Báo cáo khoa học :Nghiên cứu tạo giống cây ăn quả kháng bệnh virus phổ rộng bằng kỹ thuật chuyển gen đa đoạn

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƯỚC KC04



BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI
NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG CÂY ĂN QUẢ
KHÁNG BỆNH VIRUS PHỔ RỘNG
BẰNG CHUYỂN GEN ĐA ĐOẠN

Mã số: KC.04.03/06-10






Chủ nhiệm đề tài: TS. Chu Hoàng Hà
Thư ký đề tài: TS. Lê Văn Sơn
BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƯỚC KC04




BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI
NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG CÂY ĂN QUẢ
KHÁNG BỆNH VIRUS PHỔ RỘNG BẰNG
CHUYỂN GEN ĐA ĐOẠN

Mã số: KC.04.03/06-10



Chủ nhiệm đề tài: TS. Chu Hoàng Hà
Cơ quan chủ trì: Viện Công nghệ sinh học
Địa chỉ: Nhà A10, 18 Hoàng Quốc Việt, Hà Nội
Điện thoại: 37562368 E-mail:





Hà Nội, 2010


BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƯỚC KC04




BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI
NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG CÂY ĂN QUẢ
KHÁNG BỆNH VIRUS PHỔ RỘNG BẰNG
CHUYỂN GEN ĐA ĐOẠN

Mã số: KC.04.03/06-10

Chủ nhiệm đề tài

TS. Chu Hoàng Hà
Cơ quan chủ trì đề tài

Ban chủ nhiệm Chương trình Bộ Khoa học và Công nghệ





Hà Nội, 2010

Báo cáo Tổng kết đề tài KC04.03/06-10
Thời gian thực hiện 2007 - 2010
i



L
L
L
ờ
ờ
ờ
i
i
i

c
c
c
ả
ả
ả
m
m
m



ơ
ơ
ơ
n
n
n





Chủ nhiệm đề tài xin chân thành cảm ơn Văn phòng Các chương
trình trọng điểm cấp Nhà nước, Bộ Khoa học và Công nghệ, Ban
Chủ nhiệm Chương trình KC04, Viện Nghiên cứu Rau quả, Viện
Nghiên cứu cây ăn quả miền Nam, Viện Bảo vệ thực vật, Phòng
Thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen đã tham gia và hỗ trợ
công trình nghiên cứu này.

CƠ QUAN CHỦ TRÌ
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI








TS. Chu Hoàng Hà


Báo cáo Tổng kết đề tài KC04.03/06-10
Thời gian thực hiện 2007 - 2010
ii
CÁC CHỮ VIẾT TẮT
2,4-D Dichlorophenoxy acetic acid
bp base pair
BAP Benzyladenine purin
BSA Bovine serum albumin
CaMV35S- P

Cauliflower Mosaic Virus 35S Promotor
cDNA Complementary DNA
CP Coat protein
CPm Minor coat protein

CTV Citrus tristeza virus
ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long
DNA Deoxyribonucleic acid
dNTP deoxyribonucleotide
EDTA Ethylene Diamine Tetraacetace Axit
ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay=Phản ứng miễn dịch liên kết
enzyme
gus
β-Glucuronidase gene = gen mã hoá β-Glucuronidase
IBA
Indole-3-butyric Acid
IPTG
Isopropylthio-β-D-galactoside
Kb Kilobase
Km Kanamycine
LB Luria and Bertani
MS Môi trường nuôi cấy theo Murashige & Skoog
NAA 1 Napthye Acetic Acid
Nib Nuclear Inclusion Protein b
nptII
Neomycine phosphotransferase II gene=Gen mã hóa neomycine
phosphotransferase II
PBS Phosphate buffer saline
PBST Phosphate buffer saline with 0.05 % Tween20
PCR Polymerase Chain Reaction
PRSV Papaya ring spot virus
RdRp RNA-dependent RNA polymerase
RNA
Ribonucleic Acid
RNAi RNA interference

RT-PCR Reverse transcription PCR
T-DNA Transfer-DNA=DNA chuyển
X-gluc 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide

Báo cáo Tổng kết đề tài KC04.03/06-10
Thời gian thực hiện 2007 - 2010
iii

MỤC LỤC

Lời cảm ơn
Báo cáo thống kê
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5
1.1. Cây đu đủ và bệnh đốm vòng 5
1.1.1. Giới thiệu chung về cây đu đủ
5
1.1.2. Giới thiệu về bệnh đốm vòng và virus gây bệnh đốm vòng
6
1.1.3. Tình hình nghiên cứu tạo cây đu đủ chuyển gen kháng bệnh đốm vòng
8
1.1.4. Hiện trạng sản xuất và nghiên cứu cây đu đủ
10
1.2. Cây cam quýt và bệ
nh tàn lụi 11
1.2.1. Giới thiệu chung về nhóm cây cam quýt
11
1.2.2. Giới thiệu về bệnh tàn lụi và virus gây bệnh tàn lụi
14
1.2.3. Tình hình nghiên cứu tạo cây cam quýt kháng bệnh tristeza

18
1.2.4. Hiện trạng sản xuất và nghiên cứu cây ăn quả có múi
19
1.3. Tạo cây trồng chuyển gen sử dụng kỹ thuật RNAi (RNA interference) và sử
dụng các gen “đa đoạn” nhân tạo để tạo tính kháng phổ rộng

21
1.3.1. Lịch sử phát hiện cơ
chế RNAi
21
1.3.2. Cơ chế hoạt động của RNAi trong thực vật
24
1.3.3. Ứng dụng RNAi trong nghiên cứu tạo cây trồng kháng bệnh virus
28
CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34
2.1. Phương pháp phát hiện bệnh 34
2.1.1. Các phương pháp phát hiện virus tristeza (CTV)
34
2.1.2. Phương pháp phát hiện PRSV
39
2.2. Phương pháp phân lập gen 39
2.2.1. Phương pháp thiết kế mồi
39
2.2.2. Phương pháp tách dòng
40
2.2.3. Phương pháp thống kê và xử lý số liệu về trình tự gen
40
2.3. Phương pháp thiết kế vector chuyển gen đa đoạn 40
2.3.1. Thiết kế gen đa đoạn gen CP, Nib và HC-pro của PRSV
40

2.3.2. Thiết kế Ti-vector mang đa đoạn gen CP, Nib và HC-pro của PRSV
43

Báo cáo Tổng kết đề tài KC04.03/06-10
Thời gian thực hiện 2007 - 2010
iv
2.3.3. Thiết kế gen nhân tạo mang đa đoạn gen RdRp-CP-p20-p23 của CTV
45
2.3.4. Thiết kế Ti-vector mang đa đoạn gen RdRp-CP-p20-p23 và RdRp-CP của CTV
46
2.4. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật và chuyển gen thông qua Agrobacterium 47
2.4.1. Nuôi cấy mô tế bào và chuyển gen ở đu đủ
47
2.4.2. Nuôi cấy mô tế bào và chuyển gen ở cam quýt
49
2.5. Phương pháp phân tích cây chuyển gen 53
2.5.1. Phân tích cây chuyển gen qui mô phòng thí nghiệm
53
2.5.2. Phương pháp đánh giá cây chuyển gen ngoài nhà lưới
60
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 63
3.1. Kế
t quả phân lập và thiết kế gen 63
3.1.1. Kết quả thu mẫu bệnh đốm vòng ở đu đủ và Tristeza ở cam quýt
63
3.1.2. Kết quả tách dòng và phân tích trình tự gen của PRSV
71
3.1.3. Phân lập và phân tích gen của CTV
96
3.1.4. Thiết kế các vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi gen đa đoạn của PRSV

120
3.1.5. Thiết kế các vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi gen đa đoạn của CTV
131
3.2. Kết quả tạo cây đu đủ chuyển gen kháng PRSV 143
3.2.1. Kết quả xây dựng quy trình chuy
ển gen vào cây đu đủ thông qua phôi soma
143
3.2.2. Kết quả tạo cây đu đủ chuyển gen mang cấu trúc gen đa đoạn CP-Nib-HCpro
151
3.2.3. Đánh giá các dòng đu đủ chuyển gen
155
3.3. Kết quả tạo cây cam, quýt chuyển gen kháng CTV 161
3.3.1. Kết quả xây dựng quy trình chuyển gen vào cây có múi thông qua Agrobacterium
161
3.3.2. Kết quả tạo cam, quýt mang cấu trúc gen RdRp-CP-p20-p23 của CTV
188
3.3.3. Kết quả đánh giá các dòng cam, quýt chuyển gen
199
3.4. Thảo luận kết quả nghiên cứu 201
3.4.1. Kết quả
xây dựng quy trình chuyển gen vào cây có múi thông qua Agrobacterium
161
3.4.2. Kết quả tạo cam, quýt mang cấu trúc gen RdRp-CP-p20-p23 của CTV
188
3.4.3. Kết quả đánh giá các dòng cam, quýt chuyển gen
199
3.4.4. Xây dựng quy trình chuyển gen cho các đối tượng nghiên cứu…………
206
3.4.5. Tạo cây đu đủ chuyển gen và đánh giá tính kháng PRSV
206

3.4.6. Tạo cây cam, quýt chuyển gen và đánh giá tính kháng CTV
207
3.4.7. Tổng kết kết quả đánh giá các dòng cây chuyển gen
208
4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 210

Báo cáo Tổng kết đề tài KC04.03/06-10
Thời gian thực hiện 2007 - 2010
v
4.1. Kết luận 210
4.2. Kiến nghị 213
TÀI LIỆU THAM KHẢO 214
PHỤ LỤC


Báo cáo Tổng kết đề tài KC04.03/06-10
Thời gian thực hiện 2007 - 2010
vi
MỤC LỤC BẢNG

Bảng 1.1: Sản lượng đu đủ trên thế giới trong năm 2002-2004 6
Bảng 1.2: Vùng phân bố tập trung của cây đu đủ ở Việt Nam 10
Bảng 1.3: Sản lượng quả có múi trên thế giới trong năm 2001-2003 12
Bảng 1.4: Một số bệnh chính trên cây cam quýt 13
Bảng 1.5: Diện tích và sản lượng cam quýt ở Việt Nam năm 2007 19
Bảng 1.6: Các loại vector RNAi sử dụng công nghệ Gateway 29
Bảng 2.1: Thành phần phản ứng gắn gen vào vector pBT 41
Bảng 2.2: Thành phần phản ứng gắn gen đa đoạn vào vector pENTR
TM
43

Bảng 2.3: Thành phần phản ứng LR 44
Bảng 2.4: Kích thước các phân đoạn khi cắt plasmid tái tổ hợp bằng XbaI/HindIII 47
Bảng 2.5: Thành phần các môi trường nuôi cấy đu đủ 48
Bảng 2.6: Thành phần các môi trường nuôi khuẩn 48
Bảng 2.7: Thành phần các môi trường nuôi cấy cam, quýt 50
Bảng 3.1: Danh sách các vùng thu mẫu PRSV cho kết quả dương tính 65
Bảng 3.2: Danh sách các vùng thu mẫu CTV kết quả dương tính 70
Bảng 3.3: Danh sách trình tự nucleotide gen CP PRSV đã phân lập được 73
Bảng 3.4: Hệ số tương đồng của gen CP ở mức độ nucleotide của các dòng PRSV của Việt Nam 75
Bảng 3.5: Hệ số tương đồng của CP ở mức độ amino acid của các dòng PRSV của Việt Nam 76
Bảng 3.6: Danh sách trình tự nucleotide gen Nib PRSV-P đã phân lập được 82
Bảng 3.7: Hệ số tương đồng của gen Nib ở mức độ nucleotide 83
Bảng 3.8: Hệ số tương đồng của gen Nib ở mức độ amino acid 84
Bảng 3.9: Mồi được sử dụng cho RT-PCR nhân dòng các vùng genome RNA của PRSV 86
Bảng 3.10: Hệ số tương đồng của trình tự nucleotide các chủng PRSV Việt Nam với các
chủng PRSV khác trên thế giới
89
Bảng 3.11: Mức độ tương đồng của trình tự amino acid các chủng PRSV Việt Nam với các
chủng PRSV khác trên thế giới
90
Bảng 3.12: Đặc điểm của một số dòng CTV được sử dụng để tách dòng gen 97
Bảng 3.13: Trình tự mồi sử dụng nhân các đoạn gen của CTV 99
Bảng 3.14: Danh sách các trình tự A, F, C, P của CTV đã được phân lập 100
Bảng 3.15: Danh sách trình tự nucleotide toàn bộ gen CP và CPm của CTV đã phân lập được 108
Bảng 3.16: Danh sách các đoạn gen của genome CTV đã được phân lập 115
Bảng 3.17: Trình tự các cặp mồi tách dòng gen CP và CPm 116
Bảng 3.18: Ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D tới khả năng tạo mô sẹo và phôi đu đủ 143
Bảng 3.19: Xác định thời gian siêu âm thích hợp chuyển vào phôi soma đu đủ 146
Bảng 3.20: Xác định ngưỡng nồng độ kanamycin thích hợp cho chọn lọc 148
Bảng 3.21: Xác định mật độ khuẩn thích hợp cho chuyển gen 149

Báo cáo Tổng kết đề tài KC04.03/06-10
Thời gian thực hiện 2007 - 2010
vii
Bảng 3.22. Hiệu suất chuyển gen phôi soma 151
Bảng 3.23: Kết quả chuyển gen CP-Nib-HcPro vào phôi soma đu đủ 153
Bảng 3.24: Thí nghiệm tính kháng virus với các dòng đu đủ Lạng Sơn T0 156
Bảng 3.25: Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tạo mô sẹo cam Sành 162
Bảng 3.26: Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tạo mô sẹo quýt
Đường canh
163
Bảng 3.27: Kết quả tạo mô sẹo trên ba loại môi trường cơ bản khác nhau 164
Bảng 3.28: Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng tới khả năng tạo cụm chồi 166
Bảng 3.29: Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng BAP tới khả năng tạo đa chồi của
cam Sành khi bổ dọc thân
167
Bảng 3.30: Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng tới khả năng ra rễ quýt Đường Canh 169
Bảng 3.31: Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng tới khả năng ra rễ 171
Bảng 3.32: Ảnh hưởng của giá thể tới khả năng tái sinh của cây 173
Bảng 3.33: Ảnh hưởng Km tới khả năng sống sót của cây quýt Đường Canh 176
Bảng 3.34: Ảnh hưởng Km tới khả năng sống sót của cây cam Sành 177
Bảng 3.35: Ảnh hưởng của mật độ Agrobacterium tới hiệu quả chuyển gen 178
Bảng 3.36: Ảnh hưởng của môi trường lây nhiễm khuẩn tới khả năng chuyển gen 180
Bảng 3.37: Ảnh hưởng của nồng độ sucrose tới hiệu quả chuyển gen 182
Bảng 3.38: Ảnh hưởng của thời gian nhiễm khuẩn tới khả năng chuyển gen 184
Bảng 3.39: Kết quả phân tích cây chuyển gen gus 187
Bảng 3.40: Kết quả chuyển gen vào quýt Đường Canh 190
Bảng 3.41: Kết quả chuyển gen cam Xã Đoài 192
Bảng 3.42: Kết quả chuyển gen vào cam Sành 192
Bảng 3.43: Kết quả đánh giá mức độ nhiễm bệnh Tristeza của một số dòng cam 195

Bảng 3.44: Kết quả đánh giá mức độ nhiễm bệnh Tristeza của một số dòng quýt 200
Bảng 3.45: Tổng kết kết quả phân tích cây chuyển gen ở phòng thí nghiệm và ngoài nhà
lưới
208





Báo cáo Tổng kết đề tài KC04.03/06-10
Thời gian thực hiện 2007 - 2010
viii
MỤC LỤC HÌNH

Hình 1.1: Cấu trúc của PRSV
7
Hình 1.2: Bản đồ tổ chức genom của PRSV
8
Hình 1.3: Ảnh kính hiển vi điện tử CTV
15
Hình 1.4: Bản đồ tổ chức genom của CTV
18
Hình 1.5: Ví dụ về cây hoa dã yên thảo trong đó các gen quy định sắc tố hoa đã bị làm
câm lặng bởi RNAi
22
Hình 1.6: Mô tả con đường tạo thành RNAi
25
Hình 2.1: Triệu chứng vàng ở lá non trên lá chanh Eureka bị nhiễm chủng CTV
35
Hình 2.2: Triệu chứng lõm thân của thân cây bưởi bị nhiễm CTV-D

35
Hình 2.3: Dụng cụ dùng cho phương pháp phát hiện bằng que thử nhanh
37
Hình 2.4: Mô hình kết quả kiểm tra CTV bằng que thử nhanh
37
Hình 2.5: Sơ đồ plasmid pK7GWIWG2(II)
44
Hình 2.6: Bể thấm chuyển Southern
56
Hình 3.1: Bản đồ phân bố khu vực thu mẫu PRSV-p
64
Hình 3.2: Một số mẫu đu đủ nhiễm PRSV với triệu chứng bệnh điển hình
64
Hình 3.3: Bản đồ các khu vực thu mẫu CTV ở Việt Nam
67
Hình 3.4: Hình ảnh thu mẫu tại các vùng miền núi phía Bắc
68
Hình 3.5: Kết quả giám định bệnh Tristeza bằng que thử nhanh
68
Hình 3.6: Kết quả giám định bệnh Tristeza bằng Elisa
69
Hình 3.7: Một số triệu chứng bệnh Tristeza
69
Hình 3.8: Kết quả điện di các sản phẩm RT-PCR gen mã hóa protein vỏ (CP) của các mẫu
đủ đủ nhiễm bệnh thu thập tại các địa phương khác nhau
73
Hình 3.9: So sánh trình tự đoạn mã hóa vùng N của gen CP của các dòng PRSV-P phân
lập của Việt Nam và trình tự của các dòng PRSV đã công bố trong Genebank
78
Hình 3.10: Cây phát sinh chủng loại MP (Maximum Parsimony) 80

Hình 3.11: Sơ đồ các đoạn gen được tách dòng của genome PRSV 86
Hình 3.12: So sánh các chủng PRSV Việt Nam với các chủng khác trên thế giới theo trình
tự nucleotide tương ứng từ vị trí 9300-9400 của genome PRSV
91
Hình 3.13: So sánh đoạn protein CP ứng với vị trí 9300-9400 của genome các dòng PRSV
phân lập tại các vị trí khác nhau ở Việt Nam (amino acid)
92
Hình 3.14: Cây phát sinh chủng loại MP (Maximum Parsimony) được xây dựng dựa trên
trình tự genome 3 chủng PRSV Việt Nam (Lý Nhân, Kontum, Sai Gòn) với các
chủng PRSV khác trên ngân hàng gen NCBI bằng phần mềm DNAstar.
92
Hình 3.15: So sánh trình tự đầu 5’ của các genome PRSV Việt Nam với các trình tự
genome khác trên thế giới
94
Hình 3.16: Kết quả PCR minh họa các đoạn A, F, C, P của một số dòng CTV
98
Hình 3.17: Cây phân loại dựa trên các đoạn gen của CTV
104
Hình 3.18: So sánh protein CP của một số dòng có triệu chứng bệnh nhẹ ở Việt Nam với
chủng T36 có triệu chứng bệnh nặng ở Mỹ. Vị trí 124 của các protein đều là
109

Báo cáo Tổng kết đề tài KC04.03/06-10
Thời gian thực hiện 2007 - 2010
ix
phenylanlanine (F)
Hình 3.19: Điện di sản phẩm PCR tách dòng gen CP và CPm
111
Hình 3.20: Điện di sản phẩm colony-PCR của các dòng khuẩn lạc biến nạp gen CP và
CPm

111
Hình 3.21: So sánh trình tự gen CPm của VL1, CT2, DT1 với CPm của chủng T36 bằng
phần mềm BioEdit. Dấu chấm thể hiện sự giống nhau giữa các nucleotide
113
Hình 3.22: So sánh trình tự protein CPm của VL1, CT2, DT1 với CPm của chủng T36
bằng phần mềm BioEdit. Dấu chấm thể hiện sự giống nhau giữa các acid amin
114
Hình 3.23: Trình tự nucleotide và acid amin của CP và CPm
117
Hình 3.24: Kết quả điện di protein CP và CPm trên gel polyacrylamide
118
Hình 3.25: Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân gen CP, Nib, Hcpro
122
Hình 3.26: Kết quả PCR gắn gen đa đoạn CP-Nib và CP-Nib-Hcpro
123
Hình 3.27: Kết quả điện di colony-PCR của các dòng khuẩn lạc E.coli biến nạp gen đa
đoạn CP-Nib và CP-Nib-HCpro
124
Hình 3.28: Điện di sản phẩm PCR nhân gen đa đoạn CP-Nib và CP-Nib-HCpro
126
Hình 3.29: Kết quả điện di colony-PCR của các dòng E.coli biến nạp pENTR/CP-Nib-
Hcpro; pENTR/CP-Nib
127
Hình 3.30: Điện di colony-PCR của dòng E.coli biến nạp pK7GWIWG2(II)/CP-Nib và
pK7GWIWG2(II)/CP-Nib-HCpro
128
Hình 3.31: Điện di pK7GWIWG2(II)/CP-Nib và pK7GWIWG2(II)/CP-Nib-HCpro cắt bằng
enzyme giới hạn Xba I và Hind III
128
Hình 3.32: Biến nạp cấu trúc RNAi pK7WIWG2(II)/CP-Nib-HCpro vào tế bào A.

tumefaciens pGV2260
130
Hình 3.33: Điện di colony-PCR từ A. tumefaciens pGV2260 mang vector
pK7WIWG2(II)/CP-Nib-HCpro và pK7WIWG2(II)/CP-Nib
130
Hình 3.34: Sơ đồ gen đa đoạn 'RdRp-CP-p20-p23’ 134
Hình 3.35: Điện di sản phẩm PCR bốn đoạn gen RdRp, CP, p20, p23 136
Hình 3.36: Điện di sản phẩm PCR nối 2 phân đoạn gen 136
Hình 3.37: Kết quả điện di sản phẩm PCR nối 4 phân đoạn gen RdRp, CP, p20 và p23 137
Hình 3.38: Điện di colony - PCR các khuẩn lạc pENTR/RdRP-CP và pENTR/RdRP-CP-p20-
p23
138
Hình 3.39: Điện di sản phẩm colony-PCR từ khuẩn lạc E.coli Top10 mang cấu trúc
pK7GWIWG2(II)/RdRp-CP-p20-p23và pK7GWIWG2(II)/RdRp-CP
139
Hình 3.40: Kết quả điện di tách chiết plasmid từ E.coli Top10. A) pK7GWIWG2(II)/RdRp-
CP-p20-p23; B) pK7GWIWG2(II)/RdRp-CP
139
Hình 3.41: Điện di sản phẩm plasmid RNAi tách từ E.coli Top 10 cắt bằng Xba I và HindIII 140
Hình 3.42: Điện di sản phẩm colony-PCR từ khuẩn lạc A. tumefaciens mang cấu trúc
pK7GWIWG2(II)/RdRp-CP-p20-p23 và pK7GWIWG2(II)/RdRp-CP
141
Hình 3.43: Điện di sản phẩm plasmid cắt bằng enzyme giới hạn XbaI và HindIII
142
Hình 3.44: Một số hình ảnh tái sinh cây đu đủ qua phôi soma
145
Hình 3.45: Mức độ biểu hiện gen Gus ở OD
600
khuẩn khác nhau sau 3 tuần
150

Hình 3.46: Quy trình chuyển gen vào phôi soma đu đủ thông qua Agrobacterium
151
Hình 3.47: Hình ảnh quả của 2 giống đu đủ sử dụng trong nghiên cứu 152

Báo cáo Tổng kết đề tài KC04.03/06-10
Thời gian thực hiện 2007 - 2010
x
Hình 3.48: Một số hình ảnh của quy trình biến nạp gen đã được thực hiện
154
Hình 3.49: Ảnh điện di sản phẩm PCR các dòng đu đủ Lạng Sơn chuyển gen 154
Hình 3.50: Cây đu đủ chuyển gen được thử tính kháng virus PRSV 157
Hình 3.51: Ảnh phim lai Southern DNA gemone cây đu đủ cắt bằng HindIII và mẫu dò 159
Hình 3.52: Lai Nothern kiểm tra sự biểu hiện gen nptII các dòng đu đủ chuyển gen 160
Hình 3.53: Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tạo mô sẹo cam Sành 162
Hình 3.54: Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tạo mô sẹo cây quýt
Đường Canh
163
Hình 3.55: Ảnh hưởng của IBA, NAA lên khả năng hình thành cam Sành
171
Hình 3.56: Cây cam quýt trên giá thể ½ cát vàng + ½ trấu hun
174
Hình 3.57: Mẫu cam Sành sống sót trên môi trường có bổ sung Km sau 8 tuần
177
Hình 3.58: Biểu hiện gen gus tạm thời ở các mật độ khuẩn khác nhau
179
Hình 3.59: Biểu hiện gus tạm thời ở môi trường nhiễm khuẩn MS bổ sung 3% sucrose
181
Hình 3.60: Biểu hiện tạm thời của gus trên mẫu đã được xử lý sucrose
183
Hình 3.61: Biểu hiện của gen gus ở lá cây chuyển gen chuyển gen

187
Hình 3.62: Điện di sản phẩm PCR các dòng cây chuyển gen Bar
187
Hình 3.63: Hình ảnh minh họa các bước chuyển gen đa đoạn vào cam quýt
189
Hình 3.64: Mô tả các bước của thí nghiệm thử tính kháng
194
Hình 3.65: Lai Southern DNA gemone các dòng cam Xã Đoài
197
Hình 3.66: Lai Nothern kiểm tra sự biểu hiện gen npt II các dòng cam Xã Đoài chuyển gen
198
Hình 3.67: Lai Southern DNA gemone cây quýt Đường Canh
201


Báo cáo Tổng kết đề tài KC04.03/06-10
Thời gian thực hiện 2007 - 2010
xi
NHỮNG NGƯỜI THAM GIA THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

TT Họ và tên
Học hàm,
học vị
Cơ quan
Nhiệm vụ
trong Đề tài
1. Chu Hoàng Hà TS Viện Công nghệ sinh học Chủ nhiệm
2. Lê Văn Sơn TS Viện Công nghệ sinh học Thư ký
3. Lê Trần Bình GS.TS Viện Công nghệ sinh học Thành viên
4. Đỗ Xuân Đồng ThS Viện Công nghệ sinh học Thành viên

5. Đỗ Tiến Phát ThS Viện Công nghệ sinh học Thành viên
6. Đặng Thị Hương ThS Viện Công nghệ sinh học Thành viên
7. Nguyễn Chi Mai KS Viện Công nghệ sinh học Thành viên
8. Nguyễn Văn Phượng KS Viện Công nghệ sinh học Thành viên
9. Nguyễn Minh Hùng CN Viện Công nghệ sinh học Thành viên
10. Phạm Bích Ngọc TS Viện Công nghệ sinh học Thành viên
11. Lâm Đại Nhân TS Viện Công nghệ sinh học Thành viên
12. Trần Mỹ Linh TS Viện Công nghệ sinh học Thành viên
13. Phạm Thị Vân ThS Viện Công nghệ sinh học Thành viên
14. Đinh Thu Hiền KS Viện Công nghệ sinh học Thành viên
15. Đỗ Đình Ca TS Viện Nghiên cứu Rau quả Thành viên
16. Ngô Vĩnh Viễn TS Viện Bảo vệ thực vật Thành viên
17. Mai Thị Liên TS Viện Bảo vệ thực vật Thành viên
18. Nguyễn Thị Bích Ngọc ThS Viện Bảo vệ thực vật Thành viên
19. Nguyễn Minh Châu PGS.TS
Viện Nghiên cứu Cây ăn quả
miền Nam
Thành viên
20. Lê Thị Thu Hồng TS
Viện Nghiên cứu Cây ăn quả
miền Nam
Thành viên
21. Nguyễn Thị Ngọc Trúc ThS
Viện Nghiên cứu Cây ăn quả
miền Nam
Thành viên


1
VIỆN KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC


CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc



Hà Nội, ngày 20 tháng 4 năm 2010

BÁO CÁO THỐNG KÊ
KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

I. THÔNG TIN CHUNG
1. Tên đề tài: Nghiên cứu tạo giống cây ăn quả kháng bệnh virus phổ
rộng bằng kỹ thuật chuyển gen đa đoạn
Mã số: KC.04.03/06-10
Thuộc: Chương trình KH&CN trọng điểm cấp Nhà nước KC04
2. Chủ nhiệm đề tài:
Họ và tên: Chu Hoàng Hà
Ngày, tháng, năm sinh: 1969 Nam/ Nữ: Nam
Học hàm, học vị: Tiến sỹ
Chức danh khoa học: Nghiên cứu viên chính
Chức vụ: Phó Trưở
ng phòng Công nghệ tế bào thực vật
Phó Giám đốc Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen
Điện thoại: Cơ quan: 37562368; Nhà riêng: 39745707; Mobile: 0912175636
Fax: 38363144 E-mail:
Tên cơ quan: Viện Công nghệ sinh học, Viện KH & CN Việt Nam

Địa chỉ: 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội
Địa chỉ nhà riêng: 302/11 Đội Cung, quận Hai Bà Trưng, Hà Nội

2
Tên tổ chức chủ trì đề tài: Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công
nghệ Việt Nam
Điện thoại: 37562790 Fax: 38363144
E-mail:
Website:
Địa chỉ: 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội
Họ và tên thủ trưởng cơ quan: PGS.TS. Trương Nam Hải
Số tài khoản: 931.01.064
Tại: Kho bạc nhà nước Ba Đình, Hà Nội
Tên cơ quan chủ quản đề tài: Bộ Khoa học và Công nghệ


II. TÌNH HÌNH THỰC HIỆN
1. Thời gian thực hiện đề tài
- Theo Hợp đồng đã ký kết: từ tháng 01 năm 2007 đến tháng 12 năm
2009.
- Thực tế thực hiện: từ tháng 01 năm 2007 đến tháng 04 năm 2010.
- Được gia hạn: Lần 1 từ tháng 01 năm 2010 đến tháng 04 năm 2010
(
Quyết định số 2892/QĐ-BKHCN, ngày 18/12/2009 của Bộ Khoa học và
Công nghệ
).
2. Kinh phí và sử dụng kinh phí
a) Tổng số kinh phí thực hiện: 3.350 triệu đồng (Ba tỷ ba trăm năm mươi
triệu đồng), trong đó:
+ Kính phí hỗ trợ từ SNKH: 3.350 triệu đồng

+ Kinh phí từ các nguồn khác: 0 tr.đ.

3
b) Tình hình cấp và sử dụng kinh phí từ nguồn SNKH
Số
TT
Theo kế hoạch Thực tế đạt được Ghi chú
(Số đề nghị quyết
toán - VNĐ)

Thời gian Kinh phí (VNĐ) Thời gian Kinh phí (VNĐ)
1 2007 1 212 800 000

2007 780 275 669 780 275 669

2 2008 1 223 000 000

2008 709 989 084 709 989 084

3 2009 914 200 000

2009 1 012 964 250 1 012 964 250



4/2010 846 770 997 846 770 997

Tổng 3 350 000 000

3 350 000 000

c) Kết quả sử dụng kinh phí theo các khoản chi
Đơn vị tính: Triệu đồng
Số
TT
Nội dung
các khoản chi
Theo kế hoạch Thực tế đạt được
Tổng SNKH
Nguồn
khác
Tổng SNKH
Nguồn
khác
1
Trả công lao động
(khoa học, phổ thông)
1 056



1056

2
Nguyên, vật liệu, năng
lượng
1 780

1772,020003

7,98

3 Thiết bị, máy móc 150



150



4
Xây dựng, sửa chữa
nhỏ
40



40



5 Chi khác 324



321,642

2,358

Tổng cộng 3 350



3339,662003

10.338

3. Các văn bản hành chính trong quá trình thực hiện đề tài
Số
TT
Số, thời gian ban
hành văn bản
Tên văn bản
1
769/QĐ-BKHCN ngày
19/4/2006
QĐ về việc phê duyệt các tổ chức và cá nhân trúng tuyển chủ trì
thực hiện đề tài, dự án SXTN năm 2006 thuộc lĩnh vực CNSH
2
2092/QĐ-BKHCN
ngày 22/9/2006
QĐ phê duyệt chủ nhiệm, cơ quan chủ trì và kinh phí các đề tài,
dự án bắt đầu thực hiện năm 2006 thuộc chương trình KHCN
trọng điểm cấp NN giai đoạn 2006-2010 “Nghiên cứu, phát triển
và ứng dụng CNSH”, mã số KC.04/06-10

4
3

26/QĐ-BKHCN ngày
21/2/2006
QĐ về việc thành lập Hội đồng khoa học công nghệ cấp NN tư
vấn tuyển chọn, xét chọn tổ chức và cá nhân chủ trì thực hiện đề
tài cấp NN để thực hiện trong kế hoạch năm 2006 thuộc lĩnh vực
Công nghệ sinh học
4
03/2006.HĐ– ĐTCT–
KC04/06-10 ngày
12/5/2007
Hợp đồng nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ
5
1111/QĐ-BKHCN
ngày 13/06/2008
QĐ về việc cử các đoàn đi công tác nước ngoài
6
189/QĐ-CNSH ngày
25/5/2009
QĐ về việc cử các đoàn đi công tác nước ngoài
7
445/QĐ-BKHCN ngày
30/3/2009
QĐ về việc điều chỉnh thời gian đi công tác nước ngoài của Đề tài
KC.04.03/06-10 thuộc chương trình “Nghiên cứu, phát triển và
ứng dụng CNSH”, mã số KC.04/06-10
8
2892/QĐ-BKHCN,
ngày 18/12/2009
QĐ về việc điều chỉnh thời gian thực hiện của Đề tài
KC.04.03/06-10 thuộc chương trình KH & CN trọng điểm cấp NN

giai đoạn 2006-2010 “Nghiên cứu, phát triển và ứng dụng
CNSH”, mã số KC.04/06-10
9
170/QĐ-CNSH, ngày
20/4/2010
QĐ nghiệm thu cấp cơ sở
4. Tổ chức phối hợp thực hiện đề tài
Số
TT
Tên tổ
chức
đăng ký
theo
Thuyết
minh
Tên tổ
chức đã
tham gia
thực hiện
Nội dung
tham gia chủ yếu
Sản phẩm chủ yếu đạt được
1
Viện
Công
nghệ
sinh học
Viện Công
nghệ sinh
học

(1) Xây dựng đề tài; (2)
Thu thập mẫu nhiễm
bệnh; (3) Phân lập, thiết
kế gen và vector chuyển
gen; (4) Tiến hành
chuyển gen vào cây đu đủ
và cây cam, quýt; (5)
Đánh giá cây chuyển gen
trong phòng thí nghiệm và
trong nhà lưới; (6) Đào
tạo và viết báo cáo tổng
kết

Các mẫu bệnh
Các dòng mang các đoạn gen của
PRSV và CTV
Thiết kế các đoạn gen nhân tạo và
các vector chuyển gen mang đa
đoạn gen CP, Nib và HC-pro của
PRSV và RdRp-CP và RdRp-CP-
p20-p23 của CTV
Các dòng đu đủ, cam, quýt
chuyển gen kháng virus
Các dòng chuyển đã đánh giá
kháng virus ở nhà lưới
2
Viện NC
Rau quả
Viện NC
Rau quả

Thu thập mẫu nhiễm bệnh Các mẫu bệnh

5
3
Viện
Nghiên
cứu Cây
ăn quả
Miền
Nam
Viện
Nghiên
cứu Cây
ăn quả
Miền Nam
Thu thập mẫu nhiễm bệnh Các mẫu bệnh
4
Viện Bảo
vệ Thực
vật
Viện Bảo
vệ Thực
vật
(1) Thu thập mẫu nhiễm
bệnh; (2) Tham gia đánh
giá các dòng cây chuyển
gen trên đồng ruộng.
Các mẫu bệnh
Phương pháp đánh giá đánh giá
tính kháng virus của cây cam,

quýt chuyển gen đa đoạn
5. Cá nhân tham gia thực hiện đề tài (không quá 10 người kể cả chủ nhiệm
đề tài)
Số
TT
Tên cá nhân dăng kí
theo Thuyết minh
Tên cá nhân đã tham gia
thực hiện
Nội dung
tham gia
chính
Sản
phẩm chủ
yếu đạt
được
1 TS. Chu Hoàng Hà TS. Chu Hoàng Hà Chủ nhiệm
2 GS. Lê Trần Bình GS. Lê Trần Bình Tham gia
3 TS. Lê Văn Sơn TS. Lê Văn Sơn Thư ký
4 PGS. Lê Thị Muội CN. Nguyễn Chi Mai Tham gia
5 ThS. Lê Xuân Đắc CN. Nguyễn Văn Phượng Tham gia
6 CN. Nguyễn Minh Hùng ThS. Đỗ Xuân Đồng Tham gia
7 KS. Bùi Chi Lăng ThS. Đặng Thị Hương Tham gia
8 TS. Vũ Mạnh Hải TS. Đỗ Đình Ca Tham gia
9 TS. Nguyễn Minh Châu TS. Nguyễn Minh Châu Tham gia
10 TS. Ngô Vĩnh Viễn TS. Ngô Vĩnh Viễn Tham gia
Lý do thay đổi: Việc thay đổi cán bộ tham gia thực hiện đề tài chủ yếu do điều
kiện bận công tác, học tập ở nước ngoài hoăc bổ sung cán bộ mới. PGS.
TSKH. Lê Thị Muội đã mất.
6. Tình hình hợp tác quốc tế

Số TT Theo kế hoạch Thực tế đạt được
1 Một đoàn công tác tại Mỹ
Đoàn 3 người công tác tại Mỹ để trao đổi KH từ
15/6-3/7/2009, kinh phí từ đề tài KC04.03/06-10


6
7. Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị
Số
TT
Theo kế hoạch Thực tế đạt được
1 Hội thảo về đề tài
Tổ chức được 3 hội thảo cấp Viện Công nghệ sinh học
với mục đích thảo luận các kết quả nghiên cứu đã đạt
được và hướng giải quyết các vấn đề tồn đọng, phương
hướng thực hiện các nội dung nghiên cứu tiếp theo.
Kinh phí tổ chức lấy từ đề tài KC04.03/06-10
8. Tóm tắt các nội dung, công việc chủ yếu
Số
TT
Các nội dung, công việc
chủ yếu
Thời gian
Người, cơ quan
thực hiện
Theo kế
hoạch
Thực tế
đạt
được

1 Phân lập và thiết kế gen
1.1 Thu mẫu virus
1/2007-
5/2007
1/2007-
5/2007
Viện Cây ăn quả miền
Nam, Viện BVTV; Viện
Nghiên cứu Rau quả,
Viện CNSH
1.2 Phân lập gen CP và Nib của PRSV
2/2007 –
7/2007
2/2007 –
7/2007
Viện CNSH: Chu Hoàng
Hà, Đặng Thị Hương, Lê
Văn Sơn
1.3
Phân lập gen CP, CPm và RDRP của
CTV
3/2007 –
9/2007
3/2007 –
9/2007
Viện CNSH: Chu Hoàng
Hà, Lê Văn Sơn và cs
1.4
Thiết kế các gen nhân tạo mang đa
đoạn gen CP và Nib của các dòng

PRSV
6/2007 –
10/2007
6/2007 –
10/2007
Viện CNSH: Chu Hoàng
Hà, Đặng Thị Hương
1.5
Thiết kế các gen nhân tạo mang đa
đoạn gen CP và RDRP của các dòng
CTV
8/2007 –
12/2007
8/2007 –
12/2007
Viện CNSH: Lê Văn Sơn
và cộng sự
1.6
Thiết kế các Ti-vector mang các đoạn
gen nhân tạo đã tạo được
9/2007 –
3/2008
9/2007 –
3/2008
Viện CNSH: Lê Văn Sơn,
Chu Hoàng Hà
2 Tối ưu hoá quy trình chuyển gen
2.1
Hoàn thiện quy trình chuyển gen
thông qua phôi soma sử dụng

Agrobacterium cho cây đu đủ
1/2006 –
10/2007
1/2006 –
10/2007
Viện CNSH: Đỗ Xuân
Đồng và công sự
2.2
Xây dựng quy trình chuyển gen sử
dụng Agrobacterium cho 2 giống cam
1/2007 –
1/2008
1/2007 –
1/2008
Viện CNSH: Nguyễn Văn
Phượng và cộng sự

7
quýt có ý nghĩa kinh tế của Việt Nam
3 Tiến hành chuyển gen
3.1
Tạo cây đu đủ chuyển gen kháng
PRSV
8/2007 –
8/2008
8/2007 –
8/2008
Viện CNSH: Chu Hoàng
Hà, Đỗ Xuân Đồng
3.2

Tạo cây cam và quýt chuyển gen
CTV
2/2008 –
2/2009
2/2008 –
2/2009
Viện CNSH: Nguyễn Văn
Phượng và cộng sự
4 Đánh giá các dòng cây chuyển gen
4.1
Đánh giá các dòng cây chuyển gen
trong phòng thí nghiệm
2/2009 -
4/2009
2/2009-
6/2009
Viện CNSH: Chu Hoàng
Hà và cộng sự
4.2
Đánh giá tính kháng bệnh của các
dòng cây trong nhà lưới thông qua
gây nhiễm nhân tạo
4/2009 -
8/2009
6/2009-
3/2010
Viện CNSH, Viện bảo vệ
thực vật
5
Báo cáo tổng kết đề tài và

nghiệm thu
12/2009
3/2010-
4/2010
Chu Hoàng Hà, Lê Trần
Bình và cộng sự
III. SẢN PHẨM KH&CN CỦA ĐỀ TÀI, DỰ ÁN
1. Sản phẩm KH&CN đã tạo ra
a) Sản phẩm Dạng I
(Mẫu (model, maket); sản phẩm (là hàng hoá, có thể được tiêu thụ trên thị trường); vật liệu;
thiết bị, máy móc; dây chuyền công nghệ; giống cây trồng; giống vật nuôi và các loại khác)
Số
TT
Tên sản phẩm và chỉ tiêu
chất lượng chủ yếu
Đơn
vị đo
Số lượng
Theo kế hoạch Thực tế đạt được
1
Các đoạn gen CP, Nib của
PRSV
gen
thu được 20-30 đoạn
gen trong vector tách
dòng
28 CP
5 Nib
3 genome
2

Các đoạn gen CP, CPm và
RDRP của CTV
gen
thu được 20-30 đoạn
gen trong vector tách
dòng
28 CP; 3 CPm; 2
RdRP; 18 p20; 36
p349; 1 genome
3
Các đoạn gen nhân tạo
mang đa đoạn gen đại diện
nhất cho các dòng PRSV và
CTV của Việt Nam
gen
thu được từ 2-4 gen
nhân tạo
4
4
Các vector chuyển gen có
mang các gen nhân tạo tổng
hợp được
vector thu được 4-8 Ti-vector 4
5
Các dòng cây chuyển gen có
triển vọng để phát triển
thành giống
dòng
cây
thu dược 2-3 dòng đu

đủ; 1-2 dòng cam quýt
có triển vọng để phát
triển thành giống
4 dòng đu đủ; 2 dòng
quýt đường Canh ; 5
dòng cam xã Đoài
chuyển gen đã kiểm
tra có tính kháng virus

8
b) Sản phẩm Dạng II
(Nguyên lý ứng dụng; phương pháp; tiêu chuẩn; quy phạm; phần mềm máy tính; bản vẽ
thiết kế; quy trình công nghệ; sơ đồ, bản đồ; số liệu, cơ sở dữ liệu; báo cáo phân tích; tài
liệu dự báo (phương pháp, quy trình, mô hình, ); đề án, qui hoạch; luận chứng kinh tế-kỹ
thuật, báo cáo nghiên cứu khả thi và các sản phẩm khác)
Số
TT
Tên sản phẩm

Yêu cầu khoa học
cần đạt

Theo kế hoạch Thực tế đạt được
1
Quy trình chuyển gen
thông qua
Agrobacterium cho đu
đủ
đảm bảo hiệu xuất chuyển
gen cao, dễ thực hiện

Đảm bảo hiệu suất chuyển
gen cao, dễ thực hiện
2
Quy trình chuyển gen
thông qua
Agrobacterium cho cam
quýt
đảm bảo hiệu xuất chuyển
gen cao, dễ thực hiện
Đảm bảo hiệu suất chuyển
gen cao, dễ thực hiện
3
Quy trình đánh giá cây
chuyển gen trong phòng
thí nghiệm và nhà lưới
đảm bảo nhanh dễ thực hiện
và có độ chính xác cao
Đảm bảo nhanh dễ thực hiện
và có độ chính xác cao
4 Số liệu và cơ sở dữ liệu
các trình tự cấu trúc gen của
các dòng PRSV và CTV của
Việt Nam có giá trị công bố
quốc tế, các số liệu đánh giá
tính đa dạng di truyền của
các virus Việt Nam
Các trình tự cấu trúc gen của
các dòng PRSV và CTV của
Việt Nam có giá trị công bố
quốc tế, các số liệu đánh giá

tính đa dạng di truyền của
các virus Việt Nam
5
Phương pháp xác định
bệnh PRSV và CTV
dựa trên cơ sở RT-PCR và
Elisa có độ chính xác cao và
dễ sử dụng
Phương pháp RT-PCR có độ
chính xác cao và dễ sử dụng
6 Báo cáo phân tích
Phân tích về hiện trạng bệnh
PRSV và CTV ở Việt Nam, tính
đa dạng của các virus gây
bệnh
Phân tích tính ổn định của các
gen chuyển và khả năng sử
dụng trong tạo giống
Phân tích về hiện trạng bệnh
PRSV và CTV ở Việt Nam,
tính đa dạng của các virus
gây bệnh
Phân tích tính ổn định của
các gen chuyển
7
Tài liệu dự báo:
Các bài tổng quan về
tình hình phát triển cây
chuyển gen trên thế giới
và đinh hướng phát

triển cho Việt Nam
Đảm bảo cập nhật, mang tính
khách quan, sat với tình hình
và điều kiện của Việt Nam, đề
xuất được các định hướng
phát triển tương lai có tính
khả thi.
Đảm bảo cập nhật, mang
tính khách quan, sat với tình
hình và điều kiện của Việt
Nam, đề xuất được các
định
hướng phát triển tương lai có
tính khả thi.



9
c) Sản phẩm Dạng III
(Bài báo; Sách chuyên khảo; và các sản phẩm khác. Tình hình công bố kết quả nghiên cứu
(bài báo, ấn phẩm, ) ở các tạp chí có uy tín trong, ngoài nước và mức độ trích dẫn)
Số
TT
Tên sản
phẩm

Yêu cầu khoa họccần đạt

Số lượng, nơi công bố
Theo kế hoạch Thực tế đạt được

1 Bài báo
Công bố 5-10 bài
báo chuyên
ngành
04 bài đã xuất bản
04 bài đã được tạp
chí nhận chờ xuất
bản
(1) Hội nghị quốc tế Malaysia;
(1) Tạp chí Nông nghiệp &
phát triển Nông thôn;
(2) Tạp chí Công nghệ sinh
học
d) Kết quả đào tạo
Số TT
Cấp đào tạo, Chuyên
ngành đào tạo
Số lượng
Ghi chú
(Thời gian kết
thúc)
Theo kế hoạch
Thực tế đạt
được
1 Cử Nhân 1 4 2007-2009
2 Thạc sỹ 3-5 4 2007-2010
3 Tiến sỹ Di truyền học 1 1 2012
đ) Tình hình đăng ký bảo hộ quyền sở hữu công nghiệp, quyền đối với giống
cây trồng
Số

TT
Tên sản phẩm đăng ký
Kết quả
Ghi chú
(Thời gian kết
thúc)
Theo kế
hoạch
Thực tế đạt
được
1
Quy trình chuyển gen thông qua
Agrobacterium cho cây cam, quýt
0
01 Giải pháp
hữu ích
2010
2
Các đoạn gen nhân tạo mang đa đoạn
gen của các dòng PRSV và CTV của
Việt Nam
0 02 Sáng chế 2010

10
2. Đánh giá về hiệu quả do đề tài mang lại
a) Hiệu quả về khoa học và công nghệ
(Nêu rõ danh mục công nghệ và mức độ nắm vững, làm chủ, so sánh với trình độ
công nghệ so với khu vực và thế giới…)
1. Đề tài đã ứng dụng một cách thành công các kỹ thuật sinh học phân tử
trong phân lập, xác định, phân tích so sánh trình tự gen và đánh giá đa

dạng di truyền số lượng lớn và một cách có hệ thống các chủng virus
gây bệnh đốm vòng và bệnh tàn lụi, các kết quả thu được đạt trình độ
tương đương các nghiên cứu trên thế giới.
2. Tạo được những quy trình kỹ thuật, công nghệ nền như: công nghệ
RNAi ứng dụng trong tạo cây trồng kháng bệnh virus đây là một công
nghệ hiện đại và có tính hiệu quả cao hiện đang được ứng dụng trên thế
giới, các quy trình kỹ thuật chuyển gen ở cây ăn quả có múi và cây đu
đủ là các đối tượng cây gỗ lâu năm khó chuyển gen, các qui phạm cơ
bản về đánh giá cây ăn quả chuyển gen góp phần phát triển lĩnh vực
khoa học tạo giống cây trồng kháng b
ệnh virus nói riêng và tạo giống
cây trồng nói chung, góp phần tăng cường năng lực quản lý nhà nước
về an toàn sinh học đối với sinh vật chuyển gen.
3. Đưa công nghệ tạo cây chuyển gen thành một công cụ hỗ trợ đắc lực cho
công tác tạo giống truyền thống cho cây ăn quả nói riêng và cây trồng nói
chung, đồng thời nâng cao năng lực tiếp cận các lĩnh vực khoa học hiện
đại trong lĩnh vực tạ
o giống và khoa học cây trồng nói chung.
4. Góp phần đưa sinh học phân tử kết hợp với các phương pháp miễn dịch
enzyme vào chuẩn đoán các bệnh cây, quản lý cây chuyển gen và quản
lý dịch bệnh ở trên cây trồng.
5. Góp phần nâng cao năng lực của cán bộ nghiên cứu tham gia đề tài,
trong lĩnh vực tạo giống cây trồng chuyển gen và góp phần đào tạo

11
nhân lực khoa học trong lĩnh vực công nghệ sinh học hiện đại, góp
phần đưa nền khoa học nước ta từng bước hội nhập khu vực và quốc tế
trên các lĩnh vực về công nghệ sinh học thực vật nói chung và công
nghệ tạo cây trồng biến đổi gen nói riêng.
b) Hiệu quả về kinh tế xã hội

1. Giảm chi phí sản xuất khi không phải dùng nhiều thuốc sâu, thuốc bệnh
hoá chất,
đảm bảo con người và môi trường không bị ô nhiễm hoá chất độc.
2. Giảm chi phí bảo vệ thực vật, hạ giá thành nông sản, tăng thu nhập cho
người nông dân.
3. Đa dạng hóa sản phẩm, kéo dài tuổi thọ sản phẩm mở rộng thị trường
(hoa tươi, quả nhiệt đới) tạo thêm công việc cho nông dân, góp phần
chuyển dịch cơ cấu trong sản xuất nông nghiệp.
4. Đưa nướ
c ta hội nhập bình đẳng vào trào lưu phát triển nông nghiệp
công nghệ cao của khu vực và thế giới thông qua giảm sử dụng hoá
chất và tăng cường chất lượng sản phẩm.
3. Tình hình thực hiện chế độ báo cáo, kiểm tra của đề tài, dự án:
Số
TT
Nội dung
Thời gian
thực hiện

Ghi chú
(Tóm tắt kết quả, kết luận chính, người chủ
trì…)
I Báo cáo định kỳ

Lần 1:
(1) Thu thập mẫu virus
tristeza và PRSV ở các vùng
khác nhau;
(2) Phân lập gen CP, CPm,
RDRP của CTV;

(3) Phân lập gen CP và Nib
của PRSV;
(4) Xây dựng được quy trình
chuyển gen cho cây đu đủ
thông qua phôi soma sử
dụng Agrobacterium
1 –
10/2007
(1) Thu thập được một số lượng lớn các
mẫu bệnh: 121 mẫu CTV và 136 mẫu PRSV
từ các vùng khác nhau đảm bảo đầy đủ về
số lượng so với đăng ký củ
a đề tài;
(2) Phân lập và xác định trình tự được 47
gen (CP và Nib) của virus PRSV;
(3) Phân lập, xác định trình tự gen (CP,
CPm và RDRP) của 18 dòng virus CTV
nghiên cứu, ngoài ra để đánh giá quan hệ
và đa dạng di truyền của các giống này
chúng tôi đã phân lập và xác định trình tự
thêm 43 vùng gen của các chủng nghiên
cứu;
(4) Xây dựng được 01 quy trình chuyển gen
cho giống đu đủ Lý Nhân (Mexico) qua phôi
soma sử dụng Agrobacterium
Người chủ trì: TS. Chu Hoàng Hà