công nghệ sinh học trong việc phòng trừ nấm bệnh phan3

57
Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 KẾT QUẢ TĂNG SINH , LY TRÍCH, VÀ ĐỊNH LƢỢNG GENOMIC DNA
4.1.1 Kết quả tăng sinh và ly trích
Các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens được tăng sinh trên môi trường LB
48 giờ ở 27
o
C. Sau 48 giờ nuôi cấy, các dòng đều cho sinh khối. Chúng tôi đã ly trích
được 34 dòng (phụ lục) trong tổng số 51 dòng từ bộ mẫu (phụ lục).










Hình 4. 1 Kết quả ly trích DNA từ các dòng Pseudomonas fluorescens sau 48 giờ
nuôi cấy trên môi trƣờng LB ở nhiệt độ 27
o
C.

Kết quả điện di (hình 4.1) cho thấy, hai mẫu 18, 128 không thu được DNA. Các
mẫu 23, 65, 149, 154, 121, 123,127, 150 cho sản phẩm DNA tổng số ít lẫn tạp chất.
Các mẫu 28, 129, 70 có sản phẩm DNA còn lẫn nhiều tạp chất. Các vệt sáng kéo dài
phía dưới DNA tổng số có thể là RNA hoặc DNA bị đứt gãy. Lỗi này có thể do thao
tác, khi thu phần dịch nổi chứa DNA , chúng tôi đã hút lẫn phần cặn bên dưới, hoặc do
thao tác quá mạnh nên làm đứt gãy DNA. Mặt khác, trong qui trình này chúng tôi

không sử dụng men RNAse và protein K để loại bỏ các phân tử RNA và protein còn
lẫn tạp trong mẫu. Tuy nhiên, do yêu cầu sử dụng mẫu DNA ly trích không cần đạt độ
tinh khiết cao, vì thế với kết quả có được vẫn đảm bảo điều kiện để chúng tôi thiết lập
qui trình. Từ thực nghiệm, chúng tôi rút ra được những điểm cần lưu ý trong quá trình
ly trích:
70 121 123 127 128 150 154
23 28 65 67 18 129 149 154
58
- Dụng cụ ly trích cần khử trùng cẩn thận để phòng ngừa sự tạp nhiễm.
- Mang bao tay, khử trùng tay cẩn thận bằng cồn 70 % trước khi tiến hành ly trích.
- Bước thu sinh khối vi khuẩn rất dễ xảy ra sự tạp nhiễm giữa các mẫu với nhau,
nên khử trùng tay cẩn thận khi thực hiện với những mẫu khác nhau.
- Thao tác nhẹ nhàng trong khi ly trích, thao tác mạnh có thể làm đứt gãy DNA.
- Thu dung dịch DNA chỉ hút phần dịch nổi, không nên hút lẫn phần cặn phía dưới.
- DNA phải được làm khô hoàn toàn trước khi hòa tan với TE.
- Eppendorf chứa mẫu DNA phải sạch.
- Hóa chất ly trích như: phenol / chloroform / isoamyl alcohol; CTAB có khả năng
gây độc cho người sử dụng, khi sử dụng và pha chế phải thực hiện trong buồng hút.
- Khi nhuộm gel và đọc kết quả ly trích, không được tiếp xúc trực tiếp ethidium
bromide và tia UV.
4.1.2 Kết quả hiệu chỉnh nồng độ
Từ kết quả ly trích, chúng tôi có được các mẫu DNA với nồng độ khác nhau. Sau
khi hiệu chỉnh nồng độ, chúng tôi có được độ tương đồng về nồng độ giữa các mẫu
(hình 4.2).

Để có được kết quả này, chúng tôi đã thực hiện nhiều thí nghiệm pha loãng dựa
trên một mẫu làm chuẩn. Mẫu chuẩn cũng là mẫu gốc ly trích được có nồng độ loãng
Hình 4.2 Kết quả hiệu chỉnh nồng độ DNA ly trích từ các dòng
Pseudomonas fluorescens khác nhau.
59
hơn các mẫu còn lại. Mẫu làm chuẩn phải có nồng độ thực nghiệm, nghĩa là có thể tiến
hành các phân tích tiếp theo, không nên có nồng độ quá loãng.
4.1.3 Kết quả định lƣợng bằng phân tử Mass
Chúng tôi sử dụng mẫu 130 làm mẫu đại diện để định lượng.

Mẫu 130 sau khi được pha loãng 8 lần có độ sáng của band sau khi điện di tương
đồng với band 200 bp của phân tử Mass (hình 4.3). Theo chuẩn của phân tử Mass, thì
band 200 bp có nồng độ tương đương là 20 (ng / µl). Vậy mẫu 130 đạt được nồng độ
tương đương 20 ng / µl sau khi đã thực hiện pha loãng 8 lần. Từ đây tính được nồng
độ mẫu 130 trước khi pha loãng là 160 (ng / µl). Như vậy, các mẫu genomic DNA sau
khi hiệu chỉnh đạt nồng độ tương đương 160 (ng / µl).

4.2 KẾT QUẢ PHẢN ỨNG CẮT DNA GENOMIC BẰNG ENZYME GIỚI HẠN
Trong 34 dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens ly trích được, chúng tôi chọn ra
các mẫu số 4, 16, 28, 67, 73, 123, 124, 127, 130, 152, 154 để thực hiện phản ứng cắt,
nhằm chuẩn bị mẫu lai cho quá trình lai.

a)
b)
M 130(1) 130(2) 130(3) 130(4) M
M 130(5) 130(6) 130(7) 130(8) M
Hình 4.3 Kết quả định lƣợng mẫu 130 bằng phân tử Mass (M: phân tử Mass)
a)Mẫu 130(1); 130(2); 130(3); 130(4) được pha loãng 1 lần; 2 lần; 3 lần; 4 lần
b) Mẫu 130(5); 130(7); 130(7); 130(8) được pha loãng5 lần; 6 lần; 7 lần; 8 lần
1000 bp
700 bp
500 bp

200 bp
100 bp
60


Kết quả ở hình 4.4a, mẫu số 4 cho phản ứng cắt hoàn toàn so với mẫu DNA tổng
số chưa cắt (giếng 1 và 3 hình 4.4a), còn mẫu 130 chỉ cắt một phần, vẫn còn band
genomic DNA rất đậm. Đối với hình 4.4b, mẫu 123 và 124 được cắt với ba enzyme
BamH I, Eco RV và Hind III, cả hai mẫu đều bị cắt vụn, tạo nên những phân tử có
Hình 4.4 Kết quả thực hiện phản ứng cắt DNA tổng số bằng enzyme giới hạn
a) DNA mẫu số 4, 130 được cắt bằng BamH I và Eco RV; G: mẫu genomic DNA
b) DNA mẫu số 123, 124 được cắt bằng 3 enzyme BamH I, Eco RV và Hind III
c) DNA mẫu số 4, 154 được cắt bằng 3 enzyme BamH I, Eco RV và Hind III
d)DNA mẫu số130, 28, 152 được cắt bằng 2 enzyme BamH I và Eco RV.



G
G

61
trọng lượng thấp gần tương đương nhau dồn xuống đáy, hình thành nên một band đậm
sau khi chạy điện di. Những mẫu cắt không hoàn toàn và những mẫu cắt quá vụn như
vậy sẽ không có ý nghĩa trong quá trình tạo mẫu lai.
Những mẫu sản phẩm cắt có thể được dùng chuyển lên màng tạo mẫu lai là các mẫu
4, 154, 130, 28, 152 ở hình 4.4c và hình 4.4d. Tuy nhiên, những mẫu ở hình 4.4d có
nồng độ mẫu quá thấp và không đều nhau, do đó cần phải tính toán lượng mẫu sao cho
phù hợp trước khi chuyển lên màng.
Khi sử dụng từng enzyme giới hạn, cần có các điều kiện nhiệt độ, độ pH và dung
dịch đệm thích hợp. Nếu mẫu được cắt với nhiều loại enzyme khác nhau và có cùng
dung dịch đệm thì lần lượt thực hiện phản ứng cắt ở từng enzyme đơn ở nhiệt độ thích
hợp, sau đó làm bất hoạt enzyme đó và thực hiện phản ứng cắt cho enzyme kế tiếp.
Nếu các enzyme sử dụng không cùng dung dịch đệm thì phản ứng cắt sẽ phức tạp hơn.
Nhiệt độ phản ứng cắt phải luôn luôn ổn định, tránh có sự dao động lớn, nên ủ phản
ứng trong bồn ổn nhiệt có nắp đậy. Bảo quản enzyme ở - 20
o
C.

4.3 KẾT QUẢ PHẢN ỨNG PCR VỚI HAI CẶP PRIMER B2BF, BRR4 VÀ Phl -
2a, Phl - 2b

Hình 4.5 Sản phẩm PCR với 2 cặp primer B2BF, BRR4 và ph l- 2a, ph l- 2b
a) Sản phẩm PCR của các mẫu số 4, 28, 129, 130 với cặp primer B2BF, BRR4;
L: Ladder (thang chuẩn 1000 bp).
b) Sản phẩm PCR của các mẫu 130, 129, 121, 4, 28 với hai cặp primer B2BF, BRR4
và phl - 2a, ph l- 2b
62
Chúng tôi đã thực hiện phản ứng PCR trên các dòng số 4 (2P24), 28, 129, 130,121,
124 và 154 với cặp primer B2BF, BRR4. Kết quả là đã khuếch đại được trình tự đoạn
DNA có chiều dài 629 bp chuyên biệt trên gene phlD (hình 4.5a). Sản phẩm PCR xuất
hiện các band phụ phía dưới sản phẩm chính. Điều này chứng tỏ các thành phần tham
gia phản ứng như dNTP, primer chưa phản ứng hết.
Với cặp primer phl - 2a và phl - 2b, chúng tôi đã thực hiện phản ứng PCR trên hai
dòng số 4 và 28. Kết quả đã khuếch đại được trình tự là 745 bp trên gene phlD (hình
4.5b), nhưng trong sản phẩm khuếch đại còn tồn tại nhiều band tạp. Do đó trong quá
trình khuếch đại chưa tạo ra được sản phẩm chuyên biệt. Sản phẩm PCR cần được tinh
sạch để thực hiện phản ứng đánh dấu, chuẩn bị probe cho quá trình lai.

4.4 KẾT QUẢ TINH SẠCH SẢN PHẨM PCR BẰNG PHƢƠNG PHÁP CẮT
GEL.
Sử dụng sản phẩm khuếch đại của cặp primer B2BF, BRR4 đem tinh sạch và làm
probe đánh dấu.

Kết quả tinh sạch trên các dòng 4, 28, 129, 130, 154 đạt độ tinh khiết cao (Hình
4.6). Chúng tôi chọn dòng số 4 để thực hiện phản ứng đánh dấu, kết quả đánh dấu sẽ
được thể hiện trên kết quả lai.

Hình 4.6 Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR các mẫu 4, 28,
130, 129, 154 bằng phƣơng pháp cắt gel.
sản phẩm PCR trước
khi tinh sạch
M 4 28 129 130 154 M
sản phẩm PCR
sau khi tinh sạch
629 bp
63
4.5 KẾT QUẢ PHẢN ỨNG LAI
Mẫu DNA tổng số cắt bằng enzyme giới hạn được dùng làm mẫu lai. Sản phẩm
PCR được bố trí là mẫu đối chứng dương cho phản ứng lai. Chúng tôi đã thiết lập phản
ứng lai ở nhiệt độ, thời gian lai và thời gian ủ phát hiện khác nhau. Probe đánh dấu sử
dụng cho phản ứng lai có chiều dài 629 bp.
Thí nghiệm 1: Lai ở 55
o
C, thời gian lai là 12 giờ, thời gian ủ phát hiện là 30 phút.
Hai mẫu 4 và 154 được cắt bằng hai enzyme BamH I và Eco RV dùng làm mẫu lai.
Sản phẩm PCR làm mẫu đối chứng dương. Kết quả lần phát hiện đầu tiên ở thí nghiệm
này không có sản phẩm lai, nền phim bị đen hoàn toàn. Chúng tôi thực hiện lại bước ủ
phim (dùng tấm phim mới) với màng lai 1 giờ, sau đó rửa phim và phát hiện. Kết quả
vẫn không phát hiện sản phẩm lai, nền phim vẫn bị đen hoàn toàn. Nguyên nhân nền

phim bị đen có thể do buồng tối và dung dịch rửa phim chưa đạt yêu cầu. Chúng tôi
tiến hành thiết kế lại buồng tối, pha dung dịch rửa phim mới để thực hiện lại thí
nghiệm này. Màng lai có chứa DNA được bảo quản trong tối.
Chúng tôi thực hiện lại bước phát hiện, tác nhân phát hiện được cho trực tiếp lên
màng lai, để 2 – 5 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó loại bỏ tác nhân phát hiện thừa rồi ủ
màng lai với phim trong thời gian 30 phút. Rửa phim với dung dịch rửa phim mới. Kết
quả phát hiện được thể hiện trong hình 4.7 b.
Sản phẩm lai xuất hiện trên nền phim sau khi rửa (hình 4.7 b). Đây là kết quả của
sự bắt cặp giữa probe đánh dấu với sản phẩm PCR. Các mẫu 4, 154 được cắt bằng 2
enzyme BamH I và Eco RV thì sự bắt cặp với probe không xảy ra. Kết quả này chứng
minh được với nhiệt độ lai là 55
o
C, thời gian lai là 12 giờ thì probe đã bắt cặp với trình
tự DNA mục tiêu. Tuy nhiên, các mẫu 4, 154 sử dụng làm thí nghiệm thì không có
hiện tượng bắt cặp. Vì vậy trong thí nghiệm 1, chúng tôi tạo một mẫu lai mới để kiểm
tra lại qui trình và hoạt động của probe đánh dấu. Mẫu 16, 28 được cắt bằng 2 enzyme
BamH I và Eco RV dùng làm mẫu lai. Sản phẩm PCR làm mẫu đối chứng dương.
Kết quả trên hình 4.8b cho thấy chỉ có sản phẩm PCR mới cho kết quả lai, các mẫu
16, 128 không cho sản phẩm lai. Với kết quả này, có thể khẳng định rằng qui trình lai
đã ổn định, probe hoạt động rất hiệu quả. Tuy nhiên, các mẫu 4, 154, 16, 28 dùng làm
thí nghiệm cho kết quả lai âm tính. Điều này có thể do các nguyên nhân: