công nghệ sinh học trong việc phòng trừ nấm bệnh phan2

44
3.3.2.1 Tăng sinh vi khuẩn Pseudomonas fluorescens trên môi trường LB
Bộ mẫu Pseudomonas fluorescens được giữ - 70
o
C, do các anh chị trước đã phân
lập và giữ nguồn. Các dòng được chọn từ bộ mẫu này được đem ra rã đông và tăng
sinh trên môi trường LB. Phần sinh khối thu được dùng cho việc ly trích và giữ làm bộ
mẫu nguồn riêng phục vụ cho việc thiết lập qui trình.
Sử dụng micropipette 10 – 100 µl, hút 10 µl dịch khuẩn cho vào ống nghiệm đựng
5 ml môi trường LB đã hấp vô trùng, đậy lại bằng nút bông. Các ống nghiệm này được
gói lại thành bó và cho vào tủ lắc định ôn, nhiệt độ nuôi là 27
o
C, tốc độ lắc là 150
vòng / phút. Sau 48 giờ tăng sinh, dịch khuẩn thu được đem đi ly tâm để thu sinh khối.
3.3.2.2 Ly trích genomic DNA từ các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens
* Qui trình ly trích
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng phương pháp tách chiết DNA theo
phương pháp sử dụng CTAB / NaCl đã có cải tiến, qui trình thực hiện như sau:
1. Sử dụng sinh khối vi khuẩn đã được tăng sinh ở trên để tiến hành ly trích
genomic DNA.
2. Thu sinh khối vi khuẩn bằng cách ly tâm 10000 vòng/5phút/4
o
C. Rửa sinh khối
thu được với 1 ml nước cất hai lần vô trùng và đánh tan bằng vortex (3 lần).
3. Hoà tan sinh khối vi khuẩn thu được trong 567 µl dung dịch TE và đánh tan
bằng vortex, thêm 30 µl dung dịch SDS 10 % và đánh tan bằng vortex. Sau đó ủ ở
37
o
C khoảng 1 - 2 giờ.
4. Cho thêm vào 100 µl dung dịch NaCl 5M, hòa tan thật kỹ bằng vortex.
5. Thêm vào 80 µl dung dịch CTAB / NaCl (khoảng 1 / 10 thể tích). Pha trộn (đánh

tan bằng vortex), ủ ở 65
o
C trong 10 phút.
6. Thêm 780 µl dung dịch hổn hợp chloroform / isoamyl alcohol (24 : 1 ; v/v). Hòa
lẫn đều bằng lắc tay, ly tâm 10 phút ở 12000 vòng/ 4
o
C.
7. Thu hết dung dịch bên trên (dung dịch DNA) cho vào ống ly tâm mới (nếu
không thể phân biệt mặt phân cách chung giữa các dung dịch, có thể ly tâm lần nữa
ở tốc độ lớn hơn).
8. Chiết xuất dung dịch DNA với phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25 : 24 :
1; v/v). Hòa lẫn đều bằng cách lắc tay, ly tâm 14000 vòng/10 phút /4
o
C.
9. Thu lấy dung dịch bên trên cho vào ống ly tâm mới (khoảng 500 µl). Kết tủa
DNA với isopropanol, dùng khoảng 0,6 thể tích cùa dung dịch (khoảng 300 µl) và
45
ủ ở tủ - 20
o
C / 30 phút. Sau đó ly tâm 12000 vòng/10 phút /4
o
C, lấy kết tủa sau khi
ly tâm.
10. Rửa kết tủa bằng cồn 70% (khoảng 500 µl). Tốt hơn có thể dùng ethanol 70 %
được làm lạnh ở - 20
o
C, nghiêng nhẹ qua lại, ly tâm 13000 vòng/10 phút/4
o
C. Đổ
cồn ra hết và làm khô bằng cách cho cồn bay hơi.

11. Hòa tan kết tủa trong 40 µl dung dịch TE 1X, đem mẩu giữ ở tủ 4
o
C trong suốt
thời gian thử nghiệm.
* Kiểm tra kết quả ly trích genomic DNA
Chuẩn bị gel agarose 0,8%
Cân 0,1 g agarose cho vào 12,5 ml TAE 0,5X, lắc nhẹ cho agarose phân tán đều,
đem đun trong lò viba ở 650 W, 2 phút. Để nguội, đổ vào khuôn có gắn lược với số
giếng mong muốn. Chờ gel đông (thường 30 phút), rút lược ra và bắt đầu tiến hành
nạp mẫu.
Nạp mẫu, xác lập các thông số điện di và đọc kết quả
Hút 2 µl genomic DNA đã ly trích ở trên, trộn đều với 2 µl đệm tải mẫu (loading
buffer) 6X, sau đó hút hỗn hợp dung dịch bơm vào giếng tương ứng với số mẫu đã xác
lập trước của gel agarose 0,8 %. Gel được đặt trong đệm TAE 0,5 X, hiệu điện thế 100
V, 250 mA và thời gian chạy là 15 phút. Sau đó, gel được lấy ra và nhuộm trong
ethidium bromide 10 phút, rửa sạch và xem kết quả ly trích bằng máy Gel Doc 2000,
sử dụng phần mềm Quatity One 2000 (Bio - Rad).
3.3.2.3 Hiệu chỉnh nồng độ và định lượng DNA bằng phân tử Mass
* Hiệu chỉnh nồng độ
Từ các mẫu DNA đã được ly trích, chọn một mẫu DNA có nồng độ loãng nhất
trong các mẫu còn lại dựa trên kết quả kiểm tra sản phẩm ly trích genomic DNA bằng
điện di làm mẫu chuẩn. Cũng từ đó, ta tính được số lần cần pha loãng của các mẫu có
nồng độ cao so với mẫu chọn làm chuẩn.
Mẫu được chọn làm chuẩn phải có nồng độ sử dụng được, không nên quá loãng, vì
như thế sẽ gây khó khăn trong quá trình tiến hành các thử nghiệm đòi hỏi phải sử dụng
nồng độ DNA tương đối lớn như thực hiện phản ứng cắt genomic DNA.
* Định lượng DNA bằng phân tử Mass
Chuẩn bị gel agarose 2%
46
Cân 0,2 g agarose cho thêm vào 10 ml TAE 0,5X, lắc cho agarose phân tán đều,

đem đun trong lò viba ở 500 W, cứ mỗi phút đem ra xem agarose tan hoàn toàn chưa.
Khi agarose thật sự tan hết trong TAE, để nguội, đổ vào khuôn với lược 6 giếng. Chờ
gel đông khoảng 30 phút, sau đó tiến hành nạp mẫu.
Thiết lập phương pháp định lượng bằng phân tử Mass
Giếng đầu tiên và giếng cuối cùng sử dụng Mass, các giếng còn lại theo thứ tự sử
dụng một mẫu genomic DNA bất kì đã hiệu chỉnh nồng độ được pha loãng theo cách
sau:
4 µl DNA đã hiệu chỉnh nồng độ + 4 µl nước cất hai lần vô trùng
4 µl DNA đã hiệu chỉnh nồng độ + 8 µl nước cất hai lần vô trùng
4 µl DNA đã hiệu chỉnh nồng độ + 12 µl nước cất hai lần vô trùng
4 µl DNA đã hiệu chỉnh nồng độ + 16 µl nước cất hai lần vô trùng
4 µl DNA đã hiệu chỉnh nồng độ + 20 µl nước cất hai lần vô trùng
4 µl DNA đã hiệu chỉnh nồng độ + 24 µl nước cất hai lần vô trùng
Nạp mẫu, xác lập các thông số điện di và đọc kết quả
Giếng 1: hút 2 µl phân tử Mass, trộn đều với 2 µl loading dye 6X, hút hỗn hợp
dung dịch bơm vào giếng 1.
Giếng 2: hút 1 µl phân tử Mass, trộn đều với 2 µl loading buffer 6X, hút hỗn hợp
dung dịch bơm vào giếng cuối cùng.
Các giếng còn lại theo thứ tự là mẫu DNA gốc trước khi pha loãng, kế đến là các
mẫu pha loãng 1 lần, 2 lần, 3 lần, 4 lần , 5 lần , 6 lần, 7 lần, 8 lần với thể tích như sau:
2 µl mẫu + 2 µl loading buffer, trộn đều và bơm vào với giếng tương ứng.
Điều kiện chạy trong đệm TAE 0,5X, ở hiệu điện thế 70 V trong 60 phút. Sau đó,
gel được nhuộm ethidium bromide trong 15 phút và đem ra rửa thật kỹ bằng nước
sạch. Đọc gel bằng máy Gel Doc 2000 và phân tích kết quả.
3.3.2.4 Thiết lập phản ứng cắt genomic DNA bằng enzyme giới hạn
* Thiết lập phản ứng
Sử dụng enzyme cắt giới hạn BamH I, Eco RV và Hind III để cắt genomic DNA,
chúng tôi đã thiết lập phản ứng cắt ở hai thể tích khác nhau 25 µl và 50 µl như sau:

47
Bảng 3.1 Thành phần phản ứng cắt với tổng thể tích phản ứng là 25 µl.
BamH I Eco RV Thể tích
DNA DNA 5 µl
10X đệm BamH I 10X đệm Eco RV 2.5 µl
Enzyme BamH I Enzyme Eco RV 0.1 µl
Nước Nước 17.4 µl
Tổng cộng 25 µl

Phản ứng được ủ ở 37
o
C trong 2 giờ.
Thể tích các thành phần phản ứng cắt ở bảng 3.1 được thực hiện theo khuyến
cáo chỉ dẫn của nhà sản xuất.

Bảng 3.2 Thành phần phản ứng cắt với tổng thể tích phản ứng là 50 µl.
BamH I Eco RV Hind III Thể tích
DNA DNA DNA 30 µl
10X đệm BamH I 10X đệm Eco RV 10X đệm Hind III 5 µl
Enzyme BamH I Enzyme Eco RV Enzyme Hind III 1 µl
Nước Nước Nước 14 µl
Tổng cộng 50 µl

Phản ứng được ủ ở 37
o
C qua đêm.
Thể tích các thành phần phản ứng cắt ở bảng 3.2 đã được thay đổi.
Các thành phần trên đã được khảo sát và hiệu chỉnh cho phản ứng cắt tốt nhất.

* Trộn phản ứng cắt
Đầu tiên cần xác định lượng sản phẩm cắt cần sử dụng, tính toán thể tích hút, số
phản ứng và điều chỉnh nhiệt độ ủ ở bồn ủ water bath. Thông thường, người ta hay
trộn các thành phần chung trong một hỗn hợp rồi mới phân chia thành các phản ứng
riêng lẻ. Tiến hành trộn phản ứng cắt theo thứ tự sau:
- Hút nước
- Hút dung dịch đệm của enzyme
- Hút enzyme
48
- Trộn các thành phần trên thật nhẹ và đều, phân chia ra các eppendorf dùng
để thực hiện phản ứng cắt.
- Bơm mẫu DNA vào các eppendorf đã trộn ở trên, đậy nắp kỹ và đem đi ủ ở
nhiệt độ thích hợp.
* Kiểm tra kết quả phản ứng cắt
Bố trí mẫu
Bố trí giống như phương pháp định lượng DNA bằng phân tử Mass, giếng đầu tiên
và giếng cuối cùng là genomic DNA lúc chưa thực hiện phản ứng cắt, các giếng còn
lại là sản phẩm cắt của các mẫu. Cũng có thể bố trí theo kiểu xen kẻ, liên tiếp nhau
mẫu DNA chưa cắt, đến mẫu sản phẩm cắt.
Nạp mẫu, chạy điện di, đọc kết quả
Hút 4 µl mẫu, trộn đều với 2 µl loading buffer 6X, bơm vào giếng tương ứng đã bố
trí. Thực hiện điện di trên gel agarose 0,8 % trong đệm TAE 0,5X, hiệu điện thế 50 V
trong 90 phút. Xem kết quả cắt bằng cách nhuộm gel trong ethidium bromide 10 phút,
rửa sạch và đọc kết quả bằng phần mềm Quatity One của máy Gel Doc 2000 (Bio-
Rad).
3.3.2.5 Thực hiện phản ứng PCR khuếch đại gen phlD trên hai cặp primer
B2BF, BRR4 và phl- 2a, phl- 2b.
Trong vi khuẩn có lợi, gen mã hóa các đặc tính thường là một tổ hợp các gen có
chức năng khác nhau, trong đó một số gen đóng vai trò quan trọng trong quá trình mã
hóa các chất kháng sinh chính và một số gen có vai trò mã hóa các chất phụ như là các

chất xúc tác phản ứng tổng hợp chất kháng sinh chính.
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng các kết quả nghiên cứu đã được công bố
để thiết lập các primer chuyên biệt dùng để phát hiện các gen mã hóa các chất kháng
sinh và dùng dòng vi khuẩn P. fluorescens 2P24 cung cấp bởi tiến sỹ Zhang, Liqui Đại
học Nông Nghiệp Bắc Kinh, Trung Quốc làm dòng vi khuẩn đối chứng.
- Cặp primer ngoài: Khuếch đại trình tự 745 bp
Phl - 2a: GAGGACGTCGAAGACCACCA
Phl - 2b: ACCGCAGCATCGTGTATGAG
- Cặp primer trong: Khuếch đại trình tự 629 bp
B2BF: ACCCACCGCAGCATCGTTTATGAGC
BRR4: CGCCGGTATGGAAGATGAAAAAGTC