tóm tắt luận án nghiên cứu chuyển gen mã hóa protein bề mặt của virus h5n1 vào cây đậu tương phục vụ sản xuất vaccine thực vậ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
––––––––––––––––––––



NGUYỄN THU HIỀN





NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN MÃ HÓA PROTEIN BỀ MẶT
CỦA VIRUS H5N1 VÀO CÂY ĐẬU TƯƠNG PHỤC VỤ SẢN
XUẤT VACCINE THỰC VẬT



Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 62.42.01.21



TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC






Thái Nguyên - 2013

Công trình được hoàn thành tại:

Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học
Bộ môn Di truyền- Sinh học hiện đại, Khoa Sinh – KTNN
Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên.






Phản biện 1:
Phản biện 2:





Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Chu Hoàng Hà
GS.TS. Chu Hoàng Mậu








1
MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề
Cúm là một căn bệnh nguy hiểm gây tử vong cao và hằng năm
trên thế giới đã có hơn nửa tỷ người mắc bệnh. Hiện nay, virus cúm
A/H5N1- chủng virus nguy hiểm nhất ở gia cm đã lan truyền trên 40
quốc gia ở châu Á, Trung đông, châu Âu và châu Phi.  nước ta, dịch
cúm gia cm H5N1 xảy ra từ những tháng cuối năm 2003 gây thiệt
hại nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi gia cm và ảnh hưởng đến sức
khoẻ con người. Chính vì vậy nghiên cứu làm sáng tỏ bệnh cúm
A/H5N1 và nhân tố gây bệnh để xây dựng biện pháp phòng và khống
chế bệnh là yêu cu thực tiễn đặt ra. Vaccine ăn được từ thực vật là
vaccine tác động vào thể dịch, kích thích cả hệ thống miễn dịch thể
dịch và miễn dịch tế bào. Vaccine thực vật có hoạt tính tương tự như
vaccine thông thường, chỉ khác là vaccine này được thực vật sản xuất
trong những phn ăn được như lá, củ, quả và hạt.  Việt Nam, đậu
tương là cây có giá trị kinh tế cao, hạt đậu tương là nguồn thực phẩm
chính cho vật nuôi và con người. Với ưu điểm nổi bật như sản xuất
đơn giản, giá thành thấp, hiệu quả cao trong phòng bệnh và có độ an
toàn, vaccine sản xuất từ thực vật được xem là hướng đi phù hợp
trong chiến lược chăm sóc sức khoẻ cộng đồng ở các quốc gia đang
phát triển.Xuất phát từ lý do trên chúng tôi đã tiến hành đề tài luận án
là: “Nghiên cứu chuyển gen mã hóa protein bề mặt của virus
H5N1 vào cây đậu tương phục vụ sản xuất vaccine thực vật”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Thiết kế được vector mang cấu trúc gen HA, HA1 của virus
cúm A/H5N1;
Tạo được cây đậu tương chuyển gen mang cấu trúc gen HA1
và biểu hiện được protein tái tổ hợp HA1 ở hạt đậu tương.

2
3. Nội dung nghiên cứu

3.1. Thiết kế và tổng hợp gen HA,đoạn gen HA1, nhân dòng gen HA,
đoạn gen HA1 trong tế bào vi khuẩn E.coli và tạo vector chuyển gen
mang cấu trúc gen HA và đoạn gen HA1.
3.2. Biến nạp cấu trúc vector chuyển gen mang gen HA và đoạn gen
HA1 vào vi khuẩn A.tumefaciens. Lây nhiễm vi khuẩn A. tumefaciens
tái tổ hợp vào mô lá thuốc lá và tái sinh tạo cây thuốc lá chuyển gen
mang gen HA , đoạn gen HA1;
3.3. Phát triển hệ thống tái sinh đa chồi phục vụ chuyển gen ở cây
đậu tương;
3.4. Chuyển cấu trúc vector mang gen gus biểu hiện ở hạt vào cây
đậu tương. Đánh giá hiệu quả chuyển gen gus ở giống đậu tương
ĐT12 và DT84;
3.5. Chuyển cấu trúc vector mang đoạn gen HA1 vào cây đậu tương
và phân tích sự có mặt của đoạn gen chuyển HA1 ở cây đậu tương
của thế hệ T
0
3.6. Phân tích dòng cây đậu tương chuyển gen ở thế hệ T
1
bằng kỹ
thuật PCR và lai Western blot để xác định sự biểu hiện của protein
HA1 ở hạt đậu tương.
4. Những đóng góp mới của luận án
4.1. Hai cấu trúc vector mang gen HA và mang đoạn gen HA1 biểu
hiện trong hạt đã được thiết kế thành công và tạo được chủng vi
khuẩn Agrobacterium tumefaciens tái tổ hợp mang cấu trúc gen HA
và HA1 của virus cúm A/H5N1.
4.2. Hai giống đậu tương ĐT12 và DT84 đã được thử nghiệm chuyển
gen gus. Hiệu suất chuyển gen được kiểm tra ở giai đoạn hạt thu
được khoảng 7,8% đối với giống ĐT12 và 4,3 % với giống DT84.
4.3. Chuyển cấu trúc SLHEP-HA1 vào cây đậu tương và thu được 8

dòng cây đậu tương ở thế hệ T
0

3
mang cấu trúc vector biểu hiện đặc trưng trong hạt SLHEP-HA1.
4.4.  thế hệ T
1
đã thu được dòng đậu tương H11 chuyển gen mang
đoạn gen HA1op và biểu hiện thành công protein HA1 trong hạt của
dòng đậu tương H11.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
Về khoa học: Đã thiết kế được vector chuyển gen mang cấu trúc gen
HA và đoạn gen HA1 biểu hiện ở hạt thực vật. Biểu hiện thành công
gen gus ở hạt. Đã hoàn thiện được quy trình tái sinh đa chồi ở cây
đậu tương. Với việc lây nhiễm vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
tái tổ hợp vào mô đậu tương đã tổn thương, tạo cây đậu tương chuyển
gen và đã biểu hiện thành công gen HA1 của virus H5N1 trong hạt
đậu tương.
Về thực tiễn: với kết quả protein HA1 đã được biểu hiện thành công
trong hạt đậu tương ở thế hệ T1 làm tiền đề cho việc kiểm tra đáp
ứng khả năng miễn dịch của gia cm đồng thời làm cơ sở cho việc
sản xuất vaccine ăn được ở thực vật.
6. Cấu trúc luận án: Gồm 110 trang, được chia thành các phn: Mở
đu: 4 trang, chương 1: tổng quan tài liệu 43 trang, Chương 2: vật
liệu và phương pháp nghiên cứu: 14 trang, Chương 3: kết quả nghiên
cứu và thảo luận: 43 trang, Kết luận: 2 trang, các bài báo liên quan
đến luận án:1 trang. Với 156 tài liệu tham khảo luận án gồm 37 hình,
16 bảng.

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Luận án đã tham khảo tài liệu 23 tiếng Việt và 133 tài liệu
tiếng Anh,với các nội dung liên quan bao gồm: (1) Bệnh cúm gia
cm và virus cúm A/H5N1 (2)Vaccine phòng chống bệnh cúm

4
A/H5N1 (3) Ứng dụng kĩ thuật chuyển gen trong nghiên cứu sản xuất
vaccine thực vật.
Cúm gia cm (Avian Influenza, AI) là bệnh truyền nhiễm cấp
tính của gia cm, do nhóm virus cúm A thuộc họ Orthomyxoviridae
gây ra . Đây là nhóm virus có biên độ rộng, được phân chia thành
nhiều phân type khác nhau dựa trên kháng nguyên HA và NA có trên
bề mặt capsid của hạt virus. Nhóm virus cúm A có 16 phân type HA
(từ H1 đến H16) và 9 phân type NA (từ N1 đến N9) và sự tái tổ hợp
giữa các phân type HA và NA, về mặt lý thuyết, sẽ tạo ra nhiều phân
type khác nhau về độc tính và khả năng gây bệnh.Virus cúm A/H5N1
có hệ gen được cấu trúc gồm 8 phân đoạn riêng biệt và không có gen
mã hóa enzyme sửa chữa RNA. Trong đó phân đoạn phân đoạn 4
mã hóa cho protein trên bề mặt capsid của virus, có tính kháng
nguyên đặc trưng theo từng chủng virus cúm A đó là hemagglutinin
(HA) có thể được coi là một loại protein vừa quyết định tính kháng
nguyên, vừa quyết định tính độc lực của virus cúm và có khả năng
kích thích cơ thể sinh ra đáp ứng miễn dịch dịch thể đặc hiệu với
từng type HA và tham gia vào phản ứng trung hòa virus, là đích bảo
vệ miễn dịch học nhằm ngăn chặn sự xâm nhiễm của virus ở cơ thể
nhiễm,đây chính là cơ sở điều chế các vaccine phòng cúm hiện
nay.Đối với dịch cúm trên người, nghiên cứu phát triển vaccine
không những ngăn ngừa làm giảm được bệnh ở gia cm mà còn
khống chế nguồn truyền lây của loại virus nguy hiểm này sang người.

Các loại vaccine sử dụng phòng chống bệnh cúm A/H5N1 bao gồm
vaccine truyền thống, vaccine thế hệ mới hay vaccine công nghệ gen,
vaccine nhược độc virus cúm nhân tạo, vaccine ăn được ở thực vật. 
Việt Nam, việc nghiên cứu biểu hiện gen HA đang được tiến hành
trên đối tượng thực vật như cây đậu tương và đã thành công trong
việc biểu hiện gen HA trên cây thuốc lá.Tạo vaccine thực vật là một

5
hướng đi cn thiết nhưng cho đến nay vẫn chưa có vaccine thực vật
mang gen HA được đưa vào sử dụng. Mặc dù kết quả nghiên cứu còn
khiêm tốn, nhưng đy hứa hẹn trong tương lai sẽ có nhiều mô hình
vaccine thực vật phòng bệnh cho người và vật nuôi sẽ được phát triển
ở Việt Nam.

Chương 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT,THIẾT BỊ
Nguyên liu thực vật:
Giống đậu tương ĐT12 và DT84 do Trung tâm Nghiên cứu và
Phát triển cây đậu đỗ, Viện cây lương thực và cây thực phẩm- Viện
Khoa học Nông nghiệp Việt Nam cung cấp.
Chủng vi khun và các loại vector:
Vector pPTN289; pDest-phaso do VUB cung cấp, gen HA của
virus A/H5N1 do viện Công nghệ sinh học cung cấp. Các chủng vi
khuẩn E. coli DH5 và A.tumefaciens CV58, EHA101 do Phòng Công
nghệ tế bào thực vật-Viện Công nghệ sinh học cung cấp.
Hóa chất,thiết bị:
Đề tài sử dụng một số hóa chất và các trang thiết bị của Phòng
Công nghệ tế bào thực vật và Phòng thí nghiệm trọng điểm Công

nghệ gen, Viện Công nghệ Sinh học.
2.2. PHƯƠNG PHÁP
2.2.1. Nhóm phương pháp sử dụng để thiết kế vector chuyển gen
2.2.1.1. Phương pháp PCR
2.2.1.2. Thôi gel và tinh sạch sản phẩm thôi gel
2.2.1.3. Phản ứng ghép nối :Thực hiện quá trình biến nạp vào E.coli
theo phương pháp sốc nhiệt của Cohen(1972)

6
2.2.1.4. Chọn dòng bằng PCR và cắt bằng enzyme hạn chế:
Tách chiết plasmid tái tổ hợp được thực hiện theo Sambrook và
đtg(2001), phương pháp sử dụng enzym cắt hạn chế thực hiện theo
Sambrook và đtg(2001).
2.2.1.5. Tạo vector chuyển gen bằng kỹ thuật Gateway
2.2.1.6. Biến nạp các vector tái tổ hợp vào tế bào A. tumefaciens
2.2.2. Các phương pháp sử dụng trong xây dựng mô hình tái sinh
và chuyển gen in vitro
2.2.2.1. Kỹ thuật tái sinh cây thuốc lá
2.2.2.2. Kỹ thuật tái sinh cây đậu tương
Kỹ thuật tái sinh cây đậu tương qua đa chồi từ nách lá mm hạt
chín được tiến hành dựa trên phương pháp của Olhoft và cộng sự (2001).
2.2.3. Phương pháp phân tch cây chuyển gen
2.2.3.1. Kỹ thuật PCR:
DNA hệ gen của các dòng cây được tách nhanh bằng phương
pháp của Edwards et al(1991).
2.2.3.2. Tách chit protein t ht
Protein tổng số được chạy trên gel 12.5% SDS polyacrylamide
theo phương pháp của Laemmli (1970) .
2.2.3.3. Phân tch western blot:
Protein tổng số được chạy trên gel 12.5% SDS sau đó được

chuyển lên màng nitrocellulose Hybond
TM
(Amersham). Màng lai đã
được rửa bằng TBS và block với 3% BSA trong 1 giờ. Sau đó màng
được rửa tiếp và ủ với kháng thể c-myc trong TBS bổ sung 0.5%
BSA và 0.05% Tween 20. Sau thời gian 1 giờ, màng được rửa và ủ
với kháng thể 2 có gắn ALP hoặc kháng thể IgG của chuột cộng hợp
với horseradish peroxidase HRP (Abcam). Sau khi rửa ln cuối màng
được ủ trong NBT/BCIP hoặc sử dụng bộ kit EDL
TM
(Amersham) để
phát hiện protein tái tổ hợp.


7
Chương 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG GEN HA VÀ
ĐOẠN GEN HA1 CỦA VIRUS H5N1
3.1.1. Kết quả thiết kế vector chuyển gen mang gen HA
Các tế bào miễn dịch không phản ứng hoặc không nhận diện
toàn bộ phân tử kháng nguyên mà chúng chỉ nhận diện những vị trí
nhất định trên phân tử kháng nguyên. Những vị trí đó được gọi là
epitope hoặc vị trí quyết định kháng nguyên. Dựa trên công bố của
một số công trình nghiên cứu về epitope trên gen HA của H3N1 các
trình tự của epitope B và T được xác định các epitope B và T nằm ở
các vị trí tương ứng là 91-108 và 307-319. Trình tự HA của A/H5N1
(AJ867074) cho thấy ở các vị trí này trình tự amino acid có độ tương
đồng cao với các epitope trên. Vector biểu hiện trong thực vật bao
gồm một cấu trúc SLHEP chứa signal peptide (2S2), các epitope B và

T của HA, một trình tự có khả năng gây miễn dịch niêm mạc ruột
(LTB), trình tự nhận biết protein trong nội chất (KDEL) và các vị trí
nhận biết điểm cắt của enzyme.
3.1.1.1. Tổng hợp gen HA chứa mã bộ ba biểu hiện cao trong thực vật
Sự biểu hiện protein tái tổ hợp là hướng đi cơ bản của công
nghệ sinh học hiện đại. Tuy nhiên các protein rất khó biểu hiện trong
cơ thể khác loài. Một số mã bộ ba rất dễ biểu hiện cao trong loài này
nhưng không biểu hiện hay biểu hiện thấp trong loài khác. Mục tiêu
của nghiên cứu này là biểu hiện gen HA của virus H5N1 ở cơ thể thực
vật, do vậy cn thiết phải thay đổi một số mã bộ ba nhằm làm tăng mức
độ biểu hiện gen HA trong tế bào chủ.Trên cơ sở trình tự gen HA và

8
protein HA của virus H5N1 chúng tôi đã thiết kế và tổng hợp nhân tạo
một gen HA (HAop) có khả năng biểu hiện cao phù hơp với cây trồng.
Gen nhân tạo HAop gồm 1695 nucleotide và có sự thay đổi một số mã
bộ ba nucleotide nhưng trình tự amino acid không thay đổi
3.1.1.2. Thit k vector tái tổ hợp mang cấu trúc gen HAop
Kết quả khuyếch đại gen HA
Dựa trên trình tự gen HAop, cặp mồi đặc hiệu XhoI-
HA/HindIII-HA đã được thiết kế. Sản phẩm PCR được điện di kiểm
tra trên gel agarose 0,8% cùng với thang DNA chuẩn 1kb (Hình 3.3)
cho thấy kết quả nhận được một đoạn DNA có kích thước khoảng 1,7
kb phù hợp với kích thước gen HAop theo tính toán lý thuyết

Hình 3.3. Hình ảnh đin di kiểm tra kết quả PCR nhân đoạn gen
HAop bằng XhoI-HA/HindIII-HA (M: Thang DNA chun 1kb)
Ghép nối đon gen HA vào vector p201-SLHEP
Sản phẩm thôi gel được xử lý đồng thời bởi hai enzym
XhoI/HindIII và được nối vào vector p201-SLHEP. Trên vector có 2
vị trí tái tổ hợp attL1 và attL2, đoạn gen cn chuyển sẽ được xen vào
giữa 2 vị trí này. Trên vector còn chứa gen kháng kháng sinh
1 M


1,7kb

9
kanamycin và vị trí gắn mồi, phục vụ cho việc chọn các dòng khuẩn
lạc mang plasmid mong muốn. Nhờ enzyme nối mà các đu của sản
phẩm PCR sẽ được ghép vào vector, kết quả plasmid tái tổ hợp p201-
SLHEP-HA được tạo thành.
Chọn plasmid tái tổ hợp bằng enzyme hn ch
Để khẳng định chắc chắn rằng gen HA đã được gắn vào vector
chúng tôi tiến hành kiểm tra bằng phản ứng cắt plasmid với enzyme
giới hạn XhoI/HindIII. Theo tính toán lý thuyết, khi cắt bằng 2
enzyme giới hạn XhoI/HindIII sẽ thu được sản phẩm gồm 2 phân
đoạn DNA: (i) Đoạn gen HA cn chèn vào vector bị cắt ở 2 đu bởi 2
enzyme giới hạn có kích thước khoảng 1,7kb và (ii) Khung vector
còn lại sau khi cắt bỏ gen chèn có kích thước khoảng 2,5kb. Sản
phẩm phản ứng cắt được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%, kết
quả thể hiện trong Hình 3.7.

Từ kết quả kiểm tra ở Hình 3.7 cho thấy cả 3 dòng khuẩn lạc
tiến hành kiểm tra đều đã cho các băng DNA với kích thước như
mong muốn. Điều này chứng tỏ rằng đoạn gen HA đã được chèn
thành công vào vector p201- SLHEP và kết quả tạo ra vector tiếp
nhận p201-SLHEP-HAop làm nguyên liệu cho việc thiết kế vector
chuyển gen theo kỹ thuật Gateway
®
.
Hình 3.7. Hình ảnh đin
di kiểm tra kết quả chọn
dòng plasmid tái tổ hợp
p201-SLHEP-HAop
2,5kb
1,7kb

10
3.1.1.3. Thiết kế vector mang cấu trúc HAop biểu hin đặc trưng
ở hạt
Trong nghiên cứu này các cấu trúc gen chứa HAop và các gen
mã hóa các peptid chức năng đã được thiết kế chuyển vào vector
pPhaso-dest bằng phản ứng LR của hệ thống Gateway. Kết quả
kiểm tra vector tái tổ hợp bằng PCR cho thấy sản phẩm PCR với
cặp mồi đăc hiệu XhoI-HA/HindIII-HA có kích thước khoảng 1,7

kb. Còn kết quả kiểm tra bằng enzyme hạn chế EcoRI cho thấy
sản phẩm cắt thu được 3 đoạn DNA có kích thước khoảng 2,2kb,
5kb và 10 kb. Các kích thước này hoàn toàn phù hợp với tính
toán theo lý thuyết (Hình 3.9).
Hình 3.9.Kiểm tra vector tái tổ hợp pPhaso-HAop A: Kết quả
kiểm tra bằng PCR, và B: kết quả kiểm tra bằng phản ứng ct bởi
enzyme hạn chế EcoRI. M: thang chun 1 Kb; 1, 2, 3: mu vector tái
tổ hợp tách t các dòng khun lạc
Chúng tôi lựa chon dòng plasmid số 1 sử dụng cho biến nạp
vào vi khuẩn A. tumefaciens.
3.1.1.4. Kt quả to dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
Để kiểm tra hoạt động của gen HA trên vector tái tổ hợp trong
cây trồng cũng như tạo ra nguyên liệu chuẩn bị cho quá trình chuyển
gen vào cây đậu tương thì vector tái tổ hợp pPhaso-HAop đã được biến

11
nạp vào vi khuẩn A. tumefaciens bằng xung điện Kết quả điện di kiểm tra
sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8% với cặp mồi đặc hiệu XhoI/HindIII-
HA trên Hình 3.10 cho thấy dòng khuẩn lạc được lựa chọn cho kết quả
dương tính với phản ứng PCR với một băng duy nhất có kích thước 1,7kb.
Điều này đã chứng tỏ kết quả biến nạp thành công vector pPhaso-HAop
vào tế bào A. tumefaciens và như vậy chúng tôi đã tạo được chủng
Agrobacterium mang plasmid tái tổ hợp pPhaso-HAop.

Hình 3.10. Hình ảnh đin di sản phm PCR kiểm tra vector
biếnnạp trong chủng Agrobacterium tumefaciens CV58
M: Thang DNA chun 1 kb; 1-2: Dòng khun lạc A. tumefaciens

3.1.2. Kết quả thiết kế vector chuyển gen mang đoạn gen HA1
Gen HA có kích thước tương đối lớn (1,7kb), epitope B và T

- yếu tố quyết định kháng nguyên có vị trí tương ứng là 91-108 và
307-319 và nằm ở phn đu gen HA. Chính vì vậy trong nghiên cứu
này chúng tôi đã chọn vùng của gen HA chứa epitope có kích
thước ngắn hơn gen HA khoảng 0,5kb có kí hiệu HA1op. Trên cơ
sở trình tự của gen HA1op và với mục đích ghép nối đoạn gen
HA1 vào vector p201-SLEHP, chúng tôi sử dụng cặp mồi đặc hiệu
XhoI-HA1/ HindIII-HA1 để nhân đoạn gen HA1. Cặp mồi được
thiết kế tạo được mã mở đu và mã kết thúc cho gen HA1 khi được
nhân lên và có chứa điểm nhận biết của enzyme cắt giới hạn XhoI
và Hind III.

1,7kb

1,5kb

12
3.1.2.1. Kt quả thit k cấu trúc gen HA1op
Kết quả nhân gen, tách dòng và đọc trình tự đoạn gen HA1
Chúng tôi đã sử dụng 50ng DNA plasmid tái tổ chứa gen HA
cho phản ứng PCR để nhân đoạn gen HA1 với cặp mồi đặc hiệu đã
thiết kế. Sản phẩm của phản ứng PCR được điện di kiểm tra trên gel
agrose 0,8% với thang DNA 1kb (Hình 3.13).

Hình 3.13. Hình ảnh đin di kiểm tra kết quả PCR
nhân đoạn gen HA1 bằng XhoI-HA/HindIII-HA

Kết quả ở Hình 3.13 cho thấy một đoạn DNA có kích thước
khoảng 1,25kb phù hợp với chiều dài của gen HA1 quan tâm đúng theo
tính toán lý thuyết và sản phẩm PCR là đặc hiệu và đủ hàm lượng
cho thí nghiệm tách dòng. Từ kết quả chọn dòng gen và tách
plasmide tái tổ hợp mang đoạn gen HA1 và tiến xác định trình tự
đoạn gen HA1 trên thiết bị đọc trình tự tự động ABI- 3130 DNA
capillary electrophoresis system.
Ghép nối đoạn gen HA1 vào vector p201-SLHEP
Tiến hành thí nghiệm tương tự như thiết kế vector chuyển gen
mang cấu trúc gen HA, sản phẩm thôi gel sau đó được xử lý đồng
thời với 2 enzym XhoI/HindIII và được nối vào vector p201-SLHEP.
Trên vector có 2 vị trí tái tổ hợp attL1 và attL2, đoạn gen cn chuyển
sẽ được xen vào giữa 2 vị trí này. Trên vector còn chứa gen kháng


13
kháng sinh kanamycin và vị trí gắn mồi, phục vụ cho việc chọn các
dòng khuẩn lạc mang plasmid mong muốn Kết quả thu được các
khuẩn lạc mọc được trên môi trường chọn lọc và có thể kết luận sơ
bộ rằng đã biến nạp thành công plasmid tái tổ hợp p201- SLHEP-
HA1 vào tế bào E. coli. Để có thể chọn lọc được những dòng khuẩn
lạc mang vector chứa gen HA1 còn nguyên vẹn như mong muốn,
chúng tôi tiến hành nuôi và tách plasmid từ những khuẩn lạc này và
kiểm tra bằng phản ứng cắt với enzyme giới hạn.
Chọn plasmid tái tổ hợp bằng enzyme ct hạn chế
Để khẳng định chắc chắn rằng gen HA1 đã được gắn vào vector
chúng tôi tiến hành kiểm tra bằng phản ứng cắt plasmid với enzyme giới

hạn XhoI/HindIII. Theo tính toán lý thuyết, khi cắt bằng 2 enzyme giới
hạn XhoI/HindIII sẽ thu được sản phẩm gồm 2 phân đoạn DNA: (i)
Đoạn gen HA1 cn chèn vào vector bị cắt ở 2 đu bởi 2 enzyme giới hạn
có kích thước khoảng 1,25kb và (ii) Khung vector còn lại sau khi cắt bỏ
gen chèn có kích thước khoảng 2,5kb. Sản phẩm phản ứng cắt được điện
di kiểm tra trên gel agarose 0,8%, kết quả thể hiện trong Hình 3.15.

Hình 3.15. Hình ảnh đin di kiểm tra kết quả chọn dòng plasmid
tái tổ hợp p201-SLHEP-HA1
Tạo vector chuyển gen mang đoạn gen HA1 bằng kỹ thuật
Gateway:
Cấu trúc SLEHP - HA1 đã được thiết kế được chuyển vào
vector pPhaso-dest bằng LR- reation của hệ thống Gateway. Các cấu

14
trúc đều được kiểm soát bởi promotor đặc trưng biểu hiện trong hạt
phasoline .Sau đó, để chọn ra được những dòng khuẩn lạc như mong
muốn (mang vector chuyển gen) chúng tôi đã tiến hành kiểm tra bằng
phản ứng colony- PCR và sử dụng enzyme cắt hạn chế.
Kt quả kiểm tra vector tái tổ hợp bằng phản ứng colony –PCR:
Chọn 5 dòng khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch để tiến hành phản ứng
colony-PCR bằng cặp mồi đặc hiệu: XhoI-HA1/HindIII-HA1. Sản phẩm
phản ứng được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%, kết quả được thể
hiện trong Hình 3.16. Kết quả kiểm tra trên Hình 3.16 cho thấy với 5
dòng khuẩn lạc được chọn một cách ngẫu nhiên đều thu được những
băng DNA với kích thước như mong muốn 1,25kb. Điều này chứng
tỏ rằng chúng tôi đã biến nạp thành công vector pPhaso-SLEHP-
HA1 vào tế bào khả biến E. coli DH5α.

Hình 3.16. Hình ảnh đin di kiểm tra vector chuyển gen mang cấu
trúc pPhaso-SLEHP-HA1
M: Thang DNA chun; 1-5 : Dòng khun lạc; Hàng trên: Kết quả
kiểm tra bằng PCR với cặp mồi XhoI-HA1/HindIII-HA1; Hàng
dưới: Sản phm ct bởi enzyme Hind III


15
Kt quả bin np pPhaso – SLEHP- HA1 vào vi khuẩn
Agrobacterium
Chúng tôi sử dụng 50-100ng plasmid pPhaso-SLEHP-HA1
để biến nạp vào tế bào khả biến A. tumefaciens. Sản phẩm của quá
trình biến nạp được nuôi trên môi trường chọn lọc có chứa kháng
sinh, ủ đĩa ở 28
o
C. Sau 2 ngày, kết quả thu được một lượng lớn
khuẩn lạc trên đĩa thạch. Để chọn ra những dòng khuẩn lạc như
mong muốn (mang vector chuyển gen), chúng tôi đã tiến hành
kiểm tra bằng phản ứng colony-PCR.
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8%
với cặp mồi đặc hiệu XhoI- HA1/HindIII-HA1 được thể hiện trên
Hình 3.17 cho thấy dòng khuẩn lạc được lựa chọn cho kết quả dương

tính với phản ứng PCR với một băng duy nhất có kích thước khoảng
1,25kb. Điều này đã chứng tỏ kết quả biến nạp thành công vector
pPhaso-SLEHP-HA1 vào tế bào A. tumefaciens.









Hình 3.17. Hình ảnh đin di sản phm PCR kiểm tra vector biến
nạp trong chủng CV58 (M: Thang DNA chun 1 kb; 1-3: Dòng
khun lạc A. Tumefaciens)


16
3.2. KẾT QUẢ TẠO CÂY ĐẬU TƯƠNG CHUYỂN GEN MANG
ĐOẠN GEN HA1
3.2.1. Phát triển h thống tái sinh phục vụ chuyển gen ở hai giống
đậu tương ĐT12 và DT84
3.2.1.1. Tối ưu thời gian khử trùng hạt:
Thời gian khử trùng là nhân tố đu tiên cn phải tối ưu, nó ảnh
hưởng lớn đến khả năng nảy mm cũng như tỉ lệ mẫu nhiễm trên môi
trường nuôi cấy in vitro chính vì vậy căn cứ vào tỉ lệ mẫu nhiễm và
chất lượng mẫu sau nảy mm cho thấy thời gian khử trùng thích hợp
cho hạt đậu tương là 16 giờ. Đây cũng là thời gian chúng tôi sử dụng
để khử trùng hạt thu nguyên liệu cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.1.2. Tái sinh cây

Mẫu sau khi gây tổn thương và cắt bỏ đỉnh sinh trưởng, chúng
được tạo đa chồi trên 5 loại môi trường (SIM1-SIM5) chứa nồng độ
BAP từ 0,5 mg/l đến 2,5 mg/l, kết quả thu được đối với giống ĐT12
khi bổ sung 2mg/l BAP vào môi trường SIM tỷ lệ tạo chồi và số chồi
trung bình/cụm thu được đạt giá trị cao nhất (82,3% và 6,2
chồi/cụm), trong khi đó với giống DT84, tỷ lệ tạo chồi và số
chồi/cụm đạt giá trị cao nhất ở môi trường bổ sung 1,5 mg/l BAP
(41,6% và 3,4 chồi/cụm), các giá trị này thấp hơn nhiều so với giống
ĐT12. Ngoài ra bằng quan sát chúng tôi nhận thấy rằng chất lượng
chồi của giống DT84 thu được khỏe hơn, phát triển tốt hơn so với
chồi ĐT12.
Ảnh hưởng của GA
3
và IAA tới khả năng kéo dài chồi
Các cụm chồi tạo trên môi trường cảm ứng chồi tốt nhất được
chuyển sang các môi trường kéo dài chồi có bổ sung GA
3
và IAA với
các nồng độ khác nhau. Hiệu quả kéo dài chồi được đánh giá thông
qua tỷ lệ mẫu kéo dài chồi và chất lượng chồi sau kéo dài cho thấy,

17
khi môi trường chỉ có mặt GA
3
, tỷ lệ mẫu kéo dài chồi cũng như số
chồi kéo dài/cụm tăng lên ở cả 2 giống đậu tương. Tuy nhiên cũng
nhận thấy rằng chất lượng chồi giảm theo sự tăng nồng độ GA
3
bổ
sung vào môi trường. Như vậy, căn cứ vào kết quả thu được trên

những nồng độ GA
3
nghiên cứu, chúng tôi thấy nồng độ GA
3
bổ sung
vào môi trường là 0,5 mg/l phù hợp cho việc kéo dài chồi ở cả 2
giống đậu tương ĐT12 và chất lượng chồi tốt nhất thu được ở công
thức có bổ sung 0,1 mg/l IAA, chồi có thân mập, lá to và có màu
xanh đặc trưng, đảm bảo cho việc ra rễ tái sinh cây hoàn chỉnh.
Ảnh hưởng của IBA đn khả năng to rễ
Bộ rễ có ảnh hưởng rất lớn tới hiệu quả ra cây ngoài nhà lưới.
Để tạo được cây đậu tương in vitro có bộ rễ có chất lượng rễ tốt,
chúng tôi đã thử nghiệm tạo rễ cho các chồi trên các môi trường
chứa các nồng độ IBA khác nhau trong những nồng độ IBA chúng
tôi đã nghiên cứu nhận thấy 0,1 mg/l là nồng độ thích hợp nhất cho
việc tạo rễ cây đậu tương in vitro.
3.2.2. Kết quả chuyển gen gus vào cây đậu tương thông qua vi
khun A. tumefaciens
Thí nghiệm chuyển gen gus với tổng số 395 mẫu đối với
giống đậu tương ĐT12 và 480 mẫu đối với giống DT84, sau khi đồng
nuôi cấy với vi khuẩn A.tumfaciens các chồi sẽ bị sàng lọc trên môi
trường cảm ứng tạo đa chồi chứa kháng sinh kanamycine (Kan). Khi
chuyển sang môi trường SEM chứa kháng sinh Kan 50 mg/l, kết quả
thu được 114 chồi (giống ĐT12) và 70 chồi (giống DT84),trong số
đó có 9 chồi ĐT12 và 3 chồi DT84 cho kết quả dương tính khi
nhuộm bằng X-gluc (Hình 3.23) .


18

Hình 3.23. Hình ảnh kết quả nhuộm X-gluc để kiểm tra biểu hin
gen gus trên cây đậu tương chuyển gen A, B: lá mm hạt non; C,
D: mảnh lá; A, C: cây không chuyển gen; B, D: cây chuyển gen;
E: cây đậu tương mang gen gus

Từ các kết quả nghiên cứu chuyển thành công gen gus ở giống
đậu tương ĐT12 và DT84, chúng tôi đã đề xuất quy trình hoàn chỉnh
cho việc tái sinh phục vụ chuyển gen đối với cây đậu tương thông
qua phương pháp nách lá mm ở sơ đồ hình 3.24.

19

Hình 3.24. Sơ đồ mô tả quy trình tái sinh phục vụ chuyển gen ở
giống đậu tương ĐT12

Khử trùng bề mặt
(khí Clo, 16 giờ)
Nảy mm trên GM
Nuôi lỏng tạo huyền phù
Hạt đậu tương
Ly tâm thu cặn khuẩn, hoà cặn trong
CCM (OD
600
0,6-1)
Gây tổn thương nách lá mm trong dịch khuẩn
Lây nhiễm 30 – 40 phút
Đồng nuôi cấy trên CCM ở điều kiện tối
Cảm ứng tạo chồi trên SIM ln 1

(bổ sung 2 mg/l BAP + 50 mg/l kanamycin)
Cắt bỏ lá mm, chuyển sang môi trường kéo dài chồi SEM
(bổ sung 0,5 mg/l GA
3
+ 0,1 mg/l IAA + 50 mg/l kanamycin)
Ra rễ trên RM
(bổ sung 0,1 mg/l IBA)
4-5 ngày
5 ngày
2 tun
Ra cây
(giá thể 1 trấu hun : 1 cát vàng)
Chủng vi khun A. tumefaciens

Cảm ứng tạo chồi trên SIM ln 2
(bổ sung 2 mg/l BAP + 75 mg/l kanamycin)
2 tun
2 tun/ln
14-20 ngày

20
3.2.3. Kết quả chuyển cấu trúc đoạn gen HA1 vào cây đậu tương
Trong hai vector chuyển gen đã thiết kế thành công (p201-
SLHEP-HA và vector p201- SLHEP-HA1) chúng tôi chọn cấu trúc
vector p201- SLHEP-HA1 mang đoạn gen HA1 chuyển vào giống
đậu tương ĐT12. Tiến hành lây nhiễm vi khuẩn A.tumefaciens tái tổ
hợp mang cấu trúc p201- SLHEP-HA1 vào nách lá mm đã tổn
thương của giống đậu tương ĐT12 theo quy trình đã được tối ưu. Thí
nghiệm chuyển đoạn gen HA1 vào giống đậu tương ĐT12 được tiến
hành với 650 mẫu, thu được 65 chồi kéo dài trên môi trường chọn lọc

SEM chứa 50 mg/l kanamycin, trong đó 45 chồi có khả năng ra rễ và
thu nhận được 32 cây T
0
phát triển trên giá thể ( Hình 3.26).



Hình 3.26. Các cây đậu tương chuyển gen thế h T
0
được trồng
trong nhà lưới


21
3.3. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CÂY ĐẬU TƯƠNG CHUYỂN
GEN MANG ĐOẠN GEN HA1
3.3.1. Phân tch sự có mặt của đoạn gen HA1 ở các dòng cây đậu
tương chuyển gen ở thế h T
0
Sử dụng 3µl sản phẩm DNA đã được tách chiết để tiến hành
phản ứng PCR với các cặp mồi đặc hiệu. Kết quả điện di sản phẩm
PCR thu nhận được 8 cây dương tính với phản ứng PCR nhân bản
đoạn gen chuyển HA1, chiếm tỷ lệ 1,2 % tổng mẫu biến nạp (Hình
3.27).

Hình 3.27. Phân tch cây đậu tương chuyển gen mang đoạn gen
HA1 ở thế h T
0
(M: Thang DNA chun 1kb;( -): Đối chứng âm;
WT: Cây không chuyển gen; 1 – 8: Các dòng T
0
được phân tch;
(+): Đối chứng dương (plasmid)
3.3.2. Phân tch các dòng cây đậu tương chuyển gen ở thế h T
1
Sử dụng lá non của 8 dòng cây đậu tương chuyển gen theo
dõi ở thế hệ T1 để tách chiết DNA và kiểm tra sự có mặt của đoạn
gen HA1 bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu. Kết quả trong 8
dòng cây phân tích ở thế hệ T1 chỉ có 2 dòng cây cho hạt là H11 và H4
(T
2
). Thu mẫu lá của hai dòng đậu tương chuyển gen H11 và H4 để


22
tách chiết DNA, kiểm tra đoạn gen HA1 bằng PCR với cặp mồi XhoI-
HA1/HindIII-HA1, kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại
gen chuyển HA1 được trình bày ở hình 3.28.



1,25kb


Hình 3.28. Phân tch sản phm PCR bằng cặp mồi đặc hiu XhoI-

HA1/ HindIII-HA1 với các dòng cây đậu tương thế h T
1
(M: Thang DNA chun 1kb, (-) đối chứng âm, (wt) cây không
chuyển gen, H4, H11: hai dòng đậu tương phân tch ở thế h T
1
)

Kt quả phân tch biểu hiện protein ở ht của cây đậu tương
chuyển gen
Từ kết quả chọn dòng đậu tương chuyển gen H11 dương tính
với phản ứng PCR ở thế hệ T
2
, chúng tôi sử dụng hạt của dòng H11
(T
2
) để phân tích protein tái tổ hợp HA1. Protein tổng số được chiết
rút từ hạt của dòng đậu tương chuyển gen H11 ở thế hệ T
2
được phân
tích bằng phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamide và
kiểm tra với kháng thể c-myc bằng kỹ thuật lai Western blot, kết quả
lai Western blot được trình bày ở hình 3.29.


23




40kDa

Hình 3.29. Hình ảnh protein HA1 hin phim được phân tch bằng
Western blot t protein tổng số tách chiết t hạt của dòng đậu
tương H11 chuyển gen
(M: Thang protein chun; (-): cây không chuyển gen; 1-2: các
mu hạt thu được của cây đậu tương H11)

Kết quả phân tích Western blot ở hình 3.29 cho thấy protein
HA1 được phát hiện ở kích thước khoảng 40kDa, tương ứng với kích
thước của protein HA1 theo tính toán lý thuyết. Từ kết quả lai
Western chúng tôi đã dự đoán protein tái tổ hợp HA1 biểu hiện trong
hạt của dòng đậu tương chuyển gen H11 có hàm lượng thấp, tuy
nhiên, chúng tôi chưa định lượng được loại protein tái tổ hợp HA1
này, vì thế cn phải có những nghiên cứu tiếp theo để đánh giá mức
độ biểu hiện của protein tái tổ hợp HA1 trên hạt đậu tương chuyển
gen. Trong thực tế để có đủ nguồn vật liệu phục vụ đánh giá khả
năng đáp ứng miễn dịch của động vật thí nghiệm cn có những
nghiên cứu nhằm tăng cường sự biểu hiện của gen HA1 trong hạt với
mục đích thu được protein tái tổ hợp có hàm lượng cao.
M – 1 2
35kDa
55kDa