Nghiên cứu chuyển gen mã hóa protein bề mặt của virus H5N1 vào cây đậu tương phục vụ sản xuất vaccine thực vật

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
––––––––––––––––––





NGUYỄN THU HIỀN






NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN MÃ HÓA PROTEIN
BỀ MẶT CỦA VIRUS H5N1 VÀO CÂY ĐẬU TƯƠNG
PHỤC VỤ SẢN XUẤT VACCINE THỰC VẬT





LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2013




BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
––––––––––––––––––




NGUYỄN THU HIỀN





NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN MÃ HÓA PROTEIN
BỀ MẶT CỦA VIRUS H5N1 VÀO CÂY ĐẬU TƯƠNG
PHỤC VỤ SẢN XUẤT VACCINE THỰC VẬT
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 62 42 01 21

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC




Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. CHU HOÀNG HÀ
2. GS. TS. CHU HOÀNG MẬU





THÁI NGUYÊN - 2013




1
MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề
Cúm là một căn bệnh nguy hiểm gây tử vong cao và hằng năm trên thế
giới đã có hơn nửa tỷ người mắc bệnh. Hiện nay, virus cúm A/H5N1- chủng
virus nguy hiểm nhất ở gia cm đã lan truyền trên 40 quốc gia ở châu Á,
Trung đông, châu Âu và châu Phi.  nước ta, dịch cúm gia cm H5N1 xảy ra
từ những tháng cuối năm 2003 gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành chăn
nuôi gia cm và ảnh hưởng đến sức khoẻ con người. Việt Nam và Indonesia

là hai quốc gia có số người nhiễm virus cúm A/H5N1 và có tỷ lệ tử vong cao
nhất so với các quốc gia trên thế giới. Chính vì vậy nghiên cứu làm sáng tỏ
bệnh cúm A/H5N1 và nhân tố gây bệnh để xây dựng biện pháp phòng và
khống chế bệnh là yêu cu thực tiễn đặt ra.
Dịch cúm gia cm diễn biến ngày càng phức tạp vì hệ gen của virus cúm
A luôn biến đổi. Bên cạnh đó, nguồn tàng trữ và lây lan bệnh là chim di cư và
thủy cm rất khó kiểm soát và khống chế. Hiện nay, việc phòng chống virus
cúm A nói chung và H5N1 nói riêng, bên cạnh các biện pháp phòng chống
dịch như tiêu độc, xử lý gia cm bị bệnh, thanh lý gia cm nhiễm hoặc nguy
cơ nhiễm thì biện pháp sử dụng vaccine vẫn là hướng thiết yếu nhất để khống
chế và ngăn chặn sự lây lan dịch sang người. Hiện nay, ngoài vaccine truyền
thống, vaccine thế hệ mới được tạo ra bằng các phương pháp tái tổ hợp và di
truyền ngược đang được sử dụng rộng rãi. Tuy nhiên, các loại vaccine này có
nhược điểm như giá thành cao, khó bảo quản và mức độ an toàn thấp. Do vậy,
các nhà khoa học trên thế giới vẫn đang tiếp tục phát triển những loại vaccine
mới có tính ưu việt hơn, rẻ hơn, dễ bảo quản, an toàn và hiệu quả hơn.
Vaccine ăn được từ thực vật là vaccine tác động vào thể dịch, kích thích cả hệ
thống miễn dịch thể dịch và miễn dịch tế bào. Vaccine thực vật có hoạt tính




2
tương tự như vaccine thông thường, chỉ khác là vaccine này được thực vật sản
xuất trong những phn ăn được như lá, củ, quả và hạt. Vaccine thực vật có
một số ưu điểm nổi bật so với các loại vaccine khác ở chỗ có thể ăn tươi hoặc
nấu chín; dễ dàng sản xuất khối lượng lớn bằng cách tăng diện tích trồng cây
chuyển gen có khả năng sản xuất kháng nguyên; vaccine thực vật có tính ổn
định, an toàn cao, dễ bảo quản, dễ sử dụng và có hiệu quả kinh tế.
 Việt Nam, đậu tương là cây có giá trị kinh tế cao, hạt đậu tương là

nguồn thực phẩm chính cho vật nuôi và con người. Sự biểu hiện thành công
gen gus trên cây đậu tương là cơ sở của việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen để
sản xuất các chất có dược tính như vaccine trong hạt đậu tương. Với ưu điểm
nổi bật như sản xuất đơn giản, giá thành thấp, hiệu quả cao trong phòng bệnh
và có độ an toàn, vaccine sản xuất từ thực vật được xem là hướng đi phù hợp
trong chiến lược chăm sóc sức khoẻ cộng đồng ở các quốc gia đang phát triển.
Xuất phát từ lý do trên chúng tôi đã tiến hành đề tài luận án là: “Nghiên
cứu chuyển gen mã hóa protein bề mặt của virus H5N1 vào cây đậu tương
phục vụ sản xuất vaccine thực vật”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Thiết kế được vector mang cấu trúc gen HA, đoạn gen HA1 của virus
cúm A/H5N1.
Tạo được cây đậu tương chuyển gen mang cấu trúc đoạn gen HA1 và
biểu hiện được protein tái tổ hợp HA1 ở hạt đậu tương.
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Thiết kế và tổng hợp gen HA và đoạn gen HA1, nhân dòng gen HA và
đoạn gen HA1 trong tế bào vi khuẩn E.coli và tạo vector chuyển gen mang
cấu trúc gen HA và đoạn gen HA1.




3
3.2. Biến nạp cấu trúc vector chuyển gen mang gen HA và đoạn gen HA1 vào
vi khuẩn A. tumefaciens. Lây nhiễm vi khuẩn A. tumefaciens tái tổ hợp vào
mô lá thuốc lá và tái sinh tạo cây thuốc lá chuyển gen mang gen HA và đoạn
gen HA1;
3.3. Phát triển hệ thống tái sinh đa chồi phục vụ chuyển gen ở cây đậu tương;
3.4. Chuyển cấu trúc vector mang gen gus biểu hiện ở hạt vào cây đậu tương.
Đánh giá hiệu quả chuyển gen gus ở giống đậu tương ĐT12 và DT84;

3.5. Chuyển cấu trúc vector mang đoạn gen HA1 vào cây đậu tương và phân
tích sự có mặt của đoạn gen chuyển HA1 ở cây đậu tương của thế hệ T0;
3.6. Phân tích dòng cây đậu tương chuyển gen ở thế hệ T1 bằng kỹ thuật PCR và lai
Western blot để xác định sự biểu hiện của protein HA1 ở hạt đậu tương.
4. Những đóng góp mới của luận án
4.1. Hai cấu trúc vector mang gen HA và mang đoạn gen HA1 biểu hiện trong
hạt đã được thiết kế thành công và tạo được chủng vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens tái tổ hợp mang cấu trúc gen HA, đoạn gen HA1 của virus cúm
A/H5N1.
4.2. Giống đậu tương ĐT12 và DT84 đã được thử nghiệm chuyển gen gus.
Hiệu suất chuyển gen được kiểm tra ở giai đoạn hạt là 7,8% đối với giống
ĐT12 và 4,3 % với giống DT84.
4.3. Chuyển cấu trúc SLHEP-HA1 vào cây đậu tương và thu được 8 dòng cây
đậu tương ở thế hệ T
0
mang cấu trúc vector biểu hiện đặc trưng trong hạt
SLHEP-HA1.
4.4.  thế hệ T1 đã thu được dòng đậu tương H11 chuyển gen mang đoạn gen
HA1 và biểu hiện thành công protein HA1 trong hạt của dòng đậu tương H11.






4
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
Về khoa học: Đã thiết kế được vector chuyển gen mang cấu trúc gen HA và
đoạn gen HA1 biểu hiện ở hạt thực vật. Biểu hiện thành công gen gus ở hạt.
Đã hoàn thiện được quy trình tái sinh đa chồi ở cây đậu tương. Với việc lây

nhiễm vi khuẩn A. tumefaciens tái tổ hợp vào mô đậu tương đã tổn thương,
tạo cây đậu tương chuyển gen và đã biểu hiện thành công protein HA1 của
virus H5N1 trong hạt đậu tương.
Về thực tiễn: Với kết quả protein HA1 đã được biểu hiện thành công trong hạt
đậu tương ở thế hệ T
1
là cơ sở của việc tiếp tục kiểm tra đáp ứng khả năng
miễn dịch của gia cm, đồng thời làm tiền đề cho việc nghiên cứu sản xuất
vaccine ăn được ở thực vật.



















5
Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. BỆNH CÚM GIA CẦM VÀ VIRUS CÚM A/H5N1
1.1.1. Bệnh cúm gia cầm và dịch bệnh cúm A/H5N1
Cúm gia cm (Avian Influenza, AI) là bệnh truyền nhiễm cấp tính của
gia cm, do nhóm virus cúm A thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra [38]. Đây
là nhóm virus có biên độ rộng, được phân chia thành nhiều phân type khác
nhau dựa trên kháng nguyên HA và NA có trên bề mặt capsid của hạt virus.
Nhóm virus cúm A có 16 phân type HA (từ H1 đến H16) và 9 phân type NA
(từ N1 đến N9) và sự tái tổ hợp giữa các phân type HA và NA sẽ tạo ra nhiều
phân type khác nhau về độc tính và khả năng gây bệnh [42].
Virus cúm A/H5N1 có độc lực cao và gây bệnh trên người vào những
năm 1996-2008 [106]. Chủng virus cúm A/H5N1 được phát hiện ln đu tiên
gây bệnh dịch trên gà tại Scotland vào năm 1959. Sau đó, cúm A/H5N1 đã tái
xuất hiện tại Quảng Đông (1996) và Hồng Kông (1997) với sự biến đổi sâu
sắc, không những gây chết gia cm mà còn thích ứng trên người và gây chết
người bệnh [142]. Năm 2003, virus H5N1 gây ra dịch cúm trên gia cm tại
Hồng Kông, Trung Quốc và lây lan sang hàng chục quốc gia ở châu Á, châu
Âu và châu Phi, trong đó có Việt Nam. Cấu trúc virus cúm A/H5N1 vẫn như
trước đó, nhưng xét về độc lực , loài vật chủ nhiễm bệnh, tính kháng nguyên-
miễn dịch và mức độ truyền lây có nhiều nét đặc trưng hơn và khác với những
biến chủng H5N1 trước đây. Các chủng virus cúm A/H5N1 thuộc phân dòng
Thanh Hải (nguồn gốc vùng Bắc Trung Quốc) xuất hiện cuối năm 2005, bắt
đu lan sang một số nước vùng Trung Á, Nga rồi tràn ngập vào các nước
vùng Tây Á, bao gồm cả Thổ Nhĩ Kỳ, các nước Bắc-Trung Phi, trong đó Ai
Cập và Nigeria là các nước chịu thiệt hại nhiều nhất [25].

6
Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đến tháng 3/2013, đã
có tới 622 trường hợp mắc cúm A/H5N1, trong đó có 371 trường hợp đã tử
vong, chiếm 59,65%. Trong đó quốc gia có số người mắc bệnh và số tử vong
cao là các nước Ai cập, Indonesia và Việt Nam. Kết quả điều tra dịch tễ học
cho thấy, hu hết những ca nhiễm cúm gia cm H5N1 trên người đều có liên
quan đến tiếp xúc với gia cm bị bệnh hoặc trung gian qua thực phẩm chế
biến từ gia cm bị bệnh hoặc qua tiếp xúc trực tiếp như giết mổ, vận chuyển,
mua bán gia cm.
Việt Nam được WHO xác định là quốc gia “điểm nóng” do virus cúm
A/H5N1 có các điều kiện thuận lợi để tiến hóa thích nghi lây nhiễm và trở thành
virus của người.  Việt Nam, đại dịch bùng phát từ năm 2003, đã tái phát qua
bốn đợt dịch. Đợt thứ nhất xảy ra ở 57 tỉnh, thành phố; đợt dịch thứ tư gn đây
nhất xảy ra ở 21 tỉnh, thành phố, đã tiêu hủy trên 50 triệu gia cm các loại, thiệt
hại lên đến hàng ngàn tỷ đồng [9].
Qua điều tra dịch tễ, các trường hợp nhiễm cúm A/H5N1 trên người
được ghi nhận đồng thời với thời điểm có dịch cúm trên gia cm. Mặc dù số
ca nhiễm ít nhưng tỷ lệ tử vong rất cao (59%) và chi phí điều trị rất tốn kém,
do vậy biện pháp tốt nhất là dự phòng để tránh mắc bệnh [7].
1.1.2. Virus cúm A/H5N1
1.1.2.1. Đặc tính của virus cúm A/H5N1
Virus cúm A/H5N1 mẫn cảm với nhiệt độ, với các dung môi hòa tan
lipid, với các loại hóa chất sát trùng và oxy hóa, với formaldehyde và với các
tia phóng xạ. Các hạt virus tồn tại trong pH từ 6,5 đến 7,9. Trong điều kiện
quá acid hoặc quá kiềm đều làm giảm khả năng lây nhiễm. Virus A/H5N1 bị
bất hoạt dưới ánh sáng trực tiếp sau 40 giờ, tồn tại được 15 ngày ánh sáng
thường, tia tử ngoại bất hoạt được virus nhưng không phá hủy được kháng
nguyên của virus. Tuy nhiên, virus bị phá hủy hoàn toàn ở 100
o
C hoặc 30

7
phút ở 60
o
C, tồn tại 3 tháng ở nhiệt độ thấp (trong phân gia cm), và hàng
năm ở -70
o
C. Trong phủ tạng gia cm (40
o
C) tồn tại được 25-30 ngày, nhưng
trong cơ thể người (37
o
C) chỉ sống được 7-8 ngày, còn ở nước 30
o
C tồn tại
được 4 ngày [24] [26] [75].
Về mặt dịch tễ học, virus cúm A có nhiều biến chủng khác nhau. Các phân
type (subtype) là kết quả tái tổ hợp của 15 HA (H1-H15) và 9 NA (N1-N9).
Hemagglutinin mới, dạng thứ 16 (H16), được tìm thấy năm 2005 từ con mòng
biển đu đen. Trình tự H16 có độ tương đồng cao với H13 [25] [32]. Các phân
type gây nhiễm cho hu hết các loài sinh vật bao gồm loài người, các loài lông
vũ (gà, thủy cm), lợn, ngựa, chim, chồn đất, hải cẩu, cá voi Chúng thích ứng
hu hết với mọi loại vật chủ và hệ gen luôn luôn biến đổi, định kỳ gây nên
những vụ dịch cúm kinh hoàng trong lịch sử ở động vật và người [140]. Do đặc
tính biến đổi gen nhanh chóng và trao đổi gen để tái tổ hợp tạo biến thể mới lan
truyền trong qun thể sinh vật, cúm A là nhóm virus nguy hiểm truyền bệnh từ
động vật sang người .Virus A/H5N1 được coi là loại biến chủng có mức độ độc

lực cao nhất đối với các loài động vật và người, có nhiều minh chứng khoa học
cho thấy chủng này bắt nguồn từ H6N2 hoặc và trao đổi gen thông qua H9N2
trên lợn [77].
Về danh pháp, để ký hiệu và lưu trữ một cách khoa học và đy đủ, các
chủng virus cúm sau khi phân lập phải được ký hiệu theo danh pháp quy định
với trật tự như sau: tên serotype/loài bị nhiễm/nơi phân lập/số hiệu chủng/thời
gian phân lập/loại hình subtype (HA (H) và NA (N)) [35] [25]. Ví dụ: virus
cúm có ký hiệu A/chicken/Vietnam/HG4/ 2005(H5N1) có thông tin về danh
pháp là cúm nhóm A, loài nhiễm là gà (chicken), nơi phân lập là Việt Nam, số
hiệu chủng là HG4 – Hậu Giang 4, thời gian phân lập là năm 2005, phân type
là H5N1.




8
Tính gây bệnh hay độc lực của virus cúm A được chia làm hai loại: (1)
loại độc lực cao (HPAI - Highly pathogenic avian influenza) và (2) loại độc
lực thấp (LPAI - Low pathogenic avian influenza). Cả hai loại đều cùng tồn
tại trong tự nhiên [30]. HPAI là loại virus cúm A có khả năng gây tổn thương
nhiều cơ quan nội tạng trong cơ thể nhiễm, trên gia cm chúng thường gây chết
100% số gia cm bị nhiễm trong vòng 48 giờ sau nhiễm. Loại này rất nguy
hiểm gây lo ngại cho cộng đồng. Virus loại HPAI phát triển tốt trên tế bào phôi
gà và tế bào thận chó trong môi trường nuôi cấy không có trypsin [29]. LPAI là
loại virus khi phát triển trong cơ thể nhiễm, có thể gây bệnh cúm nhẹ không có
triệu chứng lâm sàng điển hình và không làm chết vật chủ. Đây là loại virus lây
truyền rộng rãi và tạo nên các ổ bệnh trong tự nhiên của virus cúm A, loại này
có thể trao đổi gen với các chủng virus có độc lực cao đồng nhiễm trên cùng
một tế bào và trở thành loại virus HPAI nguy hiểm [68] [155].
1.1.2.2. Cấu trúc hệ gen của virus cúm A/H5N1

Hệ gen của virus cúm A/H5N1 có khoảng 13500 nucleotide, gồm 8 phân
đoạn gen mã hoá cho 8 phân tử protein [34]. Các phân đoạn 1, 2 và 3 là những
phân đoạn mã hóa tổng hợp các enzyme trong phức hợp polymerase (RNA
transcriptase) của virus, có độ dài ổn định và có tính bảo tồn cao, cụ thể là:
Phân đoạn 1 (gen PB2) mã hóa tổng hợp enzyme PB2, là tiểu đơn vị
thành phn trong phức hợp polymerase của virus, chịu trách nhiệm khởi đu
phiên mã RNA virus. PB2 có khối lượng phân tử 87.10
3
Da [38]. Tính thích
nghi nhiệt độ cơ thể loài vật chủ được cho là có liên quan đến vị trí amino
acid 627 ở protein PB2 (ở virus cúm gia cm vị trí này là Glu - thích ứng với
nhiệt độ cơ thể gia cm khoảng 40
o
C, còn ở virus thích nghi trên người là Lys
- thích ứng nhiệt độ cơ thể người khoảng 37
o
C) [63].
Phân đoạn 2 (gen PB1) mã hóa tổng hợp enzyme PB1 - tiểu đơn vị xúc
tác của phức hợp enzym polymerase trong quá trình tổng hợp RNA virus, chịu




9
trách nhiệm gắn mũ RNA [38]. Gn đây, đã có phát hiện thêm một protein
(PB1-F2) được mã hóa bởi một khung đọc mở khác của PB1, có vai trò gây ra
hiện tượng apoptosis (hiện tượng tế bào chết theo chương trình) [38].
Phân đoạn 3 (gen PA) là phân đoạn gen bảo thủ cao, mã hóa tổng hợp
protein enzyme PA có khối lượng phân tử là 96.10
3

Da. PA là một tiểu đơn vị
của polymerase chịu trách nhiệm kéo dài sự phiên mã RNA trong quá trình
tổng hợp RNA của virus [8].
Các phân đoạn 4 và 6 mã hóa cho các protein (HA và NA) bề mặt capsid
của virus, có tính kháng nguyên đặc trưng theo từng chủng virus cúm A, cụ
thể như sau:
Phân đoạn 4 (gen HA) có độ dài thay đổi tuỳ theo từng chủng virus cúm
A Gen HA mã hóa tổng hợp protein HA - kháng nguyên bề mặt virus cúm,
gồm hai tiểu phn là HA1 và HA2. Vùng nối giữa HA
1
và HA
2
gồm một số
amino acid mang tính kiềm được mã hóa bởi một chuỗi oligonucleotide, đó là
điểm cắt của protease và đây là vùng quyết định độc lực của virus [8 ].
Protein HA có khối lượng phân tử khoảng 63.10
3
Da (nếu không được
glycosyl hóa) và 77.10
3
Da (nếu được glycosyl hóa, trong đó HA
1
là 48.10
3
Da
và HA
2
là 29.10
3
Da) [29].

Phân đoạn 6 (gen NA) là một gen kháng nguyên của virus, có kích thước
thay đổi theo từng chủng virus cúm A. Đây là gen mã hóa tổng hợp protein
NA, kháng nguyên bề mặt capsid của virus, có khối lượng phân tử là 50 -
60.10
3
Da. Các nghiên cứu phân tử gen NA của virus cúm cho thấy phn đu
5’- của gen (hay phn tận cùng N của polypeptide NA) có tính biến đổi cao và
phức tạp giữa các chủng virus cúm A, sự thay đổi này liên quan đến quá trình
thích ứng và gây bệnh của virus cúm trên nhiều đối tượng vật chủ khác nhau [
93]. Đặc trưng biến đổi của gen NA trong virus cúm A là hiện tượng đột biến
trượt-xóa một đoạn gen là 57 nucleotide, rồi sau đó là 60 nucleotide [42].




10
Các phân đoạn gen M, NP và NS mã hóa tổng hợp các protein chức năng
khác nhau của virus, có độ dài tương đối ổn định giữa các chủng virus cúm A,
cụ thể:
Phân đoạn 5 (gen NP) mã hóa tổng hợp nucleoprotein (NP) - thành phn
của phức hệ phiên mã, chịu trách nhiệm vận chuyển RNA giữa nhân và bào
tương tế bào chủ. NP là một protein được glycosyl hóa, có đặc tính kháng
nguyên biểu hiện theo nhóm virus, tồn tại trong các hạt virus ở dạng kết hợp
với mỗi phân đoạn RNA, có khối lượng phân tử theo tính toán khoảng 56.10
3
Da (trên thực tế là 50 - 60.10
3
Da) [38].
Phân đoạn 7 (gen M) mã hóa cho protein đệm (matrix protein - M) của
virus (gồm hai tiểu phn là M1 và M2 được tạo ra bởi những khung đọc mở

khác nhau của cùng một phân đoạn RNA), cùng với HA và NA có khoảng
3000 phân tử MP trên bề mặt capsid của virus cúm A, có mối quan hệ tương
tác bề mặt với hemagglutinin. Protein M1 là một protein nền, là thành phn
chính của virus có chức năng bao bọc RNA tạo nên phức hợp RNP và tham gia
vào quá trình “nảy chồi” của virus [38]. Protein M2 là chuỗi polypeptide bé, có
khối lượng phân tử là 15.10
3
Da, là protein chuyển màng - kênh ion (ion
channel) cn thiết cho khả năng lây nhiễm của virus, chịu trách nhiệm “cởi áo”
virus trình diện hệ gen ở bào tương tế bào chủ trong quá trình xâm nhiễm trên
vật chủ.
Phân đoạn 8 (gen NS), là gen mã hóa protein không cấu trúc (non
structural protein), có độ dài ổn định nhất trong hệ gen của virus cúm A mã
hóa tổng hợp hai protein là NS1 và NS2 (còn gọi là NEP, nuclear export
protein), có vai trò bảo vệ hệ gen của virus [42]. Độc tính của virus có sự liên
quan với gen không cấu trúc (non-structural gen) này được tìm thấy ở biến
chủng A/H5N1/97 [24 ], trong tự nhiên, việc đột biến xóa đi một phn gen có
liên quan đến giảm độc lực [25]. NS1 có khối lượng phân tử là 25.10
3
Da,




11
chịu trách nhiệm vận chuyển RNA thông tin của virus từ nhân ra bào tương tế
bào nhiễm, và tác động lên các RNA vận chuyển cũng như các quá trình cắt
và dịch mã của tế bào chủ. NEP hay NS2, là gen hình thành từ hai đoạn gen
(30 nucleotit và 336 nucleotit) mã hóa loại protein có khối lượng phân tử là
12x10

3
Da, đóng vai trò vận chuyển các RNP của virus ra khỏi nhân tế bào
nhiễm để lắp ráp với capsid tạo nên hạt virus mới [42].
Như vậy, virus cúm A/H5N1 có hệ gen được cấu trúc từ 8 phân đoạn
riêng biệt và không có gen mã hóa enzyme sửa chữa RNA. Do vậy, trong thực
tế dễ xuất hiện các đột biến điểm trong mỗi phân đoạn gen và trong hệ gen
qua quá trình sao chép nhân lên của virus, hoặc trao đổi các phân đoạn gen
giữa các chủng virus cúm đồng nhiễm trên cùng một tế bào, rất có thể dẫn đến
thay đổi đặc tính kháng nguyên tạo nên các chủng virus mới [29].








Hình 1.1. Hình thái, mô hình cấu tạo, cấu trúc ribonucleoprotein
của virus cúm A/H5N1
A: Các dạng hình thái khác nhau của virus cúm A dưới kính hiển vi điện tử; B: Mô hình
cấu tạo hạt virus cúm A (Hemagglutinin: phân tử kháng nguyên HA, Neuraminidase:
phân tử kháng nguyên NA; PB2, PB1, PA: ba tiểu phầndưới đơn vị phức hợp enzyme
polymerase của virus). C: Cấu trúc của phức hợp ribonucleoprotein (RNP) (Nguồn: ©
Paul Digard, Dept Pathology, University of Cambridge).




A
C

12
Nucleic acid và protein của virus sắp xếp theo kiểu xoắn lò so xung
quanh một trục tạo nên cấu trúc đối xứng xoắn hình cu (đường kính 89 – 120
nm) hoặc hình sợi kéo dài (tới vài μm) của virion. Nucleocapsid được bao bọc
bởi màng protein nền M1, phía ngoài màng là lớp lipid kép có nguồn gốc từ
màng sinh chất của tế bào chủ, có chức năng chính là ổn định cấu trúc của virus.
Lớp vỏ ngoài của virus còn có các glycoprotein (protein đã được glycosyl hoá).
Những protein này thực chất là protein của màng tế bào nhiễm đã được chuyên
hoá để gắn protein màng của virus vào, gồm protein M2 đâm xuyên và nhô ra
khỏi vỏ ngoài và 2 protein gai nhô ra ngoài bề mặt (HA và NA).
1.1.2.3. Đặc trưng của kháng nguyên HA và NA
HA và NA là các protein chính bề mặt capsid đặc trưng cho bản chất của
từng chủng virus cúm A [38].
Protein HA (Hemagglutinin)
Gen HA có kích thước thay đổi tùy theo từng chủng virus cúm. Gen
HA mã hóa cho protein kháng nguyên ngưng kết hồng cu có độ dài 568-569
amino acid. Gen HA được phân lập từ chủng H1N1 (1934) Tây Ban Nha,
chủng H5N1 (1996) ở Quảng Đông, Trung Quốc như các chủng nguyên thủy
[42 ]. Nhiều gen HA phân lập từ các chủng trong giai đoạn 1997-2003 là các
biến chủng có khả năng gây bệnh rất cao. Hệ gen của virus biến đổi nhanh,
trong đó, những biến đổi gen HA thường xảy ra nhiều và sử dụng chính sự
biến đổi này để phân định nhóm kháng nguyên, phân type và phân tích mối
quan hệ tiến hóa của các chủng H5N1. Các chủng phân lập trong giai đoạn từ
1997-2002 vẫn mang tính đồng kháng nguyên, nhưng các chủng thu được
trong giai đoạn từ 2003 -2005 đã có bằng chứng của sự lệch kháng nguyên
của A/H5N1. Virus cúm A/H5N1 có 12 genotype, những dạng cũ (A, B, C,

D) trước 2002 không còn tồn tại, mà tồn tại 8 dạng mới (V, W, X1, X2, X3,
Y, Z và Z+). Các chủng H5N1 phân lập tại Việt Nam từ 2004 đến 2006 đều




13
thuộc dòng Quảng Đông, tập trung chủ yếu ở genotype Z, nhưng phân thành 2
nhóm: nhóm N – miền Bắc và nhóm S- miền Nam thuộc nhóm tiến hóa
(clade) 1. Năm 2007 đã phát hiện thêm dưới dòng Phúc kiến thuộc clade 2.3.4
[4]. Gen HA được phân lập từ chủng A/Ck/Vietnam/HG4/2005 (Hậu Giang)
có 9 vị trí nucleotide sai khác hoàn toàn so với các chủng khác phân lập ở
Việt Nam và Đông Nam Á, được xác định thuộc nhóm dưới dòng Quảng
Đông và clade 1 [7].
Hemagglutinin (HA) có thể được coi là một loại protein vừa quyết định
tính kháng nguyên, vừa quyết định tính độc lực của virus cúm A. Protein HA
là một glycoprotein thuộc protein màng type I (lectin), có khả năng gây ngưng
kết hồng cu gà trong ống nghiệm (in vitro), kháng thể đặc hiệu với HA có
thể phong tỏa sự ngưng kết đó, được gọi là kháng thể ngăn cản ngưng kết
hồng cu (HI-Hemagglutinin Inhibitory andibody). Có 16 phân type HA đã
được phát hiện (H1-H16), ba phân type (H1, H2 và H3) thích ứng lây nhiễm
gây bệnh ở người liên quan đến các đại dịch cúm trong lịch sử [102]. Có
khoảng 400 phân tử HA trên bề mặt capsid của một virus và khởi động quá
trình xâm nhiễm của virus vào tế bào chủ [9] [7]. Phân tử HA có dạng hình
trụ, dài khoảng 130Å, thường ở dạng kết 3 (trimer), mỗi chuỗi polypeptid
được tạo thành từ HA1 (36 kDa) và HA2 (27 kDa) và các chuỗi polypeptid
liên kết với nhau bởi các cu nối disulfide (-S-S-). Các chuỗi polypeptid sau
khi tổng hợp đã được glycosyl hóa và gắn vào mặt ngoài capsid là chuỗi HA2,
phn đu tự do hình chỏm cu được tạo bởi hạt HA1 chứa đựng vị trí gắn với
thụ thể thích hợp của HA trên bề mặt màng tế bào đích. Sự kết hợp của HA

với thụ thể đặc hiệu (glycoprotein chứa sialic acid) trên bề mặt màng tế bào,
khởi đu quá trình xâm nhiễm của virus trên vật chủ giúp cho virus xâm nhập,
hòa màng và giải phóng RNA hệ gen thực hiện quá trình nhân lên ở tế bào
cảm nhiễm 150. Quá trình kết hợp phụ thuộc vào sự phù hợp cấu hình không




14
gian của thụ thể chứa sialic acid của tế bào đích với vị trí gắn thụ thể này trên
phân tử HA của virus cúm, quyết định sự xâm nhiễm dễ dàng của virus ở các
loài vật chủ khác nhau [133] Vị trí amino acid 226 của chuỗi HA1 được xác
định là vị trí quyết định phù hợp gắn HA với thụ thể đặc hiệu của nó, ở hu
hết các chủng virus cúm A lưu hành trong tự nhiên vị trí này là glycine, thích
ứng với thụ thể Gal α-2.3 sialic acid (chứa sialic acid liên kết với nhóm
hydroxyt (4-OH) của galactose ở góc quay α-2.3) của tế bào biểu mô đường
hô hấp của chim và cúm gia cm . Ngoài ra, một số vị trí amino acid khác như
glutamine 222, glycine 224, hay cấu trúc SGVSS và NGQSGR cũng có sự
liên quan chặt chẽ đến khả năng thích ứng với thụ thể chứa sialic acid bề mặt
màng tế bào chủ [142]. Đặc biệt, một số chủng cường độc A/H5Nx; A/H7Nx
lưu hành hiện nay có thể xâm nhiễm trên người, khi chúng có tải lượng cao
trong đường hô hấp (do tiếp xúc trực tiếp với chất thải hay gia cm nhiễm
bệnh. Trình tự mã hóa chuỗi nối và thành phn chuỗi nối trên protein HA
cũng như các vị trí amino acid liên quan đến khả năng gắn với thụ thể thích
ứng được coi là chỉ thị phân tử trong nghiên cứu phân tích gen kháng nguyên
HA [ 130]. Protein HA còn là kháng nguyên bề mặt quan trọng của virus cúm
A, kích thích cơ thể sinh ra đáp ứng miễn dịch dịch thể đặc hiệu với từng type
HA và tham gia vào phản ứng trung hòa virus, được coi là protein vừa quyết
định độc lực của virus, là đích bảo vệ miễn dịch học nhằm ngăn chặn sự xâm
nhiễm của virus ở cơ thể nhiễm, đây chính là cơ sở điều chế các vaccine

phòng cúm hiện nay [105].









15












Hình 1.2. Mô hình cấu trúc protein Hemagglutinin
A: Rải biểu đồ protein bề mặt Hemagglutin của virus cúm A/H5N1 giới hạn bởi
kháng thể F10 (màu đỏ). Hai chuỗi của HA là HA1 (màu vàng) và HA2 (màu xanh);
B: Protein Hemagglutinin đại diện từ 1918 virus cúm. Vị trí bám receptor là nơi
protein của virus cúm tấn công vào phổi con người

Hemagglutinin là polypeptide gồm 2 chuỗi HA1 và HA2 (Hình 1.2) nối

với nhau bằng một đoạn peptid ngắn, thuộc loại hình motif riêng biệt, đặc
trưng cho các subtype H (H1-H16) trong quá trình tái tổ hợp tạo nên biến
chủng [133]). Chuỗi nối này cũng chính là điểm cắt của protease tạo nên 2
phân đoạn HA rời nhau. Motif của chuỗi nối peptid chứa một số amino acid
mang tính kiềm làm khung, thay đổi đặc hiệu theo từng loại hình subtype H,
và sự biến đổi thành phn của chuỗi nối quyết định tính độc lực của virus
thuộc biến chủng mới [133].
Để minh chứng cho điều đó, gn đây các nhà khoa học đã thành công
trong việc tạo vaccine tái tổ hợp bằng cách đưa các đoạn gen mã hóa kháng





16
nguyên HA hoặc tiểu đơn vị của kháng nguyên HA (HA1, HA2) của chủng
H5N1 vào biểu hiện trong adenovirus. Điều đáng chú ý là kháng nguyên HA1
và HA tái tổ hợp có mức bảo hộ 100% đối với gà thực nghiệm, trong đó
kháng nguyên HA2 có mức độ bảo hộ 60% [146].
Protein NA (Neuraminidase)
Protein neuraminidase còn gọi là sialidase (mã số quốc tế là E.C
3.2.1.18), là một enzyme có bản chất là glycoprotein được gắn trên bề mặt
capsid của virus cúm A, mang tính kháng nguyên đặc trưng theo từng phân
type NA [29]. Có 9 phân type (từ N1 đến N9) được phát hiện chủ yếu ở virus
cúm gia cm, hai phân type N1 và N2 được tìm thấy ở virus cúm người [32].
Có khoảng 100 phân tử NA xen giữa các phân tử HA trên bề mặt capsid hạt
virus. Phân tử NA có dạng nút lồi hình nấm, đu tự do (chứa vùng hoạt động)
gồm 4 dưới đơn vị giống như hình cu nằm trên cùng một mặt phẳng, và phn
kị nước gắn vào vỏ capsid.
Protein NA có vai trò là enzyme cắt đứt liên kết giữa gốc sialic acid của

màng tế bào nhiễm với phân tử cacbonhydrate của protein HA, giải phóng hạt
virus ra khỏi màng tế bào nhiễm, đẩy nhanh sự lây nhiễm của virus trong cơ thể
vật chủ, và ngăn cản sự tập hợp của các hạt virus mới trên màng tế bào. Mặt
khác, NA tham gia vào phân cắt liên kết này trong giai đoạn “hòa màng”, đẩy
nhanh quá trình cởi áo “uncoating” giải phóng hệ gen của virus vào trong bào
tương tế bào nhiễm, giúp cho quá trình nhân lên của virus diễn ra nhanh hơn
[135]. Ngoài ra, NA còn phân cắt các liên kết glycoside, giải phóng neuraminic
acid làm tan loãng màng nhy bề mặt biểu mô đường hô hấp, tạo điều kiện cho
virus nhanh chóng tiếp cận tế bào biểu mô và thoát khỏi các chất ức chế không
đặc hiệu. Cùng với vai trò của kháng nguyên HA, cả 3 khâu tác động trên của
NA đều tham gia làm gia tăng độc lực gây bệnh của virus cúm A ở cơ thể vật
chủ. Do đó, NA là đích tác động của các thuốc, hóa dược ức chế virus không




17
đặc hiệu hiện nay, đặc biệt là Oseltamivir (biệt dược là Tamiflu) phong tỏa
enzyme này, ngăn cản sự giải phóng hạt virus mới khỏi các tế bào đích, bảo vệ
cơ thể [154].
Bên cạnh đó, NA còn là một kháng nguyên bề mặt của virus, tham gia
kích thích hệ thống miễn dịch của cơ thể chủ, sinh ra kháng thể đặc hiệu với
kháng nguyên NA của các chủng virus đương nhiễm có tác dụng phong tỏa
protein NA [150]. Như vậy, kháng nguyên NA cùng với kháng nguyên HA
của virus là các đích chủ yếu của cơ chế bảo hộ miễn dịch của cơ thể với virus
cúm A, và là cơ sở điều chế các vaccine phòng cúm hiện nay cho người và gia
cm, nhằm ngăn chặn dịch cúm ở gia cm và hạn chế lây truyền sang người [5].
1.1.2.4. Cơ chế xâm nhiễm của virus cúm A/H5N1 vào tế bào chủ
Virus cúm A khi xâm nhập vào tế bào động vật hay người qua đường
hô hấp trên hoặc hệ tiêu hóa, ngay lập tức virus sẽ bám vào lớp màng nhày

niêm mạc vật chủ. Virus được gắn vào bề mặt của tế bào thích ứng nhờ có cơ
quan cảm thụ mà bản chất là glycoprotein chứa acid sialic, sau đó virus qua
màng tế bào nhờ loại enzym đặc biệt để vào nguyên sinh chất và nhân tế bào
(Hình 1.3). Tại đây, protein HA bề mặt của virus gắn vào thụ thể chứa
neuraminic acid của tế bào chủ và tiến hành nhập bào tạo nên endosome
(“khoang ẩm bào”). Tiếp theo là quá trình dung hợp giữa vỏ ngoài của virus
với màng endosome, điều này thực hiện được nhờ gai HA chồi lên khi pH
trong endosome thấp. Sau khi dung hợp, ribonucleoprotein (RNP) và RNA-
polymerase vào.









18

Hình 1.3. Sơ đồ xâm nhiễm của virus cúm A/H5N1 trong tế bào chủ
1. Virus được gắn vào bề mặt của tế bào thích ứng nhờ có cơ quan cảm thụ mà bản
chất là glycoprotein chứa acid sialic; 2. Sau đó virus qua màng tế bào nhờ loại enzym
đặc biệt để vào nguyên sinh chất tạo nên endosome (“khoang ẩm bào”); 3. Sợi RNA (-)
xâm nhập vào nhân tế bào; 4. RNA (-) làm khuôn tổng hợp sợi RNA (+) (mRNP (+);
5. Sợi mRNP (+) dịch mã tổng hợp protein; 6. Sợi cRNP (+) ;(sợi bổ sung làm khuôn
tổng hợp sợi âm); 7. Sợi cRNP (+) làm khuôn tổng hợp vRNP (-); 8. Các loại protein
của virus H5N1 được tổng hợp; 9. vRNP (-) kết hợp với các loại protein tạo thành
virus và ra ngoài.


Kết quả của quá trình phiên mã từ 8 phân đoạn RNA từ hệ gen sợi âm
của virus là tạo ra 10 phân tử protein. Sáu phân đoạn (từ 1 đến 6) RNA thông
tin (mRNA) được tạo ra và chịu trách nhiệm tổng hợp thành 6 loại protein:
HA, NA, NP, PB1, PB2, PA, còn phân đoạn 7 và phân đoạn 8 do có hai
khung đọc trên mỗi phân đoạn, nên có hai mRNA tạo ra cho mỗi phân đoạn
để tổng hợp các protein M1, M2 và NS1, NS2.

7




19
Sau khi hợp nhất màng đã được thực hiện trong “khoang ẩm bào”,
nucleocapsid của virus được chuyển vào trong nhân tế bào để thực hiện quá
trình tổng hợp RNA nguyên liệu hệ gen cho các virus mới. Hệ thống enzym
sao chép của virus ngay lập tức tạo nên các RNA thông tin.
Đối với virus cúm, để tổng hợp RNA thông tin, các phân đoạn RNA hệ

gen được mũ hoá ở 10 -13 nucleotide ở đu 5’ với nguyên liệu mũ hoá lấy từ
RNA tế bào, nhờ vào hoạt tính enzym PB2 (polymerase basic protein 2) của
virus. RNA sợi đơn âm được chuyển thành RNA sợi đơn dương theo cơ chế
bổ sung, và sợi dương này lại được sử dụng làm khuôn để tổng hợp nhiều
RNA đơn âm mới nhờ RNA polymerase. Các sợi RNA được tạo ra là một sợi
hoàn chỉnh, không được mũ hóa ở đu 5' và không được adenyl hóa ở đu 3',
chúng sẽ được bao gói lại để hình thành nên ribonucleocapsid. Sau khi được
bao gói, ribonucleocapsid được vận chuyển đến màng tế bào mà ở đó các gai
HA, NA, M2 đã được gắn sẵn nhờ hệ thống Golgi chuyển ra và hạt virus mới
được hình thành, lúc này NA sẽ cắt thụ thể sialic acid giải phóng virus khỏi
tế bào chủ, bắt đu một quá trình lây nhiễm mới.
Quá trình phiên mã, sao chép của virus cúm đặc biệt khác với các
RNA virus khác là quá trình này chỉ xảy ra trong nhân tế bào bị nhiễm. Thời
gian xâm nhiễm và giải phóng hạt virus mới của virus cúm kéo dài trong vài
giờ, các hạt virus mới được tạo thành không làm tan tế bào bị nhiễm, nhưng
các tế bào này dường như không còn khả năng sống sót do rối loạn ở hệ
thống tổng hợp các đại phân tử sinh học.
1.2. VACCINE PHÒNG CHỐNG BỆNH CÚM A/H5N1
1.2.1. Các loại vaccine phòng chống bệnh cúm A/H5N1
Đối với bệnh truyền nhiễm, vaccine được coi là biện pháp có tính chiến
lược, nhằm ngăn chặn lây lan, tạo bảo hộ miễn dịch [4]. Đối với dịch cúm
trên người, nghiên cứu phát triển vaccine không những ngăn ngừa làm giảm




20
được bệnh ở gia cm mà còn khống chế nguồn truyền lây của loại virus nguy
hiểm này sang người. Nhiều công trình nghiên cứu về gen của virus A/ H5N1
và phát triển công nghệ vaccine gây miễn dịch cho gia cm được xúc tiến

mạnh mẽ. Kháng thể đặc hiệu có thể được cơ thể sinh ra do kích thích của
kháng nguyên trong vaccine và đó là các kháng thể kháng HA, NA, MA và
nhiều loại hình khác của virus đương nhiễm, góp phn vô hiệu hóa virus cúm
đúng đối tượng khi chúng xâm nhập vào. Có nhiều loại kháng thể, nhưng
trước hết chỉ kháng thể kháng HA (H5) có vai trò tiên quyết quan trọng trong
quá trình trung hòa virus phòng bệnh hiện nay dựa trên cơ sở hai loại chính:
vaccine truyền thống và vaccine thế hệ mới. Virus cúm H5N1 rất độc có thể
giết chết ngay phôi gà (nguyên liệu dùng trong sản xuất vaccine) từ khi mới
cấy virus vào phôi. Vì vậy loại bỏ vùng gây độc là tiêu chí bắt buộc khi sản
xuất vaccine.
Các loại vaccine sử dụng phòng chống bệnh cúm A/H5N1 bao gồm
vaccine truyền thống, vaccine thế hệ mới hay vaccine công nghệ gen, vaccine
nhược độc virus cúm nhân tạo, vaccine ăn được ở thực vật (plant edible
vaccine).
(1) Vaccine truyền thống
Vaccine truyền thống bao gồm vaccine vô hoạt đồng chủng và dị
chủng. Vaccine vô hoạt đồng chủng (homologus vaccine), đó là các loại
vaccine được sản xuất chứa cùng những chủng virus cúm gà giống như chủng
gây bệnh trên thực địa. Vaccine vô hoạt dị chủng (heterologus vaccine) là
vaccine sử dụng các chủng virus có kháng nguyên HA giống chủng virus trên
thực địa, nhưng có kháng nguyên NA dị chủng [113].
(2) Vaccine thế hệ mới hay vaccine công nghệ gen
Vaccine thế hệ mới hay vaccine công nghệ gen là loại vaccine được sản
xuất dựa trên kỹ thuật gen loại bỏ các vùng “gen độc” đang được nghiên cứu




21
và đưa vào sử dụng phổ biến, bao gồm: (i) vaccine tái tổ hợp có vector đậu

gia cm dẫn truyền, sử dụng virus đậu gia cm làm vector tái tổ hợp mang gen
H5 và N1 phòng chống virus type H5N1 và H7N1 [59]; (ii) vaccine dưới
nhóm chứa protein kháng nguyên NA, HA tái tổ hợp và tách chiết làm
vaccine [92] [123].
(3) Vaccine nhược độc virus cúm nhân tạo
Vaccine nhược độc virus cúm nhân tạo được sản xuất bằng kỹ thuật di
truyền ngược, đó là việc lắp ghép virus cúm nhân tạo chứa đy đủ hệ gen,
trong đó các gen kháng nguyên H5 có vùng “độc” đã được biến đổi bằng kỹ
thuật gen [92]. Có 3 loại vaccine đã được Tổ chức Y tế thế giới (WHO) công
nhận về độ an toàn và khuyến cáo đưa vào chương trình sản xuất vaccine trên
thế giới hiện nay, đó là NIBRG-14 (NIBSC), VN/04xPR8-rg (SJCRH) và
VNH5N1-PR8/CDC-rg (CDC) [95].
(4) Vaccine ăn được ở thực vật (plant edible vaccine)
Do hiện tượng kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn và sự gia tăng
các vi sinh vật mới, ngoài vaccine tiêm chủng ra, từ năm 1990, đã xuất hiện
một thuật ngữ mới vaccine đường miệng (oral vaccine) để chỉ loại vaccine
không cn giữ lạnh, trong đó vaccine ăn được ở thực vật (plant edible
vaccine) cũng thuộc nhóm này [61]. Đây là lĩnh vực nghiên cứu mới trong
công nghệ sinh học bao gồm cả lĩnh vực nghiên cứu sản xuất vaccine và
nghiên cứu cây trồng chuyển gen [71].
Vaccine thực vật (vaccine ăn được ở thực vật) là vaccine tiểu phn protein
được sản xuất dựa trên hệ thống thực vật để thu được protein làm kháng nguyên
mong muốn. Chúng tác động vào dịch thể, kích thích cả hệ thống miễn dịch thể
dịch và miễn dịch tế bào. Vaccine thực vật bền vững trong dịch tiêu hóa, đi qua
đường tiêu hóa mà không bị phân hủy [4]. Sản xuất vaccine thực vật có thể thực
hiện theo quy trình sau đây:

22
(1) Lựa chọn gen cn biểu hiện và đưa vào vector thích hợp;
(2) Lựa chọn đối tượng thực vật thích hợp để chuyển gen;
(3) Chuyển vector tái tổ hợp mang gen quan tâm vào thực vật đã lựa chọn
bằng các phương pháp chuyển gen khác nhau;
(4) Kiểm tra biểu hiện của gen quan tâm trong những bộ phận ăn được của
thực vật;
(5) Thử nghiệm khả năng đáp ứng miễn dịch của vaccine sản xuất từ thực vật;
(6) Sử dụng vaccine đã được thử nghiệm thành công bằng cách ăn tươi
hoặc dưới dạng thức ăn đã chế biến [135].
Kỹ thuật chuyển gen ở thực vật trong định hướng nghiên cứu vaccine
thực vật đã thu được một số thành tựu như nghiên cứu vaccine virus viêm gan
B biểu hiện trong chuối, vaccine chống bệnh đường ruột [69], vaccine chống
bệnh SARS-CoA ở nhiều loài thực vật [69], vaccine từ gạo chống bệnh dị ứng
phấn hoa.Tuy nhiên nghiên cứu vaccine thực vật phòng chống bệnh cúm
A/H5N1 còn ít được công bố.
1.2.2. Nghiên cứu sản xuất vaccine phòng chống bệnh cúm A/H5N1
Đồng thời với các biện pháp phòng bệnh thì việc sử dụng vaccine được
xem như là một biện pháp hỗ trợ tích cực và chủ động trong việc phòng và
hạn chế bệnh cúm gia cm. Vaccine virus cúm có hai thành phn kháng
nguyên chính có vai trò kích thích sản sinh kháng thể tạo miễn dịch chủ động
là HA và NA, trong đó kháng thể kháng HA có vai trò chủ đạo trong đáp ứng
miễn dịch chống virus cúm gia cm. Còn kháng thể kháng NA có ý nghĩa
trong việc phát hiện giữa gia cm được tiêm vaccine với những gia cm
nhiễm virus trên thực địa [143].
Nghiên cứu gen học kháng nguyên liên quan đến vaccine và miễn dịch
cũng đã được Viện Công nghệ sinh học, Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương,
Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh, Viện Thú y quốc gia, Trung tâm chẩn

23
đoán thú y trung ương tiến hành, đó là việc thu thập gen kháng nguyên H5 và
N1 từ các chủng phân lập trên gà, vịt, ngan của Việt Nam ở các năm và so
sánh với trình tự chuỗi gen cúm A/H5N1 của các chủng cường độc đương
nhiễm và vaccine của Việt Nam và thế giới [4]. Nhận định hỗn hợp virus gây
bệnh và phân hoá kháng nguyên của virus cúm A/H5N1 tại Việt Nam cũng đã
được xác nhận qua phân tích hàng chục chủng thu nhận từ nhiều vùng khác
nhau trong cả nước. Điều này ảnh hưởng đến dịch tễ, chẩn đoán, phòng trừ và
quan hệ lây nhiễm trong tự nhiên cũng như vai trò miễn dịch của các chủng cổ
điển đang sử dụng làm vaccine tại Việt Nam và thế giới (vaccine H5N1,
chủng gốc: A-Gs-CN-Gd1(96)(H5N1), vaccine H5N2, chủng gốc: A-Turkey-
ENG-N28(73)(H5N2), vaccine TrovacAIV-H5, chủng gốc: A-Tk-
IRE1378(83)(H5N8)), vaccine H5N2, chủng gốc: A-Ck-MEX-Hidalgo-
232(94)(H5N2). Giống NIBRG-14 từ chủng gốc A/Vietnam/1194/2004
(H5N1) đã được Việt Nam nghiên cứu công nghệ sản xuất vaccine cho gia
cm và người [9].
Để có thể đáp ứng nhanh nhu cu về vaccine cúm gia cm, ngoài việc tiếp
tục những nghiên cứu về vaccine tái tổ hợp trên cơ sở các tiểu đơn vị và
vaccine DNA, ngày 3 tháng 11 năm 2005 Viện Công nghệ sinh học đã hoàn
tất các thủ tục và tiến hành tiếp nhận chủng virus sản xuất vaccine NIBRG-14
từ Viện Quốc gia về Tiêu chuẩn và Kiểm định sinh học, Vương Quốc Anh.
Đây là chủng virus được tạo bằng kỹ thuật di truyền ngược, tái tổ hợp trên cơ
sở các gen của chủng gốc PR8/34 với các gen HA (đã bị đột biến mất 4 amino
acid RRRL và đột biến thay thế 3 amino acid tại vùng gây độc) và NA có
nguồn gốc từ chủng virus cúm H5N1 phân lập từ bệnh nhân Việt Nam
(A/Vietnam/1194/2004). Chủng NIBRG-14 này đã được Tổ chức Y tế thế
giới công nhận về độ an toàn và khuyến cáo là một trong các chủng dùng cho
sản xuất vaccine trên thế giới hiện nay. Hiện nay các chủng này cũng có được