Ứng dụng tannase trong công nghiệp thực phẩm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Enzyme trong thực phẩm

Ứng dụng tannase
trong công nghiệp thực phẩm

GVGD: TS. Trần Quốc Tuấn


i

MỤC LỤC ....................................................................................................................... i
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT........................................................................................iv
DANH MỤC HÌNH ẢNH .............................................................................................. v
DANH MỤC BẢNG BIỂU ...........................................................................................vi
MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1
1. Tổng quan ................................................................................................................... 2
1.1. Giới thiệu tannase .................................................................................................. 2
1.2. Cấu trúc của tannase .............................................................................................. 3
1.3. Cơ chế hoạt động ................................................................................................... 3
1.4. Các nguồn của tannase........................................................................................... 4
1.5. Đặc tính sinh hóa của tannase vi sinh vật .............................................................. 6
1.5.1. Khối lượng phân tử.......................................................................................... 7
1.5.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH........................................................................ 7
1.5.3. Tác dụng của các ion kim loại ......................................................................... 7
1.5.4. Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ và chất hoạt động bề mặt ........................... 8
1.6. Điều kiện lên men .................................................................................................. 9
1.7. Sản xuất tái tổ hợp các tannase ............................................................................ 11
1.8. Tinh sạch tannase ................................................................................................. 11

1.9. Cố định enzyme ................................................................................................... 12
1.10. Tannin - Nguồn cơ chất tự nhiên ....................................................................... 13
1.11. Các ứng dụng của tannase ................................................................................. 16
1.11.1. Ngành chè .................................................................................................... 16
1.11.2. Nước ép trái cây .......................................................................................... 17
1.11.3. Ngành công nghiệp rượu và bia .................................................................. 18
1.11.4. Thức ăn chăn nuôi ....................................................................................... 18
1.11.5. Xử lý môi trường ......................................................................................... 19


ii

2. Nghiên cứu tannase giúp cải thiện lượng gallic acid có trong nước ép xồi ... 19
2.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................ 19
2.2. Vật liệu và phương pháp ...................................................................................... 20
2.2.1. Vật liệu .......................................................................................................... 20
2.2.2. Phương pháp .................................................................................................. 21
2.3. Kết quả ................................................................................................................. 23
2.3.1. Q trình tiêu hóa nước xồi đường miệng in vitro và tác dụng của tannase
đối với gallotannin của xoài do protein trong nước bọt .......................................... 23
2.3.2. Ảnh hưởng của tannase đến khả năng tiếp cận sinh học của gallic acid trong
q trình tiêu hóa ở dạ dày và ruột trong ống nghiệm ............................................ 26
2.3.3. Ảnh hưởng của tannase đến màu nước xoài và độ ổn định lưu trữ polyphenol
................................................................................................................................. 29
2.4. Kết luận ................................................................................................................ 32
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 33


iii

iv

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

L-AA:

L – ascorbic acid

GA:

Gallic acid


v

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Cấu trúc tinh thể của tannase từ Lactobacillus plantarum............................... 3
Hình 1.2. Phản ứng tiêu biểu của tannase ..................................................................... 16
Hình 2.1. Thành phần của một viên nén được làm lại từ nước bọt của người và chiết xuất
gallotannin xồi. ............................................................................................................ 25
Hình 2.2. Sự thay đổi nồng độ gallic acid trong nước xồi trong q trình tiêu hóa
trong ống nghiệm. .......................................................................................................... 29
Hình 2.3. Sự thay đổi độ hấp thụ ở bước sóng 420 nm của nước xồi trong thời gian
bảo quản 6 tuần. ............................................................................................................. 31
Hình 2.4. Sự thay đổi nồng độ gallic acid trong nước xoài........................................... 32


vi

DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1. Đặc tính tannase .............................................................................................. 6
Bảng 1.2. Điều kiên lên men vi sinh vật sản xuất tannase .............................................. 9
Bảng 1.3. Chiến lược tinh sạch tannase ......................................................................... 12
Bảng 2.1. So sánh nồng độ của gallic acid (mg/L) trong nước xồi với nước xồi khi có
nước bọt trong q trình tiêu hóa trong ống nghiệm từ 0–2 giờ, 3–4 giờ và 6–10 giờ lần
lượt thể hiện các giai đoạn tiêu hóa của dạ dày, ruột non và ruột già. .......................... 24


1

MỞ ĐẦU
Tannase, tannin acylhydrolases, là một nhóm quan trọng của các enzyme liên quan
đến công nghệ sinh học, được sử dụng trong một số ứng dụng công nghiệp, bao gồm sản
xuất trà uống, bia, nước trái cây, một số loại rượu vang và sản xuất gallic acid. Tannase
thường được tạo ra bởi các vi sinh vật bao gồm Aspergillus, Paecilomyces, Lactobacillus
và Bacillus. Nó phân bố nhiều và được tìm thấy từ các nguồn động vật, thực vật và vi
sinh vật. Tuy nhiên, tannase từ nguồn vi sinh được sử dụng trong công nghiệp nhiều hơn.
Tannase thường được sản xuất trên tannic carbon như tannic acid, cám lúa mì, chiết xuất
vỏ trà và cà phê. Các tannase của vi sinh vật chủ yếu là enzyme ngoại bào cảm ứng và
được tạo ra bằng cách lên men chìm và lên men rắn.
Trong báo cáo này, nhóm sẽ trình bày tổng quan về tannase và một nghiên cứu cụ
thể là tannase cải thiện hàm lượng gallic acid và duy trì chất lượng nước ép xoài.


2

1. Tổng quan
1.1. Giới thiệu tannase
Tannase hoặc tannin acylhydrolase (EC 3.1.1.20) là enzyme cảm ứng ngoại bào,

xúc tác quá trình thủy phân tannin và gallic acid esters. Enzyme này thuộc nhóm serine
esterase xúc tác q trình thủy phân liên kết ester (ester galloyl của gốc rượu và liên kết
depside (ester galloyl của gallic acid) trong tannin để giải phóng gallic acid. Gallic acid
là cơ chất để tổng hợp hóa học hoặc enzyme của propyl gallate, một chất chống oxy hóa
mạnh [1].
Tannase lần đầu tiên được phát hiện bởi Tieghem [2] trong một thí nghiệm về sự
hình thành gallic acid thành dung dịch tannin trong nước, trong đó phát triển hai loài
nấm được xác định là Penicillium glaucum và Aspergillus niger. Cho đến nay nấm sợi
chủ yếu là các loài sau: Aspergillus, Penicillium, Fusarium và Trichoderma được phát
hiện sản xuất tannase. Vi khuẩn và nấm men cũng tạo ra loại enzyme này [3].
Tannin là hợp chất polyphenol được tạo ra bởi thực vật để kháng lại vi sinh vật và
động vật ăn cỏ xâm nhập. Quá trình sản xuất tannase của vi sinh vật có thể được xem là
q trình tự bảo vệ của các vi sinh này chống lại tannin. Thực vật rất giàu tannin và sản
xuất gallic acid từ các sản phẩm phụ của thực vật là một trong những ứng dụng chính
của enzyme tannase. Gallic acid được sản xuất từ tannin của bột tara bằng quá trình thủy
phân vi sinh vật với tổng năng suất khoảng 30% (đối với trọng lượng của nguyên liệu
thô). Tannase ứng dụng trong các ngành công nghiệp mỹ phẩm, thực phẩm và công
nghiệp thức ăn chăn nuôi, công nghiệp da và công nghiệp hóa chất. Nồng độ tannin cao
trong đồ uống như trà đá, bia, rượu, nước trái cây và đồ uống có hương vị cà phê dẫn
đến sự hình thành kết tủa do sự tương tác của chúng với các phân tử khác có trong đồ
uống. Những tác dụng khơng mong muốn này của tannin có thể được làm giảm hoặc loại
bỏ bằng cách xử lý bằng hóa chất hoặc enzyme.


3

1.2. Cấu trúc của tannase
Cấu trúc tinh thể đầu tiên thu được từ Lactobacillus plantarum của Ren et al. (2013)
(Hình 1), tiếp theo là một mơ hình phân giải ngun tử 3D khác từ L. plantarum. Enzyme
giữ cấu trúc α/β với nếp gấp serine hydrolase. Cấu trúc này mang một vùng lớn nhơ ra

vào nếp gấp serine hydrolase. Vị trí hoạt động chứa Ser 163, His 451 và Asp 419 như
một bộ ba xúc tác. Gallic acid liên kết với các chất hoạt hóa amino acid để tạo thành các
tương tác liên kết hydro. Cả depsidase và các hoạt động esterase là do vị trí liên kết
galloyl đơn và liên kết cơ chất tương tác tại vị trí này. Do đó, những enzyme này thuộc
về α/β-hydrolase. Glycerol liên kết với vị trí liên kết galloyl với chất nền. Đặc điểm cấu
trúc thứ cấp của Penicillium herquei tạo thành một chuỗi xoắn α (14%), đối song song
β-sheet (32,4%), β-sheet (4,8%), β-turn (18,8%) và 30% cuộn ngẫu nhiên (Qiu et al.
2011) [12].

Hình 1.1. Cấu trúc tinh thể của tannase từ Lactobacillus plantarum.
1.3. Cơ chế hoạt động
Tannase xúc tác cho hai phản ứng khác nhau là hoạt động esterase và hoạt động
depsidase. Vị trí liên kết galloyl đơn lẻ đóng góp cả hoạt động esterase và depsidase của
enzyme [12]. Hoạt động Esterase liên quan đến việc thủy phân các liên kết esters gallic
acid như galloyl glucose và methyl gallate. Mặt khác, hoạt động depsidase liên quan đến


4

sự phân cắt của các liên kết depside của digallic acid, gallotannin, ellagitannin, phức
tannin,... Nhưng tannase không hoạt động trên liên kết C-C, và do đó các enzyme này
khơng có khả năng thủy phân tannin cô đặc [1].
1.4. Các nguồn của tannase
Enzyme này có mặt trong rau, trái cây, lá và vỏ cây giàu tannin. Một số ít trong số
họ là quả của Terminalia chebula, lá của Anogeissus latifolia, vỏ của Caesalpinia
coriaria và vỏ của Cassia fistula . Ngoài ra, một lượng nhỏ tannase từ ruột non và màng
niêm mạc của gia súc.
Các vi sinh vật đại diện cho sản xuất tannase với số lượng lớn, với nhiều loại
enzyme và chúng là nguồn ưu tiên nhất cho enzyme thương mại. Tannase của vi sinh vật
có một số ưu điểm so với thực vật và động vật. Một trong những tính năng quan trọng

nhất của các enzyme vi sinh vật này là sự ổn định so với các nguồn khác. Một đặc điểm
khác là sản xuất enzyme liên tục với cường độ lớn nhờ vi sinh vật và do đó cung cấp các
enzyme cho sử dụng thương mại. Hơn nữa, kỹ thuật di truyền của các enzyme vi sinh
vật dễ dàng hơn các enzyme từ các nguồn khác [1].
Vi khuẩn có khả năng thủy phân gallotannin như một nguồn năng lượng duy nhất
của Achomobacter sp.. Chi Bacillus và Lactobacillus đại diện cho nhóm vi khuẩn sản
xuất tannase được nghiên cứu nhiều nhất. Vi khuẩn lactic có vai trị trong q trình phân
giải tannin thực phẩm. Methyl gallate là chất nền cho vi khuẩn tannase. Một ít vi khuẩn
khác sản xuất tannase bao gồm Citrobacter, Selenomonas và Streptococcus. Trọng lượng
phân tử của tannase vi khuẩn nằm trong khoảng từ 40 đến 90 kDa. Tuy nhiên, tannase
từ Rhodococcus sp. và L. plantarum được báo cáo có hai đơn vị con. Beniwal và cộng
sự. (2013) báo cáo trọng lượng phân tử thấp (31 kDa) của tannase từ Enterobacter
cloacae [13]. Tùy chọn nhiệt độ của tannase vi khuẩn dao động từ 30-50°C và pH tối ưu
giữa pH 3-8. Bacillus sphaericus vẫn giữ được chất tannase hoạt động ở pH=8, trong khi
L. plantarum hoạt động của tannase ở pH= 9 [1].


5

Nấm đại diện sản xuất tannase quan trọng nhất, trái ngược với tannase của vi khuẩn,
thường có bản chất đơn phân, tannase của nấm đa số bao gồm hai hoặc nhiều tiểu đơn
vị, đôi khi bắc cầu nối với nhau bằng liên kết disulfide. Trọng lượng phân tử tannase của
nấm dao động từ 50 đến 320 kDa. Nhóm nấm được nghiên cứu nhiều nhất để sản xuất
tannase. Aspergillus là một trong những loài sản xuất tannase chiếm ưu thế và A. niger,
Aspergillus phoenicis, Aspergillus ochraceus, v.v. số ít sản xuất tannase. Tannase từ A.
niger van Tieghem cho thấy khả năng điều chỉnh nhiệt lên đến 60°C và cho thấy sự ổn
định trong vi pH rộng từ pH 3 đến 8, trong khi A. niger ATTC 16620 tạo ra tannase có
trọng lượng phân tử 168 kDa cũng ổn định ở pH 4-8. Enzyme tannase 45 kDa có nguồn
gốc từ Paecilomyces variotii cho thấy sự ổn định trên độ pH khoảng 4-8 và nhiệt độ dao
động từ 30-50°C. Nấm khác là Penicillium variable tạo ra chất điều nhiệt enzyme có

trọng lượng phân tử 158 kDa cho thấy hoạt tính đáng kể ở 80°C. Enzyme này khá ổn
định ở độ pH nằm trong khoảng từ 4-8. Một số chi nấm khác như Arxula, Candida,
Cryphonectria, Debaryomyces, Fusarium sp. Penicillium sp., Hyalopus sp., Verticillium
sp., Aureobasidium, và Rhizopus sản xuất tannase [1].


6

1.5. Đặc tính sinh hóa của tannase vi sinh vật
Tannase từ một số vi sinh vật đã được nghiên cứu và các đặc tính khác nhau được
tóm tắt trong Bảng 1.1.
Bảng 1.1. Đặc tính tannase


7

1.5.1. Khối lượng phân tử
Khối lượng phân tử của tannase được tìm thấy nằm trong khoảng từ 50–320 kDa.
Tannase bao gồm hai hoặc nhiều đơn vị con. Hatamoto và cộng sự đã kết luận rằng
tannase của Aspergillus oryzae bao gồm bốn cặp của hai loại các đơn vị con (30 và 34
kDa, tương ứng) liên kết với nhau bằng liên kết disulfide, tạo thành hetero-octamer 300
kDa. Tannase gốc của Emericella nidulans bao gồm ba cặp của hai loại đơn vị con (45,8
và 52 kDa) để tạo thành một dị hexamer 302 kDa. Riul và cộng sự đã báo cáo khối lượng
phân tử gốc của dạng tannase Aspergillus phoenicis là 218 kDa với các tiểu đơn vị 120
và 93 kDa. Böer và cộng sự đã báo cáo rằng tannase gốc của Arxula adeninivorans bao
gồm bốn tiểu đơn vị giống hệt nhau (80 kDa) để tạo thành tetramer của 320 kDa.
1.5.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH
Các tannasse của vi sinh vật thường có nhiệt độ tối ưu trong phạm vi 20-60°C. Tính
ổn định nhiệt của tannase chủ yếu nằm trong khoảng từ 30 đến 60°C. Tannase từ
Aspergillus tamari, Aspergillus niger GH1, Hyalopus sp. và Aspergillus phoenicis ổn

định ở nhiệt độ thấp hơn 50°C. Tannase từ Penicillium variable hoạt động ở nhiệt độ 2580°C [7].
Nói chung, tannase của vi sinh vật có pH tối ưu có tính acid, chẳng hạn như tannase
từ Aspergillus niger van Tieghem (pH 6,0) [5], Bacillus licheniformis KBR 6 (pH 5,75)
[83], Enterobacter sp. (pH 5,5) [11], Hyalopus sp. (pH 6,5) [46], Lactobacillus
plantarum CECT 748T (pH 5,0) [50], Penicillium variable (pH 5,0) [7], Bacillus cereus
KBR9 (pH 4.5) [68]. Tuy nhiên, tannase từ Serratia ficaria DTC cho thấy pH tối ưu ở
8,9 [48], và tannase từ Lactobacillus plantarum ATCC 14917T cho thấy độ pH tối ưu
của nó ở 8,0 [81]. Tannase có pH ổn định trong phạm vi từ pH 3,0 đến pH 8,0.
1.5.3. Tác dụng của các ion kim loại
Các đồng yếu tố cofactors thường không cần thiết cho hoạt động tannase, nhưng
các cation hóa trị hai như magiê thường kích thích hoạt động của enzyme. Điều này có
thể do sự tham gia của nhiều cơ chế bao gồm hoạt hóa bởi các ion kim loại bằng cách


8

thay đổi cân bằng hằng số của phản ứng enzyme hoặc bằng cách gây ra sự thay đổi điện
tích bề mặt trên protein enzyme. Kích thích bằng magie tannase đã được báo cáo trong
trường hợp của Rhizopus oryzae và Aspergillus foetidus, Verticillium sp. P9, Aspergillus
awamori MTCC 9299, Emericella nidulans. Ngược lại, tannase từ Aspergillus niger
ATTC 16620, Lactobacillus plantarum CECT 748T, Aspergillus niger ITCC 6514.07 bị
ức chế bởi sự hiện diện của các cation magiê. Hơn nữa, hoạt tính tannase bị ức chế bởi
các kim loại nặng như Hg2+, Co2+, Ba2+, Cd2+, Ag2+, Pb2+, Sn2+. Tuy nhiên, tannase từ
Emericella nidulans được kích thích đến 117,94%, 133,59% và 137,73% bởi sự có mặt
của Ba2+, Co2+ và Hg2+ tương ứng, và chịu tác dụng của Ag+.
1.5.4. Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ và chất hoạt động bề mặt
Mata-Gómez và cộng sự đã báo cáo rằng ở nồng độ 60%, petroleum ether dường
như tăng cường hoạt tính tannase; ethanol và acetone ức chế hồn tồn hoạt tính enzyme,
trong khi THF và formaldehyde thể hiện tác dụng ức chế chỉ ở mức 20% . Tannase
Penicillium variable bị ức chế tương tự bởi acetone và formaldehyde, nhưng nó khơng

bị ảnh hưởng bởi ethanol và heptane; cũng có tác dụng ức chế báo cáo với petroleum
ether [7]. Chhokar và cộng sự đã báo cáo rằng hoạt động của tannase từ Aspergillus
awamori MT9299 tăng lên khi có 60% nồng độ butanol và benzene. Goncalves và cộng
sự đã báo cáo rằng ở nồng độ thấp (1%, v /v), isopropanol, acetonitrile và ethanol làm
tăng hoạt tính của tannase, nhưng việc tăng các hợp chất này trong phản ứng sẽ làm giảm
hoạt tính của tannase, khoảng 30% hoạt tính là bị mất khi có mặt isopropanol, acetonitrile
và ethanol.
Chất hoạt động bề mặt đóng vai trị quan trọng đối với hoạt động xúc tác của
enzyme và mức độ ảnh hưởng của chúng đến khả năng xúc tác của enzyme tannase được
tìm thấy thay đổi đáng kể. Mất hoạt tính đáng kể với sự hiện diện của Tween 20 được
báo cáo về tannase được tạo ra bởi Verticillium sp. P9, trong khi tác dụng nhẹ được báo
cáo đối với tannase từ Aspergillus niger GH1. Hoạt tính tannase của Penicillium variable
hồn tồn bị ức chế bởi SDS, Tween 60 và Tween 80 [7].


9

1.6. Điều kiện lên men
Hầu hết các tannase của vi sinh vật là ngoại bào và bị ảnh hưởng rất nhiều bởi các
yếu tố dinh dưỡng và hóa lý, chẳng hạn như pH, nhiệt độ ủ, nguồn nitơ và carbon, muối
vơ cơ, sự khuấy động và nồng độ oxy hịa tan. Các điều kiện lên men được sử dụng với
các vi sinh vật khác nhau được trình bày trong Bảng 1.2 [7].
Bảng 1.2. Điều kiên lên men vi sinh vật sản xuất tannase

Yếu tố chính cho sự biểu hiện của hoạt tính tannase ln ln là carbon vì hầu hết
các tannase là các enzyme cảm ứng và do đó thường được tạo ra khi có mặt các chất cảm
ứng, chẳng hạn như tannic acid. Tuy nhiên, sản lượng của chúng cũng bị ảnh hưởng bởi
các nguồn carbon khác, chẳng hạn như arabinose, fructose, glucose, lactose, maltose,
mannitol, sucrose và xylose. Tannase từ Paecilomyces variotii được báo cáo là được kích
thích khi có glucose, trong khi bị kìm hãm khi có mặt arabinose, raffinose, rhamnose,

sorbose, tinh bột và xylose. Lagemaat và Pyle báo cáo rằng glucose có trong mơi trường
cạn kiệt nhanh chóng và điều này có thể dẫn đến cảm ứng một phần tannase. Banerjee
và Pati cũng báo cáo tác dụng tích cực của glucose trong q trình sản xuất tannase bởi
Aureobasidium pullulans. Seiji và cộng sự đã đề cập rằng hoạt tính tannase chỉ được
biểu hiện khi sinh vật được phát triển khi có glucose.


10

Bên cạnh các nguồn carbon, các nguồn nitơ khác nhau trong môi trường cũng ảnh
hưởng đến hiệu giá tannase trong môi trường sản xuất. Selwal và cộng sự đã báo cáo sản
xuất tannase tối đa của Penicillium atramentosum KM thu được với amonium clorua,
tức là 28,9 U/ml sử dụng amla và Di-amoni hydro phosphate đã đưa ra 31,9 U / ml bằng
cách sử dụng lá keekar. Sabu và cộng sự đã báo cáo tăng sản xuất tannase với amoni
nitrate trong trường hợp môi trường chứa bột hạt me (TSP). Banerjee và Pati báo cáo sản
xuất tannase tối đa bằng cách sử dụng Di-amoni hydro photphat. Tuy nhiên, một số người
nghiên cứu đã báo cáo tác dụng ức chế của nitơ. Kumar và cộng sự đã báo cáo rằng việc
bổ sung môi trường với amoni sulfate dẫn đến giảm sản xuất tannase. Selwal và cộng sự
đã báo cáo giảm sản xuất tannase khi có natri nitrate, amoni clorua, urê và amoni sunfate,
trong khi đó là sự gia tăng sản xuất tannase khi có mặt amonium nitrate [40].
Ngồi các thành phần hóa học khác nhau của môi trường sản xuất, các thông số
sinh lý như pH, nhiệt độ, sự khuấy động và thời gian ủ cũng đóng một vai trị quan trọng
ảnh hưởng đến sản xuất bởi các vi sinh vật khác nhau. Phần lớn, vi sinh vật thích hợp
với phạm vi pH 5,0–6,0 để sản xuất tannase, chẳng hạn như Aspergillus niger ATTC
16620, Aspergillus aculeatus DBF9, Aspergillus rubber, Paecilomyces variotii,
Lactobacillus sp. ASR-S1 và Bacillus cereus KBR9. Về nhiệt độ, tannase thường được
sản xuất trong khoảng nhiệt độ 25–35°C. Tuy nhiên, Kasieczka-Burnecka và cộng sự đã
nuôi cấy Verticillium sp. P9 ở 16°C để sản xuất tannase. Thời gian ủ từ vài giờ đến vài
ngày được cho là phù hợp nhất để tạo ra tannase tối đa. Thời gian ủ là 24 giờ tối ưu cho
sản xuất tannase bởi Pseudomonas aeruginosa IIIB 8914, Aspergillus aculeatus DBF9

và Bacillus cereus KBR9. Trong khi tannase tối đa được tạo ra sau 96 giờ ủ bởi
Aspergillus ruber, thì Penicillium atramentosum KM và Aspergillus niger FETL FT3.
Tannase địi hỏi sự có mặt của các ion kim loại để thể hiện đầy đủ hoạt tính xúc tác [40].
Selwal và cộng sự đã quan sát thấy sự kích thích trong tannase sản xuất từ Pseudomonas
aeruginosa IIIB 8914 với sự hiện diện của Mg2+ trong trường hợp amla và Hg2+ trong
trường hợp lá keekar [7].


11

1.7. Sản xuất tái tổ hợp các tannase
Các enzyme của nấm rất giàu liên kết disulfulde và thường có xu hướng tập hợp và
tạo thành các phân tử có trọng lượng phân tử cao hơn. Tuy nhiên, rất ít nghiên cứu đạt
được thành cơng trong việc tạo dịng và biểu hiện tannase. Tạo dòng tannase từ A. oryzae
và sự biểu hiện chỉ ra sự có mặt của polypeptide đơn sau khi dịch mã và phân tách, tạo
thành hai tiểu đơn vị là 30 và 33 kDa được liên kết với nhau bằng các liên kết disulfide.
Enzyme gốc được tạo ra từ bốn cặp đơn vị con tạo thành hetero-octamer có 300 kDa.
Gen mã hóa enzyme tannase từ Staphylococcus ludgunensis tạo dịng và giải trình tự
thành cơng. Tuy nhiên, khi tạo tannase từ S. ludgunensis có liên quan với bệnh ung thư
ruột kết, gen A được sử dụng như marker để phát hiện những sinh vật này. Tạo dòng và
biểu hiện quá mức của tannase (Ss-Tan) từ Streptomyces sviceus với hiệu suất xúc tác
cao hơn và tốt hơn. Tan 7, gen mã hóa tannase từ A. niger SH-2, được tạo dịng và biểu
hiện quá mức ở A. niger chủng Bdel4 có ít protein tiết hơn, do đó có lợi sản xuất enzyme
ở quy mơ lớn. Gen mã hóa tannase AotanB từ A. oryzae được tạo dịng thành cơng và
biểu hiện q mức trong Pichia pastoris [1]. Hoạt tính càng cao như 7000 IU / L có thể
đạt được bằng cách tạo dòng tannase từ Aspergillus oryzea ở Pichia pastoris, tăng
khoảng 3,5 lần năng suất enzyme so với lên men ở trạng thái rắn [15]. Mức độ biểu hiện
cao đạt được bằng cách tạo dòng Lactobacillus plantarum tannase ở Escherichia coli và
năng suất sản xuất tannase tái tổ hợp tinh khiết (17 mg /L) với hoạt độ 2,35 × 106 U /
mg thu được trên 1 L nuôi cấy [17].

1.8. Tinh sạch tannase
Có rất nhiều nghiên cứu về tinh chế tannase tồn bộ và một phần liên quan đến
nồng độ của phần nổi phía trên ni cấy có chứa enzyme bằng siêu lọc, kết tủa amonium
sulfate hoặc chiết với chất hữu cơ, trao đổi ion hoặc sắc ký thẩm thấu gel, sắc ký ái lực
và tập trung điểm đẳng điện quy mô chuẩn bị (Bảng 1.3). Các phương pháp tinh chế
thông thường ở trên yêu cầu nhiều bước tốn thời gian và có thể gây ra thất thốt enzyme.
Gần đây, chiết xuất micellar đảo ngược bằng cách sử dụng chất hoạt động bề mặt ion


12

cung cấp lựa chọn hấp dẫn để tập trung và tinh sạch của tannase. Gaikaiwari và cộng sự
được tìm thấy trong các điều kiện tối ưu hóa, tinh sạch 12,7 lần, thu hồi 81,2% và nồng
độ gấp 3 lần tannase với thời gian xử lý 45 phút thu được bằng cách đảo ngược hệ thống
micelle.
Bảng 1.3. Chiến lược tinh sạch tannase

1.9. Cố định enzyme
Vì một phần tannase tạo ra duy trì liên kết với tế bào trong quá trình lên men chìm,
sinh khối được sản xuất có thể được tái chế như một chất xúc tác sinh học. Chiến lược
có thể được sử dụng tannase cô đặc hoặc tinh chế và cố định sau khi khai thác từ sinh
khối (lên men chìm) hoặc từ mơi trường ni cấy (lên men chìm trạng thái rắn). Để tăng
hoạt tính chun biệt chuẩn bị enzyme, tannase nên được cơ đặc. Vì vậy, các phương
pháp cổ điển như muối hoặc kết tủa dung môi, siêu lọc, trao đổi ion hoặc sắc ký loại trừ
kích thước, cũng như chiết xuất dung mơi có thể được sử dụng. Hoạt tính tannase được
cơ đặc và được tinh chế thơng thường, nó có thể được cố định để tái sử dụng điều chế
enzyme. Agarose, chitosan, alginate và các vật liệu silicious được tạo dẫn xuất khác nhau
có thể được sử dụng cố định tannase, cố định tannase từ Aspergillus oryzae trên nhiều
loại chất mang. Tuy nhiên, chất mang mà enzyme cố định ở chitosan glutaraldeheyde
cho thấy hoạt tính cao nhất. Cố định của từ A. oryzae gây ra tăng cường ổn định nhiệt và

cũng ổn định ở pH thấp hơn.


13

Sharma et al. (2002) cố định tannase từ A. niger trên concavalin A-Sepharose qua
tương tác ái lực sinh học. Sự cố định khá ổn định để sử dụng lại, không bị mất hoạt tính
enzyme sau ba chu kỳ và nó vẫn giữ được 81% hoạt động ngay cả sau chu kỳ thứ sáu.
Thủy phân ester bằng cách sử dụng cố định enzyme dẫn đến chuyển đổi 40% thành gallic
acid so với 30% thu được enzyme tự do. Sự cố định enzyme được thực hiện trong thời
gian dài hơn cho các ứng dụng cơng nghiệp. Ưu điểm chính là tăng cường độ ổn định
nhiệt và pH, đơn giản của các sản phẩm, sử dụng liên tục enzyme trong các lò phản ứng
đóng gói, v.v. tannase từ A. oryzae gây ra tăng cường ổn định nhiệt và ổn định pH thấp
hơn. Ngay cả sau khi sử dụng lặp lại 17 lần, hoạt động còn lại 85% đã được hiển thị bằng
enzyme cố định. Enzyme tannase cố định của Rhizopus oryzae ổn định cho đến 7 lần sử
dụng lặp lại. Tannase cố định từ P.variable IARI 2031 giữ lại 85% hoạt tính của nó sau
khi sử dụng liên tục 9 lần (Sharma et al. 2008). Tannase cố định enzyme từ
Staphylococcus lugdunensis MTCC 3614 cho thấy 80% còn lại hoạt động sau 7 chu kỳ
sử dụng và hơn 50% hoạt động còn lại sau 15 chu kỳ [15].
Tannase xúc tác quá trình thủy phân các esters gallic acid và tannin thủy phân.
Enzyme này được sản xuất bởi thực vật và vi sinh vật và được sử dụng trong công nghiệp
làm chất xúc tác trong sản xuất gallic acid. Ngồi ra, nó có khả năng được sử dụng trong
đồ uống và chế biến thức ăn. Hai yếu tố quan trọng, chi phí sản xuất và kiến thức khơng
đầy đủ về các đặc tính cơ bản, tính chất hóa lý, đặc điểm xúc tác, cơ chế điều hòa và tiềm
năng sử dụng, hạn chế sử dụng tannase ở mức độ công nghiệp. Công việc xem xét trạng
thái của các khía cạnh quan trọng liên quan đến tannase, nhấn mạnh các khía cạnh như
nguồn, chất nền, cơ chế điều hịa trao đổi chất, đặc tính hóa lý, chất ức chế, sản xuất, ứng
dụng và tiềm năng sử dụng.
1.10. Tannin - Nguồn cơ chất tự nhiên
Tannin phân bố rộng rãi ở các bộ phận khác nhau (vỏ cây, kim, tâm gỗ, cỏ, hạt và

hoa) của thực vật có mạch. Nó là một chuỗi oligomeric phức tạp được đặc trưng bởi sự
hiện diện của các hợp chất polyphenolic. Chúng có trọng lượng phân tử lớn hơn 500kDa,


14

đạt giá trị trên 20000 kDa. Một trong những đặc tính chính của tannin là khả năng tạo
phức mạnh với protein và các đại phân tử khác như tinh bột, cellulose và khống chất và
các enzyme tiêu hóa bao gồm pectinase, amylase, lipase, protease, cellulase và βgalactosidase [6]. Những đặc tính này của tannin làm cho chúng trở nên độc hại hoặc
kháng lại dinh dưỡng đối với động vật nhai lại vì chúng có thể làm giảm lượng thức ăn
ăn vào và giảm khả năng tiêu hóa chất dinh dưỡng và sẵn có của protein.
Trên cơ sở đặc điểm cấu trúc của chúng, tannin được chia thành bốn nhóm: tannin
cơ đặc, gallotannin và ellagitannin hồn chỉnh[7].
Tannin cơ đặc là các polymer được hình thành do quá trình ngưng tụ của flavan,
được hình thành do liên kết C-4 của một catechin với C-8 hoặc C-6 của catechin đơn
phân tiếp theo, và chúng khó bị thủy phân. Tannin hồn thành là những phân tử với
polyol (thường là D-glucose) làm lõi trung tâm, và các nhóm hydroxyl của những
carbohydrate này là một phần hoặc tồn bộ ester hóa với các nhóm phenol như gallic
acid hoặc acid ellagic.
Gallotannin là các polymer được hình thành bởi các acid hữu cơ, chẳng hạn như
gallic acid, digallic acid và chebulic acid, được ester hóa với nhóm hydroxyl của polyol
carbohydrate. Ellagitannin là polyphenol được tạo thành chủ yếu từ liên kết oxy hóa của
các nhóm galloyl trong 1, 2, 3, 4, 6-pentagalloyl glucose. Ellagitannin khác với
gallotannin trong đó các nhóm galloyl của chúng được liên kết thơng qua liên kết C-C,
trong khi các nhóm galloyl trong gallotannin được liên kết với nhau bằng các liên kết
depside.
Để duy trì khả năng liên kết, gallotannin phải có nhiều hơn hai thành phần gallic
acid ester hóa thành lõi glucose. Tannin thủy phân có thể dễ bị thủy phân trong điều kiện
acid nhẹ hoặc kiềm; bằng nước nóng hoặc bằng enzyme. Tannin ngưng tụ hoặc
Proanthocyanidins là các hợp chất phức tạp được tạo thành bởi các nhóm flavonoid (từ

2 đến 50) được xem là khơng thể thủy phân. Thành phần chính của chúng là cyanidin và
delphinidin làm chát hương vị của trái cây và rượu [7].


15

Tác dụng tiêu cực của tannin không chỉ liên quan đến hương vị mà còn trực tiếp
đối với các đại phân tử, khiến chúng khó tiêu hóa. Khả năng của chúng tạo thành phức
hợp ổn định với các enzyme và khoáng chất bị ảnh hưởng bởi lượng thức ăn của vật
ni, khả năng tiêu hóa thức ăn và hiệu quả sản xuất. Bên cạnh đó, sự hiện diện của
tannin cũng có thể tạo thành kem trà trong trà đồ uống và hiện tượng đục trong rượu và
cà phê. Tannin cũng ức chế sự phát triển của một số vi sinh vật, chống lại vi sinh tấn
công và dễ phân hủy sinh học. Tuy nhiên, một số vi sinh vật kháng tannin và phát triển
các cơ chế và con đường khác nhau để phân huỷ tannin trong môi trường sống. Nhiều vi
sinh vật có thể tạo ra tannase đã được sử dụng tannin làm nguồn carbon duy nhất [7].
Tannin có một loạt các hoạt tính sinh học như đặc tính chống oxy hóa, chelation
ion kim loại, kết tủa protein, v.v. . Tannin có cơ chế tự bảo vệ chống lại cơn trùng, động
vật ăn cỏ, nấm, vi khuẩn, v.v. Ngoài ra có vai trị quan trọng trong q trình chín của trái
cây và thường xuất hiện trong dâu đen, nho, táo,… Tannin có một số ưu điểm như tăng
tốc độ đơng máu, hỗ trợ vết thương chữa bệnh và làm giảm huyết áp. Tannin cũng hoạt
động như chất điều hòa miễn dịch và chất kháng khuẩn. Khả năng gắn kết protein của
tannin ảnh hưởng đến chất lượng dinh dưỡng của thức ăn. Ức chế các enzyme tiêu hóa
và loại bỏ các protein cần thiết dẫn đến khó tiêu làm cho tannin trở thành yếu tố kháng
dinh dưỡng [1].
Tannase xúc tác phân hủy chất có thể thủy phân tannin như tannic acid,
methygallate, ethyl gallate, n-propylgallate và isoamylgallate. Phản ứng tiêu biểu của
tannase là sự phân cắt thủy phân của (-) epigallocatechin-3-ol gallate (Hình 1.2). Mặc
dù tannase có trong thực vật, động vật và vi sinh vật, chủ yếu được tạo ra bởi vi sinh vật.

16

Hình 1.2. Phản ứng tiêu biểu của tannase
1.11. Các ứng dụng của tannase
Tannase có vai trị quan trọng trong các ngành công nghiệp như công nghiệp mỹ
phẩm, thực phẩm và công nghiệp thức ăn chăn nuôi, công nghiệp da và cơng nghiệp hóa
chất. Một trong những ứng dụng chính của enzyme tannase là sản xuất gallic acid từ
tannin. Loại bỏ các tác dụng không mong muốn của tannin trong ngành công nghiệp thực
phẩm, đồ uống. Loại bỏ vị đắng của dịch nước trái cây và trà bằng cách xử lý bằng
enzyme nâng cao chất lượng của những thức uống này [1].
1.11.1. Ngành chè
Đồ uống không cồn phổ biến nhất là trà (Camellia sinensis L.), và hơn 2/3 dân số
thế giới tiêu thụ chè. Khi chiết xuất trà bằng nước lạnh, nó có nồng độ giới hạn của chất
rắn chiết xuất được và nước giải khát thu được có màu nhạt khơng có hương vị của trà.
Khi xử lý bằng enzyme tannase trong điều kiện kỵ khí, các thành phần khơng tan trong


17

nước lạnh sẽ bị giảm, do đó tạo ra nước trà xanh chất lượng cao. Đánh giá độ an toàn
của enzym tannase từ A. oryzae an toàn cho việc sử dụng trong pha chế trà. Sự ức chế
N-nitrosodimethylamine (NDMA) bởi trà xanh được xử lý bằng tannase nhờ vào khả
năng chống oxy hóa của tannase. Sự pha trà chứa catechin như epicatechin,
epigallocatechin, epicatechin gallate, và epigallocatechin gallate. Catechin góp phần vào
vị đắng và làm chát trong dịch trà. Với nồng độ catechin ngày càng tăng, cường độ hương
vị tăng lên và cảm giác ngon miệng bị giảm xuống. Nhược điểm khác của catechin trong
trà là sinh khả dụng học kém. Lớp màu kem từ trà hình thành do sự xuất hiện polyphenol
trong trà, ảnh hưởng đến chất lượng bảo quản của các sản phẩm. Hơn nữa, polyphenol
chống dinh dưỡng bằng cách ức chế các enzyme tiêu hóa như amylase và pepsin. Trà ô
long Tieguanyin kém chất lượng đã được cải tiến chất lượng đặc tính chống oxy hóa nhờ

hoạt động của enzym tannase. Epigallocatechin gallate của trà xanh và trà yerba mate
được thủy phân bởi hoạt động của enzym tannase từ Paecilomyces variotti. Trong một
nỗ lực khác, epigallocatechin gallate và epicatechin gallate được thủy phân bởi tannase
để cải thiện vị ngọt [1].
1.11.2. Nước ép trái cây
Tannin có nhiều trong vỏ và hạt của quả nho đại diện cho một trong những các lớp
polyphenol hòa tan trong tannin. Quả việt quất, quả mâm xơi và quả lựu trong q trình
bảo quản sẽ tạo thành màu sẫm và vị đắng. Những đặc điểm khơng mong muốn này có
thể được loại bỏ bằng enzyme tannase trong quá trình chuẩn bị và bảo quản các loại nước
trái cây khác nhau. Lựu được biết đến với khả năng chống oxy hóa; tuy nhiên hình thành
khói, lắng cặn, hình thành màu, vị đắng và làm chát khi bảo quản nước ép lựu được đóng
góp bởi số lượng tannin nhiều. Thông thường các phương pháp không hiệu quả để khử
vị đắng của nước trái cây bằng sử dụng tannase là thuận lợi. Tuy nhiên, xử lý với tannase
và gelatin kết hợp đạt được sự phân hủy tannin nhiều hơn (49%) so với xử lý chỉ với
tannase (25%). Sự lọc của nước táo hạt điều bằng cách khử tannin sử dụng enzyme
tannase, do đó loại bỏ khả năng làm chát của nước trái cây. Nước táo hạt điều được xử


18

lý bằng enzyme thích hợp để tiêu thụ sau 2 tháng bảo quản ở 4°C (Campos et al. 2002).
Nước ép Aonla/myrobalan (Phyllanthus emblica) giàu vitamin C và tannin được xử lý
bằng tannase từ A. niger ITCC 6514.07, và 68,8% tannin được loại bỏ mà không giảm
hàm lượng vitamin C. Mặt khác, xử lý nước ép khơng có enzyme làm giảm đáng kể
vitamin C, cho thấy lợi thế của việc xử lý bằng enzyme. Biến đổi sinh học của polyphenol
trong nước cam do tannase từ P. variotti đạt được, do đó tăng cường tiềm năng dinh
dưỡng. Nho là một nguồn giàu tannin và enzyme tannase từ Penicillium montanense rất
hữu ích trong việc lọc nước nho bằng cách giảm 46% hàm lượng tanninn. 56% tổng
lượng tannin được loại bỏ trong quá trình lọc bằng enzyme của nước ép lựu bằng cách
sử dụng tannase từ A. niger MTCC 2425 [1].

1.11.3. Ngành công nghiệp rượu và bia
Sự hình thành khói thường xảy ra trong q trình bảo quản bia và rượu do có nhiều
hợp chất phenol trong rượu và bia. Tannase từ Aspergillus flavus được sử dụng để thủy
phân polyphenol trong bia lạnh, do đó làm giảm sự hình thành khói trong bia. Như
polyphenol có nhiều trong quả nho, rượu vang được sản xuất chứa các hợp chất dẫn đến
sự hình thành khói. Trước đây, xử lý bằng hóa chất được thực hiện loại bỏ sự hình thành
khói mù, được thay thế bằng xử lý bằng enzyme với tannase để loại bỏ tannin như
catechin và epicatechin. Rượu acorn với chất lượng vượt trội thu được bằng cách xử lý
với tannase tạo ra Aspergillus sp. AN-11. Hương vị của bia được cải thiện đáng kể bởi
xử lý bằng tannase. Tannase sản xuất L. plantarum được báo cáo từ rượu nho và rượu
vang, có thể trở nên hiệu quả trong việc loại bỏ khói mù [14].
1.11.4. Thức ăn chăn nuôi
Sự hiện diện của tannin trong chất thải nông nghiệp và nguyên liệu thực vật được
sử dụng như thức ăn gia súc làm cho chúng không sử dụng được. Tannin được xem là
yếu tố chống lại dinh dưỡng vì sự tương tác của chúng với các đại phân tử như protein
và làm khó tiêu. Sự hiện diện của chúng ảnh hưởng đến khả năng tiêu hóa protein và ức
chế các enzyme tiêu hóa gây ra việc loại bỏ các acid amin thiết yếu và protein. Điều này