mục đích phục vụ ngời
bệnh những thuốc có chất lợng cao, giá cả hợp lý phù hợp với điều kiện kinh tế
ngời Việt Nam, đồng thời thúc đẩy nhà sản xuất không ngừng nâng cao chất l-
ợng để sản phẩm của mình có tính cạnh tranh cao.
Xuất phát từ thực tế đó chúng tôi chọn đề tài "Xây dựng phơng pháp
định lợng arithromycin trong huyết tơng"
Mục tiêu của đề tài:
- Xây dựng phơng pháp định lợng AZI trong HT.
- Thẩm định phơng pháp phân tích đã xây dựng để khẳng định phơng
pháp có thể áp dụng định lợng AZI trong HT phục vụ cho nghiên cứu sinh khả
dụng và tơng đơng sinh học.
Chơng 1: Tổng quan
1.1 Vài nét về azithromycin(AZI).
*Công thức cấu tạo của AZI [6].
2


H
3
C
N
O
CH
3
H
3
C
O

CH
3
O
OH
CH
3
OH
O
H
3
C
O
O
CH
3
OCH
3
CH
3
CH
3
N
H
3
C
CH
3
HO
OH
H

3
C
CH
3
HO
Công thức phân tử C
38
H
72
N
2
O
12
.
Khối lợng phân tử: 748,98.
Tên khoa học là:10-dihydro-10-deoxo-11-methyl-11-azaerythromycinA.
Trong cấu trúc của AZI không có dây nối đôi liên hợp và các nhóm
mang màu nên nó hấp thụ UV kém, đây chính là điều khó khăn để định lợng
AZI trong dịch sinh học.
* Tính chất [4], [6].
AZI là một kháng sinh thuộc nhóm macrolid, ở dạng bột màu trắng đến
màu trắng ngà, không mùi, vị hơi đắng. Thực tế không tan trong nớc, rất dễ
3

tan trong methanol, aceton, ethanol, diethyl ether, cloroform và dung dịch
acid hydrocloric loãng. Dung dịch 0,2% trong hỗn hợp methanol nớc (1 :
1) có pH là 9,0 11,0. Năng suất quay cực là - 45
o
tới 49
o

(dung dịch 1%
trong ethanol) .
* Dợc động học [4].
Hp thu: AZI hp thu nhanh v sinh kh dng ng ung khong
40%. c bit thuc t nng trong t bo cao hn so vi trong HT vỡ vy
dựng iu tr vi khun ni bo tt. Thc n lm gim hp thu thuc.
Phõn b: Phõn b rng khp trong c th, ch yu vo cỏc mụ nh
phi, amidan, tin lit tuyn, bch cu ht v i thc bo..., cao hn trong
mỏu nhiu ln, tuy nhiờn nng thuc trong h thng thn kinh trung ng
rt thp.
Chuyn hoỏ: Mt lng nh AZI b kh methyl trong gan, v c
o thi qua mt dng khụng bin i v mt phn dng chuyn hoỏ.
Thi tr: Khong 6% liu ung thi tr qua nc tiu trong vũng 72
gi di dng khụng bin i.
*Cơ chế và tác dụng dợc lý [4].
AZI tỏc ng bng cỏch gn kt vo tiu n v 50S ca ribosom v
qua ú c ch s tng hp protein ca vi khun. AZI cú ph khỏng khun
rng v sau khi ung, nng nh trong HT t c sau 2-3 gi.
AZI là một kháng sinh mới có hoạt phổ rộng, có tác dụng tốt trên các vi
khuẩn gram(+) (nh Streptococcus, Pneumococcus, Staphilococcus aureus)
và gram(-) (nh Haemophilus influenzae, Neissria gonorrhoeae). Có tác
dụng vừa phải trên các vi khuẩn Escherichia coly, Samonella enteritis,
Samonella typhi, Klebsiella.
* Tác dụng không mong muốn [4].
- AZI đợc dung nạp tốt, tỷ lệ tác dụng không mong muốn thấp. Hay gặp
nhất là chứng rối loạn tiêu hoá (khoảng 10%) với các triệu chứng nh buồn nôn,
4

đau bụng, co cứng cơ bụng, nôn, đầy hơi, ỉa chảy, nhng thờng nhẹ và ít xẩy
ra hơn so với erythromycin.

- ảnh hởng thính giác: sử dụng lâu dài ở liều cao AZI có thể làm giảm
sức nghe có hồi phục ở một số ngời bệnh.
* Chỉ định [4].
AZI đợc chỉ định dùng trong các trờng hợp nhiễm khuẩn do các vi
khuẩn nhạy cảm với thuốc nh nhiễm khuẩn đờng hô hấp dới (viêm phổi, viêm
phế quản, các nhiễm khuẩn da và mô mềm, viêm tai giữa), đờng hô hấp trên
(viêm xoang, viêm họng và viêm amidan), nhiễm khuẩn đờng sinh dục cha
biến chứng do Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae không đa
kháng.
* Liều dùng và cách dùng [4].
- Dùng 1 lần mỗi ngày, uống trớc bữa ăn 1 giờ hoặc sau khi ăn 2 giờ.
- Ngời lớn: ngày đầu uống 1 liều 500mg và dùng tiếp 4 ngày nữa với
liều đơn 250mg/ngày.
- Trẻ em: liều gợi ý cho trẻ uống ngày đầu là 10mg/kg thể trọng, và 4
ngày tiếp theo là 5mg/kg thể trọng mỗi ngày uống một lần.
* Dạng bào chế [5].
- Viên nang AZI dihydrat tơng đơng AZI 250mg và 500mg.
- Bột pha hỗn dịch uống AZI dihydrat tơng đơng 200mg AZI/ 5ml, lọ
bột đông khô pha tiêm 500mg.
- Viên nén và viên nén bao phim tơng đơng AZI 125mg, 250mg và
500mg; viên nén phân tán tơng đơng AZI 100mg.
1.2. Một số phơng pháp định lợng AZI trong dịch sinh học.
Theo tài liệu khoa học của nớc ngoài có thể định lợng AZI trong dịch
sinh học bằng những phơng pháp sau:
*Các nghiên cứu sử dụng sắc ký
5

Bảng 1.1. Một số nghiên cứu định lợng AZI trong dịch sinh học bằng HPLC
T/ liệu Mẫu thử Cột sắc ký Điều kiện sắc ký
[12]

HT ngời
Acquity UPLC
TM
BHE C
18
( 50
x 2,1 mm;
1,7àm Waters)
- Dung môi chiết: Diethyl ether
- Pha động: MeCN- NH
4
CH
3
COO 0,05M
- Chuẩn nội: ROXI
- Tốc độ dòng: 0,35ml/phút
- Detector: MS
- Đờng chuẩn: 1-1000ng/ml
- LOQ: 1ng/ml
[18]
Huyết
thanh ngời
Al
2
O
3
- Pha động: Na
3
PO
4

0,02M : MeCN(1:3)
pH=10.
- Tốc độ dòng: 1,5ml/phút
- Detector: điện hóa.
- Đờng chuẩn: 10ng/ml 1000ng/ml
[13]
HT ngời
Symmetry C18
(250 x 2,1mm;
3àm)
- Pha động: MeCN- NH
4
CH
3
COO 0,05M.
- Chuẩn nội: CLA
- Tốc độ dòng: 0,5ml/phút
- Detector : MS
- Đờng chuẩn 2,5-2000ng/ml
[10]
Huyết
thanh ngời
Phenyl C18
(250 x 2,1mm;
5àm)
- Dung môi chiết: Hexan
- Pha động: MeOH- Na
3
PO
4

0,05M (71:29);
pH=5,9
- Chuẩn nội: CLA
- Tốc độ dòng: 2,5ml/phút
- Detector huỳnh quang.
- Chất dẫn xuất huỳnh quang: FMOC-Cl.
- Đờng chuẩn: 1-500ng/ml
[14]
Huyết
thanh ngời
Chromegabond
alkylphenyl 5àm
-Pha động: MeCN-MeOH-NH
4
COOCH
3
-
NaHClO
3
(53:10:22:23)
- Detector: điện hóa.
-LOQ: 90ng/ml
[16]
HT ngời
Waters C8
(100 x 4,6mm ;
3,5 àm)
- Dung môi chiết: Tert-butyl metyl ether
- Pha động: MeCN- đệm phosphat
(36,5:63,5) pH=7,40

- Tốc độ dòng: 1,2ml/phút
- Detector : điện hóa
[17]
HT ngời Spheri-5 cyano
(100x4,6mm;
5àm)
Norwark USA
- Dung môi chiết: Ethyl acetat-hexan(1:1)
- Pha động: MeCN-MeOH-Đệm phosphat
0,04M pH=6,9 (52:9:39)
- Tốc độ dòng: 1ml/phút
- Detector: điện hóa.
6

- Đờng chuẩn: 40-800ng/ml
[15]
HT ngời
Zorbax SB CN
(150x4,6mm;
5àm)
- Dung môi chiết: Tert-butyl methyl ether
- Pha động:Na
2
HPO
4
50mM-NaH
2
PO
4
50mM

-MeCN-MeOH pH 6,5-7,5
- Tốc độ dòng: 1ml/phút
- Detector : điện hóa
- Đờng chuẩn: 25-1000ng/ml
*Các phơng pháp khác
- Phơng pháp Cực phổ, mẫu thử là dịch sinh học [20].
- Phơng pháp vi sinh:
Xử lý mẫu: pha loãng HT bằng ethanol (1:1), ủ ở 4
o
C , ly tâm 12.000
vòng/phút trong 15 phút, lấy dịch nổi ở trên cô ở 55
o
C đến thể tích ban đầu của
mẫu. Định lợng trong môi trờng thạch với chủng vi khuẩn chỉ thị là
Micrococcus luteus NCTC 8440, khoảng nồng độ tuyến tính từ 0,005 đến
1mg/L[11].
1.3. Nguyên tắc chung về phơng pháp phân tích bằng HPLC [2].
Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn
và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng- rắn). Mẫu phân tích đợc chuyển lên cột
tách dới dạng dung dịch. Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích đợc
phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh. Trong hỗn hợp các chất phân tích,
do cấu trúc phân tử và tính chất lý hóa của các chất khác nhau nên khả năng t-
ơng tác của chúng với pha động và pha tĩnh khác nhau. Do vậy, chúng di
chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau.
1.3.1. Phân tích định tính.
Một trong các đại lợng đặc trng cho sự tách sắc ký của các chất trong
một hệ pha đã chọn là thời gian lu của các chất. Nghĩa là trong một hệ pha và
trong các điều kiện tách HPLC đã chọn thì mỗi chất phân tích sẽ có thời gian l-
u khác nhau và cố định. Chính đại lợng này là một tính chất hay thông số để
định tính các chất trong một hỗn hợp mẫu.

Vì vậy, sau khi đã chọn đợc các điều kiện tối u cho quá trình sắc ký, tiến
hành ghi sắc đồ của mẫu phân tích, và xác định thời gian lu của từng pic ứng
7

với mỗi chất trong sắc đồ. Sau đó so sánh thời gian lu của chất phân tích
với thời gian lu của chất chuẩn, từ đó sẽ xác định đợc trong mẫu phân tích có
những chất nào.
1.3.2. Phân tích định lợng:
Để có thể định lợng đợc thì yêu cầu giữa đáp ứng phân tích (chiều cao,
diện tích pic) phải có tơng quan với nồng độ chất thử.
Hi = k1.Ci
Si= k2.Ci
Hi; Si là chiều cao pic và diện tích pic tơng ứng của chất i
Ci là nồng độ chất i
k1; k2 là các hằng số thực nghiệm.
*Phơng pháp đờng chuẩn:
- Phơng pháp ngoại chuẩn: Lập đờng chuẩn với chuẩn đối chiếu ở
ngoài mẫu phân tích.
- Phơng pháp thêm đờng chuẩn: Lập đờng chuẩn với chuẩn đối chiếu
trên nền mẫu phân tích.
- Phơng pháp nội chuẩn: Để giảm sai số và tăng độ lặp lại, ngời ta th-
ờng dùng một chuẩn thứ 2 thêm vào mẫu phân tích và mẫu chuẩn đối chiếu.
Chất thêm vào này gọi là nội chuẩn. Trong cùng điều kiện sắc ký nó có thời
gian lu gần với thời gian lu của chất phân tích nhng đợc tách hoàn toàn, có tính
chất tơng tự nh chất cần phân tích nhng không gây ảnh hởng lên tín hiệu của
chất cần phân tích. Tỷ số diện tích hoặc chiều cao pic của chất phân tích và
chất chuẩn nội trong dung dich chuẩn đối chiếu là thông số phân tích đợc dùng
để xây dựng đờng chuẩn.
8

*Phơng pháp chuẩn hóa diện tích:
Hàm lợng phần trăm của một thành phần trong mẫu phân tích đợc xác
định bằng tỷ số (tính bằng phần trăm) của diện tích pic của thành phần đó và
tổng diện tích của tất cả các thành phần có mặt trong mẫu( trừ pic dung môi,
thuốc thử và pic các chất có hàm lợng nhỏ hơn giới hạn phát hiện).
Hai yêu cầu cần đáp ứng khi sử dụng phơng pháp này:
- Tất cả các thành phần trong mẫu phân tích cần đợc rửa giải, xuất hiện
trân sắc ký đồ.
- Detector của thiết bị có đáp ứng nh nhau đối với tất cả các thành phần
có mặt trong mẫu.
Do hai yêu cầu trên rất khó đợc đáp ứng đầy đủ nên kết quả thờng
không tin cậy. Để tăng độ tin cậy ngời ta dùng hệ số đáp ứng của detector đối
với từng thành phần của mẫu.
1.4. Vài nét về HPLC với detector huỳnh quang.
Quang phổ huỳnh quang ngoài việc áp dụng để định tính, định lợng các
chất trên máy đo quang phổ huỳnh quang thì nó còn đợc dùng để chế tạo bộ
phận phát hiện của máy HPLC. Detector huỳnh quang đóng vai trò nh một máy
huỳnh quang kết nối với sắc ký lỏng để phát hiện về phân tích định tính và
định lợng các chất sau khi ra khỏi cột sắc ký. Detector huỳnh quang có độ
chọn lọc và nhạy hơn (có thể đến 1000 lần) detector hấp thụ UV. HPLC-
detector huỳnh quang có thể phát hiện tới 10
-12
g. Do có độ nhạy cao nên
detector huỳnh quang đợc sử dụng trong phân tích vết trong kiểm soát môi tr-
ờng, giám định pháp y, định lợng hoạt chất trong dịch sinh học...
Tùy theo các chất cần định lợng có khả năng phát quang hay không mà
tiến hành định lợng trực tiếp hay gián tiếp thông qua dẫn chất có khả năng phát
quang của nó. Ngời ta có thể cho chất cần phân tích phản ứng với thuốc thử để
tạo dẫn chất phát huỳnh quang mạnh trớc khi đến detector huỳnh quang. Việc
tạo dẫn xuất này có thể tiến hành trớc hoặc sau khi chất cần phân tích đi qua

cột sắc ký. Nếu chất cần phân tích đợc phản ứng với thuốc thử trớc khi qua cột
9

thì kỹ thuật này gọi là tạo dẫn xuất tr- ớc cột. Nếu chất cần phân tích đợc
phản ứng với thuốc thử sau khi đã đi ra khỏi cột, thì đợc gọi là tạo dẫn xuất sau
cột.
1.5. V i nét về LC-MS.
LC-MS là kỹ thuật phân tích dựa trên sự kết hợp sắc ký lỏng hiệu năng
cao và phân tích khối phổ. Sự kết hợp này tạo nên một hệ thống có những ứng
dụng rộng lớn trong phân tích.
- Phơng pháp sắc ký lỏng khối phổ cho phép phân tích hỗn hợp các chất
khó bay hơi nh các thuốc bảo vệ thực vật, các thuốc chữa bệnh,... các độc tố,
các phân tử protein có phân tử lợng lớn từ vài ngàn đến hàng trăm ngàn đơn vị
dalton... [8].
- Phơng pháp sắc ký lỏng khối phổ có bộ kết nối phun điện đợc sử dụng
rất hữu hiệu phân tích dợc phẩm cả định tính và định lợng, ví dụ các thuốc có
trong các mẫu sinh học phức tạp nh HT, huyết thanh, nớc tiểu... [8].
*Nguyên tắc hoạt động của máy phân tích khối phổ:
Đây là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lợng và điện tích của ion (m/z) đ-
ợc tạo thành trong pha khí từ phân tử hay nguyên tử của mẫu.
Các ion đợc tạo thành trong buồng ion hóa, đợc gia tốc và tách riêng nhờ
bộ phân tích khối trớc khi đến detector. Tất cả các quá trình này diễn ra trong
thiết bị áp suất thấp, áp suất trong hệ dao động từ 10
-3
đến 10
-6
Pa.
Nhiệm vụ của detector khối phổ: Chuyển các ion đã đến detector thành
tín hiệu điện đo bằng hệ điện tử của máy khối phổ.
*Các bộ phận của máy phân tích khối phổ:

- Bộ nạp mẫu: Có đờng kết nối với đầu ra của máy sắc ký lỏng.
- Bộ nguồn ion hóa: Nhiệm vụ ion hóa các phân tử, nguyên tử của mẫu.
Có rất nhiều kỹ thuật ion hóa khác nhau nhng hiện nay thờng sử dụng kỹ thuật
ion hóa bằng phun điện tử (ESI) và ion hóa hóa học ở áp suất thờng (APCI)
Trong đề tài này chúng tôi sử dụng kỹ thuật ESI. ESI có vai trò chuyển
ion từ pha lỏng sang pha khí. Kỹ thuật này đợc mô tả nh sau: Các phân tử dung
10

môi và hóa chất sau khi ra khỏi cột sắc ký sẽ đợc đa vào một ống mao
quản cao thế 2 đến 5 KV (điện thế dơng ở đầu kim tạo ion dơng, điện thế âm ở
đầu kim tạo ion âm và đợc quyết định tùy chất khảo sát). Dới tác động của điện
thế cao có sự tạo thành những hạt nhỏ mang điện. Sau khi qua ống mao quản
dới tác động của luồng khí nitơ nóng các phân tử dung môi từ từ bay hơi, các
hạt mang điện tích nhỏ dần. Sau đó các ion dơng hay âm tạo thành đợc đa vào
bộ phận tách ion qua một cửa rất nhỏ, dung môi và khí nitơ bị bơm hút ra
ngoài [21].
- Bộ phân tích khối: có nhiệm vụ tách các ion có trị số m/z khác nhau
thành từng phần riêng biệt.
- Bộ phận phát hiện ion: Có nhiệm vụ chuyển các ion đã đến thành tín
hiệu điện đo bằng hệ điện tử của máy khối phổ.
-Bộ xử lý dữ liệu: Tín hiệu điện đợc khuyếch đại trớc khi chuyển thành
tín hiệu phục vụ sử lý dữ liệu theo yêu cầu khác nhau: Ghi phổ, định lợng...
* Một số kỹ thuật LC-MS
- Kỹ thuật phân tích toàn thang (full scan)
Là kỹ thuật phân tích mà phổ khối sẽ đa ra toàn bộ ion sinh ra từ ion
gốc, ta có một sắc đồ toàn ion (Total Ion Chromatogram). Kỹ thuật này có độ
nhiễu đờng nền rất lớn nên độ nhạy kém [9].
- Kỹ thuật phân tích chọn lọc ion (SIM)
Đây là kỹ thuật ngay từ đầu chỉ cho phổ kế nhận diện một ion và ghi sắc
đồ theo thời gian. Lúc này sắc đồ chỉ ghi tất cả các mũi có chứa ion đó. Kỹ

thuật này có tác dụng làm giảm bớt nhiễu đờng nền và do đó làm tăng độ nhạy
(tăng tỷ lệ tín hiệu /nhiễu đờng nền). Kỹ thuật này thuận lợi để phân tích d l-
ợng một chất đã biết trong một mẫu phức tạp [9].
- Kỹ thuật MS/MS
Kỹ thuật này chọn một ion ở chế độ MS lần 1, ion đó sẽ đợc phân tích
tiếp bằng cách tạo ra mảnh ion nhỏ hơn đặc trng cho ion trớc đó, đợc phân tích
11

MS lần 2. Nếu tiếp tục chọn ion và bẻ gãy ion ta có kỹ thuật MS
n
(n là số lần
bẻ gẫy ion) [21]
12

Chơng 2: Đối tợng, nội dung và phơng pháp nghiên cứu.
2.1.Đối tợng nghiên cứu
Để xây dựng và thẩm định phơng pháp phân tích AZI trong HT ngời,
chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên các đối tợng sau:
- Mẫu trắng: là HT ngời của viện Huyết học và truyền máu trung ơng.
- Mẫu chuẩn: là mẫu trắng đợc thêm AZI với nồng độ xác định.
- Mẫu thử: là HT ngời có sử dụng AZI.
2.2. Hoá chất và thiết bị
* Hoá chất :
Bảng 2.1: Danh mục hóa chất- thuốc thử- chất chuẩn
Tên chất Nguồn gốc Tiêu chuẩn Hàmlợng
Hóa chất
thuốc thử
Diethyl ether
Merck - Đức
P.A 99,5%

Acetonitril Baker - Mỹ HPLC nhà sản xuất 99,9%
Methanol
Baker - Mỹ HPLC nhà sản xuất
99,8%
Natri carbonat Vel - Bỉ P.A
Acid boric
Vel - Bỉ P.A
Kali clorid Vel - Bỉ P.A
Amoni acetat Vel - Bỉ P.A
FMOC-Cl Aldrich-Mỹ P.A
Chất chuẩn
Azithromycin
Viện kiểm nghiệm
TƯ - VN
97,27%
Roxithromycin
Viện kiểm nghiệm
TƯ - VN
97,73%
Clarithromycin
Viện kiểm nghiệm
TƯ - VN
97,82%
Chế phẩm
HT ngời
Viện huyết học và
truyền máu TƯ -VN
Viên nén
Zithromax
Pfizer-USA

250mg
* Thiết bị - dụng cụ
13

- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu 10A-VP -
Detector huỳnh quang.
- Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ Thermo-Finnigan LCQ Advantage
Max.
- Bộ lọc dung môi (màng lọc 0,45m), bộ lọc mẫu (màng lọc 0,2m)
- Máy lắc siêu âm (Brasonic - Mỹ).
- Cân phân tích (Sartorius - Đức)
- Máy đo pH (Metrohm - Thụy Sĩ).
- Máy ly tâm (Jouan - Pháp)
- Máy siêu li tâm (Sartorius - Đức)
- Tủ lạnh sâu (Frigo - Đan Mạch).
- Máy lọc nớc siêu sạch (Elga -Anh).
- Máy lắc (Labinco - Hà Lan).
- Nồi cách thủy.
- ống nghiệm lấy máu chứa EDTA,
- ống nghiệm teflon dung tích 30ml.
- Bình định mức chính xác, pipet chính xác và các dụng cụ thủy tinh
khác.
2.3. Phơng pháp nghiên cứu
Định lợng AZI trong HT là quá trình phân tích phức tạp yêu cầu phơng
pháp phân tích phải có tính chọn lọc tốt, độ nhạy, độ chính xác cao. Sau khi
tìm hiểu sâu về đối tợng nghiên cứu, mục tiêu của đề tài và tham khảo tài liệu
chúng tôi đã lựa chọn hai phơng án để tiến hành khảo sát đó là: HPLC với
detector huỳnh quang và LC-MS.
2.3.1. Khảo sát quy trình định lợng AZI trong dung môi bằng
HPLC detector huỳnh quang.

*Chuẩn bị dung dịch:
14

- Dung dịch chuẩn AZI nồng độ lần lợt là 5, 10, 25, 50, 100 àg/ml
trong methanol
- Dung dịch nội chuẩn CLA (IS) 50 àg/ml
- Dung dịch dẫn xuất huỳnh quang FMOC-Cl: 0,5mg/ml
- Dung dịch đệm Borat 0,1M pH 7,4
* Khảo sát điều kiện chạy sắc ký.
Khảo sát về cột, nhiệt độ cột, pha động, tốc độ dòng, detector huỳnh
quang (bớc sóng kích thích, bớc sóng phát xạ)
* Khảo sát điều kiện tạo dẫn xuất huỳnh quang.
- Khảo sát nhiệt độ phản ứng tạo dẫn xuất: Giữ nguyên các điều kiện
phản ứng khác, chỉ thay đổi nhiệt độ từ 30 đến 70
o
C, cách 10
o
C
- Khảo sát thời gian phản ứng: Giữ nguyên nhiệt độ phản ứng tối u là
50
o
C, thay đổi thời gian phản ứng trong khoảng từ 30 đến 60 phút, cách 10
phút.
* Đánh giá một số thông số kỹ thuật của phơng pháp.
- Tính chọn lọc.
- Tính phù hợp của hệ thống sắc ký.
- Khoảng tuyến tính.
- Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lợng (LOQ).
2.3.2. Khảo sát xây dựng quy trình định lợng AZI trong HT bằng
LC-MS.

2.3.2.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn.
Để giảm các yếu tố ảnh hởng đến kết quả phân tích và tăng độ chính sác
chúng tôi chọn phơng pháp nội chuẩn. Sau khi tìm hiểu, tham khảo một số tài
liệu chúng tôi chọn hai chất có cùng cấu trúc phân tử là CLA và ROXI để tiến
hành khảo sát chọn làm chuẩn nội.
15

- Pha dung dịch chuẩn gốc AZI: cân chính xác chất chuẩn AZI,
hòa tan trong methanol để đợc dung dịch gốc. Từ đó pha thành các dung dịch
chuẩn thứ cấp có nồng độ 0,2- 20àg/ml trong methanol.
2.3.2.2. Sử lý mẫu
Từ các tính chất lý hóa của AZI và theo các tài liệu đã công bố, chúng
tôi chọn xây dựng quy trình sử lý mẫu theo phơng pháp chiết lỏng - lỏng.
2.3.2.3. Khảo sát điều kiện để định lợng AZI.
Tiến hành chạy thử trên từng mẫu AZI, chuẩn nội (IS) và hỗn hợp AZI
và IS trong dung môi pha động để:
* Khảo sát điều kiện khối phổ.
- Kỹ thuật MS một lần: phân tích toàn thang để xác định ion phân tử.
- Kỹ thuật SIM sử dụng ion phân tử để định lợng.
* Khảo sát điều kiện sắc ký.
- Cột sắc ký: khảo sát khả năng tách của AZI và IS trên các cột: Thermo
C18 (50 x 2,1mm; 5àm) và Zorbax C18 SB (150 x4,6; 5àm).
- Pha động: dựa vào các tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sát trên hệ
pha động acetonitril : amoni acetat 0,05M với tỷ lệ khác nhau và chạy chế độ
đẳng dòng hay gradient.
- Tốc độ dòng: thay đổi lu lợng pha động từ 0,2 0,6ml/phút để xác
định đợc tốc độ phù hợp cho thời gian lu tối u.
- Tiêm mẫu tự động 25àl
2.3.2.4 Thẩm định phơng pháp phân tích
* Tính chọn lọc

Chuẩn bị mẫu:
- HT trắng.
- HT có AZI.
- HT có IS.
16

- HT có AZI và IS.
Xử lý mẫu và tiến hành phân tích
* Tính phù hợp của hệ thống sắc ký
Chuẩn bị mẫu chuẩn có AZI và IS trong pha động. Tiến hành sắc ký 6
lần liên tiếp, xác định độ lệch chuẩn tơng đối của các thông số: thời gian lu, tỷ
số diện tích pic.
* Khoảng nồng độ tuyến tính, hàm đáp ứng
Chuẩn bị các mẫu HT trắng, thêm AZI và IS tạo thành các mẫu có nồng
độ AZI từ 0,02 - 2 àg/ml, xử lý mẫu theo sơ đồ hình 3.1 và tiến hành phân tích.
*LOD và LOQ
LOD là nồng độ thấp nhất của chất phân tích có thể xác định đợc nhng
không nhất thiết phải định lợng đợc trong điều kiện thí nghiệm cụ thể. LOD đ-
ợc coi là nồng độ chất phân tích gây nên sự tăng tín hiệu đáp ứng 3 lần so với
đáp ứng tín hiệu của mẫu trắng (S/N=3). LOQ là nồng độ thấp nhất của chất
cần phân tích có thể định lợng đợc với độ đúng và độ chính xác phù hợp. LOQ
đợc chấp nhận nếu đáp ứng của chất phân tích phải ít nhất gấp 10 lần đáp ứng
của mẫu trắng. Trong phơng pháp sắc ký độ nhiễu của đờng nền có thể thay
cho tín hiệu của mẫu trắng.
Tiến hành xử lý các mẫu HT trắng và mẫu chuẩn có nồng độ AZI thấp
dần và tiến hành phân tích.
* Độ đúng
Chuẩn bị các mẫu AZI trong HT trắng ở 3 nồng độ khảo sát, mỗi nồng
độ làm 5 mẫu, xử lý mẫu và tiến hành phân tích, so sánh giá trị trung bình giữa
các lần định lợng của mỗi nồng độ với giá trị thực có trong mẫu, tính theo lợng

chuẩn đã cân và thể tích đã pha.
*Độ chính xác.
17