Nghiên cứu một số giải pháp sinh học trong công nghệ sản xuất nem chua

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI



Phan Thanh Tâm




NGHIÊN CỨU MỘT SỐ GIẢI PHÁP
SINH HỌC TRONG CÔNG NGHỆ
SẢN XUẤT NEM CHUA


Chuyên ngành: Công nghệ chế biến thực phẩm và đồ
uống
Mã số: 62.54.02.01


TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT

HÀ NỘI - 2008

Công trình được hoàn thành tại:
Bộ môn Công nghệ Thực phẩm - Công nghệ Sau thu hoạch
Viện Công nghệ Sinh học - Công nghệ Thực phẩm
Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội



Người hướng dẫn khoa học:
1. GS.TS Hoàng Đình Hòa
2. PGS.TS Phạm Công Thành



Phản biện 1: GS.TS Nguyễn Thành Đạt - Trường ĐH Sư phạm HN
Phản biện 2: PGS.TS Nguyễn Thị Hoài Trâm - Viện Công nghiệp
Thực phẩm
Phản biện 3: PGS.TS Hà Thị Anh Đào - Viện Dinh dưỡng Quốc gia



Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Nhà nước
họp tại Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội

Vào hồi ….giờ … ngày … tháng … năm 2008




Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Quốc gia
- Thư viện Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN
QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

1. Phan Thanh Tam, (2003). “Study on effects of carbonhydrate‘s content
and source on lactic fermentation and sausages qualities”. Proceedings
of the 8
th
Asean Food Conference (AFC 03), Vol 2, p679 - 684.
2. Phan Thanh Tam, Ha Hai Yen, Do Thi Hanh, Tran Lien Ha, (2005).
”Study on the Antimicrobial Activity of Lactic Acid Bacteria Isolated
from nem chua (Vietnamese Fermented Meat)”. Proceedings of
Regional Symposium on Chemical Engineering 2005, Science and
Technics Publishing House, Vol 1: Biotechnology and Food
Engineering, p115-120.
3. Phan Thanh Tam, Do Thi Hanh, Tran Lien Ha, Hoang Dinh Hoa,
(2005). “Isolation and characterization of Lactobacillus plantarum
H1.40, from Vietnamese tradition fermented meat (nem chua)”.
Proceedings of Regional Symposium on Chemical Engineering 2005,
Science and Technics Publishing House, Vol 1: Biotechnology and
Food Engineering, p121-126.
4. Hoàng Đình Hòa, Phan Thanh Tâm, Phạm Thị Thu Hiền, (2006).

“Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của các chế phẩm từ tỏi (Allium
sativum) nhằm ứng dụng để bảo quản thực phẩm”. Tuyển tập Hội nghị
khoa học lần thứ 20 Trường ĐHBK Hà Nội, Phân ban Công nghệ Sinh
học - Công nghệ Thực phẩm, trang 120 -125.
5. Phan Thanh Tâm, Phạm Công Thành, Phạm Thị Thu Hiền, (2006).
“Nghiên cứu ứng dụng các chế phẩm tỏi trong công nghệ sản xuất nem
chua nhằm nâng cao chất lượng và kéo dài thời gian bảo quản”. Tuyển
tập Hội nghị khoa học lần thứ 20 Trường ĐHBK Hà Nội, Phân ban
Công nghệ Sinh học - Công nghệ Thực phẩm, trang 224 -229.
6. Phan Thanh Tâm, Chử Thị Mai Phương, (2007). “Nghiên cứu tối ưu
hóa các điều kiện sinh tổng hợp bacterioxin của chủng Lactobacillus
plantarum H1.40 và các đặc tính của chúng”. Tạp chí Khoa học và
Công nghệ các Trường đại học kỹ thuật, số 61, trang 107-112.
7. Phan Thanh Tâm, Phạm Công Thành, (2007). ”Khảo sát các yếu tố
công nghệ ảnh hưởng đến chất lượng nem chua”. Tạp chí Khoa học và
Công nghệ các Trường đại học kỹ thuật, số 62, trang 76 - 81.
8. Hoàng Đình Hòa, Phan Thanh Tâm, (2008). “Tuyển chọn chủng vi
khuẩn lactic có hoạt tính thuỷ phân protein thịt cao nhằm ứng dụng
trong công nghệ sản xuất nem chua”. Tạp chí Khoa học và Công nghệ
các Trường đại học kỹ thuật, số 64, trang 95 -100.
9. Phan Thanh Tâm, Vũ Thị Nga, (2008). “Tuyển chọn chủng vi khuẩn
lactic có đặc tính probiotic nhằm ứng dụng trong công nghệ sản xuất
nem chua”. Tạp chí Khoa học và Công nghệ các Trường đại học kỹ
thuật, số 65, trang 105 - 109.

1

A. ĐẶC ĐIỂM CỦA LUẬN ÁN
1. Tính cấp thiết của đề tài
Các món ăn truyền thống dân tộc đang dần dần bị mai một do qui trình công nghệ

sản xuất thủ công, không đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm. Trong số đó sản phẩm
thịt lên men truyền thống “ nem chua “ hiện đang ở mức báo động về chất lượng do sự
ô nhiễm vi sinh vật cũng như sự lạm dụng các hóa chất bảo quản gây nguy hại đến sức
khỏe người tiêu dùng. Thêm vào đó hiện vẫn chưa có những tiêu chuẩn cụ thể để
kiểm soát chất lượng cho nhóm sản phẩm này.




Hiện nay trên thế giới ngày càng quan tâm đến việc ứng dụng các thành phần
kháng khuẩn có bản chất tự nhiên (Natural food antimicrobial systems) để nâng cao
tính an toàn cho các sản phẩm thực phẩm, tuy nhiên ở Việt Nam vấn đề này gần như
còn rất mới mẻ. Chính vì vậy việc tìm ra các giải pháp như tuyển chọn bộ chủng
giống vi sinh vật có khả năng ức chế nhóm vi sinh vật gây hại, có khả năng lên men
tốt, kết hợp với nguồn kháng khuẩn từ thực vật thay thế cho các hóa chất bảo quản độc
hại để nâng cao chất lượng, kéo dài thời gian bảo quản cho nhóm sản phẩm này là hết
sức cần thiết.


2. Mục tiêu của đề tài
- Tuyển chọn bộ giống vi sinh vật có khả năng lên men lactic nem chua tốt,
sinh tổng hợp bacterioxin cao, thủy phân protein thịt tốt và đồng thời đóng
vai trò như nguồn cung cấp probiotic cho cơ thể. Kết hợp với nguồn kháng
khuẩn từ tỏi nhằm nâng cao chất lượng và VSATTP cho sản phẩm này.
- Xây dựng qui trình công nghệ sản xuất nem chua an toàn, có tính khả thi cao,
dễ dàng áp dụng ở qui mô sản xuất vừa và nhỏ.
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
Các sản phẩm nem chua nổi tiếng ở một số vùng miền trên cả nước được tiến
hành khảo sát chất lượng và phân lập tuyển chọn nguồn vi khuẩn lactic có đặc tính tốt.
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của các chế phẩm tỏi được thu nhận từ cùng

một giống tỏi trắng (Allium sativum) hiện đang được trồng phổ biến ở trong nước.
Phạm vi áp dụng đề tài: nâng cao chất lượng cho sản phẩm nem chua (thịt lên
men) ở mọi vùng miền trên cả nước, dễ dàng áp dụng ở qui mô sản xuất nhỏ, vừa, và
công nghiệp .
2

4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
 Đã đưa ra những cảnh báo ban đầu về sự mất vệ sinh an toàn thực phẩm của sản
phẩm nem chua trên thị trường. Đó là sự ô nhiễm vi sinh vật và hàm lượng hóa
chất bảo quản quá cao, ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng.
 Đã nghiên cứu tìm ra các giải pháp, đặc biệt ứng dụng công nghệ sinh học như tìm
được hỗn hợp chủng giống vi khuẩn lactic với các đặc tính sinh học tốt giúp định
hướng quá trình lên men và kiểm soát được chất lượng. Nguồn các hợp chất
kháng khuẩn có bản chất từ thực vật (tỏi) cũng đã được khai thác sử dụng có hiệu
quả. Kết quả nghiên cứu một lần nữa đã chứng minh rằng trong chế biến thực
phẩm không cần gia nhiệt vẫn có thể thực hiện được các qui trình sản xuất sạch và
an toàn.
 Là công trình nghiên cứu tổng thể về quá trình công nghệ sản xuất nem chua, giải
quyết trọn vẹn vấn đề từ khâu chủng giống đến khâu bảo quản sản phẩm và cuối
cùng đề xuất một qui trình khả thi về sản xuất nem chua “an toàn “. Làm phong
phú thêm khả năng ứng dụng của các chủng vi khuẩn lactic.
 Kết quả của đề tài là sự đóng góp tích cực trong việc xây dựng tiêu chuẩn đánh giá
chất lượng cụ thể cho nhóm sản phẩm thịt lên men nói riêng và nhóm sản phẩm
thực phẩm giàu protein lên men nói chung.
5. Những điểm mới của luận án
 Sản xuất được chế phẩm từ tập hợp các chủng vi khuẩn lactic bản địa có hoạt tính
sinh học tốt: sinh tổng hợp bacterioxin có tính kháng khuẩn tốt; có hoạt tính
proteaza cao và hoạt tính probiotic để ứng dụng vào sản xuất nem chua.
 Đã tìm được nồng độ ức chế tối thiểu (MIC - Minimum Inhibit Concentrate) của
ba chế phẩm tỏi đối với các vi sinh vật gây bệnh và ứng dụng có hiệu quả vào

sản xuất nem chua.
 Là công trình nghiên cứu có hệ thống các cơ sở khoa học cho sản xuất nem chua
truyền thống ở Việt Nam nhằm nâng cao chất lượng, đảm bảo VSATTP và kéo
dài thời gian sử dụng cho sản phẩm. Kết quả góp phần đề xuất qui trình sản xuất
“nem chua an toàn” dễ dàng áp dụng ở các cơ sở sản xuất vừa và nhỏ.
6. Nội dung nghiên cứu:
1. Khảo sát đánh giá thực trạng chất lượng nem chua về thành phần hóa
học, thành phần dinh dưỡng và vệ sinh an toàn thực phẩm.
3

2. Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi khuẩn lactic phân lập từ nem chua có các
hoạt tính sinh học tốt: sinh tổng hợp hợp chất kháng khuẩn bacterioxin, có
hoạt tính proteaza cao và tiềm năng probiotic nhằm ứng dụng làm chủng
giống trong công nghệ sản xuất nem chua
3. Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của các chế phẩm từ tỏi và ứng dụng
trong công nghệ sản xuất nem chua.
4. Nghiên cứu xây dựng qui trình công nghệ sản xuất nem chua ứng dụng chế
phẩm vi khuẩn lactic có hoạt tính sinh học tốt, chế phẩm tỏi và tối ưu các yếu
tố công nghệ nhằm nâng cao chất lượng và đảm bảo VSATTP.
7. Cấu trúc của luận án
Luận án được trình bày trong 167 trang đánh máy gồm 3 chương với 52 bảng, 82
hình, đồ thị. Phần kết luận, 149 tài liệu tham khảo, phụ lục.
B. NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN
Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Thịt lên men và nem chua: Phân loại; Những biến đổi và sự chuyển hóa xảy ra
trong quá trình lên men thịt; Nem chua sản phẩm thịt lên men nổi tiếng Việt Nam và
thực trạng vấn đề VSATTP của sản phẩm.
1.2. Các giải pháp nâng cao chất lượng sản phẩm thịt lên men và nem chua
1.2.1. Ảnh hưởng các yếu tố công nghệ đến chất lượng sản phẩm thịt lên men, nem
chua và giải pháp tối ưu các yếu tố

1.2.2. Giải pháp sử dụng vi khuẩn lactic có hoạt tính sinh học tốt trong công nghệ
sản xuất thịt lên men và nem chua
Sử dụng bộ chủng giống vi sinh vật có lợi; vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng
hợp bacterioxin; vi khuẩn lactic có hoạt tính proteaza cao thuỷ phân protein thịt tốt; vai
trò probiotic của vi khuẩn lactic và ứng dụng trong thịt lên men; Sản xuất chế phẩm vi
khuẩn lactic ứng dụng trong sản xuất thịt lên men.
1.2.3. Sử dụng tỏi - chất kháng khuẩn thực vật
1.2.4. Tình hình nghiên cứu, sản xuất và nâng cao chất lượng nhóm sản phẩm thịt
lên men, nem chua trong nước và quốc tế
1.3. Từ những dẫn liệu lý thuyết và kết quả nghiên cứu trên, có thể rút ra các
nhận xét sau:
4

- Thịt lên men là hỗn hợp các cấu tử rắn và không thể thanh trùng trước khi lên
men, trong khi đó thịt là nguồn nguyên liệu có khả năng ô nhiễm rất cao đặc biệt trong
bối cảnh giết mổ vận chuyển bảo quản thủ công như hiện nay ở Việt Nam. Nem chua
là sản phẩm thịt lên men nhanh không qua quá trình xứ lý nhiệt nên nguy cơ mất
VSATTP của sản phẩm này là rất cao.
- Lựa chọn bộ chủng giống vi khuẩn có khả năng kháng khuẩn cao, thuỷ phân
protein thịt tốt, có hoạt tính probiotic cùng với nguồn các hợp chất kháng khuẩn từ tỏi
để định hướng quá trình lên men, nâng cao chất lượng sản phẩm nem chua là việc làm
rất cần thiết. Thêm vào đó việc nghiên cứu ảnh hưởng đồng thời của các yếu tố công
nghệ đến các chỉ tiêu chất lượng sản phẩm thông qua bài toán qui hoạch thực nghiệm
để từ đó tìm được các yếu tố cho chất lượng sản phẩm tốt nhất là một lời giải hết sức
có ý nghĩa và có tính khả thi trong điều kiện hiện tại.
Chương 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1. Nguyên vật liệu
Các mẫu nem chua dùng để phân lập vi khuẩn lactic cũng như để xác định thành
phần hóa học, thành phần dinh dưỡng và vi sinh vật được thu thập từ một số cơ sở sản

xuất có uy tín ở Hà Nội, thành phố Hồ Chí Minh, Thanh Hoá, và Vinh.
Nguyên liệu tỏi được nghiên cứu là giống tỏi trắng hiện được trồng phổ biến
ở Việt Nam. Bao bì PE sản xuất trong nước, sẵn có trên thị trường.
Các chủng vi khuẩn chỉ thị: Lactobacillus plantarum JCM 1149 (Bộ sưu tập
giống của Nhật Bản), Chủng Lactococcus lactis subsp. lactis ATCC 11454 (Bộ sưu
tập giống của Mỹ) có khả năng sinh tổng hợp nisin [84]; Staphylococcus aureus
ATCC 25923; Bacillus cereus ATCC10876; Listeria monocytogens 0704 (ĐH
Toulouse, Pháp); Ercherichia coli K12TG1 (Đại Học ENSBANA - Pháp);
Salmonella typhimurium VSDTTW (Viện Vệ sinh dịch tễ TW).
2.1.2. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật: MRS (Man Rogosa Sharpe), MPA (Meat Pepton
Agar), OGYA (Oxytetracycline Glucose Yeast Agar); Staphylococcus aureus 110
(Difco); VRBGA (Violet Red Bile Glucose Agar); Glucoza Agar; …
2.1.2. Thiết bị
Nồi khử trùng, tủ cấy, tủ nuôi yếm khí (Nhật); tủ lạnh sâu (Nhật); Kính hiển
vi điện tử quét SEM: JCM- 4510LV (Nhật); Ly tâm lạnh ống to Sorvall Super
T21 (Mỹ); Máy so màu quang phổ (Anh); Sấy chân không Vacutherm Heraeus
5

(Đức); Sắc ký lỏng cao áp HPLC Watters (Mỹ); Sắc ký khối phổ GC-MS2010
Shimadzu (Nhật); Thiết bị đo cấu trúc Texture Analysis RTC 1250 (Nhật),
2.2. Phương pháp
2.2.1. Phương pháp vi sinh học
- Các phương pháp nghiên cứu vi sinh vật thông dụng.
Xác định số lượng Enterobacteriaceae theo phương pháp chuẩn F18 của Anh [77]; Số
lượng S. aureus theo phương pháp PCR theo [88], [94]. Xác định vi sinh vật gây bệnh
khác Coliform:TCVN 4883:1993; E. coli: TCVN 6846:2001; B.
cereus: TQBYT 3350:2001; C. perfringens: TCVN 4991:1989;
S. aureus: TCVN 4830:1989.
- Các phương pháp xác định khả năng kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn lactic:
cấy chấm điểm; khuếch tán thạch [51].

- Tuyển chọn chủng có khả năng thuỷ phân protein sợi cơ và protein chất cơ thịt
[68], [106].
- Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic chịu được axit và muối mật, sống sót cao trong
môi trường axit cao và nghèo dinh dưỡng [122].
- Xác định hoạt lực của bacterioxin và khả năng kháng khuẩn của các chế phẩm từ
tỏi bằng phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) [51].
2.2.2. Phương pháp hóa lý, hóa sinh
- Phân tích thành phần hóa học, thành phần dinh dưỡng theo TCVN; …
- Xác định hàm lượng nitrit trong nem chua theo AOAC 937.31; xác định nitrat
theo TCVN 5247-1990.
- Xác định hàm lượng axit amin tự do theo phương pháp đo mầu trực tiếp với
ninhydrin [5].
- Đo cấu trúc (độ chắc) các mẫu nem chua bằng thiết bị đo cấu trúc Texture Analysis
RTC 1250 (Nhật) với đầu đo Spherical Probes loại P/5S [63].
- Xác định hàm lượng histamin trong dịch nuôi cấy vi khuẩn và trong nem chua bằng
HPLC theo phương pháp [3], [59], [63].
- Xác định thành phần các hợp chất kháng khuẩn của tỏi bằng GC-MS và HPLC theo
phương pháp của Lawson [20], [93], [110].
2.2.3. Phương pháp toán học thực nghiệm: theo ma trận trực giao cấp 2, kết quả
được xử lý bằng phần mềm Nemrod 2000 và Design Experd 7.1.3.
2.2.4. Phương pháp đánh giá cảm quan: theo phương pháp cho điểm chất lượng
tổng hợp của sản phẩm theo TCVN 3215-79 [26].
6

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Khảo sát đánh giá thực trạng chất lượng nem chua về thành phần
hóa học, thành phần dinh dưỡng và vệ sinh an toàn thực phẩm
3.1.1. Thành phần hóa học, thành phần dinh dưỡng các mẫu nem chua
Tiến hành khảo sát 10 mẫu nem chua ở các thành phố lớn như Hà Nội, Thanh
Hóa, Vinh và TP Hồ Chí Minh. Kết quả cho thấy hàm ẩm đa số các mẫu nem chua

đều rất cao từ 62,83 - 71,01% cho thấy nem chua là sản phẩm thịt lên men nhanh và
có hàm ẩm cao nên việc kiểm soát chất lượng sản phẩm này là không hề dễ dàng.
Hàm lượng protein tổng số: 18,61 - 22,42%; Lipit: 2,61- 4,48 %; Gluxit:1,87 - 5,91
%; axit amin tự do: 259,33 - 368,63 mg/ 100g cho thấy quá trình lên men tạo thành
các peptit và các axit amin dễ tiêu hóa hơn và tạo nên mùi vị đặc trưng cho sản phẩm;
đạm amoniac NH
3
: 31,63 - 40,60 mg/ 100g sản phẩm, là chỉ tiêu gián tiếp đánh giá
quá trình lên men không mong muốn bởi các vi sinh vật có hại. Kết quả cho thấy nem
chua có thành phần dinh dưỡng khá hài hòa, đặc biệt cung cấp một lượng axit amin tự
do khá cao nhờ quá trình thủy phân protein thịt.
3.1.2. Khảo sát một số chỉ tiêu vệ sinh an toàn thực phẩm các mẫu nem chua
3.1.2.1 Khảo sát hàm lượng muối bảo quản nitrat và nitrit trong các mẫu nem chua









Hình 3.1. Tổng hàm lượng muối nitrat, nitrit (tính theo nitrit) và muối
nitrit trong các mẫu nem chua (ppm)
HN1, HN2,HN3: Nem chua Hà Nội; Vinh: Nem chua ở Vinh-Nghệ An.
TH1, TH2,TH3:Nem chua Thanh Hoá; HCM1, HCM2:Nem chua TPHồ Chí Minh
NC: Nem chua nghiên cứu có sử dụng 365ppm NaN0
3
theo QĐ Bộ Y tế
7

Kết quả phân tích (hình 3.1) cho thấy tất cả các mẫu nem chua ở một số địa
phương lớn trong cả nước đều có hàm lượng muối nitrat, nitrit vượt quá nhiều lần
qui định cho phép hiện đang áp dụng ở Việt Nam và đa số các quốc gia khác. Mẫu
cao nhất có tổng lượng nitrat và nitrit tính theo nitrit là 1564 ppm gấp gần 10 lần
quy định của EU [63], [134] và 12 lần theo TCVN, trong đó riêng hàm lượng nitrit
là 683 ppm gấp 5 lần qui định EU và gấp gần 6 lần TCVN 7050-2002 [19].
3.1.2.2 Khảo sát thành phần một số loại vi sinh vật trong các mẫu nem chua
Kết quả 10/10 mẫu nem chua khảo sát ở các địa phương đều không đạt chỉ tiêu
về vi sinh vật, đặc biệt Enterobacteriaceae (10
4
-10
6
CFU/ g sản phẩm) và S. aureus
(10
3
- 10
5
CFU/ g sản phẩm) gấp vài chục đến hàng trăm lần cho phép theo tiêu chuẩn
hiện đang áp dụng ở một số nước như Ailen [71] hay Úc và Niuzilân [72].
3.2. Sản xuất chế phẩm vi khuẩn lactic từ nem chua có các đặc tính sinh học
tốt: sinh tổng hợp bacterioxin, có hoạt tính thủy phân protein thịt tốt, có tiềm
năng probiotic cao nhằm ứng dụng trong công nghệ sản xuất nem chua
3.2.1. Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic sinh tổng hợp bacterioxin
và đặc tính của chúng
3.2.1.1. Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic sinh tổng hợp bacterioxin
Từ 108 chủng vi khuẩn lactic phân lập từ nem chua có khả năng lên men lactic
tốt, sinh axit cao lựa chọn được 20 chủng có khả năng kháng cao với L. plantarum
JCM 1149. Trong số đó có 12 chủng có khả năng kháng cao với 5 loại vi sinh vật gây
bệnh: S. aureus ATCC 25923, S. typhimurium VSDTTW, L. monocytogen 0704, E.

coli K12TG1 và B. cereus ATCC 10876 theo phương pháp cấy chấm điểm. Bằng
phương pháp khuyếch tán thạch và loại trừ tác dụng của a xit, chỉ có 3 trong số đó có
khả năng kháng với một số vi sinh vật gây bệnh và chủng H1.40 có khả năng kháng
cao nhất với cả 5 loại vi sinh vật gây bệnh nói trên (thể hiện ở hình 3.2 đến 3.5).
Thí nghiệm khẳng định khả năng sinh bacterioxin (hình 3.8) của hai chủng
H1.40 và chủng L. lactis subsp. lactis ATCC 11454 (chủng trong ngân hàng giống
của Mỹ được khẳng định có sinh nisin) cho thấy dịch nuôi cấy có chứa các thành phần
kháng khuẩn của hai chủng này mất hoạt tính khi bị thuỷ phân bởi enzym proteaza K,
vì vậy có thể khẳng các thành phần kháng khuẩn này có bản chất là protein.
Ảnh tế bào và khuẩn lạc chủng H1.40 thể hiện hình 3.9 và 3.10 cho thấy tế bào
có hình dạng que, sắp xếp đôi hoặc chuỗi. Các đặc tính khác là: Gram (+), Catalaza
(-), Sinh khí lên men glucoza (-); Định tên bằng kit API 50CHL (BioMérieux, France)
cho thấy chủng H1.40 thuộc loài L. plantarum với độ tương đồng đạt 99,99%.
8



Hình 3.2. Hoạt tính kháng khuẩn của
chủng H1.40(1) và 11454(2) đối với
B. cereus ATCC 10876
Hình 3.3. Hoạt tính kháng khuẩn của
chủng H1.40(1) và 11454(2) đối với
S. aureus ATCC 25923


Hình 3.4. Hoạt tính kháng khuẩn của
chủng H1.40(1) và 11454(2) đối với
L. monocytogens 0704
Hình 3.5. Hoạt tính kháng khuẩn của
chủng H1.40(1) và 11454(2) đối với

E. coli K12TG1



Hình 3.8. Sự thuỷ phân bởi enzym
proteaza K đã làm mất hoạt tính
bacterioxin của 2 chủng H1.40 và
ATCC 11454
Ghi chú:1,2: Vòng kháng S. aureus của dịch
nuôi cấy chủng ATCC11454 và H1.40;
3,4: enzym proteaza K+ dịch nuôi cấy chủng
H1.40 và ATCC 11454 không có vòng
kháng với S. aureus
Đặc điểm khuẩn lạc và hình dạng tế bào của chủng H1.40


Hình 3.9. Khuẩn lạc chủng H1.40 Hình 3.10. Tế bào chủng H1.40 x 15.000
9

3.2.1.2. Động học quá trình sinh trưởng, lên men và sinh tổng bacterioxin của hai
chủng H1.40 và ATCC 11454
Hai chủng vi khuẩn lactic H1.40 và ATCC11454 được nuôi cấy trong môi
trường MRS lỏng, nhiệt độ 30
o
C. Động học sinh trưởng, khả năng lên men và sinh
tổng hợp bacterioxin được thể hiện các hình 3.13 và 3.14. cho thấy cả hai chủng đều
có khả năng lên men chuyển hóa tốt thể hiện pH môi trường đạt 3,6 -3,8 sau 40 giờ
nuôi cấy. Hoạt lực bacterioxin cả hai chủng đạt cao nhất ở cuối pha logarit, bắt đầu
chuyển sang pha cân bằng với chủng H1.40 là 384 AU/ml sau 24 giờ và chủng ATCC
11454 là 532 AU/ml sau 16 giờ nuôi cấy.

0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
0 8 16 24 32 40 48 56 64 72
Thời gian (h)
OD pH AU/ml
ODpH
AU/m
l
0
80
160
240
320
400
480
0
1.5
3.0
4.5
6.0
7.5
9.0
560

0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
0 8 16 24 32 40 48 56 64 72
Thời gian(h)
OD pH AU/ml
ODpH
AU/ml
0
80
160
240
320
400
480
0
1.5
3.0
4.5
6.0
7.5
9.0
560

Hình 3.13. Động học sinh trưởng,

khả năng lên men và sinh tổng hợp
bacterioxin của chủng H1.40
Hình 3.14. Động học sinh trưởng, khả
năng lên men và sinh tổng hợp
bacterioxin của chủng ATCC11454
3.2 1.3.Tối ưu hóa quá trình sinh tổng hợp bacterioxin chủng H1.40 và ATCC 11454
Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp bacterioxin của hai
chủng H1.40 và ATCC 11454 bằng ma trận Hadamard, và tiến hành tối ưu hóa bằng
ma trận thực nghiệm trực giao cấp 2. Kết quả xác định được điều kiện nuôi cấy tối ưu
sinh tổng hợp bacterioxin đối với chủng H1.40 là hàm lượng glucoza là 27 g/l, pH ban
đầu 7,5 và nhiệt độ nuôi cấy là 33
o
C và ở điều kiện này hoạt lực bacterioxin tăng lên:
547/384 = 1,42 lần. Đối với chủng ATCC11454 là hàm lượng peptone là 15 g/l, pH
ban đầu 6,5 và nhiệt độ nuôi cấy là 31
o
C, ở điều kiện này hoạt lực bacterioxin tăng lên:
678/532 = 1,27 lần.
3.2.1.4. Thu hồi bacterioxin hai chủng H1.40 và ATCC 11454 bằng kết tủa sunphat
amôn
Kết quả bảng 3.12 cho thấy nồng độ sunphat amôn thích hợp để thu hồi
bacterioxin cao nhất đối với chủng H1.40 là 60% và đối với chủng 11454 là 40% ( Kết
tủa được hòa vào dung dịch đệm pH = 6,0 với H1.40 và pH = 2,5 với chủng 11454).
10

Bảng 3.12. Ảnh hưởng của nồng độ sunphát amôn đến khả năng thu hồi
bacterioxin của 2 chủng H1.40 và ATCC 11454
Hoạt lực bacterioxin (AU/ml)
H1.40 ATCC11454
Nồng độ

sunfat amôn
bão hòa (%)
Kết tủa Dịch nổi Kết tủa Dịch nổi
40 0 456 618 0
50 288 176 372 188
60 512 0 250 372
70 232 232 188 434
80 120 344 0 587
3.2.1.5. Nghiên cứu một số đặc tính bacterioxin của hai chủng H1.40 và 11454
- Hoạt tính bacterioxin của cả hai chủng đều bền ở pH từ 2 đến 6, giảm một chút ở
pH 7 và giảm mạnh ở pH 8 và mất hẳn ở pH 9 và 10.
- Bacterioxin của cả hai chủng đều bền ở nhiệt độ 60
o
C - 80
o
C; ở 100 -121
o
C hoạt
tính bacterioxin giảm theo thời gian và gần như mất hẳn sau 30-60 phút.
- Khi bảo quản hoạt tính bacterioxin của cả hai chủng này đều rất bền ở -20
o
C, khá
bền ở 4
o
C và ít bền ở nhiệt độ 30
o
C.
- Môi trường NaCl 2% và NaNO
2
200ppm không ảnh hưởng đến khả năng sinh

tổng hợp bacterioxin của chủng H1.40 nhưng có ảnh hưởng ít nhiều đến chủng
ATCC 11454 (làm trễ thời gian sinh tổng hợp cao nhất của chủng) thể hiện ở hình
3.15 và 3.16
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
0 8 16 24 32 40 48 56 64 72
Thời gian (h)
OD0 pH0 (AU/ml) 0
OD1 pH1 (AU/ml) 1
ODpH AU/ml
0
120
240
360
480
600
720
0
1.5
3.0
4.5
6.0
7.5
9.0

840

0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
0 8 16 24 32 40 48 56 64 72
Thời gian(h)
OD0 pH0 (AU/ml) 0
OD1 pH1 (AU/ml) 1
ODpH AU/ml
0
120
240
360
480
600
720
0
1.5
3.0
4.5
6.0
7.5
9.0
840

Hình 3.15. Ảnh hưởng của NaCl và
NaNO
2
đến khả năng sinh trưởng và
sinh tổng hợp bacterioxin của chủng
H1.40
Hình 3.16. Ảnh hưởng của NaCl và
NaNO
2
đến khả năng sinh trưởng,
và sinh tổng hợpbacterioxin của
chủng ATCC11454
11

3.2.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có hoạt tính proteaza cao thuỷ phân protein
thịt nhằm ứng dụng trong công nghệ sản xuất nem chua
3.2.2.1. Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả năng thuỷ phân protein chất cơ và
protein sợi cơ thịt
Từ 20 chủng vi khuẩn lactic kháng khuẩn tốt được phân lập từ nem chua (kết
quả phần 3.2.1.1), tiến hành tuyển chọn chủng có khả năng thuỷ phân protein chất cơ
thịt (sarcoplasmic proteins) và protein sợi cơ (myofibrillar proteins). Kết quả cho thấy
trong số 20 chủng vi khuẩn có khả năng kháng khuẩn tốt có 12 chủng có khả năng
thuỷ phân protein chất cơ, 8 chủng có khả năng thủy phân protein sợi cơ và trong đó 3
chủng có khả năng thuỷ phân cả hai loại protein mô cơ thịt tốt (thể hiện vòng không
bắt mầu thuốc nhuộm Coomassi Brilliant Blue xunh quanh khuẩn lạc), đó là các
chủng H1.3, H1.4 và H1.25. Kết quả được thể hiện rõ ở các hình 3.17 và 3.18:


Hình 3.17. Đường kính vòng thuỷ phân protein chất cơ

(sarcoplasmic proteins) của các chủng vi khuẩn lactic


Hình 3.18. Đường kính vòng thuỷ phân protein sợi cơ
(myofibrillar proteins)của các chủng vi khuẩn lactic
3.2.2.2. Điện di protein SDS-PAGE sản phẩm thuỷ phân protein sợi cơ thịt
(myofibrillar proteins) bởi dịch chiết tế bào các chủng vi khuẩn lactic
Kết quả điện di protein SDS-PAGE sản phẩm thuỷ phân protein sợi cơ thịt bởi
dịch chiết tế bào 3 chủng H1.3, H1.4, H1.25 được thể hiện trên hình 3.19 cho thấy các
giếng 1,2,3 chứa sản phẩm protein sợi cơ đã bị thuỷ phân bởi hệ enzym proteaza của
12

các chủng vi khuẩn lactic không thấy còn các protein có kích thước phân tử lớn như
myosin (188 kDa) mà đã bị thuỷ phân thành các peptit nhỏ hơn từ 28-49 kDa. Còn các
peptit nhỏ khác bị thuỷ phân thành axit amin nên không còn thấy xuất hiện nữa.

Hình 3.19. Kết quả điện di SDS-PAGE của
sản phẩm thuỷ phân protein sợi cơ của dịch
chiết tế bào vi khuẩn lactic.
Ghi chú: Giếng 1,2,3: SP thuỷ phân protein sợi cơ
của dịch chiết tế bào chủng H1.3, H1.4, H1.25;
Giếng 4: Dịch chiết protein sợi cơ thịt; Giếng 5:
Protein chuẩn
Bằng phương pháp Ason cải tiến xác định hoạt lực proteaza cho thấy chủng
H1.4 có hoạt lực cao nhất (0,170 U/ml) được lựa chọn. Chủng này có khả năng sinh
tổng hợp proteaza cao nhất ở điều kiện nuôi cấy pH = 6, nhiệt độ 30
o
C. Môi trường có
NaCl 2% và NaNO
2

200ppm không ảnh hưởng nhiều đến khả năng sinh trưởng và
sinh tổng hợp enzym proteaza của chủng này.
Kết quả định tên đến loài chủng H1.4 bằng Kit API 50CHL Medium
(BioMérieux, France) cho thấy chủng H1.4 là chủng L. plantarum H1.4 với độ tương
đồng 99,9%.
3.2.3 Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có hoạt tính probiotic cao
Từ hơn 108 chủng vi khuẩn lactic phân lập từ nem chua tuyển chọn được 83/108
chủng (76,85%) có khả năng sống sót trong môi trường pH 2,5 và muối mật 1% sau 3
giờ và 75/108 chủng (69,44%) sau 24 giờ.
Từ 75 chủng trên đã tuyển chọn được 64/75 chủng có khả năng sống sót trong
môi trường PBS (có pH 2,5 và nghèo dinh dưỡng) sau 3h.
Xác định nồng độ tối thiểu ức chế (MIC) muối mật với các chủng tuyển chọn được
Tiến hành xác định khả năng sống sót trên môi trường MRS có nồng độ muối
mật từ 1- 4% của 64 chủng trên, có 6 chủng chịu được nồng độ muối mật đến 4%
(hình 3.23) trong đó chủng II7.4 vừa có khả năng chịu muối mật cao đến 4% và có tỷ
lệ sống sót cao nhất khi qua môi trường PBS (89,93%) (hình 3.24) được lựa chọn làm
nguồn chủng giống có tiềm năng probiotic cao.
13


6
6.5
7
7.5
8
8.5
9
I1.2 I2.2 I2.3 I3.1 I3.2 II7.4
chủng LAB
L o g C F U /m l

truoc
sau

Hình 3.23. Khả năng sống sót của 6
chủng vi khuẩn lactic trên môi
trường MRS có 4% muối mật
( I1.2, I2.2, I2.3, I3.1, I3.2 và II7.4 )
Hình 3.24. Mật độ tế bào sống sót trong
môi trường PBS pH 2,5 của 6 chủng
LAB sau 3h nuôi cấy
Ảnh hưởng của NaCl và muối bảo quản NaNO
2
đến sự sinh trưởng, khả năng lên men
và hoạt tính của chủng II7.4
Môi trường nuôi cấy có NaCl 2% và NaNO
2
200ppm không ảnh hưởng nhiều
đến khả năng sinh trưởng và đặc tính probiotic của chủng II7.4.
Kết quả định tên đến loài chủng II7.4 bằng Kit API 50CHL Medium
(BioMérieux, France) cho thấy chủng II7.4 là chủng L. plantarum II7.4 với độ tương
đồng 99,9%.
3.2.4. Nghiên cứu sản xuất chế phẩm các chủng vi khuẩn lactic có hoạt tính
sinh học tốt ứng dụng trong công nghệ sản xuất nem chua
Đã xác định cả 4 chủng H1.40, 11454, H1.4 và II7.4 không có sự tương tác
ức chế lẫn nhau và đều không sinh histamin nên có thể ứng dụng làm chủng giống
trong sản xuất nem chua. Nghiên cứu sản xuất chế phẩm 4 chủng vi khuẩn lactic riêng
rẽ đã lựa chọn được thành phần chất mang phù hợp với quá trình sấy chân không cho
cả 4 chủng là: Sữa bột gầy/ glucoza/ thính là 10/ 20/ 70 với chế độ sấy chân không là
40
o

C sau 2 giờ, độ ẩm các chế phẩm đạt 7,82 - 8,02%, tỷ lệ tế bào sống sót là 36,45 -
41,71%. Chế phẩm các chủng sau sấy có mật độ từ 10
9
- 10
10
CFU/ g chế phẩm và
bảo tồn được hoạt tính sinh học của các chủng.
3.3. Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của các chế phẩm tỏi và ứng dụng
trong sản xuất nem chua
Hoạt tính kháng các vi sinh vật gây bệnh của các chế phẩm tỏi: dịch
chiết tỏi tươi, bột tỏi và dầu tỏi được xác định bằng phương pháp nồng độ ức
chế tối thiểu (MIC). Kết quả cho thấy các chế phẩm tỏi có khả năng ức chế
14

rất tốt các vi sinh vật gây bệnh ngay từ thời gian đầu tiên và MIC là rất nhỏ,
đặc biệt chúng ức chế tốt các vi khuẩn gram (-), các nấm men gây hại… kết
quả được thể hiện ở các bảng 3.31, 3.32, 3.33 và các hình 3.37 đến 3.40.
3.3.1. Khả năng kháng khuẩn dịch chiết tỏi tươi
Bảng 3.31. Nồng độ ức chế tối thiểu MIC (mg/ ml) của dịch chiết nước tỏi tươi
(AGE) với các vi sinh vật kiểm định (10
4
CFU/ ml)
MIC (mg/ml) của dịch chiết nước tỏi tươi
10 ngày 20 ngày 30 ngày
Thời
gian,
nhiệt độ
b
ảo quản
Vi sinh

vật KĐ
Ban

đầu
I II III I II III I II III
E. coli K12TG1
15,6
31,3 22,1 15,6 62,5 31,3 15,6 500 62,5 62,5
B. cereus ATCC
10876
15,6
62,5 23,4 15,6 250 62,5 31,3 500 62,5 62,5
L.monocytogenes
0704
15,6
125 23,4 15,6 500 31,3 31,3 1000 62,5 62,5
S. typhimurium
VSDTTW
15,6
125 15,6 15,6 250 31,3 31,3 1000 46,9 41,2
S. aureus ATCC
25923
15,6
62,5 31,3 15,6 250 61,3 31,3 500 46,9 41,2
Nấm men LĐ 4.2
7,8
44,2 15,6 7,8 62,5 15,6 7,8 500 31,3 7,8
Nấm men TX 4.2
7,8
31,3 15,6 7,8 62,5 15,6 15,6 500 15,6 15,6

L. plantarum
H1.40
62,5
250 88,3 62,5 500 125 62,5 >500 125 125
I: AGE ở nhiệt độ thường; II: AGE ở 4
o
C; III: AGE ở -20
o
C
3.3.2. Khả năng kháng khuẩn tỏi bột
Bảng 3.32. Nồng độ ức chế tối thiểu MIC (mg/ ml) của bột tỏi với các vi sinh vật
kiểm định (10
4
CFU/ ml)
Thời gian bảoquản (tháng)
Vi sinh vật KĐ
0 1 2 3 4
E. coli K12TG1 3,47 3,47 3,47 3,47 6,95
B. cereus ATCC 10876 3,47 3,47 3,47 6,95 6,95
L. monocytogenes 0704 3,47 3,47 3,47 6,95 6,95
S. typhimurium VSDTTW 3,47 3,47 3,47 6,95 6,95
S. aureus ATCC 25923 3,47 3,47 3,47 6,95 6,95
Nấm men LĐ 4.2 3,47 3,47 3,86 6,95 6,95
Nấm men TX 4.2 1,76 1,76 1,76 6,95 6,95
L. plantarum H1.40 13,9 13,9 13,9 13,9 13,9
15

Hình 3.37. Hoạt tính kháng
L. monocytogenes của tỏi bột
Hình 3.38. Hoạt tính kháng
E. coli của tỏi bột






Hình 3.39. Hoạt tính kháng
S. typhimurium của tỏi bột
Hình 3.40. Hoạt tính kháng
nấm men LĐ 4.2 của tỏi bột
3.3.3. Khả năng kháng khuẩn dầu tỏi
Bảng 3.33. Nồng độ ức chế tối thiểu MIC (mg/ ml) của dầu tỏi với các vi sinh vật
kiểm định (10
4
CFU/ ml)
Vi sinh vật kiểm định MIC
(mg/ml)
Vi sinh vật kiểm định MIC
(mg/ml)
E. coli K12TG1 0,4 S. aureus ATCC 25923 0,7
B. cereus ATCC 10876 0,2 Nấm men LĐ 4.2 0,1
L. monocytogenes 0704 0,5 Nấm men TX 4.2 0,15
S. typhimurium VSDTTW 0,5 L. plantarum H1.40 1,2
3.3.4. Nghiên cứu ứng dụng các chế phẩm tỏi và sản xuất nem chua

Từ kết quả MIC của các chế phẩm tỏi với các vi sinh vật gây bệnh và với kết quả
phân tích số lượng các loại vi sinh vật này hay gặp trong nem chua, tiến hành bổ sung
các chế phẩm tỏi vào nem chua với hàm lượng: tỏi tươi (1-5%); tỏi bột (0,5-1,5%);
dầu tỏi (0,02-0,06%). Kết quả cho thấy các chế phẩm tỏi đều không ảnh hưởng đến
quá trình lên men nem chua. Đã lựa chọn được hàm lượng chế phẩm tỏi phù hợp và
có khả năng ức chế tốt các vi sinh vật gây hại trong nem chua là: tỏi tươi 2%; tỏi
bột:1,5%; dầu tỏi: 0,04%, trong đó tỏi bột được đánh giá cao nhất.
16

3.4. Nghiên cứu xây dựng qui trình sản xuất nem chua sử dụng chế phẩm vi
khuẩn lactic có hoạt tính sinh học, chế phẩm tỏi và tối ưu các yếu tố công
nghệ nhằm nâng cao chất lượng và đảm bảo VSATTP.
3.4.1. Nghiên cứu thời gian lên men, vật liệu và phương bao gói cho chất lượng
nem chua tốt nhất
Bốn loại bao gói được lựa chọn: Lá chuối; lá chuối có PE hút chân không; PE
không hút chân không và PE có hút chân không. Chất lượng nem chua được đánh giá
qua 8 chỉ tiêu: pH, axit amin tự do, đạm amoniac NH
3
, cấu trúc (độ chắc), cảm quan, số
lượng Enterobacteriaceae, S. aureus, và nấm mốc được xác định tại các thời điểm lên
men. Kết quả lựa chọn được thời gian lên men cho chất lượng tốt nhất là sau 30 giờ và
mẫu bao gói PE hút chân không có chất lượng tốt nhất do có quá trình lên men lactic
yếm khí triệt để.
3.4.2. Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của các chế phẩm lactic sinh
bacterioxin và chế phẩm tỏi bột trong môi trường nem chua
Số lượng
E.coli
2
3
4

5
6
7
8
9
0 12 24 36 48 60 72 84 96 108
Thời gian (h)
E.coli (logCFU/g)
Mẫu 1
Mẫu 2
Mẫu 3
Mẫu 4
Mẫu 5

Số lượng
S. aureus
4
5
6
7
8
9
10
0 12 24 36 48 60 72 84 96 108
Thời gian (h)
S. aureus (logCFU/g)
Mẫu 1
Mẫu 2
Mẫu 3
Mẫu 4

Mẫu 5

Hình 3.63. Số lượng E. coli trong các
mẫu nem chua có và không bổ sung vi
khuẩn gây bệnh và các chế phẩm
Hình 3.64. Số lượng S. aureus trong
các mẫu nem chua có và không bổ sung
vi khuẩn gây bệnh và các chế phẩm
Ghi chú: Mẫu 1: mẫu nem chua lên men tự nhiên (không bổ sung gì); Mẫu 2: Bổ sung E. coli 10
6
CFU/ g và S. aureus 10
6
CFU/ g; Mẫu 3: Bổ sung E. coli 10
6
CFU/ g; S. aureus 10
6
CFU/ g và chế
phẩm tỏi 1,5%; Mẫu 4: Bổ sung E. coli 10
6
CFU/ g; S. aureus 10
6
CFU/ g và hai chế phẩm vi khuẩn
lactic sinh bacterioxin mỗi loại 10
6
CFU/ g;
Mẫu 5: Bổ sung E. coli 10
6
CFU/ g; S. aureus 10
6
CFU/ g; chế phẩm tỏi 1,5% và hai chế phẩm vi

khuẩn lactic sinh bacterioxin mỗi loại 10
6
CFU/ g;
Tiến hành bổ sung vi sinh vật gây bệnh, vi khuẩn lactic sinh bacterioxin và chế
phẩm bột tỏi vào 5 mẫu nem chua. Kết quả cho thấy khá rõ nét vai trò kháng khuẩn
17

của từng loại chế phẩm và vai trò phối hợp của hai loại chế phẩm này trong việc ức
chế các vi sinh vật gây bệnh. Chế phẩm tỏi có vai trò ức chế ngay từ thời điểm ban
đầu và ức chế cả nhóm vi khuẩn Gram (+) và làm giảm rõ rệt nhóm Gram (-) như
Enterobacteriaceae và E.coli , trong khi đó nhóm vi khuẩn lactic có vai trò ức chế
mạnh nhóm vi khuẩn Gram (+) như S. aureus , B. cereus và C. perfringenes và khả
năng ức chế kéo dài trong thời gian bảo quản. Hỗn hợp hai loại chế phẩm này có tác
dụng đồng phối hợp nên mang lại hiệu quả ức chế rất hiệu quả. Kết quả thể hiện rõ
hình 3.63 và 3.64
3.4.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng nem chua
Nem chua là một hỗn hợp nhiều cấu tử rắn và không thể thanh trùng trước khi
lên men nên chất lượng bị ảnh hưởng đồng thời của rất nhiều yếu tố. Kết quả khảo sát
bằng ma trận Hadamard với 7 yếu tố và 8 hàm mục tiêu chất lượng nem chua đã xác
định được các yếu tố ảnh hưởng nhất đó là: Hàm lượng chế phẩm vi khuẩn lactic, hàm
lượng glucoza, hàm lượng nitrit, hàm lượng muối ăn, hàm lượng bột tỏi, và nhiệt độ
lên men. Và 4 yếu tố ảnh hưởng nhất (hàm lượng chế phẩm, hàm lượng glucoza, hàm
lượng nitrit và nhiệt độ lên men ) được tiến hành tối ưu hóa bằng ma trận thực nghiệm
qui hoạch trực giao cấp 2.
3.4.4. Tối ưu hóa các yếu tố công nghệ trong sản xuất nem chua
Ma trận qui hoạch thực nghiệm trực giao cấp 2 được thiết kế với 4 biến (nhiệt độ
lên men; hàm lượng glucoza; hàm lượng NaNO
2
; và hàm lượng chế phẩm vi khuẩn
lactic) và 8 hàm mục tiêu chất lượng nem chua. Kết quả tìm được hàm mục chất

lượng nem chua phụ thuộc vào các biến yếu tố như sau:
Phương trình hồi quy hàm pH:
Y
1
(pH) = 4,58 - 0,25X
1
+ 0,049X
3
- 0,13X
4
+ 0,011X
1
2
- 0,033X
2
2
- 0,033X
3
2
-
0,10X
4
2
- 0,044X
1
X
2
- 0,031X
1
X

3
+ 0,11X
1
X
4
+ 0,019X
2
X
3
+ 0,031X
2
X
4
;
Hệ số tương quan bội R
2
= 0,9717;
Phương trình hồi quy hàm axit amin tự do (mg/100g):
Y
2
(axit amin tự do) = 405,55 + 15,10X
1
- 1,08X
2
+ 4,81X
3
+ 9,84X
4
- 7,96X
1

2
-
15,79X
2
2
- 7,96X
3
2
+ 7,57X
4
2
- 9,76X
1
X
2
- 5,61X
1
X
3
- 1,67X
1
X
4
- 0,51X
2
X
3
+
4,77X
2

X
4
+ 14,96X
3
X
4
; Hệ số tương quan bội R
2
= 0,8742 ;
Phương trình hồi quy hàm lượng NH
3
(mg/ 100g):
18

Y
3
(NH
3
) = 29,14 - 0,023X
1
- 1,57X
2
- 0,178X
3
- 2,67X
4
+ 3,47X
1
2
+ 0,35X

2
2
-
1,77X
3
2
+ 4,58X
4
2
- 1,77X
1
X
2
- 0,34X
1
X
3
+ 1,94X
1
X
4
+ 2,35X
2
X
3
- 2,35X
2
X
4
-

0,94X
3
X
4
; Hệ số tương quan bội R
2
= 0,8715 ;
Phương trình hồi quy của hàm cấu trúc (g):
Y
4
(Cấu trúc) = +374,19 +92,8X
1
+ 10,39X
2
+ 5,68X
3
- 5,88X
4
+ 25,14X
1
2
-
21,75X
2
2

+ 74,91X
3
2

-54,42X
4
2
+ 3,59X
1
X
2
+ 23,41X
1
X
3
- 2,88X
1
X
4
+ 21,66X
2
X
3

+ 9,22X
2
X
4
- 4,34X
3
X
4
; Hệ số tương quan bội R
2

= 0,9064 ;
Phương trình hồi quy hàm cảm quan:
Y
5
(cảm quan) = 17,76 + 1,16X
1
+ 0,26X
2
+ 0,42X
3
+ 0,39X
4
- 0,4X
1
2

- 0,83X
2
2

+ 0,18X
3
2
- 0,83X
4
2

- 0,24X
1
X

2
- 0,13X
1
X
3
+ 0,058X
1
X
4
– 0,15X
2
X
3
+ 0,26X
2
X
4

+ 0,29X
3
X
4
; Hệ số tương quan bội R
2
= 0,9105 ;
Phương trình hồi quy hàm Enterobacteriaceae (log CFU/ g):
Y
6
(Enterobacteriaceae) = 3,6 - 0,26X
1

+ 0,045X
2
- 0,32X
3
- 1,06X
4
- 0,041X
1
2

+
0,64X
2
2

- 0,073X
3
2

+ 0,3X
4
2

+ 0,2X
1
X
2
- 0,021X
1
X

3
+ 0,091X
1
X
4
- 0,034X
2
X
3
-
0,29X
2
X
4
+ 0,4X
3
X
4
; Hệ số tương quan bội R
2
= 0,9090;
Phương trình hồi quy hàm Staphylococcus aureus (log CFU/ g):
Y
7
(S. aureus) = 2,82 - 0,31X
1
- 0,19X
2
- 0,22X
3

- 0,58X
4
+ 0,35X
1
2

+ 0,3X
2
2

+
0,3X
3
2

+ 0,38X
4
2

- 0,02X
1
X
2
+ 0,041X
1
X
3
- 0,26X
1
X

4
- 0,14X
2
X
4
+ 0,21X
3
X
4
;

Hệ số tương quan bội R
2
= 0,9121;
Phương trình hồi quy hàm nấm mốc (log CFU/ g):
Y
8
( Nấm mốc ) = 3,01 - 0,059X
1
+ 0,059X
2
- 0,17X
3
- 0,020X
4
+ 0,013X
1
X
2
-

0,15X
1
X
3
+ 0,19X
1
X
4
- 0,11X
2
X
4
+ 0,05X
3
X
4
;

Hệ số tương quan bội R
2
= 0,8551;
Bằng phần mềm Design Experd tối ưu hóa chập mục tiêu, kết quả cho hàm
chập mục tiêu D = 0,866 thể hiện hình 3.65 cho chất lượng nem chua thỏa mãn cao
nhất các chỉ tiêu và giá trị các biến cũng như giá trị các hàm mục tiêu được thể hiện ở
các bảng 3.40 và 3.41.
Bảng 3.40. Giá trị các biến tại giá trị tối ưu
Các biến X
1
(Nhiệtđộ)

X
2
(Glucoza)

X
3
(Nitrit)

X
4
(Chế phẩm)

Giá trị biến mã hóa 0,38 0,08 1,00 0,29
Giá trị biến thực 31
o
C 1,5% 150 ppm 6x10
6
tb/g
19

Bảng 3.41. Kết quả tối ưu các hàm mục tiêu đạt được

pH

Axit amin

tự do
(mg/100g)
NH3
(mg/

100g)
Cấu
trúc
(g)
Cảm
quan

Enterobac-
teriaceae
(logCFU/g)
S. aureus
(logCFU/g)
Nấm mốc
(logCFU/g)
4,46 412,06 27,07 500 18,83 2,95 2,72 2,78
1
1
1
1
0.887967
0.880694
1
1
1
0.973369
0.954023
0.478895
0.866008
Desirability
0.000 0.250 0.500 0.750 1.000

A
B
C
D
pH
Aa
NH3
Luc
Camquan
Entero
Staphy
Moc
Combined

Hình 3.65. Kết quả hàm chập mục tiêu D (Desirability) với phương án tối ưu

3.4.5 Nghiên cứu chế độ bảo quản nem chua
Tiến hành làm mẫu nem chua theo các yếu tố đã được tối ưu, mẫu được bao gói
bằng PE có hút chân không (TƯ-PE) và mẫu gói bằng lá chuối (TƯ-LC). Mẫu đối
chứng không bổ sung chế phẩm vi khuẩn lactic và bột tỏi, được gói bằng lá chuối và
ký hiệu là (ĐC), nhiệt độ lên men 31
o
C. Sau 30 giờ lên men các mẫu được bảo quản ở
3 điều kiện: nhiệt độ môi trường; 10
o
C và 2
o
C. Tiến hành phân tích các chỉ tiêu sau
hóa lý, cảm quan, vi sinh vật tại thời điểm 30 giờ lên men và sau thời gian bảo quản 5,
10, 15, 20 và 30 ngày, đồng thời so sánh với mẫu nem chua trên thị trường Hà Nội

(HN) có cùng thời gian lên men, kết quả thể hiện bảng 3.42, 3.43.
Kết quả cho thấy chất lượng các mẫu nem chua sau thời gian 30 giờ lên men
(thời điểm kết thúc quá trình lên men và đạt độ chín “ sinh hóa “ có thể sử dụng) có sự
khác biệt giữa các mẫu. Các mẫu tối ưu là (TƯ-PE), (TƯ-LC) có quá trình lên men tốt
pH giảm nhanh, mẫu (ĐC) có pH giảm chậm và hàm lượng đạm amoniac cao hơn
hẳn. Về chỉ tiêu vi sinh vật gây bệnh 2 mẫu (TƯ-PE) và (TƯ-LC) thấp hơn hẳn đặc
20

biệt Enterobacteriaceae và S. aureus đạt về ngưỡng cho phép của nhóm sản phẩm này
theo Ailen [71], Úc và Niuzilân [72] do được cấy hệ vi khuẩn lactic có hoạt tính kháng
khuẩn cao và chế phẩm bột tỏi vì vậy 2 mẫu này cũng có hàm lượng NH
3
thấp nhất và
axit amin tự do cao nhất (do vai trò vi khuẩn lactic thủy phân protein thịt cao). Đối với
2 mẫu (HN) và (ĐC) chỉ tiêu về vi sinh vật đều vượt ngưỡng cho phép (10

4
đến 10
6
CFU/ g

) gây nguy hại đến sức khỏe người tiêu dùng (bảng 3.43).
Bảng 3.42. Đánh giá chỉ tiêu hóa lý và cảm quan các mẫu nem chua sau
30 giờ lên men và sau thời gian bảo quản
Điểm cảm quan
pH
Axit amin tự do
(mg/ 100g SP)
NH
3

(mg/ 100g SP)
Mẫu

Thời
gian(h)
t
0

MT
10
0
C 2
0
C t
0

MT
10
0
C 2
0
C t
0

MT
10
0
C 2
0

C t
0

MT
10
0
C 2
0
C
30
17,93 4,65 364,5 36,3
120 15,12 17,64 18,60 4,75 4,70 4,65 348,2 356,3 358,6
49,3 40,3 37,3
240
hỏng
14,80 15,28 4,85 4,75 4,65 306,6 348,4 349,2
85,4 43,9 39,3
360
- hỏng
11,00 5,1 4,85 4,75 291,5 334,4 335,7
-
56,6 50,7
480
- - hỏng
- 4,95 4,80
-
315,2 330,1
-
67,3 61,2
HN

720
- -
- - 5,10 4,85
-
297,2 317,0
-
77,6 73,1
30
11,60 4,75 350,3 38,3
120
hỏng
11,72 13,0 4,85 4,85 4,75 325,5 339,7
342,2 75,4 45,2 42,2
240
- hỏng hỏng
5,35 4,95 4,85 307,6 326,4
336,4 105,6 50,7 46,7
360
- -
-
-
5,15 4,95 262,4 314,3
327,6
-
63,3 58,7
480
-
- -
-
5,30 5,20

-
295,7 315,4
-
74,2 70,4
ĐC
720
-
- -
-
5,50 5,30
-
273,1 300,2
-
95,1 85,3
30
17,86 4,55 417,5 27,9
120 15,76 18,24 18,24 4,55 4,55 4,55 410,5 414,4
418,0 34,6 30,3 29,2
240
hỏng
17,12 18,12 4,6 4,60 4,55 402,4 412,4
416,4 42,5 34,3 30,6
360
-
17,04 17,80 4,7 4,60 4,55 387,3 409,2
412,2 59,7 36,3 32,3
480
-
16,24 17,28
-

4,65 4,60
-
403,3 409,3
-
38,2 37,3
TƯ-
PE
720
-
15,20 16,32
-
4,70 4,60
-
395,3 405,0
-
40,2 39,2
30
17,63 4,55 407,5 28,5
120 15,40 17,68 17,88 4,55 4,55 4,55 395,5 402,4 405,0
35,3 32,2 31,3
240
hỏng
17,04 17,52 4,6 4,60 4,55 389,5 396,3 400,4
43,3 36,2 32,7
360
-
16,48 16,80 4,8 4,60 4,60 384,6 388,5 395,2
62,4 38,3 34,5
480
-

15,40 15,80
-
4,65 4,60
-
380,2 388,2
-
39,1 38,9
TƯ-
LC
720
-
14,80 15,80
-
4,70 4,65
-
374,4 383,1
-
40,8 40,2
HN: Mẫu nem chua thị trường Hà Nội; ĐC: mẫu nem chua không sử dụng chế phẩm, bao gói
bằng lá chuối;TƯ-PE, TƯ-LC: Mẫu nem chua sử dụng chế phẩm vi khuẩn lactic BIO-NC, tỏi
bột được tối ưu bao gói bằng PE hút chân không và bao gói bằng lá chuối
21

Bảng 3.43. Đánh giá một số thành phần vi sinh vật các mẫu nem chua sau 30
giờ lên men và thời gian bảo quản
Enterobacteriaceae
(log CFU/ g SP)

S. aureus

(log CFU/ g SP)
Nấm mốc
(log CFU/ g SP)

Tổng số vi khuẩn lactic
(log CFU/ g SP) Mẫu

Thời
gian(h)
t
0

MT
10
0
C 2
0
C t
0

MT
10
0
C 2
0
C t
0

MT
10

0
C 2
0
C t
0

MT
10
0
C 2
0
C
30 5,13 4,72 3,72 8,91
120 5,40 5,00 4,82 5,20 4,58 4,54 4,7 4,30 4,23 9,60 9,20 8,50
240 5,91 5,13 4,85 5,72 4,52 4,55 5,61 4,81 4,42 9,23 8,53 8,22
360 6,62 5,36 4,95 6,11 4,78 4,47 6,05 5,32 4,83 8,81 8,33 8,04
480 - 5,53 5,37 - 5,06 4,85 - 5,52 5,15 - 8,17 7,81
HN
720 - 5,42 5,32 - 5,23 5,21 - 5,72 5,34 7,72 7,33
30 5,62 5,21 4,08 8,53
120 6,10 5,47 5,38 5,86 5,16 5,07 5,80 5,48 4,85 9,30 8,80 8,10
240 6,82 5,52 5,34 6,64 5,14 4,94 6,94 5,94 5,22 8,91 8,07 7,44
360 - 5,69 5,45 - 5,39 4,85 - 6,23 5,35 - 7,65 7,12
480 - 5,94 5,68 - 5,78 5,45 - 6,63 5,71 7,42 7,03
ĐC
720 - 6,05 5,84 - 5,91 5,73 - 6,93 6,02 7,03 6,45
30 3,58 2,67 2,75 11,52
240 4,21 3,42 3,32 3,32 2,52 2,41 3,42 3,12 3,08 10,84 10,62 10,62
120 4,20 3,65 3,51 3,20 2,70 2,45 3,40 3,20 3,20 11,20 10,90 10,8
360 4,43 3,75 3,25 3,73 2,63 2,14 3,82 3,31 3,12 9,93 10,32 9,92

480 - 3,82 3,33 - 2,71 2,33 - 3,63 3,44 - 10,13 9,67
TƯ-
PE
720 - 3,91 3,45 - 2,83 2,43 - 3,82 3,62 9,31 9,36
30 3,73 2,85 2,95 10,72
120 4,30 3,68 3,58 3,30 3,00 2,56 3,70 3,40 3,40 10,90 10,90 10,60
240 4,23 3,68 3,43 3,55 2,73 2,47 4,04 3,33 3,21 10,02 10,78 10,43
360 4,67 3,73 3,35 3,97 2,68 2,22 4,32 3,67 3,53 9,52 10,56 9,64
480 - 3,82 3,49 - 2,83 2,45 - 3,88 3,73 - 10,04 9,25
TƯ-
LC
720 - 3,97 3,67 - 2,91 2,66 - 4,21 4,02 - 9,06 9,04
Trong quá trình bảo quản ở 3 chế độ nhiệt độ cho thấy chế độ bảo quản nem
chua thích hợp nhất là ở 2
o
C và có thể ở 10
o
C, không thích hợp khi bảo quản ở nhiệt
độ thường. Do vai trò của chế phẩm vi khuẩn lactic và chế phẩm tỏi nên các mẫu nem
chua nghiên cứu tạo được một sự ổn định bền vững và do đó vẫn cho chất lượng tốt
sau 30 ngày bảo quản ở 2
o
C và kéo dài thời hạn sử dụng hơn ít nhất 15-20 ngày so với
mẫu thị trường và mẫu đối chứng ở cùng điều kiện.
22

3.5.6 Xây dựng qui trình sản xuất nem chua sử dụng chế phẩm vi khuẩn lactic,
chế phẩm tỏi và tối ưu các yếu tố công nghệ

Hình 3.74. Qui trình công nghệ sản xuất nem chua sử dụng chế phẩm vi
khuẩn lactic có hoạt tính sinh học, chế phẩm tỏi và tối ưu hóa các yếu tố
công nghệ
Thái sợi
Định lượng
Bao bì PE,

L
á
chu
ối

Bì l
ợn

Làm sạch

Thịt lợn nạc
Ph
ối trộn

Chần
Bao gói PE hút chân
không, hoặc lá chuối
Bảo quản ở 2
o
C, thời hạn sử
dụng ít nhất 30 ngày
Lên men 31
o
C, 30 giờ
Thái mi
ếng

Xay nhuyễn
Glucoza 1,5%
NaCl 1,2%

Thính 2,0%
Bột tỏi 1,5%
NaNO
2
150ppm
VTM C 500 ppm
Chế phẩm BIO-NC
6x10
6
CFU/ g