Luận án : Khảo sát các biến dị dòng tế bào soma trên chuối tiêu laba (cavendish sp ) in vitro và biện pháp khắc phục

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Mở đầu
1

MỞ ĐẦU
Di truyền học thực vật đã phát triển từ khá lâu và có nhiều ứng dụng quan trọng
trong cuộc sống hiện đại như mang lại số lượng lớn những loài hoa đẹp, những
giống cây cảnh trang trí đặc sắc, những giống cây ăn quả, cây công nghiệp có chất
lượng, phẩm chất tốt, mang lại hiệu quả kinh tế cao.
Không thể phủ nhận những thành tựu mà kĩ thuật nuôi cấy mô thực vật đã mang
lại trong vài thập kỉ vừa qua, chỉ tính riêng trong lĩnh vực nông nghiệp với sự ra đời
của các giống cây trồng mới mang nhiều đặc tính ưu việt đã thay đổi một cách lớn
lao bộ mặt nông nghiệp toàn cầu.
Vấn đề đặt ra là: ban đầu nuôi cấy mô được sử dụng như một kỹ thuật mới để
tạo sinh khối và là phương pháp nhân giống lý tưởng để sản xuất hàng loạt cây đồng
nhất và giống bố mẹ ban đầu. Tuy nhiên, theo các công trình nghiên cứu ở nhiều
loài cây trồng có giá trị kinh tế người ta thấy rằng tế bào và mô được nuôi cấy trong
môi trường nhân tạo thường xuất hiện các biến đổi di truyền bao gồm số lượng và
cấu trúc nhiếm sắc thể, sự sắp xếp lại trong nhiễm sắc thể, đột biến gene,… Các
biến dị này được truyền lại cho cây khi tái sinh. Tập hợp các biến dị di truyền hình
thành do quá trình nuôi cấy được gọi là biến dị dòng tế bào soma (somaclonal
variation) (Larkin và Scowcroft, 1983). Các biến dị này có thể mang lại những đột
biến có lợi hay bất lợi đến chất lượng cũng như mức ổn định di truyền của sản phẩm
nuôi cấy mô, trong đó có chuối.
Chuối là cây ăn trái rất được ưa chuộng ở hầu hết các nước trên thế giới. Ở một
số vùng nhiệt đới ẩm, chuối còn là nguồn cung cấp năng lượng chính. Ngoài lượng
carbohydrate phong phú, trái chuối còn giàu kali, một chất dinh dưỡng khoáng cần
cho hoạt động nhịp nhàng của tim, và chứa nhiều vitamin C, B
6
, đặc biệt là vitamin
A, loại vitamin thường thiếu hụt trong bữa ăn của người dân vùng nhiệt đới (Smith
và cs, 1992). Vì vậy, việc nghiên cứu nhằm tạo các giống chuối mới có tính đồng

nhất về tuổi, sạch bệnh, cho năng suất cao và ổn định về chất lượng rất được quan
tâm.
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Mở đầu
2

Như vậy, trong quá trình nuôi cấy mô chuối trên quy mô công nghiệp với số
lượng lớn và trong thời gian kéo dài thì sự xuất hiện của các biến dị dòng tế bào
soma có thể có những ảnh hưởng nhất định lên độ đồng nhất và mức độ ổn định về
chất lượng của các cây chuối con. Nhằm hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro
chuối tạo giống chuối khỏe mạnh, sạch bệnh, giảm tỉ lệ cây biến dị và ổn định về
mặt di truyền, chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “Khảo sát các biến dị dòng tế bào
soma trên chuối tiêu Laba (Cavendish sp.) in vitro và biện pháp khắc phục”.
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Tổng quan tài liệu
3

1. Tổng quan tài liệu
1.1 Sơ lược về cây chuối
1.1.1 Giới thiệu chung về cây chuối
Chuối là loại cây ăn quả nhiệt đới, dễ trồng và thời gian thu hoạch ngắn ngày.
Theo những giả thuyết của những nhà nghiên cứu thảo mộc và khảo cổ: chuối được
thuần hóa ở Đông Nam Á. Nhiều loài chuối dại vẫn còn mọc lên ở New Guinea,
Malaysia, Indonesia, và Philippines.[34]
1.1.2 Đặc điểm sinh học [34]

Hình 1.1: Cây chuối [36]
Nải
Chồi
Củ (thân thật)
Rễ
Thân giả

Bẹ lá
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Tổng quan tài liệu
4

Rễ: Số lượng rễ thay đổi tùy theo tình trạng sinh trưởng của cây, củ chuối mạnh
có khoảng 200 – 300 rễ. Từ khi trồng đến khi cây có trái chín, cây chuối có khoảng
600 – 800 rễ cái.
Thân: thân chuối hay còn gọi là củ chuối, nằm dưới mặt đất. Đầu phía trên xung
quanh củ chuối được bao phủ bởi những vết sẹo từ bẹ lá có dạng vòng cung. Ở đây
mỗi bẹ lá đều có một chồi mầm, nhưng chỉ các chồi ở từ phần giữa củ đến ngọn củ
phát triển được vì vậy thân chuối có hiện tượng mọc trồi dần lên. Mô phân sinh
ngọn củ cho ra các lá chuối ngay từ khi cây còn nhỏ. Phần bên trong củ chuối có 2
phần chính là trục trung tâm và vỏ củ. Rễ chuối phát sinh từ hệ thống mạch tiếp
giáp giữa vỏ củ và trục trung tâm.


Hình 1.2: Cấu tạo củ chuối [35]
Chồi: khi mới mọc, cây chuối con mọc thẳng góc với thân cây mẹ (củ chuối),
sau đó hướng dần lên. Khi cây con cao được 0,6 – 0,8m thì phần dính với thân mẹ
teo lại. Cây mẹ có ảnh hưởng ngăn cản sức lớn của các phiến lá trên cây chuối con.
Bẹ lá (thân giả): mọc từ thân thật, vươn dài lên cao, cắt ngang bẹ lá thấy có dạng
hình lưỡi liềm, giữa phình to 2 – 3cm, mỏng dần về hai bên. Ở chuối mọc mạnh thì
các bẹ này có xu thế tách nghiêng ra khỏi thân giả, bẹ chính sát vào thân khi cây
mọc yếu.
Phiến lá: bản lá rộng, mọc đối xứng qua gân chính, phiến lá dày 0,35 – 1mm, có
các gân phụ song song nhau và thẳng góc với gân chính. Chiều dài phiến lá thường
Trụ trung tâm
Đỉnh sinh trưởng
Chồi
bên

Rễ
Vỏ củ
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Tổng quan tài liệu
5

thay đổi nhiều hơn chiều rộng, kích thước phiến lá còn tùy thuộc các thời kỳ tăng
trưởng của cây chuối, chất dinh dưỡng, các yếu tố khí hậu. Một cây chuối đang phát
triển tốt thường có từ 10 – 15 lá bàng, trong đó có 4 – 5 lá trên ngọn là quang hợp
mạnh nhất.
Cuống lá: đỉnh bẹ lá hẹp dần, dày lên tạo thành cuống lá, các bó sợi trong bẹ xếp
chặt hơn, nhưng vẫn còn các lỗ thông khí. Cuống lá thường dai, chắc để mang nổi
phiến lá. Cuống lá mọc sau dài hơn cuống các lá mọc trước. Phiến lá cuối lớn dần
mãi cho đến khi chuối sắp trổ buồng.
Hoa và trái:

Hình 1.3: Hoa chuối
- Hoa: chu kỳ sinh trưởng chia làm 3 thời kỳ:
+ Thời kỳ tăng trưởng.
+ Thời kỳ tượng buồng: khi cây chuối xuất hiện lá thật thì vòm tăng
trưởng chuyển sang sinh sản, đỉnh của vòm củ tăng trưởng có hình chóp, thân củ
vươn lên rất nhanh. Sự phát triển của buồng hoa khoảng 100 ngày, trong suốt
thời gian đó, những hoa nguyên thủy phân hóa không ngừng, đồng thời thân
mang buồng hoa tận cùng dài ra để thoát ra khỏi thân giả (bẹ lá).
+ Thời kỳ trổ buồng: khi thân thật đẩy phát hoa ra khỏi thân giả gọi là
trổ buồng. Từ khi trổ buồng đến khi trái chín trung bình là 3 tháng. Buồng hoa:
buồng hoa là một phát hoa, trên buồng hoa mọc thành từng chùm (nải hoa) trên
chóp của thân thật theo đường xoắn ốc. Những chùm mọc sau có số hoa ít dần,
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Tổng quan tài liệu
6

kích thước cũng nhỏ đi. Sau khi điểm sinh trưởng đã cho ra một số chùm hoa,
thì hoa cái có sự thay đổi đột ngột, lúc này nồng độ hormone đã cạn, khi đó xuất
hiện những chùm hoa đực với số lượng rất nhiều. Trên mỗi chùm hoa có 2 hàng
hoa, chùm hoa phát triển từ phải sang trái luân phiên nhau. Hoa cái có nuốm vòi
nhụy lớn. Hoa đực noãn sào bị thoái hóa, vòi nhụy nhỏ và nhị đực có bao phấn,
một ngày sau khi nở, hoa đực rụng. Đầu nuốm nhụy cái có mật để thu hút ong
bướm.
- Trái: Sự phát triển của trái: trọng lượng trái, tỷ lệ thịt trái/vỏ tăng đều trong
suốt quá trình tăng trưởng của trái. Kích thước trái giảm dần từ nải thứ nhất đến nải
cuối cùng, thường nải cuối cùng chỉ đạt 50 – 60% so với nải thứ nhất. Trong cùng
một nải, trái ở hàng trên lớn hơn trái ở hàng dưới.
1.1.3 Các giống chuối ở Việt Nam :[29]
1. Nhóm chuối tiêu AAA (Cavendish) có 3 loại : lùn, nhỏ, cao có trái nhỏ và
thơm ngon.
2. Nhóm chuối tây ABB (chối sứ, chuối xiêm): gồm các giống chuối tây hồng,
tây phấn, tây sứ, được trồng phổ biến ở nhiều nơi, cây cao sinh trưởng khoẻ, không
kén đất, có khả năng chịu nóng và chịu hạn song dễ bị héo rụi, quả to, mập, ngọt
đậm nhưng kém thơm hơn so với giống khác.
3. Chuối bom AAB (bôm): được trồng phổ biến ở Đông Nam Bộ, trái thường
được dùng làm ăn tươi, chuối sấy.
4. Chuối ngự AA (tiến và mắn): cao 2,5 – 3 m, trái nhỏ, màu vỏ sáng đẹp, thịt
quả chắc, vị thơm đặc biệt.
5. Chuối ngốp ABB có 2 loại: cao và thấp, cao từ 3 – 5 m. trái tương đối lớn, vỏ
dầy, nâu đen khi chín, thịt quả nhão, hơi chua.
6. Chuối Laba được trồng ở La Ba xã Phú Sơn, Lâm Hà vào đầu thập niên 50 và
chỉ sau một thời gian ngắn đã trở nên nổi tiếng, bởi quả màu vàng ánh, dẻo, ngọt và
có mùi hương rất thơm. Ngoài ra còn các giống chuối mắn, chuối lá, chuối hột
nhưng các giống chuối này có giá trị kinh tế thấp.

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Tổng quan tài liệu

7

1.1.4 Giá trị kinh tế, dinh dưỡng và làm thuốc của chuối
 Giá trị kinh tế
Trên thế giới, chuối là loại cây nhiệt đới được trồng phổ biến ở nhiều quốc gia
và vùng miền trên thế giới, đồng thời cũng chiếm một tỷ trọng đáng kể trong
thương mại rau quả toàn cầu. Xuất khẩu chuối đứng đầu về khối lượng và đứng thứ
hai về kim ngạch, sau cam trong cơ cấu xuất khẩu trái cây của thế giới. Theo đánh
giá của FAO, tổng kim ngạch xuất khẩu chuối đạt 15,9 triệu tấn vào năm 2004.
Cùng với gạo, lúa mỳ, ngũ cốc, chuối cũng là một trong số những mặt hàng chủ lực
của nhiều nước đang phát triển.[38]
Việt Nam là nước nhiệt đới và là một trong những xứ sở của chuối với nhiều
giống chuối rất quý như: chuối tiêu, chuối bom, chuối ngự, chuối Laba,… với
những đặc điểm trên chuối được xem là mặt hàng có triển vọng xuất khẩu ở Việt
Nam, nhất là đối với giống chuối già và chuối cau.
 Giá trị dinh dưỡng và làm thuốc [28]
Theo Đông y, chuối có vị ngọt, tính bình, có tác dụng nhuận phế, chỉ khát, lợi
tràng vị. Củ chuối vị ngọt, tính hàn, có tác dụng thanh nhiệt, giải độc.
Theo phân tích khoa học, chuối chín bao gồm nhiều chất bột, chất đạm, chất xơ,
sinh tố và khoáng chất. Đặc biệt chuối có hàm lượng kali rất cao và chứa đủ cả 10
loại amino acid thiết yếu của cơ thể.
Y học dân gian dùng chuối hột để trị sạn thận và sạn mật. Sau đây, xin giới thiệu
thêm một số công dụng khác của chuối.
- Chuối chín có tác dụng làm hạ huyết áp cao
+ Sự tương quan giữa muối natri và kali có liên quan đến việc duy trì độ
pH và sự cân bằng chất lỏng trong cơ thể. Trong khi natri (thành phần quan
trọng của muối ăn và những thức ăn mặn hàng ngày) có tác dụng giữ lại một
lượng nước nhất định tạo gánh nặng cho hệ tim mạch, thì kali lại có tính năng
như một chất điện phân giúp thải trừ bớt natri ra khỏi cơ thể.
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Tổng quan tài liệu

8

+ Ngoài ra cả hai loại muối này còn liên quan đến việc làm thư giãn cơ
bắp. Sự thiếu hụt muối kali có thể làm gia tăng trương lực cơ và tương tác xấu
đến hoạt động của hệ thần kinh giao cảm. Những yếu tố này đều có khả năng
làm gia tăng huyết áp.
- Chuối là nguồn bổ sung năng lượng hoàn hảo cho hoạt động thể lực
+ Trong những hoạt động thể lực kéo dài khi năng lượng bị hao hụt
nhiều, cơ thể phải huy động đến lượng đường trong máu để cung cấp cho cơ
bắp. Những trường hợp này, đường glucose trong chuối được hấp thu nhanh vào
máu và có thể bổ sung tức thì lượng đường bị hao hụt, giúp vận động viên phục
hồi sau khi vận động mệt mỏi.
+ Ngoài ra chuối còn chứa những carbohydrate khác được chuyển hóa
chậm và phóng thích đường vào máu từ từ, có thể đáp ứng cho những hoạt động
thể lực kéo dài hàng giờ sau đó.
- Chuối xanh chữa bệnh loét dạ dày, tá tràng
+ Chuối xanh được phơi khô ở nhiệt độ thấp có khả năng kích thích sự
tăng trưởng của lớp màng nhầy, làm nó dày lên, bảo vệ thành dạ dày khỏi bị loét
và giúp hàn gắn nhanh chóng chỗ loét đã hình thành trước đó.
- Chuối chín chữa táo bón và ngăn ngừa ung thư ruột già
+ Thịt chuối chín mềm, mịn nhưng lại chứa nhiều chất xơ không hòa
tan. Chất xơ không được tiêu hóa tạo thành chất bã hấp thu nước và kích thích
nhu động ruột nên có tác dụng chống táo bón rất tốt.
Tóm tại, chuối là một nguồn dinh dưỡng quí giá và dễ tìm, dễ ăn, nên được bổ
sung vào khẩu phần ăn hàng ngày.

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Tổng quan tài liệu
9

1.2 Giới thiệu giống chuối Laba
1.2.1 Đặc điểm phân loại
Giới Plantae
Ngành Mangolioptitta
Lớp Liliospida
Phân lớp Zingiberidae
Siêu bộ Zingiberanae
Bộ Zingibereales
Họ Musaceae
Chi Musa
Dưới chi Eumusa
Loài Musa acuminata
Tên Việt Nam: chuối Laba thuộc giống chuối tiêu hay chuối già hương.[6, 33]
Những năm 20 của thế kỷ trước, khi đi khai hoang ở vùng đất Nam Tây Nguyên,
người dân đã mang theo nhiều giống chuối khác nhau đến trồng ở vùng Laba (thuộc
xã Phú Sơn, Lâm Hà, Lâm Đồng). Qua thời gian, người ta thấy chỉ với điều kiện thổ
nhưỡng, khí hậu này có một giống chuối cho ra trái thơm, ngọt, dẻo rất đậm đà,
được nhiều người ưa thích. Đây cũng là giống chuối nguyên dùng để cung tiến cho
vua (chuối tiến vua).
Chuối Laba có 3 nhóm chính: Giống tiêu cao (thường gọi là giống chuối già
hương vì khi chín có hương thơm hấp dẫn): cây cao từ 3,5 – 5m, buồng hình trụ,
quả thẳng và to, đuôi hơi lõm, ăn ngọt và thơm. Năng suất rất cao nhưng khó thu
hoạch; cây dễ bị bệnh héo rũ, dễ bị đổ ngã khi gặp gió bão. Hiện nay giống chuối
này đang có nguy cơ bị tuyệt chủng, số lượng còn lại không đáng kể (rất hiếm gặp).
Giống tiêu vừa (thường gọi là chuối già Laba): cây cao 2,8 – 3m, buồng hình trụ,
trung bình có từ 10 – 12 nải/buồng (đôi khi nhiều hơn), trái hơi cong, ăn ngọt, thơm

ít. Giống tiêu thấp (thường gọi là chuối lùn Laba): cây cao 2 – 2,5m, buồng hình
nón cụt, 12 – 14 nải/buồng, trọng lượng bình quân 35 kg/buồng, nhiều buồng đạt tới
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Tổng quan tài liệu
10

50 kg nếu được chăm sóc tốt. Giống này hiện chiếm số lượng lớn vì thấp cây, dễ
canh tác.
Nhưng hiện nay toàn tỉnh Lâm Đồng chỉ có khoảng 100 ha chuối được trồng,
trong số đó chỉ còn ít ỏi diện tích là giống chuối Laba năng suất cao, chất lượng tốt.
Trước nguy cơ lụi tàn của chuối Laba, Sở Khoa học và Công nghệ Lâm Đồng đã có
nhiều công trình nghiên cứu bảo tồn và phát triển giống chuối này. Tại Viện sinh
học Nhiệt đới Tp Hồ Chí Minh đã nhân giống bằng phuơng pháp nuôi cấy mô thành
công trên giống chuối này và sản xuất trên quy mô công nghiệp với công suất 1
triệu cây/năm.[30]
1.2.2 Đặc điểm cây chuối Laba

Hình 1.4: Cây chuối Laba
Chuối Laba buồng dài, quả chuối thon có hình dáng đẹp, dài và hơi cong, khi
chín có vỏ mỏng, màu vàng tươi. Thịt quả có màu vàng sánh, dẻo, ngọt và có mùi
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Tổng quan tài liệu
11

thơm đặc trưng. Đã có rất nhiều mô hình trồng chuối Laba chuyên canh có quy mô
từ 0,5 – 1 hoặc 2ha đất và hiệu quả kinh tế cũng khá cao so với nhiều loại cây trồng
khác. Trồng chuối chỉ một năm là đã được thu hoạch và có thể thu hoạch quanh
năm. Thu nhập khoảng 100 triệu/năm trên 1ha chuối Laba. Chuối Laba rất dễ trồng,
ít tốn công chăm sóc và không phải lo đầu ra cho sản phẩm.
1.3 Phương pháp nuôi cấy mô thực vật
1.3.1 Khái niệm nuôi cấy mô thực vật
Nuôi cấy mô là thuật ngữ dùng để chỉ quá trình nuôi cấy vô trùng in vitro các bộ

phận tách rời khác nhau của thực vật. Kỹ thuật nuôi cấy mô dùng cho cả hai mục
đích nhân giống và cải thiện di truyền, sản xuất sinh khối các sản phẩm hóa sinh,
bệnh học thực vật, duy trì và bảo quản các nguồn gen quý,… Các hoạt động này
được bao hàm trong thuật ngữ công nghệ sinh học.
Nhân giống in vitro và nuôi cấy mô bắt đầu bằng các mảnh cắt nhỏ của thực vật,
sạch vi sinh vật, và được nuôi cấy vô trùng. Thuật ngữ đầu tiên dùng trong quá trình
nhân giống là mẫu vật tương đương với các phương thức nhân giống khác là cành
giâm, cành chiết, cành ghép hoặc hạt.[4]
Năm thuật ngữ khác được dùng để chỉ các loại tái sinh sinh dưỡng cơ bản trong
nhân giống in vitro và nuôi cấy mô:
1.3.1.1 Nuôi cấy đỉnh phân sinh [3]
Phương thức nhân giống bằng cách dùng các phần rất nhỏ của đỉnh chồi bao
gồm mô phân sinh đỉnh riêng rẽ và mầm lá để kéo dài chồi ngay sau đó. Kiểu nuôi
cấy này được dùng lần đầu tiên để làm sạch virus ở thực vật. Nếu dùng đỉnh phân
sinh không thể sống sót và tạo rễ một cách độc lập, thì có thể thay thế bằng phương
thức vi ghép .
Thành công điển hình trong phương thức này là nhân giống các cây một lá mầm
như hoa lan, dứa, huệ và chuối (protocorm hoặc cụm chồi), hoặc cây hai lá mầm
như khoai tây, cà chua và cúc (kéo dài chồi),

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Tổng quan tài liệu
12

1.3.1.2 Sinh sản chồi nách [3]
Kiểu nuôi cấy này sử dụng chồi của các điểm sinh trưởng bên và ngọn nơi mà sự
kéo dài của chồi tận cùng bị kìm hãm và sự sinh sản chồi nách được đẩy mạnh. Sự
điều khiển này cho phép nhân nhanh được các chồi in vitro là các chồi có thể tách
ra và tạo rễ in vitro để hình thành cây trong ống nghiệm hoặc nó có thể được cắt ra
riêng biệt tạo thành các cành giâm in vitro để tạo rễ bên ngoài in vitro.
Phương thức này thường được áp dụng cho các đối tượng hai lá mầm như cúc,

cà chua, thuốc lá,
1.3.1.3 Tạo chồi bất định [3]
Loại nuôi cấy cho phép hình thành các chồi bất định hoặc trực tiếp trên mẫu vật
hoặc gián tiếp từ mô sẹo, mà mô sẹo này hình thành trên bề mặt vết cắt của mẫu
vật. Hệ thống nuôi cấy này có những yêu cầu tương tự với nuôi cấy mô phân sinh
đỉnh, nó chỉ khác về nguồn mẫu vật và nguồn gốc bất định của các chồi mới. Một số
loại mẫu vật được dùng như là đoạn thân (thuốc lá, cam, chanh, cà chua, bắp cải),
mảnh lá (thuốc lá, cà chua, bắp cải, cà phê, ca cao), cuống lá (thủy tiên), các bộ
phận của hoa (súp lơ, lúa mỳ, thuốc lá), nhánh củ (họ hành, họ lay ơn, họ thủy tiên),
đoạn mầm (măng tây).
1.3.1.4 Phát sinh cơ quan [3]
Thuật ngữ này dùng để mô tả quá trình tái sinh các chồi hoặc/và rễ bất định từ
các khối tế bào mô sẹo. Quá trình này xảy ra sau thời điểm mà mẫu vật được đặt
vào môi trường nuôi cấy và bắt đầu cảm ứng tạo sẹo. Đối với mục đích nhân giống
in vitro, nếu tái sinh được cây hoàn chỉnh trực tiếp từ mẫu vật nuôi cấy ban đầu thì
không những nhanh chóng thu được cây mà các cây cũng khá đồng nhất về mặt di
truyền. Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp mô nuôi cấy không tái sinh cây ngay mà
phát triển thành khối mô sẹo. Tế bào mô sẹo khi cấy chuyền nhiều lần sẽ không ổn
định về mặt di truyền. Để tránh tình trạng đó nhất thiết phải sử dụng loại mô sẹo
vừa phát sinh, tức là mô sẹo sơ cấp để tái sinh cây thì hy vọng sẽ thu được cây tái
sinh đồng nhất.
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Tổng quan tài liệu
13

1.3.1.5 Phát sinh phôi vô tính [3]
Thuật ngữ này dùng cho sự phát triển của các phôi hoàn chỉnh từ các tế bào sinh
dưỡng được sản xuất từ các nguồn mẫu vật khác nhau sinh trưởng trong nuôi cấy in
vitro. Thuật ngữ tương đương đối với sự phát triển phôi ở thực vật sinh trưởng trong
điều kiện tự nhiên là phát sinh phôi hữu tính và phát sinh phôi vô tính. Phôi vô tính
có cấu trúc tương tự phôi hữu tính của thực vật sinh trưởng trong điều kiện tự nhiên.

Điểm khác nhau cơ bản giữa phôi hữu tính và phôi vô tính là phôi hữu tính luôn
luôn đi kèm với nội nhũ là cơ quan dự trữ năng lượng và chất dinh dưỡng phục vụ
cho quá trình nảy mầm, còn ở phôi vô tính hoàn toàn không có nội nhũ. Phương
thức tạo phôi vô tính được ứng dụng rất hiệu quả trong sản xuất hạt nhân tạo.
1.4 Các giai đoạn trong quy trình nhân giống vô tính in vitro [4]
Quy trình nhân giống vô tính in vitro được thực hiện theo ba (hoặc bốn) giai
đoạn tùy theo cách phân chia của từng tác giả:
- Khử trùng mẫu.
- Nhân nhanh.
- Chuẩn bị và đưa ra ngoài đất.
1.4.1 Giai đoạn I – Khử trùng mẫu
Đưa mẫu vật từ bên ngoài vào nuôi cấy vô trùng phải đảm bảo những yêu cầu
sau:
- Tỷ lệ nhiễm thấp.
- Tỷ lệ sống cao.
- Tốc độ sinh trưởng nhanh.
Kết quả bước khử trùng mẫu này phụ thuộc rất nhiều vào cách lấy mẫu. Quan
trọng nhất vẫn là đỉnh sinh truởng, chồi nách, sau đó là đoạn hoa tự, hoa, đoạn thân,
mảnh lá, rễ,…
Chọn đúng phương pháp khử trùng sẽ cho tỷ lệ sống cao và môi trường dinh
dưỡng thích hợp sẽ đạt được tốc độ sinh trưởng nhanh.
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Tổng quan tài liệu
14

1.4.2 Giai đoạn II – Nhân nhanh
Ở giai đoạn này người ta mới kích thích tạo cơ quan phụ hoặc các cấu trúc khác
mà từ đó cây hoàn chỉnh có thể phát sinh. Những khả năng tạo cây đó là:
- Phát triển chồi nách.
- Tạo phôi vô tính.
- Tạo đỉnh sinh trưởng mới.

Trong giai đoạn này cần nghiên cứu các tác nhân kích thích phân hóa cơ quan,
đặc biệt là chồi như:
- Bổ sung tổ hợp CĐHTTTV mới (tăng cytokinin giảm auxin). Tăng tỷ lệ
auxin/cytokinin sẽ kích thích mô nuôi cấy tạo rễ và ngược lại sẽ kích thích phát sinh
chồi.
- Tăng cường thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày, tối thiểu 1000 lux.
- Bảo đảm chế độ nhiệt độ trong khoảng 20 – 30
o
C.
Mục tiêu quan trọng nhất của giai đoạn này là xác định được phương thức nhân
nhanh nhất bằng môi trường dinh dưỡng và điều kiện khí hậu tối thích.
1.4.3 Giai đoạn III – Chuẩn bị và đưa ra ngoài đất
Đây là giai đoạn quan trọng bao gồm việc tạo rễ, huấn luyện thích nghi với thay
đổi nhiệt độ, độ ẩm, sự mất nước, sâu bệnh và chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang tự
dưỡng hoàn toàn. Giai đoạn này thường bị bỏ qua một cách thiếu căn cứ.
Thời gian tối thiểu cho sự thích nghi là 2 – 3 tuần, trong thời gian này cây phải
được chăm sóc và bảo bệ trước những yếu tố bất lợi sau:
- Mất nước nhanh làm cho cây bị héo khô.
- Nhiễm vi khuẩn và nấm gây nên hiện tượng thối nhũn.
- Cháy lá do nắng.
1.5 Thành phần hoá học của các môi trường nuôi cấy mô, tế bào thực vật [3]
Môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật tuy rất đa dạng nhưng đều gồm một
số thành phần cơ bản sau:
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Tổng quan tài liệu
15

- Các muối khoáng đa lượng và vi lượng.
- Các vitamin.
- Các amino acid.
- Nguồn cacbon: một số loại đường.

- Các chất điều hoà sinh trưởng.
- Các chất hữu cơ bổ sung: nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết khoai
tây, bột chuối khô,…
- Chất làm thay đổi trạng thái môi trường: các loại thạch (agar).
Tất cả các hợp chất này đều tham gia vào một hoặc nhiều chức năng trong sự
sinh trưởng và phân hoá của thực vật nuôi cấy in vitro.
Các nhà khoa học sử dụng các môi trường nuôi cấy rất khác nhau. Việc lựa chọn
môi trường nuôi cấy với thành phần hoá học đặc trưng phụ thuộc vào một số yếu tố:
- Đối tượng cây trồng hoặc mô nuôi cấy khác nhau có nhu cầu khác nhau về
thành phần môi trường.
- Mục đích nào nghiên cứu hoặc phương thức nuôi cấy mô khác nhau (nuôi
cấy tạo mô sẹo phôi hoá hoặc phôi vô tính, nuôi cấy tế bào trần hoặc dịch lỏng tế
bào, vi nhân giống,…)
- Trạng thái môi trường khác nhau (đặc, lỏng, bán lỏng,…)
1.5.1 Các chất khoáng
Đối với cây trồng, các chất vô cơ đóng vai trò rất quan trọng. Ví dụ: Mg là một
phần của phân tử diệp lục, Ca là thành phần của màng tế bào, N là thành phần quan
trọng của amino acid, vitamin, protein và các nucleic acid. Tương tự, Fe, Zn, và Mo
cũng là thành phần của một số enzyme.
Các môi trường khác nhau có hàm lượng và thành phần chất khoáng khác nhau.
Muối khoáng là thành phần không thể thiếu trong môi trường nuôi cấy mô và tế bào
thực vật.
Muối khoáng là các vật liệu (nguồn N, S, P,…) cho sự tổng hợp các chất hữu cơ.
N, S, P là các thành phần không thể thiếu của các phân tử protein, các nucleic acid
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Tổng quan tài liệu
16

và nhiều chất hữu cơ khác. Ca và H
3
BO

3
được tìm thấy chủ yếu ở thành tế bào, đặc
biệt là Ca có nhiệm vụ giúp ổn định màng sinh học.
Đóng vai trò như một thành phần không thể thiếu của nhiều enzyme (là các
cofactor): Mg, Zn, Fe,…và nhiều nguyên tố vi lượng là những thành phần quan
trọng của các enzyme.
Các ion của các muối hoà tan đóng vai trò quan trọng ổn định áp suất thẩm thấu
của môi trường và tế bào, duy trì thế điện hoá của thực vật. Ví dụ, K và C rất quan
trọng trong điều hoà tính thấm chọn lọc của tế bào, duy trì điện thế và tham gia hoạt
hoá nhiều enzyme.
Trong môi trường, các muối khoáng được chia thành các nguyên tố vi lượng và
đa lượng. Việc chia thành các nguyên tố vi lượng và đa lượng chủ yếu dựa trên nhu
cầu của thực vật đối với các chất này. Nhu cầu của thực vật đối với các nguyên tố
đa lượng là lớn hơn, với nồng độ > 0,5mM. Các nguyên tố vi lượng được sử dụng
trong môi trường ở nồng độ < 0,5mM.
1.5.2 Các vitamin [20]
Tất cả các tế bào được nuôi cấy đều có khả năng tổng hợp tất cả các loại vitamin
cơ bản nhưng thường là với số lượng dưới mức yêu cầu. Để mô có sức sinh trưởng
tốt phải bổ sung thêm vào môi trường một hay nhiều loại vitamin.
Thông thường thực vật tổng hợp vitamin cần thiết cho sự tăng trưởng và phát
triển của chúng. Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác
nhau. Khi tế bào và mô được nuôi cấy in vitro thì một vài vitamin trở thành yếu tố
giới hạn sự phát triển của chúng. Các vitamin được sử dụng nhiều nhất trong nuôi
cấy mô là: thiamine (B1), acid nicotinic (PP), pyridoxine (B6) và myo-inositol.
1.5.3 Các chất bổ sung vào môi trường nuôi cấy [3,4,21]
Than hoạt tính: bổ sung THT vào môi trường nuôi cấy sẽ có lợi ích và có tác
dụng khử độc. Khi bổ sung THT vào môi trường nuôi cấy thì sẽ kích thích sự tăng
trưởng và biệt hoá phong lan, hành, cà rốt, cà chua, cây trường xuân nhưng làm tác
dụng cản đối với thuốc là, đậu nành, trà mi. THT nói chung ảnh hưởng trên 3 mặt:
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Tổng quan tài liệu

17

hút các hợp chất cản, hút các chất điều hoà sinh trưởng hoặc làm đen môi trường.
Người ta cho rằng tác dụng cản sự tăng trưởng của mô cấy khi có sự hiện diện của
THT trong môi trường là do nó hút chất điều hoà sinh trưởng có trong môi trường.
NAA, kinetine, IAA, BAP, 2iP liên kết với THT. Khả năng kích thích sự tăng
trưởng của THT là do nó kết hợp với các hợp chất phenol độc tiết ra trong thời gian
nuôi cấy. THT thường được bổ sung vào môi trường với nồng độ 0,5 – 3% (w/v).
Nói chung bổ sung THT giúp giảm nồng độ bằng cách đào thải các hợp chất độc
được tạo ra trong quá trình nuôi cấy và cho phép tế bào sinh trưởng mà không bị trở
ngại gì.
Nước dừa: công bố đầu tiên về sử dụng nước dừa trong nuôi cấy mô thuộc về
Van Overbeek và cộng sự (1941,1942). Sau đó, tác dụng tích cực của nước dừa
trong môi trường nuôi cấy mô, tế bào thực vật đã được nhiều tác giả ghi nhận. Nước
dừa đã được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất khoáng và chất kích
thích sinh trưởng (George, 1993). Nước dừa đã được sử dụng để kích thích phân
hoá và nhân nhanh chồi ở nhiều loại cây. Nước dừa thường được lấy từ quả của các
giống và cây chọn lọc để sử dụng tươi hoặc sau bảo quản. Thông thường nước dừa
được xử lý để loại trừ protein, sau đó được lọc qua màng lọc khử trùng trước khi
bảo quản lạnh. Tồn dư protein trong nước dừa không gây ảnh hưởng đến sinh
trưởng của mô hoặc tế bào nuôi cấy, nhưng có thể dẫn đến kết tủa dung dịch khi
bảo quản lạnh. Chất cặn có thể được lọc bỏ hoặc để lắng dưới đáy bình rồi gặn bỏ
phần cặn. Nước dừa thường được sử dụng ở nồng độ từ 5 – 20% (v/v).
Agar: đối với nuôi cấy tĩnh, nếu sử dụng môi trường lỏng, mô có thể bị chìm và
sẽ chết vì thiếu oxi. Để tránh tình trạng này, môi trường nuôi cấy được làm đặc lại
bằng agar, một loại tinh bột được chế biến từ rong biển và mô được cấy trên bề mặt
của môi trường. Agar thường được sử dụng ở nồng độ 0,6 – 1%.
1.5.4 Các chất điều hoà sinh trưởng thực vật [1,12,13,14,20]
Bên cạnh các chất cung cấp dinh dưỡng cho nuôi cấy mô, việc bổ sung một hoặc
nhiều chất điều hoà sinh trưởng như auxin, cytokinin và giberellin là rất cần thiết để

kích thích sự tăng trưởng, phát triển và phân hoá cơ quan, cung cấp sức sống tốt cho
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Tổng quan tài liệu
18

mô và các tổ chức. Tuy vậy, yêu cầu đối với những chất này tuỳ theo loài thực vật,
loại mô, hàm lượng chất điều hoà sinh trưởng nội sinh của chúng.
 Nhóm các auxin
Môi trường nuôi cấy được bổ sung các auxin khác nhau như: 1H-indole-3-
acetic acid (IAA), 1-naphthaleneacetic acid (NAA), 1H-indole-3-butyric acid
(IBA), 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) và naphthoxyacetic acid (NOA).
IAA là auxin tự nhiên có trong mô thực vật, còn lại NAA, IBA, 2,4-D và NOA
là các auxin nhân tạo, thường thì các auxin nhân tạo có hoạt tính mạnh hơn vì do
đặc điểm phân tử của chúng nên các enzyme hoá auxin (auxin-oxydase) không
có tác dụng.
Auxin có tác dụng hoạt hoá các ion H
+
trực tiếp hoặc gián tiếp (thông qua sự
ảnh hưởng lên các enzyme) làm tăng tính đàn hồi của thành tế bào, tăng tính
giãn nỡ của không bào trong tế bào trong phản ứng với áp suất trương. Auxin
cũng có ảnh hưởng ở mức độ biếu hiện gen và kích thích quá trình tạo rễ.
Auxin là nhóm CĐHTTTV được sử dụng thường xuyên trong nuôi cấy mô tế
bào thực vật. Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần khác nhau của môi
trường dinh dưỡng để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo, huyền phù tế bào và
điều hoà sự phát sinh hình thái, đặc biệt là khi nó được phối hợp sử dụng với các
cytokinin. Sự áp dụng loại và nồng độ auxin trong môi trường nuôi cấy phụ
thuộc vào:
- Kiểu tăng trưởng hoặc phát triển cần nghiên cứu.
- Hàm lượng auxin nội sinh của mẫu cấy.
- Khả năng tổng hợp auxin tự nhiên của mẫu cấy.
- Sự tác động qua lại giữa auxin ngoại sinh và auxin nội sinh.

- Đặc tính của auxin: tăng trưởng chiều dài thân, lóng (gióng), tính
hướng (sáng, đất), tính ưu thế ngọn, tạo rễ và phân hoá mạch dẫn. Auxin hoà tan
hoặc trong ethanol hoặc trong NaOH loãng (Razdan 1994).
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Tổng quan tài liệu
19

Các auxin liên quan đến độ dài của thân, đốt, chồi chính, rễ,… Đối với nuôi
cấy mô, auxin đã được sử dụng cho việc phân chia tế bào và phân hoá rễ. Những
auxin dùng rộng rãi trong nuôi cấy mô là IBA (3-indolebutiric acid), IAA (3-
indole acetic acid), NAA (Napthelenaxetic acid), 2,4-D (2,4-D-
Dichlorophenoxyacetic acid) và 2,4,5-T (Trichlorophenoxyacetic acid). Trong
số các auxin, IBA và NAA chủ yếu sử dụng cho môi trường ra rễ và phối hợp
với cytokinin sử dụng cho môi trường ra chồi. 2,4-D và 2,4,5-T rất có hiệu quả
đối với môi trường tạo vào phát triển mô sẹo.
 Nhóm các cytokinin
Các cytokinin là dẫn xuất của adenine, đây là những hormon liên quan chủ
yếu đến sự phân chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hoá chồi trong
nuôi cấy mô. Các cytokinin thường được sử dụng nhất là 6-benzylaminopurine
(BAP) hoặc 6-benzyladenin (BA), 6-γ-γ-dimethyl-aminopurin (2-iP), N-(2-
furfurylamino)-1-H-purine-6-amine (kinetin), và 6-(4-hydroxy-3-methyl-trans-
2-butanylamino)purin (zeatin). Zeatin và 2-iP là các cytokinin tự nhiên, còn BA
và kinetin là các cytokinin nhân tạo. Cytokinin hoà tan trong NaOH hoặc HCl
loãng.
Cytokinin liên quan đến sự phân chia tế bào, phân hoá chồi,… Trong môi
trường nuôi cấy mô, cytokinin cần cho sự phân chia tế bào và phân hoá chồi từ
mô sẹo hoặc các cơ quan, gây tạo phôi vô tính, tăng cường phát sinh chồi phụ.
Chức năng chủ yếu của cytokinin được khái quát như sau:
- Kích thích sự phân chia tế bào.
- Tạo và nhân mô sẹo.
- Kích thích phát sinh chồi trong nuôi cấy mô.

- Kích thích phát sinh chồi nách và kìm hãm ảnh hưởng ưu thế của chồi
đỉnh.
- Làm tăng diện tích phiến lá do kích thích sự lớn lên của tế bào.
- Có thể làm tăng sự mở khí khổng của một số loài.
- Tạo chồi bất định (ở nồng độ cao).
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Tổng quan tài liệu
20

- Ức chế sự hình thành rễ.
- Ức chế sự kéo dài chồi.
- Ức chế quá trình già (hoá vàng và rụng) ở lá, kích thích tạo diệp lục.
Tỉ lệ auxin/cytokinin rất quan trọng đối với sự phát sinh hình thái trong các hệ
thống nuôi cấy. Đối với sự phát sinh phôi, để tạo mô sẹo và rễ cần có tỉ lệ
auxin/cytokinin cao, trong khi ở trường hợp ngược lại sẽ dẫn đến sự sinh sản chồi
và chồi nách. Vấn đề quan trọng không kém đó là nồng độ của hai nhóm chất điều
hòa sinh trưởng này. Chẳng hạn, 2,4-D cùng với BA ở nồng độ 5,0ppm kích thích
sự tạo thành mô sẹo ở Agrostis nhưng nếu dùng ở nồng độ 0,1ppm chúng sẽ kích
thích tạo chồi mặt dù trong cả hai trường hợp tỉ lệ auxin/cytokinin là bằng 1. Cơ chế
hoạt động của cytokinin chưa được biết rõ ràng mặc dù có một số kết quả về sự có
mặt của các hợp chất mang hoạt tính cytokinin trong RNA vận chuyển. Các
cytokinin cũng có hoạt tính tổng hợp RNA, tăng hoạt tính enzyme và protein trong
các mô nhất định.
1.6 Hạn chế của vi nhân giống [4]
- Hạn chế về chủng loại sản phẩm: trong điều kiện kỹ thuật hiện nay, không
phải tất cả cây trồng đều được nhân giống thương phẩm bằng vi nhân giống. Nhiều
cây trồng có giá trị kinh tế hoặc quý hiếm vẫn chưa thể nhân nhanh để đáp ứng nhu
cầu thương mại hoặc bảo quản nguồn gen. Nhiều vấn đề lý thuyết liên quan đến
nuôi cấy và tái sinh tế bào thực vật in vitro vẫn chưa được giải đáp.
- Chi phí sản xuất cao: vi nhân giống đòi hỏi nhiều lao động kỹ thuật thành
thạo. Do đó, giá thành sản phẩm còn khá cao so với phương pháp truyền thống như

chiết, ghép và nhân giống bằng hạt.
- Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình: cây con nuôi cấy mô có thể sai
khác với cây mẹ ban đầu do hiện tượng biến dị dòng tế bào soma. Kết quả là cây
con không giữ được những đặc tính của cây mẹ. Tỷ lệ biến dị thường thấp ở giai
đoạn đầu nhân giống, nhưng sau đó có chiều hướng tăng lên khi nuôi cấy mô kéo
dài và tăng hàm lượng các chất điều hòa sinh trưởng. Hiện tượng biến dị này cần
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Tổng quan tài liệu
21

được lưu ý khắc phục nhằm đảm bảo sản xuất hàng triệu cây giống đồng nhất về
mặt di truyền.
1.6.1 Những thay đổi di truyền trong quá trình nuôi cấy mô [18,26]
Trong quá trình phát triển cá thể, phân hoá và già hoá của mô và tế bào một số
thay đổi di truyền đã xảy ra và được tích luỹ trong các tế bào soma (D‟amato,
1985). Nhờ kỹ thuật nuôi cấy mô, cây được tái sinh từ tế bào soma sẽ là các đột
biến. Các nhà khoa học đưa ra khái niệm automutagenesis – tự đột biến (đột biến
xảy ra không do tác nhân từ bên ngoài gây nên hay là đột biến tự nó). De Vries
(1901) – người khởi xướng Học thuyết về đột biến cho rằng cây bị đột biến do tái
sinh từ hạt già (có nhiều đột biến đã tiềm ẩn từ trước trong hạt già). Ba mươi năm
sau, Nawacin chứng minh đột biến ở hạt già là do các chất tham gia quá trình trao
đổi chất và các sản phẩm cặn bã có trong hạt gây nên. Các chất này có thể là: hợp
chất chứa lưu huỳnh, amin, amino acid, aldehyde, alkloide, phenol, quinone, acid
nucleic và các sản phẩm khác. Nguyên nhân gây đột biến có thể do cấu trúc bình
thường của hạt và tế bào bị phá vỡ - các enzym tiếp xúc với các chất và tạo sản
phẩm đột biến.
 Khái niệm biến dị dòng tế bào soma:
- Biến dị dòng tế bào soma (somaclonal variation) là khái niệm dùng để chỉ tất
cả các biến dị thể hiện ở các tế bào, mô nuôi cấy và cây có nguồn gốc từ nuôi cấy
mô (Larkin và Scowcropt, 1981).
- Biến dị dòng tế bào soma còn gọi là biến dị dòng vô tính.

- Biến dị này đã được quan sát ở nhiều loài cây trồng như thuốc lá, khoai tây,
cà chua, mía, chuối, họ cải,… bao gồm đầy đủ các tính trạng nông học như chiều
cao cây, số nhánh, thời gian sinh trưởng cũng như các tính trạng hoá sinh khác.
 Phân loại biến dị dòng tế bào soma:
- Biến dị kiểu gen
+ Đột biến hệ gen: là đột biến về số lượng NST. Loại phổ biến là sự sai
khác về số lượng NST như đa bội, dị bội hay thể khảm. Các loài có độ bội thể
cao và nhiều về số lượng NST cao dễ bị biến đổi hơn loài có mức độ bội thể
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Tổng quan tài liệu
22

thấp và ít NST. Biến đổi nào xảy ra thường xuyên trong nuôi cấy tế bào, đặc biệt
trong nuôi cấy tế bào trần. Những biến đổi này có thể xảy ra từ giai đoạn đầu
của quá trình nuôi cấy, do sự phân tách NST không bình thường ở những chu kỳ
tế bào đầu tiên.
+ Đột biến NST: là các biến đổi về cấu trúc NST, các thay đổi có thể
bao gồm các hiện tượng như: mất đoạn, đảo đoạn, thêm đoạn hay nhân đoạn (tạo
ra các NST lớn hơn), chuyển đoạn và các biến đổi trong quá trình giảm phân.
+ Đột biến gen (đột biến điểm): là các biến đổi ở mức độ phân tử như sự
thay đổi của một cặp base, thay đổi về số lượng bản sao của một trình tự đặc thù,
sự thay đổi trong thể hiện của các nhóm đa gen hay sự thể hiện của các gen
nhảy. Sự xuất hiện của các đột biến này về cơ bản mang tính ngẫu nhiên.
- Biến dị kiểu hình: các biến dị kiểu hình thường liên quan đến sự thay đổi
trong quá trình thể hiện của một nhóm gen nhất định. Điển hình là các quá trình
khuếch đại và methyl hoá gen. Các biến dị kiểu hình thường xuyên xuất hiện ở cây
tái sinh sau nuôi cấy như là kết quả của các phản hồi về mặt sinh lý. Các thay đổi về
kiểu hình có thể là tạm thời, không có tính di truyền và có thể phục hồi trạng thái
ban đầu. Tuy nhiên chúng có thể duy trì trong suốt chu kỳ sống của các cây tái sinh.
Biểu hiện của đột biến kiểu hình:
+ Hiện tượng tăng mạnh mẽ khả năng sinh trưởng của các cây tái sinh

khi trồng trên đất. Biểu hiện này có thể liên quan đến việc trở lại trạng thái trẻ
hoá hoặc quá trình loại bỏ virus khỏi nguồn mẫu cấy ban đầu.
+ Các ví dụ khác thuộc nhóm này gồm hiện tượng ra hoa sớm, bạch
tạng, các thay đổi về hình thái, màu sắc cánh hoa, hình dạng lá và chiều cao
cây,…
 Nguyên nhân gây biến dị dòng tế bào soma:
Bất kì một yếu tố có khả năng dẫn đến các thay đổi di truyền đều được xem là
như là một nguyên nhân gây ra các biến dị này. Các yếu tố này chia ra làm ba
nhóm: sinh lý, di truyền, hoá sinh.
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Tổng quan tài liệu
23

Hai nguyên nhân chính gây biến dị dòng tế bào soma: tính không đồng nhất di
truyền các tế bào soma của mẫu cấy ban đầu và tác động của các yếu tố trong quá
trình nuôi cấy in vitro.
- Sự đa dạng di truyền của tự nhiên của các tế bào nuôi cấy
+ Các mẫu cấy có nguồn gốc từ một dòng đơn tính, từ hạt hay cây con
được xem như là đồng nhất về mặt di truyền và khi lấy mẫu có thể có kiểu hình
giống nhau. Tuy nhiên các mẫu cấy này thực tế lại bao gồm nhiều loại tế bào
khác nhau như là phloem, xylem, nhu mô, mô vỏ,… Những tế nào này có mức
độ bội thể khác nhau. Nói cách khác, có sự đa dạng tế bào giữa các loại tế bào
trong cùng một mẫu cấy. Sự đa dạng này gọi là đa bội vô tính (Polysomatic).
+ Ngoài ra còn nhiều thực vật tồn tại ở dạng thể khảm. Chúng chứa
những lớp tế bào hoặc mô có cấu trúc di truyền khác nhau được phát triển từ
meristem có chứa lớp hoặc bộ phận mô bị đột biến. Hiện tượng này đặc biệt phổ
biến ở cây thân gỗ.
 Tác động của các yếu tố trong quá trình nuôi cấy
+ Phương thức nhân giống in vitro: các phương thức nhân giống khác
nhau sẽ cho tỷ lệ xuất hiện các biến dị vô tính khác nhau. Nhìn chung nếu chồi
bất định được tái sinh từ một tế bào thì cơ hội để xuất hiện các biến dị dòng tế

bào soma thường lớn hơn nhiều từ các chồi được tái sinh từ nhiều tế bào. Các
quá trình nuôi cấy mô sẹo, huyền phù hoặc protoplast do đó thường có nhiều
biến dị dòng tế bào soma.
+ Loại mẫu cấy: các loại mẫu cấy khác nhau thường thể hiện mức độ
biến dị khác nhau. Các mẫu cấy có nguồn gốc từ các thể tiền chồi như chồi nách,
chồi đỉnh hoặc meristem thường có mức độ biến dị thấp hơn khi sử dụng các
mẫu cấy có nguồn gốc không phải đỉnh sinh trưởng như lá, rễ hay protoplast.
Khả năng xảy ra biến dị dòng tế bào soma còn phụ thuộc vào kiểu gen cũng như
tuổi cây mẹ. Các dòng cây già thường tiềm ẩn các biến dị sẵn có ở mức cao hơn
các dòng trẻ. Các loài có độ bội thể càng cao và số lượng NST càng nhiều thì
tính biến dị càng cao.
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Tổng quan tài liệu
24

+ Loại và nồng độ chất điều hoà sinh trưởng thực vật sử dụng: cho các
mô nuôi cấy dài ngày trong môt trường chứa các auxin mạnh như 2,4-D hoặc
2,4,5-T thường gây ra sai khác trong cây tái sinh.
+ Thời gian nuôi và số lần cấy chuyền: việc nuôi cấy dài ngày trong
điều kiện in vitro cũng như tăng số lần cấy chuyền cũng sẽ làm tăng khả năng
xuất hiện các biến dị dòng tế bào soma. Nguyên nhân của hiện tượng này là do
sự thay đổi của các kiểu methyl hoá bình thường của DNA bộ gen.
 Cơ chế tạo biến dị dòng tế bào soma
- Sự thay đổi các kiểu methyl hoá bình thường của DNA bộ gen: quá trình
methyl hoá là một quá trình mà một nucleotide cụ thể, thường là Adenine hay
Cytosin, có một nhóm methyl gắn liền với nó. Khi quá trình methyl hoá xảy ra như
vậy trong một vùng mã hoá DNA cho một gen hoạt động, nó đã cản trở gen này và
gen bị bất hoạt. Việc bất hoạt gen do quá trình methyl hoá có thể không được nhận
biết về mặt hiện tượng mặc dù quá trình này đã được tìm thấy trong nuôi cấy mô ở
một số loài như ngô, khoai tây, nho.
- Sự sắp xếp lại NST: sự mất, nhân đôi và tái tổ hợp vô tính là nguồn chính

của biến dị di truyền thể hiện ở các dòng tế bào soma. Ví dụ: khi nghiên cứu về cơ
chế dẫn đến sự thay đổi trong NST, một số ý kiến cho rằng sự tái bản muộn của
vùng dị NST là nguyên nhân chính dẫn đến các biến dị dòng vô tính ở ngô và đậu
lớn.
- Sự hoạt hoá các nhân tố chuyển vị: sự tách ra hay xen vào của các nhân tố
này ảnh hưởng trực tiếp đến cấu trúc các gen cấu trúc ở gần nó. Hơn nữa sự tách ra
không chính xác của các nhân tố chuyển vị có thể tạo ra sự tái sắp xếp của các trình
tự nucleotic phụ. Chúng là nguyên nhân của các biến đổi trong biểu hiện gen cấu
trúc NST.
- Đột biến điểm: chúng có thể là đột biến lặn hay trội. Các đột biến gen đã
được tìm thấy ở cây cà chua, lúa mỳ, thuốc lá.
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Tổng quan tài liệu
25

1.6.2 Ứng dụng của biến dị dòng tế bào soma [18]
- Trong cải tiến giống cây trồng truyền thống, nhà chọn tạo giống phải trồng
một số lượng lớn các cây trong nhà kính hay trên đồng nếu như muốn chọn lọc một
đặc tính cụ thể nào đó. Ngoài ra yếu tố di truyền cũng cản trở đến quá trình chọn
lọc.
- Các hệ thống nuôi cấy mô tế bào giúp cho các nhà chọn tạo giống cây trồng
có môi trường được xác định rõ ràng, nơi mà áp lực chọn lọc có thể làm trên hàng
ngàn các tế bào đơn và có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Như vậy có thể
chọn lọc từ lượng rất nhỏ các vật liệu di truyền đồng nhất về di truyền và xây dựng
các thử nghiệm nhanh chóng trong vài đĩa petri hay bình nuôi cấy.
- Có thể nghiên cứu một loài nhiệt đới ở vùng ôn đới hay ngược lại vì điều
kiện môi trường đặc thù là có thể tạo ra ở bất cứ đâu.
- Tạo ra dòng tế bào nuôi cấy có khả năng sản xuất các chất hoạt tính sinh học
với năng suất cao.
- Tạo ra các giống cây trồng mang những đặc tính biến dị quý.
Một ưu điểm của biến dị di truyền trong quá trình nuôi cấy là khả năng chọn lọc

dòng tế bào in vitro. Có thể nuôi cấy và xử lý hàng triệu tế bào trong một không
gian hạn chế, chẳng hạn trong đĩa petri và chọn lọc bằng cách xử lý tế bào nuôi cấy
trong điều kiện bất lợi là tác nhân chọn lọc. Cũng có thể kết hợp xử lý đột biến
trong nuôi cấy để tăng tần số biến dị di truyền. Tuy nhiên, chỉ những tính trạng biểu
hiện ở mức tế bào mới có thể xác định được bằng cách sàng lọc tế bào nuôi cấy, bao
gồm các đặc tính như kháng thuốc diệt cỏ, chịu mặn hay chịu kim loại như sắt,
nhôm, axit amin tương đồng, chịu nhiệt độ thấp, các yếu tố dinh dưỡng và khả năng
kháng độc tố do các tác nhân gây bệnh tạo ra. Các kiểu gen phân lập kháng với các
điều kiện bất lợi này có thể được sử dụng trực tiếp trong chương trình chọn giống.
Tuy nhiên, các biến dị có lợi này được biết đến với tỉ lệ không cao, thậm chí là rất
thấp. Tần số biến dị hoàn toàn khác nhau và không lặp lại (Creissen & Karp 1985).