NGHIÊN CỨU CHUYỂN HÓA GLYCEROL THÀNH POLYHYDROXYALKANOATE (PHA) NHỜ MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ ĐẤT RỪNG NGẬP MẶN HUYỆN YÊN HƯNG, TỈNH QUẢNG NINH

Khóa luận tốt nghiệp Vũ Hồng Vân
LỜI CẢM ƠN
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn
đến TS. Đoàn Văn Thược – giảng viên Bộ môn Công nghệ Sinh học – Vi sinh,
Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội – người đã tận tâm hướng dẫn,
giúp đỡ và động viên tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong bộ môn Công nghệ Sinh
học – Vi sinh, Khoa Sinh học,Trường Đại học Sư phạm Hà Nội đã tạo điều kiện,
giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới chị Dung, chị Bình, các anh chị cao
học, bạn Vóc, bạn Ninh, các bạn, các em sinh viên đang làm thí nghiệm tại bộ
môn và người thân, những người đã động viên, khích lệ tôi rất nhiều trong
thời gian vừa qua.
Tôi xin trân trọng cảm ơn !
Hà Nội, tháng 10 năm 2013
Người viết
Vũ Hồng Vân
1
Khóa luận tốt nghiệp Vũ Hồng Vân
MỤC LỤC
2
Khóa luận tốt nghiệp Vũ Hồng Vân
CÁC TỪ VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN
CDW (cell dry weight) : Khối lượng tế bào khô
HA : Hydroxyalkanoate-Đơn phân cấu tạo nên PHA
mcl (medium-chain-length) : Mạch trung bình
OD (Optical Density) : Mật độ quang
PHA : Polyhydroxyalkanoate
PhaC : PHA synthase
PhaP : Phasin protein
PhaR : Protein điều hòa quá trình sinh tổng hợp PHA

PhaZ : PHA depolymerase
PHB (hay P(3HB)) : Poly(3-hydroxybutyrate)
phbA : Gen quy định enzyme β-ketoacyl-CoA thiolase
phbB : Gen quy định enzyme acetoacetyl-CoA reductase
phbC : Gen quy định enzyme PHB polymerase
P(3HB-co-3HV)
(hay PHBHV)
: Poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate)
PHV (hay P(3HV)) : Poly(3-hydroxyvalerate)
scl (short-chain-length) : Mạch ngắn
UV (Untraviolet) : Tia tử ngoại
%, w/v : Phần trăm khối lượng trên thể tích
3
Khóa luận tốt nghiệp Vũ Hồng Vân
MỞ ĐẦU
Dầu mỏ là một trong những nguồn nguyên liệu quan trọng nhất của xã hội
hiện đại, là nhiên liệu của đa số các phương tiện giao thông vận tải. Hơn nữa, dầu
cũng được sử dụng để sản xuất các chất dẻo (plastic) và nhiều sản phẩm khác.Tuy
nhiên, dầu mỏ là nguồn nguyên liệu không có khả năng tái tạo nên chắc chắn sẽ cạn
kiệt trong tương lai, không những vậy những sản phẩm từ dầu mỏ sau khi sử dụng
cũng gây ra ô nhiễm môi trường nghiêm trọng. Ví dụ các chất dẻo có nguồn gốc từ
dầu mỏ đang là mối nguy hại tiềm ẩn tới sức khỏe con người cũng như môi trường
sinh thái vì chỉ có những tác động về cơ học và nhiệt mới có thể phá hủy nó nhưng lại
tạo ra nhiều chất độc hại hơn và đòi hỏi những chi phí rất lớn, vượt qua cả giá thành tạo
ra chúng. Phát triển và sử dụng các polymer có khả năng phân hủy sinh học thay thế
cho polymer hóa dầu là một hướng đi có nhiều triển vọng mà thế giới nói chung và
Việt Nam nói riêng đang cố gắng từng bước thực hiện.
Trong số các polymer sinh học hiện biết thì polyhydroxyalkanoate (PHA) là loại
polymer đang được quan tâm nghiên cứu và sản xuất nhiều nhất. PHA được tích lũy
trong các tế bào vi sinh vật đóng vai trò là nguồn tích lũy cacbon và năng lượng . Sự

tích lũy PHA xảy ra khi môi trường sống của vi sinh vật dư thừa nguồn cacbon và
thiếu một nguyên tố dinh dưỡng nào đó như O, N, P, S hay Mg [28, 29]. Có khoảng
hơn 150 loại PHA khác nhau, mỗi loại có những tính chất đặc trưng riêng phù hợp
với các hướng ứng dụng khác nhau trong nông nghiệp, công nghiệp và y tế, Trong
đó có 2 loại PHA là poly(3-hydroxybutyrate) (PHB) và poly (hydroxybutyrate-co-
hydroxyvalerate) (PHBV) đang được sản xuất và ứng dụng trên quy mô công nghiệp
[28, 29].
Điểm hạn chế ảnh hưởng đến tiềm năng ứng dụng của PHA là giá thành của
PHA đắt hơn so với các loại plastic có nguồn gốc từ mỏ đang sử dụng hiện nay. Rất
nhiều yếu tố có khả năng ảnh hưởng đến giá cả của PHA, ví dụ như: hiệu suất sản
xuất PHA, hàm lượng PHA tích lũy trong tế bào, hiệu suất chuyển hóa nguồn
cacbon thành PHA, giá của các nguyên liệu dùng trong lên men, và giá của quy
trình tách chiết, tinh sạch PHA [14]. Chính vì vậy việc lựa chọn chủng dùng cho sản
xuất PHA trên qui mô công nghiệp cần phải chú ý đến nhiều yếu tố. Ví dụ như khả
4
Khóa luận tốt nghiệp Vũ Hồng Vân
năng sử dụng các nguồn cacbon rẻ tiền, tốc độ sinh trưởng và tốc độ tổng hợp PHA,
hàm lượng PHA có khả năng tích lũy trong tế bào [14].
Sản xuất nguồn nhiên liệu sinh học trong đó có diesel sinh học nhằm thay thế
dầu mỏ trong lĩnh vực nhiên liệu đang là một định hướng phát triển của các nước
trên thế giới. Quá trình sản xuất diesel sinh học sẽ tạo ra một lượng glycerol khá lớn
(khoảng 10% (w/w)) [15]. Cùng với sự phát triển của ngành sản xuất diesel sinh
học thì lượng glycerol tạo ra ngày càng nhiều. Làm thế nào để sử dụng hiệu quả
nguồn glycerol này là một câu hỏi mà nhiều nhà khoa học đang đi tìm câu trả lời.
Một trong những hướng nghiên cứu hiện nay là chuyển hóa glycerol thành
polyhydroxyalkanoate.
Với những lý do trên,chúng tôi đã tiến hành đề tài “Nghiên cứu chuyển hóa
glycerol thành polyhydroxyalkanoate (PHA) nhờ một số chủng vi khuẩn phân lập từ
đất rừng ngập mặn huyện Yên Hưng, tỉnh Quảng Ninh”
Mục tiêu

Phân lập và tuyển chọn được chủng vi khuẩn có khả năng chuyển hóa hiệu quả
glycerol thành PHA.
Nội dung nghiên cứu
1. Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng tích lũy PHA trên môi
trường có nguồn carbon là glycerol
2. Nghiên cứu đặc tính sinh học của chủng vi khuẩn đã được tuyển chọn, xác
định loại PHA tích lũy trong chủng được tuyển chọn
3. Nghiên cứu khả năng chuyển hóa glycerol thành PHA ở các điều kiện
nuôi cấy và thành phần dinh dưỡng khác nhau.
5
Khóa luận tốt nghiệp Vũ Hồng Vân
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN
1.1 Polyhydroxyalkanoate (PHA)
Polyhydroxyalkanoate (PHA) là polyester của các hydroxyalkanoate (HA)
(hình 1.1) tích lũy trong tế bào của nhiều vi sinh vật trong điều kiện môi trường
sống dư thừa nguồn cacbon và thiếu hụt một vài nguyên tố dinh dưỡng thiết yếu
như là O, N, P, S, Mg,…. PHA là polymer của khoảng 10
3
đến 10
4
monomer, chúng
tồn tại dưới dạng các hạt riêng biệt trong tế bào, có khoảng từ 5 đến 13 hạt trong một
tế bào, mỗi hạt có kích thước khoảng từ 0.2 đến 0.5 µm [18, 19, 26]
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của polyhydroxyalkanoates. R có thể là H hoặc các
gốc alkyl có số lượng C dao động từ 1-13, x = 1-4, và n = 100-30000 phân tử [28]
Bảng 1.1. Một số loại PHA thường được vi khuẩn tổng hợp [30]
R X Tên gọi Viết tắt
H 1 Poly(3-hydroxypropionate) P(3HP)
CH
3

1 Poly(3-hydroxybutyrate) P(3HB)
C
2
H
5
1 Poly(3-hydroxyvalerate P(3HV)
C
3
H
7
1 Poly(3-hydroxyhexanoate) P(3HHx)
H 2 Poly(4-hydroxybutyrate) P(4HB)
CH
3
2 Poly(4-hydroxyvalerate) P(4HV)
1.1.1 Sinh tổng hợp PHA trong tế bào vi khuẩn
PHA được tổng hợp bởi rất nhiều cơ thể sống, trong đó vi khuẩn và thực vật là
hai đối tượng đáng quan tâm nhất. Tế bào thực vật có thể tổng hợp PHA từ nguồn
carbon là CO
2
tuy nhiên hàm lượng PHA tích lũy được là rất thấp (nhỏ hơn 10%
khối lượng tế bào khô). Trong một số trường hợp, thực vật tích lũy hàm lượng PHA
cao (từ 10-40% khối lượng tế bào khô) nhưng điều này lại gây ảnh hưởng xấu tới sự
sinh trưởng và phát triển của chúng và hiện tại các nhà khoa học vẫn chưa tìm ra
biện pháp nào để khắc phục nhược điểm này. Trong tế bào vi khuẩn thì PHA có thể
tích lũy tới 90% khối lượng khô của tế bào [30].
6
Khóa luận tốt nghiệp Vũ Hồng Vân
Tích lũy PHA là cách thức tự nhiên mà vi khuẩn sử dụng để dự trữ carbon và
năng lượng khi hàm lượng các nguyên tố dinh dưỡng trong môi trường sống mất

cân bằng Việc polymer hóa các phân tử chất tan thành các hạt PHA không tan
không làm thay đổi áp suất thẩm thấu của tế bào, ngược lại điều này giúp ngăn cản
sự thất thoát của các hợp chất có giá trị. Chúng sẽ được dự trữ để duy trì sự tồn tại
của tế bào [30].
Loại PHA đầu tiên được các nhà khoa học phát hiện và cũng là loại PHA được
nghiên cứu chi tiết nhất cho đến thời điểm hiện tại chính là poly(3-hydroxybutyrate)
(PHB) [30]. Những nghiên cứu trên chủng Cupriavidus necator cho thấy quá trình
sinh tổng hợp PHB chịu sự chi phối của 3 gen, được điều hòa hoạt động bởi cùng
một operon có tên là operon phbCAB. 3 gen này mã hóa cho 3 enzyme thực hiện 3
phản ứng tổng hợp kế tiếp nhau (hình 1.3). Phản ứng đầu tiên là biến đổi hai phân
tử acetyl coenzyme A (Acetyl-CoA) thành phân tử acetoacetyl-CoA nhờ sự xúc tác
của β-ketoacyl-CoA thiolase (mã hóa bởi gen phbA). Tiếp theo là phản ứng khử
acetoacetyl-CoA thành (R)-3-hydroxybutyryl-CoA nhờ sự xúc tác của enzyme NADP-
dependent acetoacetyl-CoA reductase (mã hóa bởi gen phbB). Cuối cùng các phân tử
(R)-3-hydroxybutyryl - CoA được polymer hóa thành poly(3hydroxybutyrate) (PHB)
nhờ sự xác tác của PHB polymerase (mã hóa bởi gen phbC) [28]. Trong quá trình sinh
trưởng của vi khuẩn, enzyme β-ketothiolase bị ức chế bởi hàm lượng Coenzyme A tự
do giải phóng từ chu trình Krebs, nhưng khi sự tiếp nhận acetyl-CoA vào chu trình
Krebs bị giới hạn (xảy ra khi môi trường sống bị hạn chế một vài nguyên tố dinh
dưỡng thiết yếu, nguồn carbon vẫn dồi dào) thì lượng acetyl-CoA dư thừa sẽ được
chuyển vào con đường sinh tổng hợp PHB [30].
7
Khóa luận tốt nghiệp Vũ Hồng Vân
Hình 1.3: Ba bước của con đường sinh tổng hợp PHB. Một promoter nằm trước
gen phbC đóng vai trò khởi động quá trình sinh tổng hợp [28]
Hình 1.4 Sơ đồ cấu trúc hạt PHA [28]
Trong tế bào, PHA tích lũy dưới dạng các thể ẩn nhập (hạt dự trữ) hình cầu,
không tan trong nước, chứa các chuỗi polyester, thường được gọi là hạt PHA. Hạt
PHA được bao ngoài bởi một lớp màng có bản chất là phospholipid và được
“khảm” bởi các protein bám màng và xuyên màng trong đó bao gồm enzyme PHA

synthease (PhaC), protein phasing (PhaP), enzyme PHA depolymerase (PhaZ),
protein điều hòa (PhaR) và một số protein khác chưa rõ chức năng [28] (hình 1.4).
Kích thước của hạt PHA tăng lên khi enzyme PHA synthase không ngừng tiếp xúc
để liên kết các monomer có trong tế bào chất, làm mạch polyester dài ra. Khi tích
lũy PHA đạt đến cực đại, các hạt PHA sẽ choán hết thể tích bên trong tế bào [28].
Ngoài con đường tổng hợp trong các cơ thể sống, PHA cũng có thể được
tổng hợp bằng con đường hóa học. Con đường sinh tổng hợp tạo ra các polymer có
khối lượng phân tử lớn hơn so với polymer tạo ra từ con đường tổng hợp hóa học,
tuy nhiên trong con đường tổng hợp sinh học chúng ta khó có thể điều khiển các
monomer cấu trúc tham gia kiến tạo PHA vì điều này được quy định bởi loại PHA
synthase đặc trưng của tế bào [13].
1.1.2 Phân loại và tích chất của PHA
PHA có thể là polymer của một loại monomer hoặc của hai hoặc nhiều loại
monomer. PHA được chia thành hai nhóm phụ thuộc vào số lượng các phân tử
carbon có trong các đơn phân monomer: những PHA dạng mạch ngắn (scl-PHAs)
có khoảng 3-5 phân tử carbon trong một monomer, những PHA dạng mạch trung
8
Khóa luận tốt nghiệp Vũ Hồng Vân
bình (mcl-PHAs) có khoảng 6-16 phân tử các bon trong một monomer. PHA mạch
ngắn có tính chất giống với các loại plastic thông thường (giòn và cứng), trong khi
đó các PHA có mạch trung bình mềm dẻo, có nhiệt độ sôi và hàm lượng tinh thể
thấp, có khả năng đàn hồi [22]. Một số vi khuẩn có khả năng tổng hợp PHA có chứa
cả hai loại mạch ngắn và mạch trung bình [22].
PHA có thể được trùng hợp từ một loại monomer hoặc được đồng trùng hợp
từ hai hay nhiều loại monomer. Dựa theo cách trùng hợp có hai loại polymer là
homopolymer (đồng polymer) và heteropolymer (dị polymer) hay polymer hỗn hợp
(co-polymer). Homopolymer điển hình là polyhydroxybutyrate (PHB) được tổng hợp
từ một loại monomer duy nhất là hydroxybutyrate. Trong điều kiện môi trường thiếu
hụt các yếu tố dinh dưỡng và dư thừa carbon, tế bào vi khuẩn thường chuyển hóa
nguồn carbon thành monomer 3-hydroxybutyrate (3HB) và tổng hợp nên PHB [15].

PHA được trùng hợp ngẫu nhiên từ hai hay nhiều loại monomer khác nhau
được gọi là co-polymer (polymer đồng trùng hợp) hay heteropolymer (dị polymer).
Mặc dù homopolymer PHB là loại được tổng hợp phổ biến bởi nhiều chủng vi
khuẩn nhưng những hạn chế trong tính chất vật lý của nó khiến các nhà khoa học
quan tâm tới nhóm các co-polymer hơn. PHB trở nên cứng và giòn sau khi tách
chiết từ tế bào vi khuẩn và bảo quản trong điều kiện thường chỉ sau một vài ngày,
hơn nữa nhiệt độ nóng chảy của PHB rất gần với nhiệt độ phân hủy (xấp xỉ 185
o
C)
nên quá trình chế tạo sản phẩm từ PHB gặp nhiều khó khăn. Co-polymer có thể
khắc phục triệt để những nhược điểm này. Khả năng chịu nhiệt cũng như những tính
chất vật lý đa dạng của các loại co-polymer khiến chúng là đối tượng được các nhà
khoa học quan tâm nghiên cứu và sản xuất.
Sau khi được tách chiết và tinh sạch, các PHA thể hiện một số tính chất đặc
trưng như bền nhiệt, không dẫn điện, cứng hoặc mềm dẻo (tùy loại PHA), không
thấm nước, không cho không khí đi qua…[13] Khối lượng phân tử của PHA dao
động trong khoảng từ 2x10
5
đến 3x10
6
Dalton. Các polymer sinh học này có tính
chất cơ bản giống với polymer thông thường như polyethylene (PE) hay
polypropylene (PP) (bảng 1.2).
9
Khóa luận tốt nghiệp Vũ Hồng Vân
Bảng 1.2: Bảng so sánh các đặc tính vật lý của nhiều loại PHA và polypropylene [28]
Polymmer
Nhiệt độ hóa
lỏng (
oC

)
(1)
Tinh thể hóa
(%)
(2)
Độ đàn hồi
(MPa)
(3)
P(3HB) 175-179 60-80 40
P(4HB) 53 34 104
P(3HB-co-3 mol% 3HV) 169-170 69 38
P(3HB-co-14 mol% 3HV) 150 56 35
P(3HB-co-20 mol% 3HV) 145 50 32
P(3HB-co-25 mol% 3HV) 137 40 30
P(3HB-co-16 mol% 4HB) 150 45 26
P(3HB-co-64 mol% 4HB) 50 15 17
P(3HB-co-90 mol% 4HB) 50 28 65
P(3HB-co-6 mol% 3HA) 133 45 17
P(3HB-co-10 mol% 3HHx) 127 34 21
P(3HO-co-11 mol% 3HHx) 61 30 10
Polypropylene 176 50-70 34.5-38
Ghi chú:
(1)
T
m
(melting temperature) : nhiệt độ mà ở đó polymer chuyển từ
trạng thái rắn sang trạng thái lỏng.
(2)
Crystallinity: là tỷ lệ tinh thể có trong toàn bộ
mẫu polymer (polymer = tinh thể + chất vô định hình).

(3)
Tensile strength: là lực
căng lớn nhất mà polymer chịu được (không bị rách, đứt gãy), tính bằng
megapascal (1Pa = 1N/m
2
; 1MPa = 10
6
Pa)
Bên cạnh các tính chất nêu trên, một tính chất đặc trưng của PHA là khả năng
phân hủy sinh học. Các vi sinh vật trong tự nhiên có thể phân hủy PHA bằng cách sử
dụng các enzyme PHA hydrolase và PHA depolymerase. Hoạt động của các enzyme
này có thể rất khác nhau, phụ thuộc vào thành phần cấu tạo của polymer và điều kiện
môi trường. Một mẫu PHB có thể phân hủy hoàn toàn sau vài tháng trong điều kiện
yếm khí của bể chứa nước thải hoặc sau vài năm trong mồi trường nước biển. Tác
động của tia UV trong ánh sáng mặt trời cũng có tác dụng đẩy nhanh quá trình phân
hủy. Một điều đặc biệt nữa là PHA có tính tương thích sinh học, nghĩa là chúng
không gây tác động xấu nào khi được đưa vào cơ thể sống. Trong mô động vật có vú,
PHA phân hủy rất chậm, sau 6 tháng cấy ghép vào cơ thể chuột thí nghiệm, lượng
PHA hao mòn do phân hủy là rất nhỏ (nhỏ hơn 1.6% khối lượng) [30].
1.2 Tình hình sản xuất, ứng dụng PHA trên thế giới và ở Việt Nam
10
Khóa luận tốt nghiệp Vũ Hồng Vân
Hiện nay trên thế giới có rất nhiều công ty tham gia sản xuất các sản phẩm
có nguồn gốc PHA, thân thiện với môi trường. Ví dụ một số công ty lớn như:
Metabolic (Mỹ) sản xuất khoảng 50 000 tấn/năm, Meredian (Mỹ) sản xuất 10 000
tấn/năm, như Bio-On (Ý) sản xuất 10 000 tấn/năm, [12]. Các sản phẩm từ PHA
rất đa dạng, từ những sản phẩm thông thường như túi đựng hàng, cốc nhựa, bao bì,
chậu cây, tã lót trẻ em đến các sản phẩm có độ bền cao như vỏ máy tính, vỏ đựng
lốp ô tô dự trữ, Đặc biệt hơn, do có tính tương thích sinh học cao nên không gây
phản ứng loại thải khi được cấy ghép vào cơ thể, PHA có những ứng dụng quan

trọng trong ngành y tế, ví dụ các sản phẩm như chỉ phẫu thuật, đĩa xương, ống ghép
mạch, van tim đều có thể làm từ PHA [6]. Một trong những ứng dụng đặc biệt của
PHBHV trong ngành nông nghiệp là sự giải phóng một cách có kiểm soát của thuốc
diệt côn trùng. Thuốc diệt côn trùng được tổ hợp với các hạt PHBHV và được gieo
cùng với hạt cây trồng. Thuốc diệt côn trùng có thể được giải phóng với một tỷ lệ
nhất định phụ thuộc vào mức độ hoạt động của dịch hại tính từ khi vi khuẩn phá vỡ
chuỗi polymer bị tác động bởi điều kiện môi trường tương tự như điều kiện môi
trường đã tác động lên các dịch hại sống trong đất [22],[30].
Những ưu điểm của polymer sinh học so với các loại nhựa thông thường
trong việc hạn chế ô nhiễm môi trường là không thể phủ nhận, tuy nhiên do giá
thành hiện tại của PHA đắt hơn khá nhiều so với giá của plastic có nguồn gốc từ dầu
mỏ đang sử dụng hiện nay nên việc ứng dụng rộng rãi sản phẩm từ PHA vào đời
sống vấp phải nhiều khó khăn. Các nhà khoa học đang nỗ lực nghiên cứu nhằm
giảm giá thành của PHA, trong đó các hướng nghiên cứu chủ yếu là: tìm ra các
chủng vi sinh vật mới có khả năng tích lũy PHA mạnh, tạo ra sản lượng PHA lớn
khi lên men trên các nguồn cơ chất rẻ tiền hoặc tái sử dụng các nguồn phế, phụ
phẩm công nghiệp và nông nghiệp, tối ưu hóa quy trình sản xuất và quy trình tách
chiết, tinh sạch để đạt được hiệu suất cao hay tạo ra các dòng sinh vật chuyển gen
có khả năng sinh trưởng, phát triển tốt và tích lũy PHA với hàm lượng cao [Error:
Reference source not found].
Việt Nam cũng là một trong số các quốc gia trên thế giới đang phải đối mặt
với vấn nạn ô nhiễm môi trường do việc sử dụng tràn lan các sản phẩm nhựa không
phân hủy, đặc biệt là túi nilon và các sản phẩm đồ gia dụng. Theo kết quả điều tra
11
Khóa luận tốt nghiệp Vũ Hồng Vân
khảo sát của Cục kiểm soát ô nhiễm năm 2010 đối với 263 người tại 5 tỉnh/thành
phố đại diện cho 3 vùng miền của Việt Nam cho thấy: gần 50% số hộ sử dụng 8 bao
bì nilon trở lên trong một ngày, trong đó 35,1% số hộ sử dụng trên 10 bao bì/ngày.
Trung bình mỗi hộ sử dụng 223 bao bì/tháng (khoảng 7,5 bao bì/hộ/ngày), tương
đương 1kg bao bì nilon/hộ/tháng, trong đó 98,7% là bao bì nilon không tự phân hủy

[Error: Reference source not found]. Ở Việt Nam hiện nay polymer sinh học vẫn
đang là hướng nghiên cứu còn khá mới mẻ, bước đầu đã có một số công trình
nghiên cứu sản xuất và ứng dụng bao bì tự phân hủy vào trong sản xuất nông
nghiệp và đời sống hàng ngày.
Viện hóa học Công nghiệp trực thuộc viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam
đã đưa ra thị trường sản phẩm polymer có khả năng tự phân hủy. Đây là sản phẩm
có sự kết hợp của nhựa polyetylen tỉ trọng thấp với một số loại tinh bột và hóa chất.
Sản phẩm gồm ba dạng: Màng phủ nông nghiệp, bao bì bọc bầu ươm cây và túi
nilon phục vụ nhu cầu người tiêu dùng. Viện hóa học Việt Nam hiện nay cũng đang
tiến hành một số nghiên cứu sản xuất polymer sinh học có nguồn gốc từ tinh bột và một
số polymer khác như polylactic acid, polycaprolacton, polyethylenglycol, polyglycolic
acid. Bộ môn Công nghệ hóa, trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã
nghiên cứu sản xuất polymer sinh học từ sự phối trộn tinh bột sắn và glycerol. Bộ môn
Công nghệ sinh học - vi sinh, khoa Sinh học, trường Đại học Sư phạm Hà Nội đã tiến
hành đề tài “ phân lập và nghiên cứu vi khuẩn sinh polyhydroxyalkanoate từ rừng ngập
mặn miền Bắc Việt Nam” do Qũy Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia
(Nafosted) tài trợ trong giai đoạn 2010-2012, hàng trăm chủng vi khuẩn có khả năng
tích lũy PHA đã được phân lập và tuyển chọn. Phần lớn các chủng vi khuẩn này có khả
năng tích lũy poly(3-hydroxyalkanoate) (PHB), một số chủng vi khuẩn này có khả năng
tổng hợp co-polymer poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) (PHBV) [7]. Hai
dạng polymer PHB và PHBV chính là 2 dạng PHA được sản xuất và sử dụng phổ biến
nhất trên thế giới hiện nay.
12
Khóa luận tốt nghiệp Vũ Hồng Vân
1.3 Glycerol - một nguồn carbon có nhiều triển vọng cho ngành công nghệ vi sinh
Glycerol thường được gọi là glycerine, là một loại rượu trihydric [C
3
H
5
(OH

3
)], là một chất không màu, không mùi, nhớt. Glycerol có ba nhóm hydroxyl
nên có khả năng hòa tan trong nước và hút ẩm tự nhiên. Glycerol có vị ngọt và
thường được coi là không độc hại. Glycerol là một sản phẩm phụ của quá trình sản
xuất dầu diesel sinh học.

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của Glycerol
1.3.1 Tình hình sản xuất glycerol trên thế giới và ở Việt Nam
Sự gia tăng đáng kể trong nhu cầu vận chuyển nhiên liệu và vấn đề ô nhiễm
môi trường ngày càng trầm trọng, cùng với suy giảm dự trữ dầu thô là nguyên nhân
hướng tới tăng sự tập trung vào năng lượng tái tạo. Dầu diesel sinh học - một trong
những lựa chọn đầy hứa hẹn về nhiên liệu tái tạo. Mặc dù sản xuất dầu diesel sinh
học trên thế giới đã được dự kiến sẽ đạt công suất cao nhưng trên thực tế nó ít hơn
so với mục tiêu đề ra và tăng với tốc độ chậm hơn. Lý do chính là chi phí sản xuất
dầu diesel tương đối cao, tái sử dụng các sản phẩm phụ như glycerol trong quá trình
này đang là một trong những lựa chọn đầy hứa hẹn cho việc giảm chi phí sản xuất.
Sản xuất dầu diesel sinh học sẽ tạo ra khoảng 10% (w/w) glycerol. Nói cách khác,
mỗi gallon (tương đương ~ 4,4L) dầu diesel sinh học sản xuất tạo ra khoảng 1,05
pound (~0,476 kg) glycerol. Điều này cho thấy mỗi năm nhà máy sẽ tạo ra 30 triệu
gallon (~ 132 triệu L) dầu diesel sinh học khoảng 11.500 tấn glycerol tinh khiết
99,9% [15].
Hiện nay, ở nước ta có rất nhiều cơ sở sản xuất sử dụng dầu mỡ động thực
vật làm nhiên liệu sinh học (biodiesel), ước tính lên tới 60.000 tấn/năm trong vài
năm tới. Trong đó, sản phẩm phụ của quá trình này là glycerol thô, trong vài năm
tới sản lượng glycerol thô ở nước ta đạt khoảng 6.000 tấn. Nhưng các cơ sở sản xuất
nhiên liệu sinh học lại chưa có phương án sử dụng nguồn sản phẩm phụ này ngoài
việc làm chất đốt hoặc bán với giá 4.000đ/lít. Điều này sẽ rất lãng phí bởi hiện tại,
giá glycerol tinh chế 98% dao động trong khoảng 35.000-40.000đ/lít và nước ta
13
Khóa luận tốt nghiệp Vũ Hồng Vân

phải nhập khẩu hoàn toàn từ Malaysia. Việc thu hồi và tinh chế glycerol thu được từ
quá trình sản xuất biodiesel mang lại hiệu quả kinh tế rất cao cho các nhà máy sản
xuất biodiesel. Ngoài ra, việc tận thu và tinh chế glycerol còn góp phần giảm ô
nhiễm môi trường do việc thải glycerol thô hoặc do khói thải của quá trình sử dụng
glycerol thô làm chất đốt gây ra. Sản phẩm glycerol sau tinh chế sẽ được sử dụng
cho các quá trình chế biến tiếp theo để cho ra các sản phẩm có giá trị cao hơn nữa.
Chẳng hạn, glycerol có thể chuyển hóa thành các sản phẩm ứng dụng như chất bôi
trơn, dầu nhờn, chất nhũ hóa, chất hoạt động bề mặt. Glycerol có thể chuyển hóa
thành methanol - là nguồn nguyên liệu quan trọng cho các quá trình tổng hợp hóa
dầu [34].
Sự tăng trưởng nhanh chóng của nền công nghiệp chế biến dầu diesel sinh
học đã tạo nên sự “ thừa ” chất glycerol. Nền công nghiệp đang phải đương đầu với
một sự khủng hoảng đe dọa đối với chất thải glycerol. Các nhà khoa học trên toàn
cầu đang chạy đua nhằm tìm ra các phương pháp biến chất thải glycerol thành lợi
nhuận. Ngoài việc hướng tới quy trình sản xuất hóa chất truyền thống - tìm cách
gây xúc tác các phản ứng để biến glycerol thành những chất hóa học khác thì các
nhà khoa học cũng đang tập trung vào sự chuyển đổi sinh học. Trong sự chuyển đổi
sinh học, các nhà nghiên cứu tạo ra vi sinh vật có thể sử dụng glycerol để chuyển
hóa thành PHA - một loại nhựa sinh học có nhiều tiềm năng thay thế cho các loại
nhựa hóa dầu đang sử dụng hiện nay.
1.3.2 Ứng dụng của glycerol
Glycerol được biết đến với rất nhiều ứng dụng trong đa dạng các lĩnh vực
của đời sống thường ngày.
Trong công nghiệp thực phẩm: glycerol được sử dụng như một chất tạo ẩm,
chất tạo ngọt, chất bảo quản. Như một chất thay thế cho đường, glycerol chứa
khoảng 27 calories trong một thìa cafe (đường chứa 20 calories) và có vị ngọt gần
giống đường sucrose, tuy nhiên nó lại không làm tăng lượng đường trong máu và
cũng không gây sâu răng. Glycerol có hàm lượng calo tương đương đường ăn
nhưng chỉ số đường huyết thấp và có cách trao đổi chất khác trong cơ thể nên được
những người ăn kiêng chấp nhận thay cho đường ăn. Sử dụng glycerol như một

thành phần thức ăn cho động vật đã được biết đến từ những năm 1970. Glyxerol
14
Khóa luận tốt nghiệp Vũ Hồng Vân
được bổ sung trong khẩu phần ăn của động vật không nhai lại có tỷ lệ hấp thụ cao.
Sau khi hấp thụ, nó có thể được chuyển đổi thành glucose sản xuất năng lượng
trong gan động vật bằng các enzyme glycerol kinase. Các phương pháp điều chỉnh
chế độ ăn uống có bổ sung glycerol không có ảnh hưởng đáng kể về chất lượng thịt.
Khi glyxerol thô đã được thêm vào khẩu phần ăn của heo con cai sữa, tại mức 10%
hiệu suất thức ăn được nâng cao. Glyxerol thêm vào lên đến 15% chất khô trong
chế độ ăn của con cừu có thể cải thiện hiệu suất vỗ béo, đặc biệt là trong 14 ngày
đầu tiên. Glycerol tinh khiết được bổ sung lên tới 15% trong khẩu phần chất khô
của bò đang cho sữa không có tác hại về lượng thức ăn, khả năng sản xuất sữa và
năng suất của chúng [15].
Glycerol còn được sử dụng trong y tế, dược phẩm và chăm sóc cá nhân: chủ
yếu được dùng như một chất làm trơn và chất giữ ẩm. Nó cũng được dùng trong
chất miễn dịch dị ứng, si rô trị ho, kem đánh răng, nước súc miệng, các sản phẩm
chăm sóc da, kem cạo râu, các sản phẩm dưỡng tóc, xà phòng. Glycerol tinh khiết
hoặc gần như tinh khiết là một phương pháp điều trị hiệu quả cho bệnh vẩy nến,
bỏng, vết cắn, vết cắt, phát ban và cả những cục chai.
Chất chống đông: Giống ethylene glycol và propylene glycol, glycerol hình
thành liên kết hydro mạnh đối với các phân tử nước, làm giảm đi liên kết hydro giữa
các phân tử nước với nhau. Nhiệt độ đông đặc thấp nhất có thể đạt được vào khoảng
-37.8
o
C tương ứng với 60-70% glycerol trong nước.
Hóa chất trung gian: Glycerol được sử dụng để sản xuất nitroglycerine hoặc
glycerol trinitrate (GTN) là một thành phần thiết yếu của thuốc súng không khói và
một số loại thuốc nổ khác GNT còn được dùng trong một số loại thuốc chống tức
ngực.
Sản xuất PHA: Glycerol có thể thay thế carbohydrate truyền thống trong sản

xuất PHA, chẳng hạn như sucrose, glucose và tinh bột. Đã có rất nhiều nghiên cứu
về việc sử dụng glycerol như một nguồn carbon cho sự tích lũy PHA của vi khuẩn,
hướng tới sản xuất polymer tự phân hủy thay thế cho polymer hóa dầu hiện nay. Ví
dụ với Paracoccus denitrificans và Cupriavidus Necator JMP 134, cho thấy các
polyme thu được giống với polymer thu được khi sử dụng nguồn carbon là glucose.
Zobellella denitrificans MW1 có thể sử dụng glyxerol cho sự phát triển và sản xuất
15
Khóa luận tốt nghiệp Vũ Hồng Vân
PHB với hiệu suất cao, đặc biệt là khi có mặt của NaCl. Do đó, nó đã được phát
triển sản xuất trên quy mô lớn để tạo ra PHB từ glyxerol. Gần đây, báo cáo cho thấy
Pseudomonas oleovorans NRRL B-14682 cũng có thể được sử dụng cho sản xuất
PHB từ glycerol [15]. Đầu những năm 90, Pseudomonas putida KT2442 đã được sử
dụng để sản xuất mcl-PHA từ glycerol [24]. Polymer này có đặc điểm tương tự như
các polymer được sản xuất bởi cùng một chủng nhưng với nguồn carbon là glucose
và fructose. Hai chủng vi sinh vật được sử dụng trong lên men sản xuất PHB là
Methylobacterium rhodesianum và C.necator có thể tích lũy PHB lần lượt lên đến
50% và 65% khối lượng khô của tế bào trong 45h [10]. Sujatha và Shenbagarathai
(2006) đã sử dụng chủng E.Coli có gen phaC1 từ Pseudomonas sp. LDC-5. Chủng
tái tổ hợp này đã tích lũy được 3,4 g PHAs/L trên môi trường có nguồn carbon là
glycerol và pepton có nguồn gốc từ cá với hàm lượng trung bình [27]. Cavalherio et
al. (2009) đã công bố một kết quả đầy hứa hẹn: C.Necator DMS 545 đã sinh trưởng
lên tới 68,8g CDW/L với môi trường sử dụng nguồn carbon là glycerol [11]. Các tế
bào có khả năng tích lũy PHB tới 38% khối lượng khô của tế bào , với năng suất
0,84 g/L/h. Khi hạn chế lượng nitơ,hiệu suất chuyển hóa glycerol thành PHB có thể
được tăng lên đến 1,1 g / L/h với 50% PHB được tích lũy trong các tế bào khô [11].
Con đường sinh tổng hợp PHA từ các nguồn carbon là glycerol có thể được
tóm tắt như trong hình 1.2
16
Khóa luận tốt nghiệp Vũ Hồng Vân
Hình 1.3: Sơ đồ quá trình sinh tổng hợp PHB ở vi khuẩn khi sử dụng nguồn

17
Khóa luận tốt nghiệp Vũ Hồng Vân
carbon là glycerol .
Trước tiên, Glycerol đi vào tế bào vi khuẩn bằng một quá trình khuếch tán thụ
động được xúc tác bởi một protein tách rời màng tế bào [32]. Dưới tác động của
enzyme glycerol kinase, glycerol sẽ chuyển đổi thành glycerol-3-phosphate, sau đó bị
oxi hóa bởi enzyme glycerol-3-phosphate dehydrogenase tạo ra dihydroxyaceton
phosphate. Dihydroxyaceton phosphate sẽ đi vào quá trình đường phân để tạo ra
pyruvate. Các pyruvate này bị oxi hóa dưới tác dụng của enzyme pyruvate
dehydrogenase để tạo ra Acetyl-CoA sử dụng cho quá trình tích lũy PHB của vi khuẩn.
18
Khóa luận tốt nghiệp Vũ Hồng Vân
CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1 Đối tượng
Các chủng vi khuẩn được phân lập từ đất rừng ngập mặn ở huyện Yên Hưng,
tỉnh Quảng Ninh. Các chủng vi khuẩn này được lưu giữ trong bộ sưu tập giống vi
sinh vật rừng ngập mặn tại Bộ môn CNSH – Vi sinh, khoa Sinh học, trường Đại học
Sư phạm Hà Nội.
2.1.2. Hóa chất
Các hóa chất pha chế môi trường (bảng 2.1) và một số hóa chất khác: ethanol
(Merck, Đức), methanol (Merck), chloroform (Merck, Đức), H
2
SO
4
(Merck, Đức),
glycerol,
Bảng 2.1: Công thức của các loại môi trường sử dụng trong nghiên cứu
STT Thành phần
Môi trường hoạt

hóa - MPA (g/l)
Môi trường sản
xuât PHA-MA (g/l)
1
NaCl
30 40
2
MgSO
4
.7H
2
O
- 0.25
3
CaCl
2
.2H
2
O
- 0.09
4
KCl
- 0.5
5
KBr
- 0.06
6
KH
2
PO

4
- 0.25
7
Pepton
5 -
8
Cao nấm men
- 2
10
Glycerol
- 20
11 Cao thịt 5 -
Ghi chú: Các thành phần môi trường được hòa tan trong 1000ml nước cất, pH
của môi trường được điều chỉnh đến 7 bằng dung dich NaOH 5M và HCl 5M. Môi trường
đặc được bổ sung 2% agar (20 g/l).
2.1.3. Dụng cụ và thiết bị
Tủ ấm, tủ sấy (Binder, Đức); nồi hấp thanh trùng (Tommy, Nhật); máy đo pH
(MP200R, Thụy Sĩ); máy ly tâm (Sorvall, Mỹ), cân phân tích (Pracisa XT 320M,
19
Khóa luận tốt nghiệp Vũ Hồng Vân
Thụy Sỹ), máy lắc ổn nhiệt (BR300LF, Nhật), và các dụng cụ thông dụng khác của
phòng CNSH- Vi Sinh, khoa sinh học, Đại Học Sư Phạm Hà Nội.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Phương pháp thu mẫu [4]
Các mẫu đất được lấy ở lớp đất bề mặt ở các vị trí khác nhau. Mỗi mấu đất lấy
khoảng 30g cho vào túi nilon đã vô trùng, trên túi ghi rõ địa điểm thu mẫu và độ sâu
lấy mẫu. Mẫu được bảo quản trong đá lạnh và chuyển về phòng thí nghiệm, bảo quản ở
nhiệt độ 4-5
o
C và tiến hành phân lập ngay trong 48h.

2.2.2 Phương pháp phân lập [4]
Cân 1g đất cho vào bình tam giác chứa 49ml nước biển đã thanh trùng, trộn đều
hỗn hợp bằng máy votex. Dùng pipette hút 1ml dịch đất này chuyển sang ống nghiệm
chữa sẵn 9ml nước biển đã thanh trùng, trộn đều, được dịch đất có độ pha loãng 0.2x10
-2
.
Thao tác tương tự với ống nghiệm thứ 2, thu được dịch đất có độ pha loãng 0.2x10
-3
.
Dùng pipette hút 100µl dịch đất có độ pha loãng 0.2x10
-2
và 0.2x10
-3
nhỏ lên bề mặt
thạch trong hộp petri chứa môi trường phân lập, trang đều dịch đất trên bề mặt thạch, sau
đó gói các hộp petri lại và đặt trong tủ ấm 32-35
o
C. Sau 24 - 48h khi vi khuẩn đã mọc
tốt, lựa chọn trên hộp petri phân lập các khuẩn lạc mọc riêng rẽ để cấy sang hộp petri giữ
giống chứa môi trường MPA đặc. Với mỗi khuẩn lạc, dùng một que tăm nhọn đã sấy vô
trùng lấy 1 lượng nhỏ vi khuẩn, cấy lên một ô vuông đã đánh số trên hộp petri giữ giống,
như vậy ô số sẽ tương ứng với một chủng vi khuẩn phân lập được.
2.2.3. Phương pháp giữ giống vi khuẩn [4]
2.2.3.1. Phương pháp cấy truyền định kỳ
Tiến hành cấy truyền các chủng vi khuẩn giống định kỳ 1 - 2 tuần một lần
trên ống nghiệm thạch nghiêng chứa môi trường MPA, đặt trong tủ ấm 35ºC , sau 1
ngày khi vi khuẩn đã mọc tốt thì chuyển sang giữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4
o
C.
2.2.3.2. Phương pháp lạnh đông bằng 15% glycerol

Nuôi cấy các chủng vi khuẩn giống trên môi trường MPA đặc đến khi mọc
tốt, dùng que cấy lấy một ít vi khuẩn cho vào eppendorf có chứa sẵn 1ml dịch 15%
glycerol vô trùng, ghi tên chủng vào eppendorf, bọc kín miệng eppendorf bằng
parafilm và giữ trong tủ lạnh -80ºC.
20
Khóa luận tốt nghiệp Vũ Hồng Vân
2.2.4 Phương pháp mô tả hình thái khuẩn lạc, tế bào vi khuẩn [4]
Cấy vi khuẩn theo hình dic dắc trên môi trường MPA đặc, để trong tủ 35
o
C
trong 24h để vi khuẩn mọc thành khuẩn lạc. Quan sát, lựa chọn các khuẩn lạc mọc
riêng rẽ mô tả các đặc điểm hình thái của khuẩn lạc. Làm tiêu bản nhuộm Gram,
nhuộm đơn, quan sát và mô tả đặc điểm hình thái tế bào của chủng vi khuẩn được
tuyển chọn trên kính hiển vi quang học.
2.2.5 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn có tích lũy PHA bằng thuốc
nhuộm Nile blue A để phát hiện các hạt dự trữ [1].
Chuẩn bị môi trường MPA đặc có bổ sung 0.5µg/ml dung dịch thuốc nhuộm
Nile blue A tan trong DMSO (Dimethylsulfoxide), chia đều môi trường vào các hộp
petri. Cấy chuyển vi khuẩn từ hộp Petri giữ giống sang hộp Petri chứa môi trường
có thuốc nhuộm đã được đánh số tương ứng, đặt các hộp Petri này trong tủ ấm 32-
35
O
C. Sau 24- 48h khi vi khuẩn đã mọc tốt, soi các hộp Petri này dưới tia UV bước
sóng 254nm và quan sát, phát hiện các chủng vi khuẩn phát huỳnh quang màu vàng
cam sáng (bright orange) [25].
2.2.6 Phương pháp lên men thu sinh khối khô của tế bào [7]
Chuẩn bị môi trường MA lỏng theo công thức bảng 2.1, bổ sung 5% (v/v)
giống vi khuẩn đã hoạt hóa 13 -15h vào trong bình tam giác100 chứa 25ml môi
trường trên. Đặt các bình tam giác trong tủ lắc 180 vòng/phút ở nhiệt độ 35
o

C trong
30h. Thu mẫu và xác định khối lượng khô của tế bào (CDW) các bước: mỗi mẫu thí
nghiệm chuẩn bị 3 ependorf 2ml đã được đánh số thứ tự, sấy khô đến khối lượng
không đổi sau đó cân chính xác khối lượng m
o
(g) của từng ependorf, hút 1.5ml dịch
nuôi cấy cho vào các ependorf trên, li tâm 13000 vòng trong 5 phút, giữ lại sinh
khối tế bào, rửa sinh khối một lần bằng nước cất, sấy khô ependorf chứa sinh khối
đến khối lượng không đổi sau đó cân ependorf lần 2 để xác định giá trị m (g). Tính
khối lượng khô của tế bào (CDW) theo công thức: CDW= (m-m
o
) x 1000/1.5 (g/l).
Sinh khối khô của tế bào trong mỗi mẫu thí nghiệm được giữ lại để phân tích hàm
lượng PHA tích lũy.
2.2.7 Phương pháp sắc ký khí, phân tích hàm lượng PHA trong tế bào vi khuẩn [1]
Cân khoảng 10mg sinh khối khô của tế bào rồi trộn với 1ml dung dịch
methanol chứa 15% (v/v) axit sulfuric + 0.4% (w/v) axit benzoic và 1ml dung dịch
21
Khóa luận tốt nghiệp Vũ Hồng Vân
chloroform. Thủy phân hỗn dịch trên ở 100
o
C trong 3h để chuyển hóa toàn bộ các
thành phần trong tế bào thành các methylester. Hỗn dịch sau đó được để nguội ở
nhiệt độ phòng rồi bổ sung 0.5ml nước khử ion, trộn đều hỗn dịch trên bằng mấy
vortex trong 30s-1 phút sau đó để hỗn dịch tự lắng. Dịch chloroform ở pha dưới hòa
tan các methylester được chuyển sang một ống nghiệm mới để tiến hành phân tích
hàm lượng PHA tích lũy trong tế bào bằng hệ thống sắc ký khí (GC). Mẫu PHA tinh
sạch của công ty Sigma được sử dụng để xây dựng đồ thì chuẩn [17].
2.2.8. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố dinh dưỡng đến khả
năng sinh trưởng, phát triển của các chủng vi khuẩn tuyển chọn [6]

2.2.8.1. Hoạt hoá chủng nghiên cứu
Cấy chủng vi khuẩn trên môi trường MPA đặc ở nhiệt độ 35ºC trong 24h, cấy
chuyển sang môi trường MPA lỏng, nuôi trong máy lắc với tốc độ 180 vòng/phút ở
nhiệt độ 35ºC trong 13-15h, lúc này chủng vi khuẩn đã được hoạt hóa xong (giống
vi khuẩn) sẵn sàng sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. Các thí nghiệm được lặp
lại 2 lần và lấy kết quả trung bình.
2.2.8.2. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến sự sinh trưởng
của chủng vi khuẩn được chọn [6]
Bổ sung 5% (v/v) giống vi khuẩn được chọn đã hoạt hóa sau 13-15h vào trong
các bình tam giác chứa 25ml môi trường MA lỏng với các nồng độ NaCl khác nhau
(g/l): 0, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 nuôi trong tủ lắc với tốc độ 180
vòng/phút ở nhiệt độ 35
o
C trong 30h. Thu dịch nuôi cấy, pha loãng 10 lần, đo mật độ
quang (OD) ở bước sóng 600nm. Dựa vào kết quả thu được để đánh giá sự ảnh hưởng
của hàm lượng NaCl đến sự sinh trưởng của chủng vi khuẩn nghiên cứu.
2.2.8.3 Ảnh hưởng của pH [6]
Chuẩn bị môi trường MA lỏng có nồng độ 4% NaCl, 2% (w/v) nguồn carbon
là glycerol và có độ pH khác nhau 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8 . Bổ sung 5% (v/v) giống vi
khuẩn vào các bình tam giác 100 ml chứa 25 ml môi trường trên, nuôi lắc 180
vòng/phút ở nhiệt độ 35ºC trong 30h. Xác định mật độ quang ở bước sóng 600nm
để thấy được sự sinh trưởng và phát triển của chủng tuyển chọn.
22
Khóa luận tốt nghiệp Vũ Hồng Vân
2.2.8.4. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn nitơ khác nhau đến sự
sinh trưởng của các chủng vi khuẩn được chọn [Error: Reference source not
found]
Bổ sung 5% (v/v) giống vi khuẩn đã hoạt hóa 13-15h vào trong bình tam giác
chứa 25ml môi trường MA lỏng có nồng độ 40g/l NaCl với các nguồn nitơ khác
nhau (2g/l): cao men, NH

4
Cl, (NH
4
)
2
SO
4
, NH
4
HCO
3
, NH
4
NO
3
, KNO
3
, NaNO
3,
ure
nuôi trong tủ lắc với tốc độ 180 vòng/phút ở nhiệt độ 35
o
C trong 30h. Thu sinh khối
khô (CDW) và xác định hàm lượng PHA tích lũy của các chủng vi khuẩn được chọn.
2.2.9 Phương pháp lên men trong nồi lên men
Hoạt hóa giống trên môi trường đặc: lấy ống nghiệm chứa giống, cấy giống
theo kiểu díc dắc trên hộp lồng chứa môi trường MPA 4% NaCl ủ ở 35
0
C trong 24h.
Nhân giống cấp 1: Lấy giống đã được hoạt hóa trên môi trường đặc cấy vào

bình tam giác 250ml có chứa 50ml môi trường MPA dạng lỏng, đem nuôi lắc ở
32
o
C - 35
0
C với tốc độ 180 vòng/phút trong 13-15h.
Lên men: Cho toàn bộ giống cấp 1 vào nồi lên men chứa môi trường MA. Nuôi
lắc 24h ở 35
0
C với tốc độ lắc 200 vòng/phút, pH 7.
Trong quá trình lên men: kiểm tra điều chỉnh pH luôn ở giá trị 7, nhiệt độ
luôn ở giá trị 35
o
C trong nồi lên men. Cách 6h thu mẫu 1 lần, ly tâm thu sinh khối,
đo OD kiểm tra mật độ tế bào. Sau 24h, cứ 3h thu sinh khối 1 lần.
23
Khóa luận tốt nghiệp Vũ Hồng Vân
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Kết quả phân lập và tuyển chọn
Từ những mẫu đất rừng ngập mặn huyện Yên Hưng, tỉnh Quảng Ninh chúng
tôi đã tiến hành phân lập được hơn 200 chủng vi khuẩn, từ các chủng đó chúng tôi
đã tuyển chọn được 17 chủng vi khuẩn có khả năng tích lũy PHA bằng phương
pháp nhuộm với Nile Blue, ký hiệu lần lượt là 31, 32, 38, 56, 57, 58, 74, 75, 84, 85,
91, 94, 97, 98, 123, 124, 129. Sau đó chúng tôi đã tiến hành làm thí nghiệm nuôi
cấy, lên men, thu sinh khối, thủy phân và sắc ký khí phân tích PHA 17 chủng này
trên môi trường MA có nguồn carbon là glycerol ở 30
o
C và 35
o
C chúng tôi thu được

kết quả như sau:
 Ở 30
o
C trên môi trường có nguồn carbon là Glycerol sự sinh trưởng, phát triển và
tích lũy PHA được thể hiện ở hình 3.1
Hình 3.1 Đồ thị thể hiện khả năng sinh trưởng, phát triên và tích lũy PHBV của 17
chủng khi nuôi cấy trên môi trường MA sử dụng nguồn carbon là glycerol ở 30
o
C
24
Khóa luận tốt nghiệp Vũ Hồng Vân
 Ở 35
o
C trên môi trường MA có nguồn carbon là glycerol sự sinh trưởng, phát triển
của các chủng được thể hiện ở hình 3.2
Hình 3.2 Đồ thị thể hiện khả năng sinh trưởng và phát triển của 17 chủng khi nuôi
cấy trên môi trường có nguồn carbon là Glycerol ở 35°C
Chúng tôi nhận thấy các chủng đều có khả năng sinh trưởng phát triển và
tích lũy PHA ở nhiệt độ 30
o
C (Hình 3.1). Các chủng 32, 56, 75 có khả năng sinh
trưởng tốt khối lượng tế bào khô của các chủng này lần lượt là 3.38, 2.25, 2 g/l.
Đồng thời khả năng sinh trưởng ba chủng của 32, 56, 75 ở nhiệt độ 35
o
C của các
chủng này nhìn chung là cao so với các chủng khác lần lượt là 2.75, 2.63, 2.58 g/l.
Bên cạnh đó 3 chủng này có khả năng tích lũy PHBV ở 30
o
C. Trong công nghệ lên
men việc tăng nhiệt độ môi trường thường dễ dàng và đỡ tốn kém hơn so với việc

giảm nhiệt độ môi trường, chính vì vậy người ta thường chọn các chủng phát triển
tốt ở nhiệt độ 35-40
o
C. Chính vì vậy chúng tôi đã lựa chọn 3 chủng 32, 56, 75 để
tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
25