Đồ án tìm hiểu phương pháp chuyển gen thực vật tạo gạo vàng giàu vitamin a

LỜI CẢM
ƠN
Hoàn thành Đồ án này cho tôi được bày tỏ lòng biết ơn
sâu
sắc đến thầy giáo Thầy Tạ Ngọc Ly đã tận tình giúp đỡ tôi
trong
suốt thời gian học tập, thực tập nghiên cứu vừa
qua.
Tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trong bộ môn
Công
Nghệ Sinh Học đã giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi được trang bị
nhiều
kiến thức bổ ích cũng như hoàn thành Đồ án
này.
Cuối cùng xin cho phép con được cảm ơn các bạn trong
lớp
09SHLT đã động viên, giúp đỡ cho tôi hoàn thành Đồ án này.
Xin
được tri ân tất cả những
người.
Đà Nẵng, ngày 22 tháng 12 năm
2009
Sinh viên thực
hiện
Võ Khắc
Phi
GVHD: Tạ Ngọc
Ly
1
SVTH: Võ Khắc
Phi

ĐẶT VẤN
ĐỀ
Gạo là thức ăn chính cho hơn 3 tỷ người trên thế giới, cung cấp chủ yếu
nguồn
năng lượng và protein trong khẩu phần ăn của người dân châu á cũng như châu
Phi.
Hạn chế ở gạo là không có hoặc chứa ít các vi chất dinh dữơng thiết yếu, như
không
chứa vitamin A, rất ít vitamin E, sắt và kẽm. Thêm vào đó, nhiều trường hợp vi
chất
lại ở dạng khó hấp thu. Điều này là nguyên nhân chính gây ra hiện tượng suy
dinh
dưỡng ở nhiều nước đang phát triển nơi người dân dựa vào gạo là nguồn thức
ăn
chính. Hiện nay trên thế giới có khỏang trên 2 tỷ người suy dinh dưỡng do thiếu
chất
vi lượng sắt, vitamin A, iốt và kẽm. Vì vậy, thiếu vi chất dinh dưỡng đang còn là
vấn
đề sức khỏe cộng đồng ở các nước đang phát triển. ở Việt Nam, tình trạng thiếu
chất
sắt, vitamin A còn khá phổ biến nhất là ở các vùng sâu, vùng xa, miền
núi.
Hậu quả cho xã hội và cá nhân do thiếu vi chất dinh dưỡng rất lớn như hạn chế
khả
năng làm việc, giảm phát triển trí tuệ, dễ mắc các bệnh nhiễm trùng. Trong các
năm
qua, các hoạt động chính của chiến lược thanh toán bệnh do thiếu dinh dưỡng là
bổ
sung vi chất bằng đường uống cho các đối tượng có nguy cơ cao, đa dạng hóa bữa
ăn,

tăng cường vi chất vào thực phẩm. Tuy nhiên, biện pháp này chưa thể giải quyết
được
vấn đề vì tốn kém. Các loại thực phẩm giàu dinh dưỡng nằm ngoàI khả năng thu
nhập
của cộng đồng dân cư nghèo. Vì vậy, hiện nay một giải pháp mới được đề nghị là
chọn
tạo các giống cây trồng, đặc biệt là lúa, có chứa hàm lượng các vi chất dinh dưỡng
cao
hơn các giống đang có. Giải pháp tăng cường vi chất bằng sinh học
(biofortification)
này được xem là hiệu quả, kinh tế và bền
vững.
Theo hướng này, các trung tâm nghiên cứu lúa gạo trên thế giới đã tiến
hành
nghiên cứu tạo được nhiều dòng lúa giàu β-caroten (tiền vitamin A) bằng phương
pháp
chuyển nạp gen qua trung gian Agrobacterium tumefaciens và chọn lọc bằng
mannose
thay thế cho hệ thống chọn lọc bằng chất kháng sinh hoặc chất diệt cỏ. Phương
pháp
chuyển nạp gen này có ý nghĩa trong việc tạo ra các dòng lúa biến đổi gen sạch,
khắc
phục các mối lo ngại về tính an toàn của cây biến đổi gen hiện nay. Để góp phần
phổ
biến cho mọi người hiểu về ý nghĩa của việc nghiên cứu lúa (gạo) chuyển gen giàu
β-
caroten, cũng như cách thức mà các nhà khoa học tạo ra giống lúa này, em đã chọn
đề
tài “Tìm hiểu Phương pháp chuyển gen thực vật tạo gạo vàng giàu vitamin A” để
vừa

phát triển kiến thức của bản thân vừa tạo ra một nguồn tư liệu cho mọi người
cùng
tham khảo. Do thời gian có nhiều hạn chế, kiến thức chuyên môn còn non kém
nên
những gì trình bày trong đề tài này khó lòng tránh khỏi nhiều thiếu xót. Kính
mong
nhận được sự hướng dẫn, giúp đỡ và góp ý của quý thầy cô và các bạn để bài tìm đề
tài
của tôi được hoàn thiện
hơn.
Phần
1:
TỔNG
QUAN
A. CHUYỂN GEN THỰC
VẬT
1.1. Khái niệm chuyển gen thực
vật
Công nghệ chuyển gen thực vật là đưa vào một loài cây trồng những gen
mong
muốn có nguồn gốc từ những cơ thể sống khác nhau, không chỉ giữa các loài có
họ
gần nhau mà còn ở những loài rất xa nhau bằng các phương pháp vật lý, hóa học,
sinh
học, để tạo giống thực vật thu được giống mới nhanh hơn và vượt qua những giới
hạn
của kỹ thuật tạo giống truyền
thống.
Cây chuyển gen (transgenic plant) là cây mang một hoặc nhiều gen được đưa
vào

bằng phương thức nhân tạo thay vì thông qua lai tạo như trước đây. Những gen
được
tạo đưa vào (gen chuyển) có thể được phân lập từ những loài thực vật có quan hệ
họ
hàng hoặc từ những loài khác biệt hoàn toàn. Thực vật tạo ra được gọi là thực
vật
“chuyển gen” mặc dù trên thực tế tất cả thực vật đều được “chuyển gen” từ tổ
tiên
hoang dại của chúng bởi quá trình thuần hóa, chọn lọc và lai giống có kiểm soát
trong
một thời gian
dài.
1.2. Các phương pháp chuyển gen thực
vật
Nhiều phương pháp khác nhau đã được phát minh để đưa gen vào tế bào và
mô
thực vật. Kỹ thuật đơn giản nhất là chuyển DNA trần bằng vi tiêm
(microinjection),
xung điện (electroporation), súng bắn gen. Ngoài ra còn phương pháp phức tạp và
hiệu
quả hơn là chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn
Agrobacterium,
Tuỳ thuộc vào đối tượng chuyển gen mà người ta lựa chọn phương pháp
chuyển
gen phù
hợp.
1.2.1. Vi
tiêm
Nguyên tắc của phương pháp vi tiêm là một lượng nhỏ DNA được tiêm trực
tiếp

vào nhân tế bào phôi trần hoặc tế bào nguyên vẹn một cách cơ học dưới kính hiển
vi.
Phương pháp này cho phép đưa gen vào đúng vị trí mong muốn ở từng tế bào với
hiệu
quả tương đối cao.Tuy nhiên do đòi hỏi phải tinh vi, tỉ mỉ và cực kỳ chính xác nên
hạn
chế số lượng tế bào vi tiêm và ngoài ra còn có thể làm tổn thương đến tế bào phôi
do
tác nhân cơ học gây ra khi tiến hành vi
tiêm.
A
B
A
Hình 1.2.1 - A -Thiết bị tạo kim, B- máy vi thao
tác
C
Hình 1.2.1 - C - Hình ảnh vi
tiêm
Hệ thống này gồm có hai bộ phận chính là kính hiển vi và máy vi thao tác.
Kính
hiển vi dùng cho mục đích này là kính hiển vi soi ngược (vật kính xoay ngược lên).
Ðộ
phóng đại thích hợp cho việc tiến hành vi tiêm vào phôi cá một tế bào là khoảng
từ
40-60
lần.
Máy vi thao tác gồm 2 phần giống hệt nhau được bố trí hai bên kính hiển vi,
một
dùng để điều chỉnh kim tiêm, một dùng cho kim giữ. Tính năng của máy này là
cho

phép điều chỉnh các kim theo không gian 3 chiều. Kim tiêm và kim giữ được lắp
vào
máy vi thao tác và được nối với syringe qua ống bằng chất dẻo được nạp đầy
dầu
parafin.
Vi tiêm được tiến hành qua các bước: nạp gen vào kim tiêm bằng phương
pháp
capillar (ngâm đầu kim tiêm vào dung dịch gen khoảng 10 -12 giờ) hoặc bơm trực
tiếp
dung dịch gen vào, lắp kim tiêm và kim giữ vào máy vi thao tác, chuyển trứng
tiền
nhân vào đĩa petri có chứa môi trường được đặt dưới kính hiển vi, giữ trứng tiền
nhân
vào đầu kim giữ bằng lực hút của syringe, điều chỉnh kính hiển vi để xác định đĩa
phôi
và điều chỉnh máy vi thao tác để đưa kim tiêm vào vị trí của trứng tiền nhân, đẩy
gen
vào trứng tiền nhân bằng cách vặn nhẹ syringe. Khi thấy trứng tiền nhân hơi phồng
to
và trở nên sáng hơn thì dừng lại và kéo nhanh kim tiêm ra. Trứng tiền nhân sau
khi
tiêm được di chuyển xa đến cuối đĩa petri trước khi tiêm trứng tiền nhân tiếp
theo.
Mỗi một nhóm trứng tiền nhân đã hoàn thành được chuyển sang một đĩa môi
trường
khác để ấp và đánh giá bằng mắt trong một vài tiếng. Sau đó tất cả các trứng tiền
nhân
được nhìn thấy rõ ràng và được chuyển vào ống dẫn trứng của con cái
nhận.
Ðối với thực vật thì phương pháp này được sử dụng đối với các tế bào tiền phôi

của
hợp tử hoặc các tế bào tiền phôi của hạt phấn. Tuy nhiên sự xâm nhập của gen
chuyển
vào DNA tế bào vật chủ là một quá trình ngẫu nhiên và xác suất để gen chuyển
xen
vào vị trí DNA vật chủ mà sẽ cho phép nó biểu hiện là thấp. Hiệu quả của vi tiêm
là
không
cao.
1.2.2. Súng bắn
gen
Súng bắn gen (Gene gun) là một thiết bị sử dụng để đưa thông tin di truyền vào
tế
bào, được thiết kế đầu tiên cho biến nạp DNA ngoại lai vào tế bào thực vật. Tên
chính
xác và đầy đủ của súng bắn gen là hệ thống phân phối hạt biolistics (biolistic
particle
delivery system) và kỹ thuật này thường được gọi một cách đơn giản là biolistics
(sự
kết hợp giữa hai thuật ngữ biology (sinh học) và ballistics (sự bắn tung)). Mặc dù
có
nhiều thiết kế kỹ thuật khác nhau nhưng nguyên lý chung của phương pháp này là
sử
dụng áp lực xung của khí helium để gia tốc các
hạt.
Súng bắn gen bao gồm hai buồng bằng thép không gỉ, kích thước 6“x7“x10“
nối
với hai bơm chân không. DNA ngoại lai được gắn vào các hạt tungsten có đường
kính
rất nhỏ, khoảng 1µm (các kim loại năng khác như vàng và bạc cũng được sử

dụng
nhưng không thường xuyên do giá cả đắt). Các hạt này được đặt trên một cái đĩa ở
mặt
bên trong của súng. Sự bùng nổ khí helium ở 1000psi làm cho cái đĩa bắn về
phía
trước với tốc độ 1300 food/s, tương đương với tốc độ khi một viên đạn rời
khỏi
nòng súng. Một tấm chắn làm dừng đĩa lại và các hạt vàng hay tungsten được
phóng
về phía các tế bào đích. Chúng xuyên qua vách tế bào và phóng thích các phân
tử
DNA.
Hình 1.2. 2 – Súng bắn gen thực vật và nguyên lý hoạt
động
Mục tiêu của súng bắn gen thường là callus của các tế bào thực vật giống nhau
sinh
trưởng trong môi trường gel trên đĩa petri. Sau khi các hạt tungsten đã va chạm
vào
đĩa, gel và callus bị phá vỡ nhiều. Tuy nhiên một số tế bào không bị phá vỡ khi
va
chạm mạnhvà đã tiếp nhận các hạt tungsten được bao bọc DNA và cuối cùng các
phân
tử DNA ngoại lai đã xâm nhập và hợp nhất vào nhiễm sắc thể thực vật. Các tế bào
từ
đĩa petri được tập hợp lại và chọn lọc các tế bào đã hợp nhất thành công và biểu
hiện
DNA ngoại lai bằng các kỹ thuật hóa sinh hiện đại như sử dụng gen chọn lọc
nối
tiếp và Northern blots. Các tế bào đơn đã chọn lọc từ callus có thể được xử lý với
một

số hormone thực vật như auxin, gibberelin và mỗi một tế bào có thể phân chia,
biệt
hóa thành các tế bào mô, cơ quan, tế bào chuyên hóa của toàn bộ cây. Cây mới
có
nguồn gốc từ một tế bào nảy mầm thành công có thể mang các đặc tính di truyền
mới.
Phương pháp này có ưu điểm là thao tác dễ dàng, có thể chuyển gen vào nhiều loại
tế
bào và mô, các tế bào được biến nạp có tỉ lệ sống sót cao, cho phép đưa các gen vào
tế
bào ở vị trí mong muốn Do vậy nó được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh
vực.
1.2.3. Xung
điện
Kỹ thuật xung điện (electroporation) là một phương pháp cơ học được sử dụng
để
đưa các phân tử phân cực vào trong tế bào chủ qua màng tế bào. Trong phương
pháp
này, một xung điện cao thế trong khoảnh khắc (vài phần nghìn giây) có khả năng
làm
rối loạn cấu trúc màng kép phospholipid, tạo ra các lỗ thủng tạm thời cho phép
các
phân tử DNA ngoại lai từ môi trường xâm nhập vào bên trong tế
bào.
Ðể tạo ra xung điện cao thế trong một thời gian ngắn người ta sử dụng một thiết
bị
gọi là máy xung gen (gene pulser). Khi công tắc thứ nhất đóng, tụ điện nạp điện vào
và
tích một điện áp cao. Khi công tắc thứ hai đóng, điện áp này phóng qua dịch
huyền

phù tế bào. Một xung điện cần thiết cho kỹ thuật này thường là khoảng
10.000-
100.000 v/cm (thay đổi tùy theo kích thước của tế bào) trong vài phần triệu giây
đến
một phần ngàn giây. Xung điện này làm rối loạn phospholipid kép của màng tế bào
và
tạo ra các lỗ tạm thời. Khả năng điện qua màng tế bào cùng lúc tăng lên 0,5-1,0 v
vì
vậy các phân tử đã được nạp điện này đi qua màng tế bào thông qua các lỗ bằng
cách
thức tương tự như điện
di.
Hình 1.2.3 – Máy xung gen và sơ đồ bố trí mạch cơ bản của máy xung
điện
Khi các ion đã nạp điện và các phân tử đi qua các lỗ, màng tế bào phóng điện
và
các lỗ này đóng lại một cách nhanh chóng và phospolipid kép phục hồi lại cấu
trúc
cũ. Lúc này các phân tử mong muốn đã ở trong tế bào và chúng được sử dụng cho
các
nghiên cứu tiếp
theo.
Phương pháp này có thể sử dụng đối với tế bào thực ật ở dạng protoplast Với
một
số cây một lá mầm quan trọng (loài lúa phụ Japonica, ngô, lúa mì). Hiệu quả biến
nạp
cao.
1.2.4. Chuyển gen nhờ vi khuẩn
Agrobacterium
Agrobacterium có khả năng xâm nhiễm tế bào thực vật bằng cách chuyển

một
đoạn DNA của nó vào tế bào thực vật. Khi DNA vi khuẩn được hợp nhất với
nhiễm
sắc thể thực vật, nó sẽ tấn công vào hệ thống tổ chức của tế bào một cách có hiệu
quả
và sử dụng nó để đảm bảo cho sự sinh sôi của quần thể vi khuẩn. Mặc dù hệ
thống
chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium là có hiệu quả đối với một số loài
nhưng
không phải tất cả thực vật có thể được biến nạp bằng con đường này. Ðặc biệt, lớp
một
lá mầm bao gồm các cây ngũ cốc chính trên thế giới như lúa, lúa mì và ngô là
không
được biến nạp dễ dàng nhờ A.
tumefaciens.
Ðể khai thác và sử dụng A. tumefaciens như là một
vector
chuyển gen các nhà khoa học đã loại bỏ các gen gây khối u
và
gen mã hoá opine của T - DNA và thay thế vào đó là các
marker
chọn lọc, trong khi vẫn duy trì các vùng bờ phải và bờ trái của
T-
DNA và các gen vir. Gen chuyển được xen vào giữa các vùng
bờ
của T - DNA. Nó sẽ được chuyển vào tế bào và trở nên hợp
nhất
với nhiễm sắc thể tế bào thực vật. Phương pháp chuyển gen
gián
tiếp nhờ Agrobacterium đã được kiểm tra đối với sự xâm

nhập
bền vững, sự biểu hiện và sự di truyền của các gen chuyển
đặc
biệt. Tuy nhiên, một vài yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến
nạp
là loại mô được biến nạp, giai đoạn phát triển của mô, mức
độ
khởi đầu của vi khuẩn A. tumefaciens sử dụng, môi trường
để
nuôi cấy mô sau khi biến nạp, marker được sử dụng để chọn
lọc
thể biến nạp, loại vector sử dụng và kiểu gen của thực
vật.
Hình 1.2.
4
Chuyển gen
nhờ
Agrobacterium
1.3. Mục đích, ý nghĩa, và một số thành tựu của chuyển gen thực
vật
1.3.1. Mục đích của chuyển gen thực
vật
Mục đích của Công nghệ chuyển gen thực vật chủ yếu
là:
+ Duy trì và mở rộng đa dạng sinh học
(biodiversity).
+ Tăng khả năng kháng (sức khỏe cây trồng và chống chịu các điều kiện bất
lợi).
+ Nâng cao chất lượng sản
phẩm.

+ Cải thiện khả năng tích lũy dinh
dưỡng.
+ Tăng cường tổng hợp các hợp chất có hoạt tính sinh
học.
+ Tạo ra sản phẩm không gây hại môi
trường.
1.3.2. Ý nghĩa của chuyển gen thực
vật
Nhìn chung, việc ứng dụng cây chuyển gen đã có những lợi ích rõ rệt như
sau:
- Tăng sản
lượng.
- Giảm chi phí sản
xuất.
- Tăng lợi nhuận nông
nghiệp.
- Cải thiện môi
trường.
1.3.3. Một số thành tựu của chuyển gen thực
vật
- Chuyển gen tạo Lúa gạo giàu vitamin A và
sắt.
- Chuyển gen tạo Khoai tây tăng hàm lượng tinh
bột.
- Chuyển gen tạo Vaccine thực phẩm (edible vaccine) ở ngô và khoai
tây.
- Chuyển gen tạo những giống ngô có thể trồng được trong điều kiện
nghèo
dinh
dưỡng.

- Chuyển gen tạo dầu ăn có lợi cho sức khoẻ hơn từ đậu nành và cải
dầu.
1.4. Những nguy cơ từ chuyển gen thực
vật
Bên cạnh những ưu điểm chuyển gen thực vật cũng có những nguy cơ tiềm
ẩn
trong việc phát triển những kỹ thuật mới. Bao
gồm:
- Mối nguy hiểm trong việc vô tình đưa những chất gây dị ứng hoặc làm giảm
dinh
dưỡng vào thực
phẩm.
- Khả năng phát tán những gen biến nạp trong cây trồng sang họ hàng hoang
dại.
- Sâu bệnh có nguy cơ tăng cường tính kháng với các chất độc tiết ra từ cây
chuyển
gen.
- Nguy cơ những chất độc này tác động tới các sinh vật không phải là loại sinh
vật
cần diệt, vì thế có thể làm mất cân bằng sinh
thái.
Nhìn chung, mặc dù còn những điểm còn chưa rõ ràng về cây chuyển gen
nhưng
với khả năng tạo ra những giống cây trồng mới có giá trị kinh tế, công nghệ này có
vai
trò không thể phủ nhận được. Tuy vậy, vẫn còn một số vấn đề đáng lo ngại. Để
giải
quyết những vấn đề này thì những kết luận thu được phải dựa trên những thông tin
tin
cậy và có cơ sở khoa

học.
B.
GẠO
1.5. Gạo
(Rice)
Gạo là một sản phẩm lương thực thu từ cây lúa. Hạt gạo thường có màu trắng,
nâu
hoặc đỏ thẫm, chứa nhiều dinh dưỡng. Hạt gạo chính là nhân của thóc sau khi tách
bỏ
vỏ trấu và cám. Gạo là lương thực phổ biển của gần một nửa dân số thế
giới.
1.5.1. Nguồn
gốc
Cây lúa hiện nay được nông dân gieo trồng là kết quả xử lý trong phòng thí
nghiệm
và lai tạo tự nhiên cũng như nhân tạo của nhiều thế kỷ từ cây lúa
dại.
Hình 1.5.1 – Cây lúa của nông dân, kết quả của các nhà khoa
học
Vì quỹ đất có giới hạn, các nhà khoa học đang nghiên cứu biến đổi gen của cây
lúa
để tạo ra giống lúa mới có năng suất cao, chống được bệnh tật và thời tiết khắc
nghiệt,
đồng thời rút ngắn thời gian chăm bón và sớm cho thu hoạch. Những thành công
ban
đầu của lúa biến đổi gen đã được ghi nhận, song hiện các nhà khoa học vẫn chưa
thống
nhất được liệu loại lúa này có tác động xấu đến sức khỏe con người hay
không.
1.5.2. Sản xuất lúa gạo ở Việt

Nam
Việt Nam có hai vùng trồng lúa chính là đồng bằng sông Hồng ở phía Bắc và
đồng
bằng sông Cửu Long ở miền Nam. Hàng năm sản lượng của cả nước đạt 33-34
triệu
tấn thóc, trong đó chỉ sử dụng khoảng 8 triệu tấn (tương đương 4 triệu tấn gạo sau
khi
xay xát) cho xuất khẩu, còn lại là tiêu thụ trong nước và bổ sung dự trữ quốc
gia.
- Ở miền Bắc một năm có hai vụ lúa chính: vụ chiêm và vụ
mùa.
- Ở miền Nam, nông dân trồng ba vụ một năm: vụ đông xuân (có sản lượng
cao
nhất và thóc cũng đạt chất lượng tốt nhất cho xuất khẩu), vụ hè thu và vụ ba. Do
lũ
GVHD: Tạ Ngọc
Ly
10
hàng năm ở đồng bằng sông Cửu Long trong những năm gần đây ảnh hưởng đến
sản
xuất, một phần nữa người dân có thể kiếm lời ổn định hơn từ việc nuôi thủy sản
(tôm)
hay trồng cây ăn quả, chính quyền đã khuyến cáo nông dân giảm và chuyển đổi
một
phần đất trồng lúa vụ
ba.
Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn là bộ chủ quản, quản lý việc sản xuất
lúa
gạo của Việt
Nam.

1.6. Gạo vàng (Golden
Rice)
Hình 1.6 – Hạt gạo vàng giàu
β-caroten
"Golden rice" là loại gạo được biến đổi gen nhằm tạo ra nhiều tiền tố vitamin A
(β-
caroten ) cho người dùng. Hạt gạo vàng còn gọi là “Hạt Hy Vọng” là một khám
phá
lớn của ngành nghiên cứu lúa gạo thế giới vào đầu thế kỷ 21. Trong năm 2000,
công
nghệ này đã gây ra tiếng vang lớn trong nghiên cứu về dinh dưỡng thế giới - một
loại
gạo biến đổi di truyền màu vàng có chứa tiền sinh tố A và một số lượng lớn
chất
sắt được phát minh. Từ năm 2000 và đến nay các viện nghiên cứu trên thế giới đã
tạo
được hai loại là GR1 và
GR2.
- GR1 được tạo ra khi chuyển gen sinh tiền tố Vitamin A từ cây hoa thủy tiên
và
Erwinia uredovora vào giống lúa
Indica.
- GR2 được cải tiến từ GR1 bằng cách thay gen sinh tiền tố Vitamin A từ cây
hoa
thủy tiên bằng gen từ cây bắp. GR2 sản xuất ra lượng tiền tố vitamin A cao gấp 23
lần
so với
GR1.
1.6.1. Tình hình phát triển của gạo vàng trên thế
giới.

Gạo vàng được bắt đấu tiến hành nghiên cứu từ năm 1999. Đến năm 2000 thì
GR1
ra
đời.
Vào ngày 27-3-05, một đội ngũ khoa học gia của công ty Hạt Giống Syngenta
ở
Cambridge, Anh Quốc, đã tuyên bố khám phá được loại gạo vàng mới (GR 2)
chứa
lượng β-caroten gấp 23 lần lớn hơn gạo vàng cũ (GR 1) được khám phá vào
năm
2000.
Ngày 14-10-2008, Rockefeller Foundation tuyên bố sẽ tài trợ Viện Thí
Nghiệm
Lúa Quốc Tế (IRRI) ở Philippines để hỗ trợ dự án “Hạt gạo vàng”, nhằm tăng tốc
quy
trình kiểm tra chấp thuận loại lương thực GM này tại các nước đông dân: Ấn
Độ,
Bangladesh, Indonesia và Philippines. Cơ quan Rockefeller hy vọng tài trợ nêu trên
sẽ
giúp Hạt gạo vàng đến tay nông dân sớm hơn để họ có thể sản xuất đại
trà.
1.6.2. Ý nghĩa của việc tạo ra Gạo vàng (Golden
Rice)
Người ta dự tính khoảng 100 đến 140 triệu trẻ em trên thế giới đang bị
thiếu
vitamin A, gây ra mù mắt, bệnh sởi và tử vong. Việc nghiên cứu tạo thành công
giống
lúa cho Gạo vàng có thể cứu hàng trăm ngàn trẻ em bị mù hàng năm vì thiếu
vitamin
A.

Gạo Vàng là sự kiện lớn nhất là khi mà giá lương thực ngày một cao, trên
thị
trường giống gạo này đã xuất hiện ở Iran 2005, đang khảo nghiệm ở Trung
Quốc,
Philipin và nhiều nước Châu Á khác. Theo dự báo Gạo vàng sẽ được thương mại
hóa
vào năm 2011 là một sản phẩm dinh dưỡng mới có tiềm năng lớn về mặt kinh tế.
Hứa
hẹn mang lại một nguồn thu nhập khổng lồ cho các Quốc gia đang đầu tư nghiên
cứu
và đang dần thành công trong đề tài “Golden rice”
này.
Gạo chuyển gen góp phần đảm bảo an ninh lương thực và xóa bỏ nạn
đói.
Gạo vàng ra đời mang ý nghĩa to lớn cho thấy sức mạnh và giá trị ứng dụng
của
công nghệ sinh học đối với đời sống con
người.
Phần
2:
CHUYỂN GEN GẠO
VÀNG
2.1. Đối tượng nghiên
cứu:
Sử dụng Phôi non và hạt gạo các giống lúa Taipei 309, IR64 và MTL 250
(Indica)
có đặc điểm tốt về nông học, chất lượng để thực hiện biến đổi
gen.
Các Viện nghiên cứu đã sử dụng công nghệ biến đổi gen đưa một gen của cây
thủy

tiên hoa vàng hoặc từ cây ngô và vi khuẩn Erwinia uredovora vào bộ gen của lúa,
tạo
ra giống lúa mới có hàm lượng vi-ta-min
A.
Sử dụng hai loại vector chuyển gen gồm hai plasmid là pCaCar và pFun3
để
chuyển gen vào vi khuẩn Agrobacterium
tumefactien.
Dùng vi khuẩn A. tumefactien đã được gắn plasmid nói trên để chuyển đoạn
DNA
mong muốn vào trong phôi của các giống lúa được chọn
lọc.
2.2. Phương pháp nghiên
cứu
Hạt gạo vàng là một thành quả lớn trong chương trình nghiên cứu của đội ngũ
khoa
học gia Thụy Sĩ và Đức, được cơ quan Rockerfeller Foundation của Mỹ tài trợ
100
triệu USD trong 10 năm. Đội ngũ này được hướng dẫn bởi Giáo sư Ingo
Potrykus,
Viện Kỹ Thuật Liên Bang ở Thụy Sĩ, và Tiến Sĩ Peter Beyer, Đại học Freiburg
ở
Đức.
Các nhà khoa học đã sử dụng phôi của hạt lúa nuôi cấy mô tái sinh cây lúa
phòng
thí nghiệm rồi chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens để đưa tất cả
các
gen lạ vào phôi hạt lúa sau
đó.
Kiểm tra biểu hiện của gen qua kiểm tra kiểu hình (hạt gạo có màu vàng), kiểm

tra
theo phương pháp đánh giá cảm quan bằng mắt
thường.
Kiểm tra sự xuất hiện của các gen chuyển trong cây lúa chuyển gen bằng
phương
pháp điện di và
PCR.
2.3. Quy trình kỹ thuật chuyển gen Gạo vàng (Golden
Rice)
2.3.1. Cơ chế tạo Gạo vàng (Golden
Rice)
β-caroten
Bản thân hạt gạo có chứa geranyl geranyl diphosphate (GGPP) một tiền chất
quan
trọng trong tiến trình sinh tổng hợp β-caroten. Nhưng cây lúa thường thì lại không
hề
chứa β-caroten, bằng chứng là hạt gạo thường có màu trong suốt mà không hề có
màu
vàng đặc trưng của β-caroten. Để GGPP chuyển hóa thành các chất trung gian
rồi
chuyển thành β-caroten thì cần có các Ezim xúc tác tương ứng, nhưng bản thân cây
lúa
lại không có chứa các gen có nhiệm vụ sinh tổng hợp ra các enzim cần thiết để xúc
tác
cho các phản ứng chuyển hóa GGPP thàn β-caroten. Khi chuyển các đoạn gen
psy,
crtI, lcy vào trong cây lúa thì sẽ tạo ra một sự thay đổi rất lớn. Khi đó, gen psy là
gen
mã hóa để sinh tổng hợp ra enzim phytoen synthase có nhiệm vụ xúc tác để
chuyển

hóa GGPP (20 C) thành phytoen (40 C). Tiếp theo đoạn gen crtI mã hóa để sinh
tổng
hợp enzim phytoene desaturase có nhiệm vụ chuyển hóa phytoen thành ζ-Caroten
rồi
chuyển hóa tiếp thành Lycopen. Cuối cùng gen lcy mã hóa để sinh tổng hợp
enzim
Lycopen β-Cyclase có nhiệm vụ xúc tác chuyển hóa Lycopen thành β-caroten. Và
kết
quả là hạt gạo chuyển gen thể hiện kiểu hình có màu vàng đặc trưng của β-caroten
và
chứa một lượng tiền vitamin A rất lớn so với hạt gạo bình
thường.
Hình 2.3.1 – Sự khác biệt giữa gạo thường và gạo chuyển
gen
2.3.2. Quy trình kỹ
thuật
Tách chiết gen psy và gen
lyc
từ cây Daffodil hoặc từ
cây
ngô
Tách chiết gen crt1
từ
vi khuẩn đất Erwinia
-
uredovora
Chuẩn bị hạt
giống
B4
B3

Taipei 309, IR64
và
Chuyển gen vào
Plasmid
pCaCar
Chuyển gen
vào
Plasmid
pFun3
MTL 250
(Indica)
B5
Chuyển plasmid vào A.
tumefactien
Nuôi tăng sinh vi
khuẩn
B6
Nuôi cấy A. tumefactien trên
đĩa
thạch có chứa mầm tái sinh từ
phôi
B1
Chọn hạt có phôi
tốt
B2
B7
Nuôi cấy mô tái sinh
cây
từ phôi hạt
lúa

B8
Nuôi tăng sinh và tái tạo cây con
từ
mầm tái sinh đã chuyển
gen
B9
Trồng lúa chuyển gen và cho
lai
với giống lúa địa
phương
B10
Trồng đại trà thu
sản
phẩm gạo
vàng
2.3.3. Thuyết minh quy
trình
Trong cây lúa biến đổi gen người ta đưa vào để biểu hiện hai gen mã hóa,
phytoene
synthase (psy) và lycopene cyclase (lcy) từ cây hoa thủy tiên vàng và gen mã
hóa
carotoene synthetase 1 (crt1) từ vi khuẩn đất Erwinia uredovora. Nhưng người ta
thấy
rằng loại lúa này không cho nhiều tiền tố vitamin A như mong đợi vì psy làm
giảm
hiệu quả tích tụ β-caroten trong nội nhũ của hạt gạo. Vì thế gen psy từ cây hoa
thủy
tiên vàng được thay thế bằng gen psy từ
ngô.
Bước 1: Giống lúa Taipei 309, IR64 và MTL 250 (Indica) được trồng trong

nhà
kính với các điều kiện môi trường tối ưu, được sinh trưởng phát triển tốt, đảm bảo
sạch
bệnh. Người ta chọn những cây lúa có đặc điểm tốt, chọn hạt chắc mẩy, bóc vỏ
để
chọn phôi tốt rồi tiến hành bảo quản trong môi trường vô
trùng.
Hình 2.3.3 a – Cây lúa được trồng trong các điều kiện nhân tạo tối ưu để lấy nguyên
liệu
chuyển
gen
Bước 2: Tiến hành nuôi cấy mô từ phôi đã chọn lọc ở Bước 1 để chuẩn bị
nguyên
liệu cho giai đoạnc chuyển gen. Quá trình nuôi cấy sử dụng môi trường MS có
thành
phần như
sau:
A.Đa lượng
(g/l)
KNO
3
19.0
NH
4
NO
3
16.5
CaCl
2
.2H

2
O
4.4
MgSO
4
.7H
2
O
3.7
B.Phosphat
(g/l)
KH
2
PO
4
1.7
NaH
2
PO
4
1.7
C.Vi lượng1
(g/l)
H3BO3
0.62
MnSO4.H2O
1.69
ZnSO
4
.2H

2
O
0.86
D.Vi lượng 2
(g/l)
KI (Kali iodua)
0.83
Na2MoO4.2H2O
0.25
E.Vi lượng 3
(g/l)
CuSO
4
.5H
2
O
0.25
CoCl
2
.6H
2
O
0.25
F.Sắt/EDTA
(g/100ml)
Na
2
EDTA
0.372
FeSO4.7H

2
O
0.278
G.Vitamin
(mg/100ml)
Glycin
200
Nicotinic acid
50
Pyridoxin-HCl
50
Thiamin-HCl
10
Myo-inositol
10.000
* Muốn có 1 lít môi trường làm việc
MS
-Chuẩn bị một bình dung tích 2 lít, chứa sẵn 400ml nước
cất
-Thêm 100ml A và 100ml
B
-Thêm 10ml C và 10ml
F
-Thêm 1ml D và 1ml
G
-Thêm 0,1ml
E
-Thêm nước cất cho đủ 1
lít.
Bước 3: Tách chiết ADN từ vi khuẩn đất Erwinia uredovora, sau đó tiến hành

cắt
bằng enzim EcoRI và Kpnl để thu nhận đoạn gen
ctrI
Quá trình tách chiết gen ctrI được tiến hành như
sau:
Lấy 1 ml nước cho và một ít giống vi sinh vật (vi khuẩn Erwinia uredovora)
trên
ống thạch nghiêng cho vào ống eppendorf rồi đem cân. Lấy thêm một ống
eppendorf
khác, thêm nước vào sao cho có khối lượng bằng với khối lượng của ống thí
nghiệm
và đem hai ống đi ly
tâm.
Đưa hai ống vào máy ly tâm, đặt sao cho 2 ống ở vị trí đối xứng tâm với nhau
qua
trục quay của máy ly tâm. Đóng cửa của máy và đặt chế độ ly tâm cho máy như
sau:
- Tốc độ quay: 10000
vòng/phút
- Thời gian ly tâm : 1
phút
- Nhiệt độ ly tâm:
10
0
C
Sau khi ly tâm, lấy ống thí nghiệm ra, thấy hỗn hợp phân thành 2 lớp. Ta loại
bỏ
lớp nước nổi ở phía trên đi, chỉ giữ lại phần lắng (Phần sinh khối vi sinh vật). Tiếp
tục
ta thêm vào ống thí nghiệm vừa loại bỏ phần nổi 200 microlit InstaGene (InstaGene

là
hỗn hợp các chất – là bộ kid để test nhanh), rồi đem ủ ở 56
0
C trong máy ổn
nhiệt
trong 30 phút để hoạt hóa enzim. Bấm đồng hồ để canh thời
gian.
Sau 30 phút lấy ống thí nghiệm ra khỏi máy ổn nhiệt và đem ống đi lắc mạnh
trong
10 giây bằng máy vortex. Sau đó tiếp tục đưa ống vào đặt trong bể ổn nhiệt ở
95
0
C
hoặc nước sôi trong 8 phút. Bấm đồng hồ để canh thời
gian.
Sau 8 phút, lại lấy ống ra đem lắc mạnh bằng vortex trong 10 giây. Rồi đem ly
tâm
với chế độ ly tâm được cài đặt
là:
- Tốc độ: 11000
vòng/phút
- Thời gian ly tâm: 2-3
phút
- Nhiệt độ ly tâm:
10
0
C
Sau khi ly tâm, lấy ống nghiệm ra quan sát thấy hỗn hợp phân thành 3 lớp. Lớp
trên
cùng chính là ADN có khối lượng nhỏ nhất nên nổi lên trên sau khi ly

tâm.
Phần AND sau khi tách ra được tiến hành cắt đoạn gen cần (đoạn gen ctrI)
bằng
enzim EcoRI. Ta thu nhận được đoạn gen ctrI để sử dụng trong chuyển gen ở các
bước
sau.
Bước 4: Hoa thủy tiên (hoặc ngô) được trồng trong nhà kính với các điều kiện
môi
trường tối ưu, đảm bảo sạch bệnh, được chọn lọc với điều kiện cây sinh trưởng
phát
triển tốt, cho hoa có màu vàng tươi. Người ta chọn những bông hoa (quả ngô)
đang
trong thời gian phát triển mạnh để chiết xuất gen. Gen psy và gen lyc của các bông
hoa
(quả) này được tiến hành theo các giai đoạn như
sau:
- Bỏ 10 g đá khô vào xay nhuyễn, sau đó cho 8 g hoa thủy tiên (hoặc hạt ngô),
xay
cho đến khi thành bột
mịn.
- Chuyển bột này vào cốc đã được làm lạnh trên nitơ lỏng trước rồi cho vào cốc
50
ml nitơ lỏng. Đặt ở -20 độ trong vòng 6
tiếng.
- Cho 20 ml dung dịch đệm đã được đun sôi vào mẫu bột đã được xử lí trên rồi
tiến
hành lắc
nhẹ.
- Ngâm trong bể ổn nhiệt ở 56 độ trong vòng 20
phút.

- Cho 20 ml Chloroform: isoamylalcohol (24:1) vào rồi lắc đều ở nhiệt độ
phòng.
Sau khi lắc chuyển dịch chiết tách trên qua ống dùng để quay li tâm và tiến hành
quay
li tâm ở nhiệt độ phòng (2800 rpm, 20
phút)
- Chuyển lớp nước ở phía trên vào ống nghiệm mới sau đó cho 2 ml dung
dịch
CTAB 10 % đã được hâm nóng ở 70
0
. Sau đó trộn
đều.
- Cho 20 ml Chloroform: isoamylalcohol (24:1) vào rồi lắc đều ở nhiệt độ
phòng.
Sau đó quay li tâm ở nhiệt độ phòng (2800 rpm, 20
phút).
- Cho 30 ml đệm kết tủa CTAB sau đó trộn đều cho tới khi có một màng
ADN
màu trắng đục nổi
lên.
- Quay li tâm ở nhiệt độ phòng (3000rpm, 20 phút). Loại bỏ phần dịch lỏng
thu
phần kết
tủa.
- Hòa tan kết tủa bằng 5ml dung dịch muối ở nhiệt độ 56
o
C NaCl 1M và cho
vào
dung dịch 5µl enzyme RNase 10mg/ml để phân hủy RNA
.

- Cho 10ml cồn lạnh nguyên chất và lắc đều để kết tủa
ADN.
- Quay li tâm, lấy phần
tủa.
- Cho 20ml cồn 70 %, quay li tâm, lấy phần
tủa.
- Cho 20 ml cồn nguyên chất, quay li tâm lấy phần
tủa.
- Quay phần tủa với nắp ống nghiệm được mở để làm khô ADN. Lúc
này
ADN sẽ chuyến sang trong suốt không
màu
- Phần AND sau khi tách ra được tiến hành cắt đoạn gen cần (đoạn gen psy và
lcy)
bằng enzim EcoRI và HindIII. Ta thu nhận được đoạn gen ctrI để sử dụng
trong
chuyển gen ở các bước
sau.
Bước 5: Các nhóm gen sau khi được chiết xuất, tinh sạch sẽ được cắt thành
các
đoạn nhỏ được chuyển vào 2 plasmid là pCaCar và pFun3. Trong đó hai gen psy,
crt1
được chuyển vào plasmid pCaCar, gen còn lại là lcy được chuyển vào một
plasmid
pFun3.
Hình 2.3.3b – Plasmid chuyển gen (Đã được minh họa thành đường
thẳng)
Bước 6: Các plasmid được chuyển vào hai đĩa petri khác nhau có nuôi vi
khuẩn
Agrobacterium tumefacien dòng mannopine type Ti plasmid. Plasmid tự động

chuyển
vào bên trong tế bào vi khuẩn, nhờ sự tăng sinh của vi khuẩn chúng được nhân
bản
với
số lượng lớn và được sử dùng trong giai đoạn tiếp
theo.
Bước 7, 8: Nuôi cấy A. tumefactien trên môi trường có chứa mầm tái sinh cây
lúa
đã được chuẩn bị ở bước 2. Các đoạn gen ngoại lai từ A. tumefactien sẽ được
chuyển
vào mầm tái sinh từ
phôi.
Môi trường để nuôi cấy được pha chế thử nghiệm như bảng dưới đây, thực
nghiệm
sẽ lựa chọn ra môi trường tối ưu để sử dụng trong quá trình chuyển
gen.
GVHD: Tạ Ngọc
Ly
20
(Số liệu thu thập từ kết quả công bố của Viện lúa Đồng bằng sông Cửu
Long)
Kết quả thực nghiệm của Viện lúa đồng bằng sông Cửu Long cho biết trong số
các
môi trường được nghiên cứu nói trên thì môi trường MSReg3 là môi trường tối
ưu
nhất cho quá trình chuyển gen bằng A.
tumefactien.
+ Trong giai đoạn tiếp theo vi khuẩn mang gen chuyển được đưa vào nuôi
cấy
trong môi trường có chứa phôi của hạt lúa Indica đã được chuẩn bị ở trên. Vi

khuẩn
chuyển đoạn gen cần chuyển vào phôi. Các phôi sau chuyển gen được đưa đi nuôi
cấy
trong phòng thí nghiệm để chuẩn bị cho giai đoạn chuyển ra môi trường tự
nhiên.
Hình 2.3.3c – Quá trình chuyển gen từ A. tumefactien vào tế bào thực
vật
Bước 9: Nuôi cấy mô tái sinh tạo cây con từ mầm tái sinh đã chuyển
gen
Hình 2.3.3 d – Tế bào callus tái sinh từ phôi chuyển gen và cây lúa đang phát triển
tốt
Bước 10: Cây lúa chuyển gen sau tái sinh được nuôi tăng sinh, rồi chuyển ra
môi
trường đất và được cho tập thích nghi dần với các điều kiện môi trường ngoài
phòng
thí nghiệm n sau đó cho lai với giống lúa địa phương để tăng khả năng thích nghi
với
điều kiện tự nhiên tại vùng sản xuất và được trồng với số lượng lớn ngoài tự nhiên
để
thu sản
phẩm.
Các hạt lúa thu được sẽ được đưa đi kiểm tra kết quả chuyển gen và kiểm tra
tính
an toàn trước khi trở thành sản phẩm cho con người sử
dụng.
2.5. Kiểm tra kết quả chuyển gen
β-caroten
Để kiểm tra kết quả chuyển gen β-caroten người ta dùng hai phương pháp
sau:
2.5.1. Kiểm tra bằng cảm

quan
Quan sát và so sánh nội nhủ của hạt gạo thường và hạt gạo chuyển gen
β-caroten.
Quan sát sẽ thấy hạt gạo thường có màu trắng trong, còn hạt gạo chuyển gen
β-caroten
có màu vàng ngà. Hạt gạo nhận gen chuyển từ cây ngô có màu vàng sẫm hơn so
với
hạt gạo nhận gen chuyển từ hoa thủy tiên, cho thấy lượng β-caroten có trong hạt
gạo
nhận gen chuyển từ cây ngô cao hơn so với hạt gạo nhận gen chuyển từ hoa thủy
tiên.
Hình 10 – Kiểm tra kết quả chuyển gen bằng cảm
quang
2.5.1. Kiểm tra bằng kỹ thuật phân tích phân
tử
2.5.1.1. Sử dụng kỹ thuật PCR phát hiện sự có mặt của các gen psy, crt,
lcy.
Hình 2.5 .1.1 – Kết quả chụp
UV
Hỗn hợp dùng trong phản ứng PCR và một sô dụng cụ cần
thiết
- Tag polymerase 0,025 U/µl
(1,25U/50µl)
- Tris-HCl (pH 8.8 )
75mM
- (NH4)2SO4
20mM
- Tween 20
0,01%
- dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 200µM mỗi

loại
- MgCl2
1,5mM
- Các hóa chất dùng cho điện di
ADN
- Máy li tâm, Eppendorf 1.5ml, 0.2ml, 0.5ml, Micropipette 20, 200, 1000µl,
Máy
PCR, Máy điện di ngang80 -150V, Bộ nguồn điện di điện thế từ, Bộ chụp ảnh trên
đèn
UV, Tủ ấm, Máy lắc
Vortex.
Tiến hành
PCR
- Dùng đầu tăm chấm và lấy coloni được nuôi cấy trong thạch nuôi rắn.
Chú
ý không để thạch nuôi dính theo tăm vì trong gel có chứa các chất gây
ảnh
hưởng đến phản ứng
PCR.
- Cho coloni lấy được ở trên vào Eppendorf có chứa 100µl nước cất
tuyệt
trùng.
- Đun sôi trong vòng 5
phút
- Tiến hành quay li tâm ở tốc độ10000rpm, trong vòng 5 phút, sau đó
lấy
phần nước dịch lỏng có chứa ADN đem đi nhân
dòng.
Thiết lập chương trình cho máy
PCR

B1. 94
0
C 1-1,5’ (Biến tính
ADN)
B2. 95
0
C 20 s (Tách ADN sợi đôi thành sợi
đơn)
B3. 65
0
C 20 s (Mồi bắt cặp với sợi
khuôn)
B4. 72
0
C 1’ (Phản ứng kéo
dài)
B5. lặp lại B2 đến B4 29
lần
B6. 72
0
C 10’ ( Tổng hợp nốt các đoạn chưa được hoàn
chỉnh)
B7 4 độ
∞
2.5.1.2. Trích DNA và phân tích
Southern
DNA được trích từ lá theo phương pháp của McCouch và ctv. (1988).
Mười
micrograms DNA được cắt đoạn với EcoRI (hai điểm cắt) để xác định sự hiện diện
của

gen psy hoặc crtI đối với dòng lúa chuyển nạp bằng vắc-tơ pCaCar và cắt đoạn
với
KpnI (một điểm cắt) để xác định số bản (copy). Đối với DNA của các dòng lúa
chuyển
nạp bằng véctơ pFun3 được cắt đoạn với EcoRI và HindIII (hai điểm cắt) để xác
định
sự hiện diện của gen psy hoặc crtI và cắt với KpnI (một điểm cắt) để xác định số
bản.
DNA cắt đoạn được chạy điện di qua 0,8% agarose gel trước khi chuyển bằng
mao
dẫn và cố định trên màng nylông (Hybond-N+, Amersham). Gen psy và crtI
được
đánh dấu bằng DIG (Boeheringer, Rotkreuz, Switzerl), được dùng làm mẫu
dò
(probe). Lai, rửa và phát hiện gen được thực hiện theo phương pháp của Wiinn và
ctv.
(1996).