Khóa Luận Quy Trình Phát Hiện Listeria Monocytogenes Trong Thủy Hải Sản Đông Lạnh.pdf

LỜI MỞ ðẦU
Listeria monocytogenes những năm gần ñây nổi lên như một tác nhân gây bệnh
từ thực phẩm quan trọng. ðây là một loại trực khuẩn Gram dương ngắn, nhỏ,
không sinh bào tử, thường có kiểu chuyển động xoay trịn quanh trục thân thành
từng ñợt rất ñặc trưng trong tiêu bản giọt treo. Chúng có thể phát triển trên mơi
trường ni cấy đơn giản ở vùng pH giữa 5 và 9. Trên môi trường thạch rắn,
khuẩn lạc của chúng trông như những giọt sương trong suốt, hơi nhuốm màu lam
nhạt khi nhìn qua anh sang phản chiếu dưới góc 450.
Về mặt sinh hóa Listeria monocytogenes dễ bị nhầm với những vi sinh vật như
Lactobacillus, Brochothrix, Erysipelothrix và Kurthia. Một số thử nghiệm sinh
hóa đã được áp dụng để phân biệt Listeria monocytogenes với các loài Listeria
khác như Listeria innocua, Listeria welshimeri và Listerisamurrayi. Xác ñịnh
kiểu huyết thanh cũng là một cách ñịnh danh quan trọng ñối với vi sinh vật này.
Listeria thuộc loại ưa lạnh, có thể phát tirển ở nhiệt ñộ thấp ñến 2,50C và cao ñến
440C. Các chuyên gia FDA khuyến cáo cần lưu ý việc làm vệ sinh ống dẫn lạnh
trên trần vì đó là nơi có ñiều kiện thuận lợi cho Listeria phát triển và tích tụ.
Liều lượng gây bệnh của Listeria monocytogenes hiện vẫn chưa ñược biết. Bệnh
bắt ñầu từ ñường tiêu hóa với những triệu chứng như tiêu chảy, sốt nhẹ. Trường
hợp nặng, chủng gây bệnh có thể sinh sản trong các đại thực bào và gây nhiễm
trùng máu. Vi khuẩn tác ñộng lên hệ thần kinh trung ương, tim, mắt và có thể
xâm nhập vào bào thai trong bệnh mẹ gây sẩy thai, ñẻ non hoặc nhiễm trùng thai
nhi.
Listeria monocytogenes ñã ñược phân lập từ nhiều loại thực phẩm khác nhau như
thịt, cá, rau, sữa và cà bề mặt nước. Cần lưu ý kiểm tra sự hiện diện của vi sinh
vật ở mọi cơng đoạn trong q trình chế biến thực phẩm, từ môi trường, nguyên

1


liệu, ñiều kiện sản xuất, vận chuyển ñến sản phẩm cuối cùng. Nấu chín thực
phẩm là một biện pháp hữu hiệu ñể giảm nguy cơ nhiễm bệnh.

2


CHƯƠNG I: MỞ ðẦU
1.1. ðặt vấn ñề.
- ðất nước ta có nhiều điều kiện thuận lợi để phát triển ngành nuôi trồng
thủy hải sản. Bờ biển Việt Nam khá dài và rộng, lại nằm trong vùng giao
nhau giữa các dòng nước và có khí hậu nhiệt đới nên trữ lượng hải sản rất
dồi dào và có giá trị kinh tế cao. Vì vậy, ngành đánh bắt ni trồng thủy
hải sản ở nước ta khơng ngừng phát triển, khơng những đáp ứng mhu cầu
trong nước mà còn xuất khẩu ra thị trường nước ngoài như: Trung Quốc,
ðài Loan, Hàn Quốc, Nhật, Mỹ, Anh…. Chất lượng vệ sinh thực phẩm
hiện nay ñang là mối quan tâm hàng ñầu khi xuất khẩu thực phẩm sang
các quốc gia khác, ñặc biệt là ñối với mặt hàng thủy hải sản đơng lạnh.
- Tuy nhiên, việc xuất khẩu thủy hải sản của nước ta ñang gặp khá nhiều
khó khăn và một trong nhửng vấn đề đó là việc nhiễm các tác nhân gây
bệnh, gây ñộc như: dư lượng kháng sinh, vi sinh vật gây bệnh…. và
Listeria monocytogenes là một trong những tác nhân gây bệnh và gây ngộ
độc trong sản phẩm thủy hải sản đơng lạnh.
- Trong vấn ñề ngộ ñộc thực phẩm, vi khuẩn Listeria monocytogenes gây ra
bệnh Losteriosis. Ca ñầu tiên của bệnh Listeriosis ñã ñược nói ñến cách
ñây 70 năm, nhưng phải ñợi ñến những năm 1980, vi khuẩn Listeria
monocytogenes mới ñược chính thức xác nhận là tác nhân gây ngộ ñộc từ
thực phẩm. Listeria monocytogenes hình thành nên các triệu chứng như;
sốt, khó chịu, đau lưng. Nếu độc tố đủ mạnh, chúng sẽ gây ra ngộ độc thực
phẩm cấp tính trong khoảng 12 giờ, với các triệu chứng như: nôn mửa,
tiêu chảy, ñau quặn bụng, nhức ñầu…

3

- Với ý nghĩa khoa học và thực tiễn như vậy, chúng tơi quyết định thực hiện
đề tài: “quy trình phát hiện Listeria trong thủy sản đơng lạnh”.
1.2. Mục tiêu nghiên cứu.
- Tìm hiểu tác nhân gây bệnh Listeria monocytogenes trong thủy sản và tìm
hiểu các phương pháp xác định Listeria monocytogenes trong các sản
phẩm thủy sản đơng lạnh.

4


CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN
2.1. Giới thiệu về thủy hải sản và tình hình nhiễm khuẩn của thủy hải sản
ở Việt Nam và trên thế giới.
2.1.1. Giới thiệu chung về thủy hải sản.
- Hải sản là bất kỳ ñộng vật hoặc thực vật biển ñươc phục vụ như thực
phẩm và là thức ăn của con người. Hải sản bao gồm ñộng vật biển như; cá
và các động vất có vỏ khác ( bao gồm cả ñộng vật thân mềm và ñộng vật
giáp xác.).
- Việc thu hoạch thủy hải sản tự nhiên ñược gọi là ñánh bắt cá. Ngành ñánh
bắt cá và ni trồng thủy hải sản được biết đến như là: nuôi biển, nuôi
trồng thủy sản, hoặc trong trường hợp của cá thì ni cá. Hải sản thường
đươc phân biệt với thịt. Mặc dù, nó vẫn có một số tính chất của động vật
và nó được loại trừ trong một số chế ñộ ăn chay. Hải sản là một nguồn
quan trọng trong việc bổ sung nguồn protein trong nhiều khẩu phần ăn
trên thế giới, ñặc biệt ở các vùng ven biển.
- Hiện có hơn 32000 lồi cá được sử dụng làm nguồn thực phẩm cho con
người. Ví dụ như: cá đối, cá chép, cá da trơn, cá chim lớn, cá trích, cá thu,
cá mè, cá cơm… và một số loài khác.

- Thủy hải sản đơng lạnh là thủy hải sản sạch ñược sơ chế, chế biến theo
quy trình nghiêm ngặt về vệ sinh an tồn thực phẩm. Quy trình sơ chế, chế
biến và ñưa ra sản phẩm theo phương pháp IQF ñưa ra sản phẩm ñông
lạnh với chất lượng tốt nhất. Ngay từ khâu nguyên liệu ñược tuyển chọn
kỹ lượng với chất lượng đảm bảo và sau đó sẽ được sản xuất trên dây
truyền vơ trùng tuyệt đối đảm bảo vệ sinh an tồn thực phẩm, từ đó sẽ đưa
ra các sản phẩm an tồn. Trước khi các sản phẩm đó ñến tay người tiêu

5


dùng, chúng ñược kiểm tra bởi các cơ quan y tế và được cấp giấy phép vệ
sinh an tồn thực phẩm. Chính vì vậy, thực phẩm đơng lạnh là sản phẩm
có chất lượng vệ sinh an tồn thực phẩm rất cao.
2.1.2. Tình hình nhiễm khuẩn của thủy hải sản Việt Nam.
- Trong 3 mùa hè liên tiếp, Viện dinh dưỡng quốc gia ñã thực hiện ñề tài
nghiên cứu: “Thực trạng ô nhiễm vi sinh vật vào thực phẩm thủy hải sản
đơng lạnh và chế biến trên địa bàn Hà Nội”. Kết quả kiểm tra vi sinh vật
tại phịng thí nghiệm 300 mẫu thực phẩm thủy hải sản đơng lạnh và chế
biến sẵn (ñược lấy ngẫu nhiên) từ một số chợ và siêu thị trong 6 quận
thành Hà Nội cho thấy 82 mẫu khơng đạt tiêu chuẩn vệ sinh an tồn thực
phẩm. Trong đó có 36 mẩu cá đơng lạnh, 29 mẫu tôm, cua sơ chế, 8 mẫu
tép và 6 mẫu nem chả giị…
- ðặt biệt có tới gần 30% mẫu khơng đạt nhiễm một số loại vi sinh vật vượt
q giới hạn cho phép. Trong dó có 49 mẫu khơng ñạt tiêu chuẩn về
Coliforms ( chiếm 16.3%), 34 mẫu không ñạt về E.coli (11%), 28 mẫu
không ñạt về C.perfrigens (9.3%) và 7 mẫu khơng đạt về Vibrio
parahaemolyticus(2.3%). Trong 28 mẫu nhiễm C.perfrigens chủ yếu là:
mẫu mắm tơm, mắm tép… có thể gây ngộ ñộc bất cứ lúc nào. Nguy hại
hơn cả là trong hải sản đơng lạnh có vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus

ñươc xác nhận là nguyên nhân gây ra nhiều vụ ngộ ñộc thức ăn do cá biển
và hải sản. Bệnh hầu hết xãy ra vào mùa hè ñối với những người ăn gỏi cá
và những thực phẩm chưa chín, có thể gây ngộ độc, gây đau bụng, nơn,
sốt, đặc biệt là gây ra tiêu chảy.
2.1.3. Tình hình nhiễm khuẩn của thủy hải sản trên thế giới.

6


- Ngộ ñộc tiêu chảy ñược phát hiện vào năm 1976 từ con trai nhiễm ñộc tại
Nhật Bản.
- Ngộ ñộc Venerupin ñầu tiên bùng phát do ăn hào và nghêu chỉ có trong
vùng biển nước Nhật vào một thời điểm ñặt biệt nào ñó trong năm, chất
ñộc tạo ra bở nhiều sinh vật sinh sản mau lẹ, rất nhiều trong cuối mùa
đơng, đơi khi xuất hiện ngồi khơi nước Bồ ðào Nha. Cơn bệnh có thể
làm hư gan, chết khoảng 1/3 nạn nhân.
- Cuối năm 1987, ngộ dộc mất trí nhớ được để ý khi nó phát triển nhiều tại
phía ðông Canada thủ phạm là chất acid domoic, một chất ñộc
neurotoxinmanh phát sinh từ tảo diatom Nitzschia punens trong nước
lạnh.Nạn nhân sẽ bị mất trí nhớ trong một thời gian ngắn, một số ca dẫn
ñến tử vong.
- Ăn phải tảo ñỏ gây ra ngộ ñộc nguy hiểm, vào năm 1991 tại đảo Guam đã
có 13 trường hợp ngộ độc do ăn phải tảo đỏ Polycavemosa tsudai, có 3
trong số đó bị chết.
- Năm 2004 đã có 53 cảnh báo về vượt q giới hạn sulphit trong tơm.
Trong đó mặt hàng tơm chín chiếm 31 cảnh báo, đây cũng là mặt hàng có
quy định sulphit nghiêm ngặt nhất (khơng q 50 miligram/kg tơm). Quy
định này cũng có nghĩa là: mặc dù, nếu một nhà chế biến thực phẩm tuân
thủ nghiêm các tiêu chuẩn đối với tơm ngun liệu, nhưng sau khi nấu
chín tơm thì cơng ty này vẫn có thể vi phạm giới hạn tiêu chuẩn (do giới

hạn quy ñịnh ñối với tơm chín thấp hơn rất nhiều).
- Năm ngối, đã có 41 trường hợp bị Rasff cảnh báo lây nhiễm loại vi khuẩn
Listeria monocytogenes. Trong đó, cá hồi xơng khói của ðan Mạch bị
cảnh báo 19 lần và cá hồi của ðức bị 10 lần.

7


- Cũng theo hệ thống cảnh báo của Rasff, năm ngối có 39 cảnh báo về sự
xuất hiện của Histamin trong thủy sản. Trong đó, cá ngừ chiếm 31 cảnh
báo và hầu hết là mặt hàng ướp lạnh, sau khi nhập khẩu đã được đóng túi
chân khơng ở Hà Lan. Nước bị cảnh báo nhiều nhất là Inđơnêxia.
- Các thanh tra của Italia cũng ñã phát hiện và cảnh báo 41 lần về việc lây
nhiễm ký sinh trùng (Anisakis), chủ yếu trong cá thu tươi xuất xứ từ Nauy,
ðan Mạch, và cá vây chân từ Anh.
- Cảnh báo về dư lượng Cactimi trong thủy hải sản chiếm 43 lần, ít hơn một
nửa so với số lượng cảnh báo hồi năm 2003 (103) lần, và chủ yếu liên
quan ñến các sản phẩm cá kiếm và nhuyễn thể chân ñầu. Số lần cảnh báo
về lây nhiễm thủy ngân trong cá kiếm năm 2004 là 30 lần, tăng nhẹ so với
năm 2004.
2.2. Giới thiệu về vi khuẩn Listeria monocytogenes.
2.2.1. Lịch sử phát hiện.

Hình 2.1: Vi khuẩn Listeria monocytogenes.

8


- Chi Listeria ñược ñặt theo tên nhà ngoại khoa người Anh, Joseph Lister.
Năm 1918, một loại vi khuẩn tương tự như Erysipelothrix rhusiopathiae

ñược phân lập từ dịch não tủy của một quân nhân người Pháp. Chủng vi
khuẩn này ñược lưu giữ tại viện Pasteur Paris, nhưng phải nhiều năm sau
đó, vi khuẩn này mới được mệnh danh là Listeria monocytogenes.
- Năm 1924, Murray và cộng sự, trong quá trình nghiên cứu một dịch bệnh
trên các động vật thí nghiệm, ñã phân lập ñược một chủng vi khuẩn từ các
hạch Lympho của các động vật bị bệnh. Sau đó , lấy vi khuẩn này tiêm cho
các con khỏe mạnh thì thấy ở chúng, có hiện tượng tăng bạch cầu đơn
nhân, tương tự như bệnh của quân nhân người Pháp nói trên. Vì vậy, ơng
đặt tên cho nó là: Bacillus monocytogenes. Ba năm sau, tại Nam Phi, Piie
khi đó đang nghiên cứu sự mang Yersinia peptis trên chuột ñã phân lập
ñược một vi khuẩn từ gan chuột và ơng đặt tên nó là Listeria hepatolytica.
Trực khuẩn này khơng thể phân biệt với Bacillus monocytogenes và chủng
vi khuẩn lưu giữ ở viện Pasteur Paris. Chính vì vậy, pirie đã đề xuất một
tên mới chỉ chung cho các chủng này là Listeria monocytogenes.
- Năm 1929, Nyfeldt phân lập ñược Listeria monocytogenes từ máu của một
bệnh nhân bị sốt kèm theo viêm hạch và ơng tin rằng đó là tác nhân gây
bệnh tăng bạch cầu ñơn nhân nhiễm trùng. Tất nhiên, nhiều tác giả khác đã
khơng đồng ý với lập luận của Nifeldt. Nhiều năm sau đó, những cơng bố
kinh điển về bệnh nhiễm Listeria (Listeriosis) trên người, kể cả ở trẻ sơ
sinh và người lớn, cho thấy những bằng chứng giống như trong y văn
nhưng có nhũng tranh luận rằng, khả năng truyền bệnh từ ñộng vật sang
người là cực kỳ hiếm.

9


- Năm 1950, những nghiên cứu ñầu tiên, thực sự mang tính hệ thống về
nhiễm Listeria trên người đã thực hiện. Tuy nhiên, phải mất thêm ba thập
kỷ nữa, sau hàng loạt các báo cáo dịch được cơng bố mới thấy, nghiên cứu
về Listeria monocytogenes từ chỗ tương ñối bế tắc đã trở nên sáng sủa

hơn. Từ đó tới nay, chủ ñề này ñã thu hút ñược sự quan tâm nghiên cứu
của nhiều chun ngành, khơng chỉ bởi vì tầm quan trọng của Listeria
monocytogenes với sức khỏe cộng ñồng, mà cịn là vì, vi khuẩn này đã trở
thành một mẫu hình nghiên cứu thực nghiệm cho hiện tượng ký sinh nội
bào khơng bắt buộc.
2.2.2 Phân loại.

Hình 2.2. Vi khuẩn Listeria monocytogenes
- Lồi khuẩn giống Listeria là những vi khuẩn hình que Gram dương, ngắn,
chúng kỵ khí, dương tính với catalase, âm tính với oxidase, di động ở 20250C và khơng di ñộng ở 370C.
- Phân loại học của Listeria.spp trong giới vi sinh vật như sau:

Thuộc giới: Bacteria.

Ngành : Fitmicutes.

Lớp: Bacilli.

10



Bộ: Bacillales.

Họ: Listeriaceae.

Giống: Listeria.
- Hiện tại có 7 lồi Listeria được cơng nhận:

Listeria monocytogenes.

Listeria ivanovii.

Listeria innocua.

Listeria wells.

Listeria seeligeri.

Listeria grayi (loài này hiện bao gồm cả loài cấp dưới Listeria murayi.).
- Trong đó, các lồi này chỉ có 2 lồi gây bệnh qua thực nghiệm và tự nhiên,
Listeria monocytogenes và Listeria ivanovii. Trước kia, chúng gây bệnh

cho người và ñộng vật, sau này chúng gây bệnh chủ yếu cho ñộng vật. Cả
2 lồi này và lồi Listeria seeligeri đều sản sinh ra β_ haemolysis trên
Sheep Blood Agar và đây chính là sợi dây nối kết với mầm bệnh. Tuy
nhiên, Listeria seeligeri không gây bệnh vì thế khơng thể xem xét một
cách riêng biệt ñặc ñiểm này như là một giả ñịnh về khả năng gây bệnh
của các lồi Listeria.
2.2.3. ðặc điểm chung của chi Listeria.
- Mối liên quan giữa các loài trong chi Listeria là chủ ñề ñược tranh luận
nhiều nhất. Ban ñầu, chi này ñược cho là một thành viên của họ
Corynebacteriaceae, bởi vì các đặc điểm hình thái học và sau đó nghiên
cứu phân loại hóa học lại cho thấy các lồi Listeria tương đối khác biệt so
với Corynebacteriaceae. Cho ñến năm 1984, trình tự từng phần với 16S
rRNA ñã khẳng định chính xác vị trí trên cây di truyền của chi Listeria

11


trong

nhóm Clostridium-

Bacillus-Lactobacillus,

với

Brochothrix

thermosphacta là gần nhất.
- Chi Listeria ban đầu được mơ tả là đơn type với duy nhất một thành viên
là Listeria monocytogenes. Những năm sau này, thêm 7 loài khác ñược xác

ñịnh: Listeria invanovii (trước ñây gọi là Listeria monocytogenes
serovar5), Listeria innocua, Listeria welshimeri, Listeria seeligeri,
Listeria muarrayi, Listeria grayi và Listeria denitrificans. Listeria
denitrificans ñược phân loại là Jonesia denitrifocans. Listeria murrays và
Listeria grayi từng được cho là có khác biệt so với các lồi Listeria khác
để đảm bảo cho sự thành lập một chi mới, Murraya, nhưng ngày nay ñược
xếp thành một loài duy nhất Listeria grayi. Gần ñây, Listeria ivanovii
được chia thành hai lồi phụ là: subsp.ivanovii, và subsp.londonniensis.
Trong số các lồi khơng thuộc “monocytogenes” chỉ duy nhất Listeria
ivanovii ñược xác ñịnh là tác nhân gây bệnh trên người.
2.2.4. ðặc điểm hình thái và kháng ngun.
- Các lồi Listeria là trực khuẩn Gram dương có kích thước ngắn (0.40.5ì0.5-2.0 àm). Chỳng mc trờn cỏc mụi trng nuụi cy không acid,
không sinh nha bào. Ở 200C, chúng chỉ di ñộng bằng lông mọc xung
quanh than, nhưng sự di ñộng khơng quan sát được ở 370C. Chúng là vi
khuẩn kỵ khí khơng bắt buộc và có thể mọc trên khoảng nhiệt ñộ dao ñộng
từ 0-450C ( tối ưu là 30-360C), mặc dù tốc ñộ mọc ở nhiệt ñộ thấp là chậm.
Chúng cũng mọc trên một khoảng pH dao ñộng rộng, một số chủng có thể
mọc ở pH 9.6, nhưng đạt điều kiện tối ưu ở mơi trường trung tính hoặc hơi
kiềm.

12


- Kháng ngun chính của các lồi Listeria là kháng ngun thân (O) và
kháng ngun lơng (H).Quy trình định type huyết thanh hiện nay dựa trên
các kháng nguyên này, ñã phân loại được 6 nhóm huyết thanh (1/2, 3, 4, 5,
6 và 7) và phân loại sâu hơn thành các serovar cho tất cả các loài trừ
Listeria grayu và Listeria invanoii. Trong khi Listeria invanoii và Listeria
welshimeri có thể được phân biệt với Listeria monocytogenes khẳng định
type huyết thanh thì các lồi khác có thể có chung một hoặc nhiều kháng

nguyên trùng với Listeria monocytogenes. Ví dụ, một số chủng Listeria
seeligeri có thể khơng phân biệt được về mặt kháng nguyên so với chủng
thuộc Listeria monocytogenes ở nhó, huyết thanh ½. Cũng cần lưu ý rằng,
mặc dù có 13 serovar của Listeria monocytogenes mới ñược xác ñịnh hiện
nay, trong khi hơn 90% các chủng phân lập trên lâm sang chỉ thuộc về 3
serovar: 1/2a; 1/2b va 4b, ñiều này làm hạn chế giá trị của kỹ thuật này
trong các nghiên cứu dịch tễ học. Các đặc tính quan trọng được liệt kê ở

Loại test

L.monocytogenes

L.innocua

L.seeligeri

L.ivanovii

L.welshimeri

Subsp.grayi

Subsp.murrayi

Bảng 2.1 Dùng ñể phân biệt các loài Listeria.

Tan máu beta (β)

+

-

+

+

-

-

-

+

-

W

-

-

-

-

W

-

-

-

-

-

-

CAMP test với
S.aureus
R.equi
Khử Nitrate

13


-

-

-

+

-

-

+

α-Methyl-D-

-

-

-

-

+

+

+

glucoside

+

V

-

-

-

-

V

-

-

+

-

-

-

-

+

+

+

+

V

V

V

+

+

-

-

V

V

V

Acid từ
D-Manitol
L-Rhamnose
D-Xylose

α-Methyl-Dmannoside

Với (+) ≥ 90% các chủng dương tính.
(-) ≤ 10% các chủng dương tính.
(V) 11-89% các chủng dương tính.
(W) các chủng dương tính yếu.
2.2.5. Cấu trúc.
2.2.5.1. Cấu trúc di truyền.
- Genome của Listeria monocytogenes và Listeria innocua ñược giải trình

tự có độ dài là 2.94 Mbp với 2583 khung ñọc mở và mol % G+C là 39.
Listeria innocua có genome dài 3.01 Mbp với 2973 khung ñọc mở và
thành phần mol 5% G+C là 37. Một ñiều ñáng chú ý là nhiều protein được
mã hóa bởi vi khuẩn này mang ñộ tương ñồng rất cao so với Bacillus
subtilis. Listeria monocytogenes có mức độ đa dạng thường ở nhiều quần
thể, do vậy,chúng có tới 331 gen mã hóa cho các protein vận chuyển khác

14


nhau (11,6% trong số tất cả các gen dự kiến) và 209 các vị trí điều hịa q
trình dịch mã ñược tìm thấy trên loại vi khuẩn này.
- Khoảng 0-79% các chủng Listeria monocytogenes có chứa plasmid này ở
dạng ẩn, sự ñề kháng với cadmium là hiện tượng phụ thuộc plasmid và các
plasmid ñặc hiệu cho hiện tượng ñề kháng với một hoặc nhiều loại kháng
sinh ñã ñược ghi nhận. Plasmid thường thấy trong các chủng Listeria
monocytogenes thuộc nhóm huyết thanh 1.
2.2.5.2. Cấu trúc tế bào.
- Nhân: là vùng nhân ngun thủy, chưa có màng nhân nên khơng có hình
dạng cố định vì vậy cịn gọi là vùng nhân.
- Ribosome: nằm tự do trong tế bào chất và chiếm tới 70% trọng lượng của
tế bào chất. Ribosome gồm hai tiểu phần ( 50S và 30S), hai tiểu phần này
kết hợp với nhau tạo thành ribosome 70S.
- Lông ( khuẩn mao ): là những sợi lơng rất mảnh, chúng có tác dụng giúp
vi khuẩn bám vào giá thể.
-

Màng tế bào: Màng cấu tạo bởi 2 lớp phospholipid (PL) chiếm 30 – 40% khối
lượng của màng, các protein chiếm 60 -70% khối lượng các màng. ðầu
phosphate của PL tích điện phân cực, ưa nước. ðầu hydrocacbon khơng tích

điện, khơng phân cực, và có tính kỵ nước.

15


Hình 2.3. Màng tế bào của vi khuẩn Listeria monocytogenes.
- Chức năng chủ yếu của màng.
- Khống chế sự qua lại của các chất dinh dưỡng, các sản phẩm trao ñổi chất.
- Duy trì áp suất thẩm thấu bình thường của tế bào.
- Là nơi sinh tổng hợp của thành phần tế bào và các polymer của bao nhầy.
- Là nơi sinh tổng hợp của nhiều enzyme, các protein của chuỗi hô hấp.
- Cung cấp năng lượng cho sự hoạt ñộng của tiên mao.
- Tiên mao: chúng quyết ñịnh khả năng và phu7o7nmg pháp di ñộng của vi
khuẩn, tiên mao là nhũng sợi lơng dài, dưới kính hiển vi quang học chỉ có

16


thể quan sát cấu trúc khi nhuộm theo phương pháp riêng. Dưới kính hiển
vi điện tử có thể thấy rõ cấu trúc của từng sợi tiên mao.
- Thành tế bào:
- Peptidoglycan chiếm 30 – 95%, là loại xốp, khá bền vững, cấu tạo bởi ba
thành phần:
- N-Acetylglucolsamin (NAG)
- Acid N0- acetylmuramic (NAM)
- Tetrapepid chứa cả D- và L- axit amin.
- Thành tế bào rất dày, hấp thu và giữ lại màu tím khi nhuộm với thuốc
nhuộm tím tinh thể.
- Thành tế bào làm những nhiệm vụ sau :
- Tham gia q trình trao đổi chất.

- Là nơi chứa đựng nhiều chất có chứa hoạt tính sinh học.
- Bao nhầy :
- Bào vệ vi khuẩn trong điều kiện khơ hạn.
- Bảo vệ vi khuẩn tránh khỏi bị thực bào.
- Cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn khi thiếu thức ăn.
- Giúp vi khuẩn bám vào giá thể.

Hình 2.4. Lơng roi của vi khuẩn Listeria monocytogenes.

17


2.2.6. Yếu tố ñộc lực.
2.2.6.1. Tổ hợp gen của Listeria monocytogenes.
_ Gen prfA (prfA): hoạt hố q trình lây lan cho tế bào chủ của vi khuẩn.
_ Gen plcA (PI-PLC) (phosphatidy linocitol-specific phospholipase C) là
protein được mã hố bởi gen plcA,33kDa), có tác dụng dung giải màng
khơng bào của thể thực bào.
_ Gen plcB(PC-PLC) (phosphatidulcholine-spefic phospholipase C, là
protein ñược mã hố bởi gen pclB, 29kDa):, có tác dụng dung giải màng
không bào của thể thực bào.
_ Gen hly (LLO là protein được mã hố bởi gen hly, 58.5kDa), có tác dụng
giải phóng vi khuẩn ra khỏi lkhơng bào của tế bào chủ.
_ Gen mpl (Mpl metallprotease được mã hố bởi gen mpl,60kDa) là gen
chứa 510 amino axit, có vai trị tham gia vào q trình hoạt động của gen
plcB.
_ Gen actA ( AtcA là protein được mã hố bởi gen ACTa,97kDa) có chức
năng giúp vi khuẩn lây lan từ tế bào này sang tế bào khác.
_ Gen inlA (InlA là protein được mã hố bởi gen inlA, 80kDa). Protein InlA
ảnh hưởng mạnh tới internalin khác, xố bỏ inlA thì sẽ dẫn tới biểu hiện

inlB cao hơn, có chức năng nội bộ hoá tế bào chủ.
_ Gen inlB (InlB là protein được mã hố bởi gen inlB, 67kDa), có chức
năng nội bộ hố tế bào chủ.
_ Trong đó gen prfA có vai trị như yếu tố điều hồ chính nhằm ổn ñịnh hoạt
ñộng của các gen plcA, plcB, hly, mpl, actA, inlA, inlB. Ngồi ra, cịn có
gen hly mã hố protein tạo ra sản phẩm Listeriolysin O (LLO) là tác nhân
gây bệnh Listeriosis ở người và động vật, plcA mã hố tạo PI-PLC và gen

18


plcB mã hoá tạo PC-PLC, gen inlA ,mã hoá cho internalin A, gen inlB mã
hoá cho internalin B, gen inlC mã hố cho internalin C. tất cả các gen này
đều phụ thuộpc vào gen prfA.
2.2.6.2. ðộc tố listeriolysin A (LLO).
_ Listeriosin A (LLO) là một ñộc tố protêin ñược tiết bởi L.monocytogenes
thóat khỏi khơng bào và thực bào chủ có trọng lựơng 58.6 kDa, hình thành
1 chuỗi polypeptide gồm 529 amino acid. Trình tự đầu N có đặc điểm là
phần đầu có tính ái nước, mang điện tích dương và ñượ theo sau bởi 20
ñầu kỵ nước. trình tự này mã hố trực tiếp cho protein và được phân cắt
sau vị trí lysine 25. kết quả là LLO được bắt ñầu từ amino axit thứ 26 và
có trọng lượng phân tử là 55.8kDa, dài 504 axit amin.
_ LLO thuộc nhóm độc tố gắn lên cholesterol được hoạt hố bởi nhóm thiol
ñược tạo ra ở hầu hết các vi khuẩn Gram (+).
_ Hoạt tính dung huyết của LLO có liên quan đến pH của mơi trường. Nó
hoạt động cao nhất ở pH 5.5 và gần như bị bất hoạt ở pH 7.0. Sự phát
hiện này có thể giải thích vai trị của LLO trong quá trình xâm nhiễm của
Listeria monocytogenes. Sau q trình thực bào, mơi trường acid của
khơng bào chứa tế bào vi khuẩn sẽ hoạt hố LLO. Chính độc tố này xúc
tiến q trình ly giải khơng bào và vi khuẩn xâm nhập vào tế bào chất,

trong khi đó pH cao hơn sẽ làm giảm hoạt tính của LLO.
2.2.6.3. Vai trị của yếu tố độc lực.
_ Listeria monocytogenes tồn tại trong mơi trường đa dạng như: mơi trường
sống bao gồm ñất, nước, thức phẩm, ñộng vật. Gen prfA quy định sự biểu
hiện của các gen có tính độc đó. Bên ngoài tế bào chủ, gen prfA tồn tại ở

19


trạng thái hoạt ñộng thấp. Khi ở bên trong tế bào chủ, gen prfAkích hoạt
(prfA*) và biểu hiện các gen cần thiết cho cuộc xâm nhập vào tế bào chủ.
_ Listeria monocytogenes xâm nhập vào tế bào của cơ thể vật chủ thông qua
cơ chế thực bào. Nếu Listeria monocytogenes vẫn cịn sống sau giai đoạn
đầu xâm nhiễm này, nó ñược cơ thể vật chủ tiếp nhận nhờ protein bề mặt
ñượ gọi là internalin A (inlA) và internalin B (inlB). InlA tương tác với eCarherin tạo ñiều kiện cho Listeria monocytogenes đi vào tế bào biểu mơ,
InlB nhận diện Clq-R ( hoặc Met) cho phép Listeria monocytogenes xâm
nhập vào trong nhiều loại tế bào của vật chủ. Sauk hi xâm nhiễm ñược vào
tế bào vật chủ, Listeria monocytogenes phân giải không bào tạo ra các lỗ
trên màng tế bào và hoạt giải độc tính lưu huỳnh PI-PLC kết hợp với PCPLC, giúp LLO phân giảikhông bào.

20