Chương 5: CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG TRỒNG TRỌT ppt

CHƯƠNG 5
CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG TRỒNG TRỌT
NỘI DUNG
Nuôi cấy mô tế bào thực vật
Các kỹ thuật chuyển gen ở thực vật
1. Nuôi cấy mô, tế bào thực vật
1.1. Khái niệm
Nuôi cấy mô, tế bào thực vật là khái niệm chung cho
tất cả các phương pháp nuôi cấy các nguyên liệu (tế bào,
mô, phôi) trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo trong điều
kiện vô trùng
Nuôi cấy mô, tế bào gồm nuôi cấy cây non, cây
trưởng thành, nuôi cấy các bộ phận cơ quan như rễ, thân,
lá, hoa, bao phấn, noãn chưa thụ tinh,… nuôi cấy phôi, nuôi
cấy mô sẹo, nuôi cấy tế bào đơn bội và nuôi cấy tế bào trần.
1.2. Cơ sở kỹ thuật của nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.2.1. Cơ sở khoa học
- Tính toàn năng của tế bào (totipotency cell)
- Sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào
1.2.2. Yêu cầu kỹ thuật của nuôi cấy mô, tế bào thực vật
Các thiết bị, hóa chất:
Môi trường nuôi cấy:
Các chất vô cơ đa lượng: N, P, K, S, Ca, Mg
Nguyên tố vi lượng: Fe, Mn, Zn, Br, Cu, Co, Mo
Vitamin:
Nguồn cacbon: sucrose hoặc glucose
Các chất điều hòa sinh trưởng: auxin và cytokinin
Agar
1.2.3. Mẫu dùng cho nuôi cấy mô, tế bào thực vật
Mẫu có thể được thu theo hai cách:
- Từ hạt: Khử trùng bề mặt hạt, gieo hạt trong điều

kiện vô trùng thành cây và lấy mẫu
- Mẫu cấy: lấy trực tiếp từ cây tươi được xử lý bằng
dung dịch sát trùng
1.3. Nhân giống cây trồng bằng nuôi cấy mô, tế
bào
1.3.1. Khái niệm
Khái niệm: Nhân giống vô tính hoặc công nghệ vi
nhân giống được tiến hành trên nguyên tắc cắt, nuôi đoạn
thân (có mang chồi ở nách lá), đoạn rễ, mảnh củ, cánh hoa,
… có kích thước nhỏ trong điều kiện vô trùng.
Các thực vật được nhân giống bao gồm các loài hoa
(lan, cẩm chướng, đồng tiền, lily, cúc,…), cây lương thực,
thực phẩm (khoai tây, mía, cà chua,…), cây ăn quả (chuối,
dứa, cam, chanh,…), cây lâm nghiệp (bạch đàn, keo,
thông,…) cây cảnh (sung, đa, si, )
1.3.2. Phương pháp nhân giống vô tính in vitro
a) Nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng
Phát triển cây trực tiếp: Chủ yếu trên cây 2 lá mầm
(dicotyledon)
Phát triển cây gián tiếp qua giai đoạn cụm chồi
(protocorm): Trên cây một lá mầm (monocotyledon)
b) Nhân giống qua giai đoạn mô sẹo
Trong nhiều trường hợp mô nuôi cấy không tái sinh
thành cây mà phát triển thành khối mô sẹo (callus) sau đó mô
sẹo được tái sinh thành cây hoàn chỉnh
c) Nhân giống vô tính thông qua phát sinh phôi vô tính –
công nghệ hạt nhân tạo
Ở thực vật sinh sản hữu tính, phôi là sản phẩm của
quá trình thụ tinh đó là phôi hữu tính (zygotic embryo). Tuy
nhiên trong nuôi cấy in vitro, phôi có thể được phát triển từ

tế bào sinh dưỡng, gọi là phôi vô tính (somatic embryo)
Phôi vô tính là dạng phôi được hình thành từ tế bào
soma, không qua thụ tinh và có bản chất di truyền hoàn toàn
giống với tế bào soma sinh ra nó
1958, Street và Reinert đã mô tả sự hình thành phôi
vô tính ở cà rốt
Các phôi vô tính có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh
Một số cây trồng được nhân giống qua phôi vô tính
Công nghệ hạt nhân tạo
Hạt nhân tạo (artificial seed hoặc synthetic seed) là
phôi vô tính được bọc trong một lớp vở polyme như agar,
agarose, alginate,…. Trong cấu trúc lưới của các lớp vỏ đó,
nước, chất dinh dưỡng và chất sinh trưởng được cung cấp
thay cho nội nhũ, giúp cho phôi vô tính có thể nảy mầm trở
thành cây hoàn chỉnh.
1.3.3. Những ưu điểm và hạn chế của nhân
giống vô tính
Ưu điểm:
- Đưa ra sản phẩm nhanh, độ đồng đều cao
- Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao
- Nâng cao chất lượng giống cây trồng, tạo quần thể
cây sạch bệnh
Hạn chế:
- Hạn chế về chủng loại
- Có thể phát sinh một số hiện tượng như biến dị
soma, nhiễm khuẩn, tạo độc tố, thủy tinh hóa (cay có thân,
lá mọng nước)
1.4. Chọn tạo giống bằng nuôi cấy mô, tế bào

1.4.1. Nuôi cấy bao phấn, noãn chưa thụ tinh và tạo cây
đơn bội
Khi nuôi cấy hạt phấn, noãn phát triển thành cây hoàn
chỉnh ta sẽ thu được cây đơn bội (1n)
1964, Guda và Maheshwari (Ấn Độ) đã thu được cây
đơn bội ở cây cà độc dược (Datura innoxia)
Cây đơn bội được áp dụng trong:
- Nghiên cứu di truyền của các gen, trội và lặn, tương
tác gen
- Tạo đột biến đơn bội
- Tạo cây đồng hợp tử tuyệt đối phục vụ chọn giống
Hai phương pháp tạo cây đơn bội là:
- Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn: Nuôi cấy hạt phấn
(pollen) hoặc bao phấn (anther) trên môi trường thích hợp để
phát triển thành cây đơn bội hoàn chỉnh
- Nuôi cấy noãn chưa thụ tinh: Nuôi cấy noãn chưa thụ
tinh phát triển thành cây đơn bội
1.4.2. Nuôi cấy tế bào trần và ứng dụng trong chọn giống
Tế bào trần (protoplast) là tế bào được loại bỏ
thành tế bào
Có hai phương pháp tạo tế bào trần:
- Hóa chất: Dùng enzym cellulase và pectinase
- Cơ học
Quy trình nuôi cấy tế bào trần:
- Tách tế bào trần
- Tái sinh cây từ tế bào trần
Cây lai giữa khoai tây và cà chua
Ứng dụng :
- Dung hợp tế bào trần (protoplast fusion) để tạo tế

bào lai soma. Các tế bào trần có thể dung hợp để tạo
thành tế bào lai soma. Bằng phương pháp dung hợp tế bào
trần có thể tạo ra con lai xa. Có hai phương thức dung hợp
tế bào trần:
+ Hóa chất: PEG (polyethylen glycol)
+ Điện trường
- Chọn dòng tế bào
- Biến nạp di truyền và tạo cây chuyển gen
1.4.3. Biến dị dòng soma và chọn lọc biến dị soma
Biến dị dòng soma là những biến dị thể hiện ở các tế
bào, mô và cây có nguồn gôc từ việc nuôi cấy mô, tế bào.
Biến dị dòng soma còn gọi là biến dị dòng vô tính
Chọn lọc dòng kháng bệnh, chống chịu stress
1.4.4. Thụ phấn in vitro và cứu phôi in vitro
Hiện tượng bất thụ trong lai xa
Thụ phấn in vitro để khắc phục hiện tượng bất hợp
giao tử trong lai xa
Nuôi cấy phôi in vitro (cứu phôi). Sau khi thụ phấn in
vitro cần tiến hành nuôi cấy phôi in vitro nhằm cứu phôi
Thành tựu: Trên cây củ cải, sắn, đu đủ, lạc,
Khó khăn: Môi trường dinh dưỡng phức tạp
1.5. Công nghệ tế bào trong bảo quản nguồn
gen thực vật
Mục đích: Duy trì sự đa dạng, phong phú của thực vật
Các phương thức bảo quản
- Bảo quản In – situ: Bảo quản tại chỗ
- Bảo quản Ex – situ. Bảo quản dưới điều kiện nhân
tạo. Gồm các phương thức sau:
+ Bảo quản tại vườn ươm (field genebank)
+ Bảo quản hạt trong kho lạnh (seed genebank)

+ Bảo quản in vitro (in vitro genebank)
+ Bảo quản ADN
Những kết quả và khó khăn của công tác bảo quản nguồn
gen thực vật
Thành tựu: Các cây được bảo quản như dứa, cà
phê, cao su, khoai lang, khoai tây, sắn, chuối, nho, cây có
múi, mía,…
Khó khăn: Chưa có những nghiên cứu đầy đủ về mối
tương quan giữa các yếu tố môi trường trong quá trình bảo
quản.
2. Kỹ thuật chuyển gen ở thực vật
Có hai nhóm phương pháp chính:
- Chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn
- Chuyển gen trực tiếp bằng súng bắn gen
2.1. Chuyển gen gián tiếp qua vi khuẩn Agrobacterium
Agrobacterium là nhóm vi khuẩn đất, gram (-), gây ra
các triệu chứng bệnh ở cây khi xâm nhiễm qua vết thương
A.tumefaciens gây bệnh u thân cây
A.shizogenes gây bệnh tóc rễ cây
A.rubi gây bệnh u trên cây dâu đất, mâm xôi