(Luận Văn Thạc Sĩ) Nghiên Cứu Quy Trình Phân Lập Và Sản Xuất Sinh Khối Sợi Nấm Lim Xanh (Ganoderma Lucium (Leyss. Ex Fr.) Karst) Có Nguồn Gốc Tại Thanh Hóa.pdf

ĐẠI HỌC THÁI NGUN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM

HỒNG VĂN NÂNG

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH PHÂN LẬP VÀ SẢN XUẤT
SINH KHỐI SỢI NẤM LIM XANH (Ganoderma lucium (Leyss. Ex
Fr.) Karst) CÓ NGUỒN GỐC TẠI THANH HĨA

LUẬN VĂN THẠC SĨ CƠNG NGHỆ SINH HỌC

Thái nguyên, năm 2018


ĐẠI HỌC THÁI NGUN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM

HỒNG VĂN NÂNG
NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH PHÂN LẬP VÀ SẢN XUẤT
SINH KHỐI SỢI NẤM LIM XANH (Ganoderma lucium (Leyss. Ex

Fr.) Karst) CÓ NGUỒN GỐC TẠI THANH HĨA
Nghành: Cơng nghệ sinh học
Mã số: 8 42 02 01
LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giáo viên hướng dẫn: GS.TS. Ngơ Xn Bình

Thái ngun, năm 2018

i

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tác giả xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành và sâu sắc tới
GS.TS. Ngơ Xuân Bình và Ths. Nguyễn Thị Tình, Giáo viên hướng dẫn thực
hiện luận văn này.
Đồng thời, tác giả cũng xin chân thành cảm ơn Khoa Công nghệ Sinh
học, Khoa Sau Đại học, trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên đã tạo mọi
điều kiện thuận lợi cho tác giả trong quá trình học tập và nghiên cứu. Cảm ơn
các thầy cơ và đồng nghiệp đã trao đổi cùng tác giả những kiến thức và kinh
nghiệm quý báu để giúp cho luận văn được hồn thiện hơn.
Bên cạnh đó, sự quan tâm của gia đình, bạn bè là nguồn động viên
khơng thể thiếu để giúp tác giả hoàn thành luận văn này.
Em xin chân thành cảm ơn.
Thái Nguyên, ngày

tháng năm 2018

Học viên

Hoàng Văn Nâng


ii

MỤC LỤC
MỤC LỤC ...................................................................................................................ii
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................... v
DANH MỤC HÌNH ................................................................................................... vi
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ..........................................................................vii

MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
1.1. Mục tiêu nghiên cứu: ........................................................................................... 3
1.1.1. Mục tiêu chung .................................................................................................. 3
1.1.2. Mục tiêu cụ thể .................................................................................................. 4
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 5
1.1. Phân loại ............................................................................................................... 5
1.2. Nguồn gốc ............................................................................................................ 5
1.3. Tác dụng của nấm Linh chi .................................................................................. 6
1.4. Đặc điểm hình thái, phân loại nấm Lim xanh .................................................... 14
1.4.1. Nguồn gốc và phân loại nấm Lim xanh ..........................................................14
1.4.2. Đặc điểm thực vật và phân bố naams Lim xanh .............................................14
1.5. Tổng quan về phân lập ....................................................................................... 15
1.6. Nuôi cấy sinh khối nấm Linh chi trong môi trường lỏng .................................. 16
1.6.1. Nuôi cấy hệ sợi nấm Linh chi trong môi trường lỏng .....................................16
1.6.2. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lỏng tới sự phát triển của hệ sợi
nấm Linh chi .............................................................................................................18
1.7. Tình hình nghiên cứu nấm Linh chi trong và ngồi nước.................................. 19
1.7.1. Tình hình nghiên cứu nấm Linh chi ngồi nước .............................................19
1.7.2. Tình hình nghiên cứu nấm Linh chi trong nước .............................................19
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP ............................ 22
2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ...................................................................... 22
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu......................................................................................22
2.2. Nội dung nghiên cứu .......................................................................................... 22


iii

2.3. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................... 23
2.3.1. Phân lập giống nấm Lim xanh Thanh Hóa tại trường Đại học Nơng Lâm
Thái Nguyên ..............................................................................................................23

2.3.2. Nội dung 2: Nghiên cứu sản xuất sinh khối nấm Lim xanh trong môi
trường lỏng ................................................................................................................28
2.3.3. Nội dung 3: Nghiên cứu sản xuất sinh khối nấm Lim xanh trên giá thể rắn .........30
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 32
3.1. Phân lập giống nấm Lim xanh Thanh Hóa tại trường Đại học Nơng Lâm
Thái Ngun .............................................................................................................. 32
3.1.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến khả năng phân lập
giống từ mô thịt nấm Lim xanh Thanh Hóa..............................................................32
3.1.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của độ pH đến khả năng sinh trưởng hệ sợi nấm
từ quả thể nấm Lim xanh...........................................................................................34
3.1.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng cao nấm men đến khả năng sinh
trưởng hệ sợi từ quả thể nấm Lim xanh. ...................................................................36
3.1.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng Pepton đến khả năng phát triển hệ
sợi từ nấm từ quả thể. ................................................................................................38
3.1.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại đường đến khả năng phát triển hệ sợi
từ nấm Lim xanh .......................................................................................................40
3.1.6. Kết quả kiểm tra giống, đánh giá chất lượng giống nấm Lim xanh đã
phân lập .....................................................................................................................41
3.2. Kết quả nghiên cứu sản xuất sinh khối nấm Lim xanh trên môi trường lỏng.... 44
3.2.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường lỏng đến khả năng sản
xuất sinh khối nấm Lim xanh ....................................................................................44
3.2.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng nhân sinh
khối của hệ sợi nấm Lim xanh ..................................................................................46
3.3. Kết quả nghiên cứu thành phần giá thể nhân tạo đến năng suất và chất
lượng nấm Lim xanh ................................................................................................. 49


iv

3.3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ phối trộn nguyên liệu mùn cưa

gỗ lim đến năng suất và chất lượng nấm Lim xanh ..................................................49
3.3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ phối trộn phụ gia đến năng suất
và chất lượng nấm Lim xanh.....................................................................................50
3.3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng đạm đến năng suất và chất
lượng nấm Lim xanh sau 90 ngày nuôi cấy. .............................................................51
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 53
4.1. Kết luận .............................................................................................................. 53
4.2. Kiến nghị ............................................................................................................ 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 55


v

DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sinh
trưởng của sợi nấm được phân lập từ quả thể. ................................ 32
Bảng 3. 2: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của độ pH đến sự sinh trưởng của
hệ sợi nấm Lim xanh ....................................................................... 34
Bảng 3.3: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng cao nấm men đến
khả năng sinh trưởng của hệ sợi nấm Lim xanh ............................. 37
Bảng 3.4: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng Pepton đến sự sinh
trưởng của hệ sợi nấm Lim xanh .................................................... 39
Bảng 3.5: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các loại đường đến sự sinh
trưởng của hệ sợi nấm Lim xanh .................................................... 41
Bảng 3.6: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường lỏng đến khả năng
sản xuất sinh khối nấm Lim xanh ................................................... 44
Bảng 3.7: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng nhân
sinh khối của hệ sợi nấm Lim xanh ................................................ 47
Bảng 3.8: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ phối trộn gỗ lim đến năng
suất và chất lượng của nấm Lim xanh ............................................ 49

Bảng 3.9: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ phối trộn cám ngô đến năng
suất và chất lượng của nấm Lim xanh sau 90 ngày nuôi cấy ......... 50
Bảng 3.10: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ phối trộn 10% cám ngô và
hàm lượng đạm đến năng suất và chất lượng của nấm Lim xanh sau
90 ngày nuôi cấy ............................................................................. 51


vi

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Hình thái quả thể nấm Lim xanh thu nhận từ Thanh Hóa và ni
trồng tại trường Đại học Nơng Lâm Thái Ngun ........................... 15
Hình 2.1 : Quy trình phân lập giống nấm Lim xanh. ...................................... 24
Hình 3.1: Biểu đồ thể hiện sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Lim xanh phân lập
từ quả thể nấm ở các loại mơi trường khác nhau. ............................. 33
Hình 3.2: Nấm lim xanh phát triển trên một số môi trường cơ bản trong 13
ngày ................................................................................................... 33
Hình 3.3: Biểu đồ thể hiện sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Lim xanh ở các điều
kiện pH khác nhau. ........................................................................... 35
Hình 3.4. Sự sinh trưởng của nấm Lim xanh trên 3 mơi trường có pH lần lượt
là 4; 6,5; 8 trong 12 ngày. ................................................................. 36
Hình 3.5: Biểu đồ thể hiện sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Lim xanh ở các mơi
trường có bổ sung cao nấm men với tỉ lệ khác nhau ........................ 37
Hình 3.6: Sinh trưởng của hệ sợi nấm trong mơi trường A1: 2 g nấm men: A2:
4 g nâm men; A3 6 g nấm men (thí nghiệm quan sát sau6 ngàyni
cấy) .................................................................................................... 38
Hình 3.7: Biểu đồ kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng pepton đến
sinh trưởng của hệ sợi nấm ............................................................... 39
Hình 3.8. Sinh trưởng của hệ sợi nấm trên mơi trường: A1: 2g pepton/lít mơ
trường, A2: 4g pepton/lít mơi trường, A3: 6g pepton/lít mơi trường. .....40

Hình 3.9. Sự sinh trưởng của hệ sợi nấm trên các môi trường có bổ sung các
loại đường khác nhau. ....................................................................... 41
Hình 3.10: Sơ đồ quy trình kiểm tra giống nấm Lim xanh đã phân lập ......... 42


vii

Hình 3.11: Kết quả kiểm tra hình thái quả thể nấm Lim xanh được thu thập từ
Thanh Hóa và nấm Lim xanh được nuôi trồng tại trường ĐH Nông
Lâm Thái Nguyên ............................................................................. 43
Hình 3.12: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng môi trường lỏng đến khả năng sản
xuất sinh khối nấm Lim xanh ........................................................... 45
Hình 3.13. Sự sinh trưởng của sinh khối nấm Lim xanh trên các môi trường
CD và PD trong 6 ngày. .................................................................... 46
Hình 3.14: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng nhân
sinh khối của hệ sợi nấm Lim xanh .................................................. 48
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

PDA

Potato Detrose Agar

CDA

Corn Detrose Agar

PD

Potato Detrose

CD

Corn Detrose


1

MỞ ĐẦU
Việt Nam là một trong 16 quốc gia được đánh giá có sự đa dạng tài
nguyên sinh học đứng đầu trên thế giới. Theo kết quả điều tra, Việt Nam có
12.000 lồi thực vật, hàng ngàn lồi động vật và nấm lớn. Trong đó đã ghi
nhận được 5000 lồi thực vật và nấm lớn, 52 loài tảo biển, 408 lồi động vật
và 75 loại khống vật có cơng dụng làm thuốc.
Nấm phân bố trên toàn thế giới và phát triển ở nhiều dạng môi trường
sống khác nhau, đa phần sống ở trên cạn, nhưng một số loài lại chỉ tìm thấy ở
mơi trường trong nước. Dựa theo tỷ lệ giữa số loài nấm với số loài thực vật ở
cùng một mơi trường, người ta ước tính giới nấm có khoảng 1,5 triệu lồi.
Hiện nay có khoảng 80.000 lồi nấm đã được các nhà phân loại học phát hiện
và định danh. Giới nấm ngày càng có ý nghĩa to lớn trong nền kinh tế quốc
dân, trong khoa học cũng như trong vịng tuần hồn vật chất. Nấm đã được sử
dụng trong dân gian từ hàng ngàn năm nay và một số có ý nghĩa rất quan
trọng trong đời sống con người.
Thanh Hóa là tỉnh có diện tích rừng lớn, có khu bảo tồn Pù Hu, Quan
Hóa, Mường Lát, Thanh Hóa, Khu bảo tồn thiên nhiên Xuân Liên, Khu bảo
tồn thiên nhiên rừng sến,... đây là tỉnh được đánh giá là có tính đa dạng sinh
học rất cao, tại đây có chứa đựng nguồn lợi lớn giá trị kinh tế và giá trị trong
nghiên cứu khoa học từ các loài động thực vật. Trong đó có nguồn lợi lớn về
nấm và có thể sử dụng chúng làm nguyên liệu tốt cho các ngành cơng nghiệp
thực phẩm, dược phẩm.
Từ xưa lồi người đã biết sử dụng nấm lớn để làm thuốc đặc biệt là Linh

chi. Giá trị dược liệu của Linh chi đã được ghi chép trong các thư tịch cổ của
Trung Quốc cách đây 4.000 năm. Từ những kinh nghiệm lưu truyền trong
nhân gian, loài người đã biết sử dụng Linh chi với nhiều cách khác nhau. Đến
nay khoa học phát triển loài người đã chứng minh được các tác dụng hữu ích


2

trong điều trị ung thư, cao huyết áp, tiểu đường, tim mạch, HIV, viêm gan
siêu virus, suy nhược thần kinh.
Nấm Lim xanh (tên khoa học là Ganoderma Lucidum) là một dược liệu
quý với nhiều tác dụng tốt như chữa suy nhược thần kinh, các bệnh tim mạch,
điều hòa huyết áp, giảm lượng đường và cholesterol trong máu, tác dụng
chống oxy hóa, bảo vệ gan, tăng khả năng miễn dịch của cơ thể [1].
Nấm Lim xanh thuộc họ nấm gỗ mọc trên thân hoặc gỗ mục đã được
khẳng định là loại dược liệu có ích cho sức khỏe con người. Nấm Lim xanh là
một loại dược liệu mà con người từ thời xa xưa đã biết dùng làm thuốc. Sách
Thần nông bản thảo xếp nấm Lim xanh vào loại siêu thượng phẩm hơn cả
nhân sâm và bản thảo cương mục coi nấm Lim xanh là loại thuốc quý, có tác
dụng bảo can (bảo vệ gan), giải độc, cường tâm, kiện não (bổ óc), tiêu đờm,
lợi niệu, ích vị (bổ dạ dày).
Điều làm lên giá trị dược liệu (nấm Lim xanh) là cấu trúc đặc biệt có
chứa 119 khống tố vi lượng trong đó có một số khống tố như germanium,
vanadium, crom, polysaccharides và triterpenoids. Các thành phần khoáng
chất này đã được khẳng định là nhân tố quan trọng trong các phản ứng chống
ung thư, dị ứng, lão hóa, xơ vữa, đơng máu nội mạch... Trong các thành phần
trên polysaccharide và germanium là hai thành phần quan trọng của nấm lim.
Trên thế giới có rất nhiều cơng trình nghiên cứu về polysaccharide và
germanium trong nấm Lim xanh [7].
Polysaccharide trong nấm là các polymer thiên nhiên, có cấu trúc đa

dạng và phức tạp. Hàm lượng, cấu trúc và thành phần hóa học của
polysaccharide phụ thuộc vào loại nấm, điều kiện sinh thái.
Germanium hữu cơ trong nấm là các polymer thiên nhiên có tăng cường
khả năng vận chuyển oxy của máu, ức chế khối u phát triển và ngăn chặn các
khối u không cho chúng lây lan sang các tế bào lành bệnh xung quanh [7].


3

Với phương pháp nhân invitro bằng hệ thống nuôi cấy lỏng đã được
khẳng định có hiệu quả cao trong việc nhân nhanh số lượng tế bào trong thời
gian ngắn. Không chỉ trên thế giới đã được ứng dụng kỹ thuật này vào sản
xuất nhân sinh khối để sản xuất các hoạt chất sinh học như: Hàn Quốc nhân
sinh khối rễ sâm, ở Việt Nam đã sử dụng hệ thống nuôi cấy lỏng nhân sinh
khối một số lồi thực vật có hoạt tính sinh học như nhân sinh khối cây Thơng
đỏ, sinh khối cây Lô Hội, Viện Sâm nhân sinh khối rễ sâm. Hiện tại việc
nghiên cứu nhân sinh khối bằng hệ thống nuôi cấy lỏng đang được nghiên cứu
áp dụng đối với một số loài như tam thất hoang, hoàng tinh…[10].
Để phát triển các sản phẩm nấm của Việt Nam thành các sản phẩm chức
năng có giá trị và được thực hiện ở quy mơ lớn thì ngồi việc ni trồng theo
phương pháp truyền thống việc nhân nhanh sinh khối để tách các hoạt chất có
giá trị là cần thiết. Việc thu hoạt chất có giá trị từ sinh khối là công nghệ mới
đã được ứng dụng ở các nước có trình độ sản xuất nấm tiên tiến như: Nhật,
Hàn Quốc, Đài Loan,…tuy nhiên công nghệ này chưa được nghiên cứu ở Việt
Nam. Bằng các nghiên cứu chúng tôi thấy phương pháp này có nhiều tính ưu
việt như: Có khả năng kiểm soát được chất lượng, hàm lượng, thành phần
hoạt chất do kiểm soát chặt chẽ được các điều kiện dinh dưỡng và mơi trường
ni cấy vì vậy chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu quy trình
phân lập và sản xuất sinh khối sợi nấm Lim xanh (Ganoderma lucium
(Leyss. Ex Fr.) Karst) có nguồn gốc tại Thanh Hóa”.

1.1. Mục tiêu nghiên cứu:
1.1.1. Mục tiêu chung
Nghiên cứu được quy trình phân lập và sản xuất sinh khối sợi nấm Lim
xanh (Ganoderma lucium (Leyss. Ex Fr.) Karst) có nguồn gốc tại Thanh Hóa.


4

1.1.2. Mục tiêu cụ thể
- Phân lập thành công giống nấm Lim xanh Thanh Hóa tại trường Đại
học Nơng Lâm Thái Nguyên.
- Nghiên cứu nhân nhanh sinh khối sợi nấm Lim xanh trong môi trường
lỏng.
- Nghiên cứu sản xuất nấm Lim xanh trên môi tường giá thể rắn.


5

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Phân loại
Nấm Linh Chi có vị trí phân loại được thừa nhận rộng rãi hiện nay:
Tên khoa học: Ganoderma lucidum
Ngành: Eumycota
Ngành phụ: Basidiamyctina
Lớp: Hymenomycetes
Lớp phụ: Hymenomycetidae
Bộ: Aphyllophorales
Họ: Ganodermataceae
Họ phụ: Ganodermoidae

Chi: Ganoderma [14].
1.2. Nguồn gốc
Linh chi (Ganoderma) là loại nấm gỗ mọc hoang trong thiên nhiên, có
hàng trăm các lồi khác nhau, trong đó có 2 nhóm lớn là: Cổ Linh chi và Linh
chi [12].
Linh chi rất phong phú về chủng loại, ước tính trên tồn thế giới có 200
lồi Linh chi. Riêng Trung Quốc có 84 lồi, trong đó có 12 lồi được dùng
làm thuốc như Xích Linh chi, Tử Linh chi, Hắc Linh chi [14],[16].
Theo sách bản thảo cương mục của Lý Thời Trần (1959) thì đại danh y
của Trung Quốc đã phân loại Linh chi theo màu sắc thành 6 loại:
Thanh chi hay Long chi: màu xanh, vị chua, tính bình, khơng độc.
Hồng chi, Xích chi hay Đơn chi: màu đỏ vị đắng, tính bình, khơng độc.
Hồng chi hay Kim chi: màu vàng, vị ngọt, tính bình, khơng độc.
Bạch chi hay Ngọc chi: màu trắng, vị cay, tính bình, khơng độc.


6

Hắc chi hay Huyền chi: màu đen, vị mặn, tính bình, khơng độc.
Tử chi hay Mộc chi: màu tím, vị ngọt, tính ơn, khơng độc.
Thành phần các hoạt chất sinh học trong nấm Linh chi
Các nghiên cứu về thành phần hoá học của nấm Linh chi đầu tiên được
tiến hành vào đầu thế kỷ XX, khi các nhà khoa học nghiên cứu đến lớp vỏ
láng của nấm và đã phát hiện các chất như: esgosterol, các enzyme
phenoloxidase và peroxidase.
Theo phân tích của G. Bing Lin thì thành phần hố học của Ganoderma
lucidum gồm các chất: Nước (12 - 13%), cellulose (54 - 56%), lignin (13 14%), monosaccharide (4,5 - 5%), lipid (1,9 - 2,0%), protein (0,08 - 0,12%),
sterol (0,14 - 0,16%), các nguyên tố vô cơ như: Ag, Br, Ca, Fe, K, Na, Mg,
Mn, Zn, Bi…[12].
Hiện nay người ta đã tìm được các hoạt chất sinh học trong nấm Linh chi

như: Hoạt chất Beta–D-glucan, D-6, polysaccharide, ganoderic acid, oleic acid,
lucidenol và triterpenoid [12].
1.3. Tác dụng của nấm Linh chi
Vai trò dược lý của nấm Linh chi rất lớn nhờ sự có mặt của các hoạt chất
sinh học. Nấm Linh chi được sử dụng như một dược liệu quý, kết quả nghiên
cứu dược lý học hiện đại cho thấy, nấm Lich chi có tác dụng trên hệ tuần hồn
[19],[21],[22]. Tác dụng trên hệ miễn dịch và chống ung thư [25]. Chế phẩm
nấm Lim xanh làm gia tăng quá trình sản xuất Interleukin-1 & 2, có tác dụng
hạn chế sự phát triển của nhiều loại mơ có hại [22]. Tác dụng phịng, chống
bệnh tiểu đường [21], cholesterol và đường trong máu [19]. Làm giảm đường
huyết và điều chỉnh rối loạn lipid máu. Nấm Linh chi có chất Polysaccharides
làm khơi phục tế bào tiểu đảo tuyến tụy và từ đó thúc đẩy quá trình tiết insulin
[12], Tác dụng ngăn chặn quá trình lão hóa, giúp cơ thể tráng kiện. Trong
thành phần nấm Linh chi có chứa Acid ganoderic (dẫn chất triterpenoid) có


7

tác dụng như một chất oxy hóa khử các gốc tự do trong cơ thể chống lão hóa.
Ổn định và cải thiện chức năng sinh lý của màng tế bào, tăng cường năng lực
tổng hợp DNA, RNA và protein [26]. Nhóm steroid trong nấm Linh chi có tác
dụng giải độc gan, bảo vệ gan ngưng tổng hợp cholesterol, ức chế nhiều loại
vi khuẩn gây bệnh nên có hiệu quả tốt đối với bệnh về gan, mật như: Viêm
gan mãn tính, viêm gan cấp tính, xơ gan, gan nhiễm mỡ... [12]. Nấm Linh Chi
giúp bài tiết các độc tố trong cơ thể, có tác dụng loại bỏ các sắc tố lạ trên da,
làm cho da dẻ đẹp, hồng hào, chống lại các bệnh ngoài da như dị ứng, trứng
cá... [23].
Về giá trị sử dụng làm thuốc của nấm Linh chi
Trong các nghiên cứu lâm sàng cho rằng nấm Linh chi cần được nghiên
cứu và xem xét trong việc (1) phòng ngừa và điều trị bệnh ung thư ở những người

có nguy cơ ung thư cao (2) sử dụng chất bổ trợ trong cơng tác phịng chống di căn
hoặc tái phát ung thư (3) thuốc giảm đau của bệnh ung thư và (4) sử dụng bổ trợ
với hóa trị liệu đồng thời giảm thiểu tác dụng phụ, (5) có khả năng ngăn chặn q
trình hình thành khối u, (6) điều hịa huyết áp, (7) ngăn ngừa các bệnh về tim
mạch, (8) các bệnh về mạch máu não, (9) điều chỉnh lượng đường trong máu, (10)
sản sinh chất chống oxy hóa và chất chống lão hóa hiệu quả[21][22][20].
Về thành phần hóa học và tác dụng dược lý
Cấu trúc đặc biệt của Nấm Linh chi gồm 119 khống tố vi lượng trong
đó có một số khoáng tố như polysaccharides, germanium, Vanadium, crom,
và Triterpenoids đã được nghiên cứu. Các thành phần khoáng chất này đã
được khẳng định là nhân tố quan trọng trong các phản ứng chống ung thư, dị
ứng, lão hóa, xơ vữa, đơng máu nội mạch...[17].
Polysaccgaride là một hợp chất hữu cơ có chứa trong thực vật: quả, củ hoặc
thân cây. Trong thực vật, polysaccharide tồn tại dưới hai dạng: dạng không
tan và dạng hịa tan. Polysaacharide có trong thành phần một số thực vật điển


8

hình như: nhân sâm, nấm linh chi, nấm hương,… hợp chất cao phân tử có
chứa hàng trăm thậm chí hàng nghìn mắt xích monoscacchride trong mỗi
phân tử [2].
Polysacharide là những polime được tạo ra từ thiên nhiên hoặc nó có
thể là sản phẩm của phản ứng trùng ngưng các andozo hoặc xentozo.
Polysacharide tồn tại ở các loại mạch như mạch hở, mạch khơng nhánh
hoặc có nhánh, mạch vịng hay uốn khúc.
Polysacharide thường được phân loại thành hai loại là omopolysacchride và
heteropolysacchride.
Homopolysacchride được tạo thành từ một loại monosacchride như tinh bột,
xenlluose, glycogen.

Heteropolysacchride được thành từ hai loại monosacchride trở lên như
pectit, aga, hemixenllulose….
Trong dược tính của nấm nói chung và nấm Linh chi nói riêng thì
hoạt tính dược học của polysaccharide là quan trọng và được nghiên cứu
nhiều nhất.
Thành phần polysaccharide hoạt tính sinh học chủ yếu thuộc nhóm βGlucan. Các chất này trong nhóm hợp chất có hoạt tính sinh học có nguồn gốc
từ tự nhiên, là loại chất có khả năng điều chỉnh đáp ứng sinh học. Là tác nhân
điều hòa hệ thống bảo vệ miễn dịch tự nhiên quan trọng nhất, β - Gluccan từ
nấm không giống với các loại sản phẩm từ tự nhiên khác mà β- Gluccan từ
nấm được tinh khiết duy trì tác dụng sinh học cho phép chúng có hiệu quả ở
mức độ phân tử và tế bào [20].
Năm 1980, tại Nhật Bản β- Gluccan trong nấm Linh chi đã chứng minh
được khả năng kích thích máu tương tự chủ yếu tố kích thích các bạch cầu hạt
đơn nhân. Các thí nghiệm đều cho thấy rằng, hiệu quả tác dụng vào tế bào
ung thư rất tốt, có thể làm giảm 70-95% trọng lượng khối u so với chúng. Tuy


9

vậy, kết quả cho khả năng kháng, tác động tích cực tới khối u khi sử dụng kết
hợp với chất kháng chống ung thư, còn nếu sử dụng riêng lẻ thì khơng thể làm
khối u biến mất. Qua đó, β- Gluccan có thể làm giảm sự phát triển của khối u,
ngăn chặn khối u di căn. Trái ngược với vi sinh vật, tế bào khối u cũng như
các tế bào vật chủ khác, β- Gluccan là một thành phần không thể thiếu là một
thành phần bề mặt để kích hoạt thụ thể bổ sung bắt đầu gây độc tế bào và giết
chết tế bào khối u. Điều này chỉ xảy ra khi có mặt β- Gluccan [20],[28].
Các hoạt tính của Polysaccharide có tác dụng kháng virus và điều hịa
miễn dịch là do có ligmin, các chất kháng sinh; Lentinan là một
polysaccharide có tác dụng phục hồi tế bào Lympho T, tăng sản xuất
interferol [8].

Hoạt tính tăng khả năng miễn dịch.
Hoạt chất Polysaccharide còn được nghiên cứu trong nấm hương, kết
quả nghiên cứu cho thấy có khả năng hoạt hóa miễn dịch tế bào thúc đẩy quá
trình sinh trưởng và phát triển tế bào Lympho T, Lympho B từ đó góp phần
tăng cường hệ miễn dịch ở bệnh nhân bị bệnh gan, giúp bệnh gan nhiễm mỡ
máu chóng hồi phục các tế bào bị tổn thương nhanh chóng hơn [20].
Polysaccharide JSL-18 có trong nấm hương là tăng hoạt tính đại thực
bào, tăng tiết IL-6 (Interleakin-6). Bên cạnh đó, trong nấm hương còn
chứa các chất như Lentinacin, dezoxy lentinacin, 5’ –GMP, 5’ –AMP có
tác dụng chống đơng máu. Ngồi ra, cịn có chất eritadenine có hiệu quả
làm giảm hàm lượng cholesterol trong máu [5].
Với nhiều tác dụng như vậy việc tách chiết Polysaccharide được quan
tâm và nghiên cứu ở nhiều loài nấm trong đó có nấm Linh chi. Các nghiên
cứu cho thấy Polysaccharides trong nấm tồn tại như một thành phần cấu trúc
của vách tế bào nấm và việc lựa chọn phương pháp trích ly phụ thuộc về cấu
trúc tế bào. Một số phương pháp trích ly thu polysaccharides thơng thường


10

như: Chiết bằng dung mơi, bằng sử dụng nước nóng, giải pháp kiềm và
phlyethylene glycol; và các phương pháp sử dụng sóng siêu âm. Ngồi ra
Polysaccharide cịn chiết bằng nước, kết tủa bằng etanol với quy trình như
sau: Quả thể nấm T. microcaspus tươi (1kg) rửa sạch bằng nước. Sau đó đun
sơi nấm quả thế trong 250ml nước cất trong 12 giờ. Hỗn hợp dịch chiết được
để qua đêm tại 4 độ C và được lọc qua vải lọc. Sau đó, ly tâm ở 8000 rpm
trong 45 phút tại 6 độ C để thu nhận dịch chiết sạch tạp chất. Thu nhận lấy
phần dịch nổi (200ml) và kết tủa trong ethanol theo tỉ lệ (1:5, v/v) ở nhiệt độ
phòng. Để kết tủa qua đêm tại 4 độ C, sau đó ly tâm ở 6 độ C trong 1 giờ.
Phần kết tủa thu được rửa sạch với nước cất và thẩm tách qua ống thẩm tách

trong 6 giờ để loại bỏ các vật liệu có trọng lượng phân tử thấp. Phần cịn lại
đem sấy khơ [2].
Germanium đây là chất có hàm lượng nhiều thứ 5 trong các chất
khống (489 µg/g) có trong nấm Linh chi. Chất này tồn tại rất ít ở các loại
thực vật trong tự nhiên, chỉ một phần rất nhỏ được tìm thấy trong nhân sâm,
lơ hội và tỏi [18]. Mặc dù germanium không phải là thành phần thiết yếu,
nhưng chỉ cần một liều lượng thấp cũng đã có tác dụng tăng cường khả năng
miễn dịch, kháng khối u, chống oxy hóa và chống đột biến [19]. Germanium
có tác dụng chống lại các vi khuẩn nhất định. Tồn tại dưới dạng hữu cơ, nó
đang được đánh giá cao, và đưa vào nghiên cứu điều trị ung thư. Germanium
có khả năng cải thiện và tăng cường hệ miễn dịch, tăng cường quá trình cung
cấp oxy cho cơ thể, tiêu diệt các gốc tự do gây hại. Nó cũng có tác dụng bảo
vệ cơ thể, chống lại các tia bức xạ từ môi trường. Germanium không trực tiếp
tấn công vào các tế bào khối u, mà kích thích hệ thơng miễn dịch của cơ thể,
tự sản sinh ra các chất, và có khả năng ức chế sự hình thành và phát triển của
khối u và các bệnh thối hóa khác. Hàm lượng Germanium hữu cơ có trong


11

nấm Linh chi được đánh giá là cao hơn những loại thảo dược khác. Vượt trên
cả Germanium có chứa trong nhân sâm từ 5 – 8 lần [18].
Germanium hữu cơ có tăng cường khả năng vận chuyển oxy của máu, ức
chế khối u phát triển và ngăn chặn các khối u không cho chúng lây lan sang các
tế bào lành bệnh xung quanh [9].
Polysaccharide trong nấm Linh chi tăng cường hệ thống miễn dịch, kìm
hãm và ức chế sự phát triển và di căn của khối u, điều hòa huyết áp, ngăn
ngừa các bệnh về tim mạch và các bệnh về mạch máu não, kích hoạt sản sinh
insulin, điều chỉnh lượng đường trong máu, cũng như sản sinh chất chống oxy
hóa và chất chống lão hóa hiệu quả. Chiết xuất Polysaccharide được sử dụng

làm thành phần trong một số loại thuốc chống ung thư, chống tiểu đường hay
thuốc trợ tim, tốt cho tim mạch, vv…[18].
Triterpene có tác dụng làm giảm các tác hại do rượu, bia hay thuốc lá
gây ra cho gan, phổi nên do đó bảo vệ gan, phổi; giết chết tế bào ung thư; làm
giảm đau; giảm viêm; làm giảm cholesterol; ngăn ngừa đông cứng mạch máu;
tăng cường chức năng gan và tiêu hóa. Ngành sản xuất dược phẩm Nhật Bản,
Hàn Quốc, Việt Nam và một số nước tại khu vực Châu Âu đã sử dụng thành
phần Triterpene này vào sản xuất các loại thuốc giảm đau, thuốc ngùa tim
mạch, thuốc bổ gan,...[19].
Yếu tố vi lượng selenium Ngăn ngừa ung thư và làm giảm đau cho bệnh
nhân ung thư. Ngồi ra selenium cịn có tác dụng chống lão hóa, làm q trình
lão hóa xảy ra chậm, giúp cho làn da sáng mịn, giảm tàn nhang và các đốm
thâm rám trên da cũng như hạn chế sự xuất hiện của nếp nhăn. Hiện một số
công ty mỹ phẩm cũng đang nghiên cứu và đưa vào sản xuất thành công các
loại mỹ phẩm, các loại sản phẩm chăm sóc sắc đẹp như kem dưỡng da, sữa
rửa mặt, kem làm trắng da, sữa dưỡng thể, … có thành phần là selenium chiết
xuất từ nấm Linh chi [9].


12

1.4. Tổng quan về sản xuất sinh khối ở nấm linh chi
Hiện nay các cơng trình nghiên cứu tách chiết các hợp chất mới được
thực hiện ở nấm Linh chi. Năm 1976 Polysaccharide đã được tách chiết ở
Nhật và được bằng sáng chế dùng để điều trị ung thư. Năm 1982 cơng ty
Teikoko Chemical Industry tách chiết gốc glucoprotein có trong nấm Linh chi
làm chất ức chế neoplasm và được nhận bằng sáng chế của mỹ do có khả
năng chống ung thư [19].
Linh chi sinh khối được chứng minh có chứa các thành phần hoạt chất
quý cao gấp nhiều lần so với Linh chi sản xuất bằng phương thức truyền

thống. Thành phần chống khối u của nấm Linh chi của cơng trình đạt 18%, có
trường hợp đạt 20-36%, trong khi nấm Linh chi từ các nơi khác, tức sản phẩm
nấm dưới dạng quả thể to như cái đĩa, chỉ đạt 5-6%. Đó là các enzym, kháng
sinh, protein, 17 loại acid min, polysacharid (1-3 beta-D-glucan)...[10].
Không những thế, Linh chi sinh khối cịn hơn hẳn cơng nghệ sản xuất nấm
quả thể như thời gian thu hoạch ngắn. Đặc biệt, giá bán của linh chi sinh khối
cao gấp đôi quả thể, 600.000 đồng/kg so với 300.000 đồng/kg. Khi sử dụng,
không cần loại bỏ bã như nấm quả thể. Trong số tám sản phẩm của cơng trình,
đáng chú ý có sản phẩm mang tên Sinh linh và Bào tử nấm Linh chi. Bào tử
nấm Linh chi lâu nay bị nhiều người cho là không tốt nên thậm chí cho rửa
trơi bào tử. Các nhà khoa học trong nhóm đề tài làm ngược lại. Họ cho thu hồi
và sử dụng chúng như một trong những sản phẩm chính. Điều thú vị là chính
những bào tử này chứa hoạt chất germanium có tác dụng làm giảm đau cho
bệnh nhân ung thư. Đặc biệt, khả năng bảo vệ tế bào khi đột biến gene (khi tế
bào lành chuyển sang tế bào ác tính, tế bào ung thư) của Linh chi sinh khối
cao hơn linh chi ở dạng quả thể. Trong khuôn khổ hợp tác với Hàn Quốc theo
nghị định thư cấp chính phủ thuộc Trường đại học Khoa học Tự nhiên, sản


13

phẩm sinh khối vừa được cấp cho 30 bệnh nhân ung thư gan tại BV Ung thư
Trung ương dùng thử trong ba tháng để đánh giá tác dụng hỗ trợ chữa ung thư
của sản phẩm độc đáo này. Ưu điểm nổi bật về công nghệ của Linh chi sinh
khối mà nhóm đề tài thực hiện chính là ở chỗ cơng nghệ đơn giản trong khi
sản phẩm có hoạt chất sinh học cao như nêu qua ở trên. Không cần máy móc
đắt tiền, các nhà khoa học có thể giúp bà con sản xuất sinh khối quanh năm và
không phải theo thời vụ. Các nước phát triển cũng đã và đang sản xuất Linh
chi sinh khối và đúng là họ đi trước ta từ lâu. Song công nghệ của họ phức
tạp, đắt và vì thế, khơng phù hợp với hồn cảnh hiện tại ở Việt Nam.

Trung Quốc được coi là cái nôi phát hiện nấm Linh Chi. Ngay từ đầu thế
kỷ 17 (1621), nấm Linh chi đã được biết đến, nuôi trồng và sử dụng như
nguồn dược liệu quý. Nấm Linh chi hay gặp ở nơi có khí hậu lạnh như Tứ
Xuyên, Phúc Kiến, Quảng Đông... Quốc gia này được coi là trung tâm lớn
nhất thế giới về nuôi trồng và sản xuất nấm Linh chi. Hàng năm, trên thế giới
sản xuất 4300 tấn nấm Linh chi, riêng Trung Quốc chiếm 3000 tấn, còn lại là
Hàn Quốc, Đài Loan, Nhật Bản, Thái Lan, Mỹ, Malaysia, Việt Nam,
Indonesia và Srilanka. Đến nay có rất nhiều cơng trình nghiên cứu về giá trị
dược liệu của nấm Linh chi. Trước những lợi ích to lớn từ Linh chi, nhiều cơ
sở nuôi trồng nấm Linh chi đã được xây dựng đặc biệt là Linh chi đã được
nuôi trồng trên quy mô công nghiệp ở Mỹ. Ngoài ra tại Mỹ, Viện nghiên cứu
nấm Linh chi quốc tế đã được thành lập ở New York [21].
Nấm Linh chi, từ nhiều ngàn năm nay đã được trọng dụng ở Á Đông,
hiện nay Linh chi là một trong những đề tài nghiên cứu và ứng dụng đang
được quan tâm của ngành y dược Âu Mỹ [8]. Nấm Linh chi được xếp vào
nhóm thuốc bổ có khả năng giúp tăng lực, đây là một thực tế không thể chối
cãi, sau khi sử dụng nấm Linh chi. Điều này không chỉ căn cứ vào cảm giác


14

chủ quan của người dùng, mà dựa trên các tiêu chuẩn khoa học khách quan và
theo kết quả của hàng trăm cơng trình nghiên cứu từ châu Á sang châu Âu [9].
Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về trích ly và ứng dụng các hoạt
chất sinh học trong nấm Linh chi. Theo cơng trình nghiên cứu gần đây, thành
phần chủ yếu của các loại Linh chi có: Acid amin, protid, steroid,
polysaccharide, germanium (cao hơn lượng germanium trong Nhân sâm 5 - 8
lần), acid ganodenic [16].
1.4. Đặc điểm hình thái, phân loại nấm Lim xanh
1.4.1. Nguồn gốc và phân loại nấm Lim xanh

Trong đó nấm Lim xanh thuộc nhóm Hồng chi có tên khoa học là
Ganoderma lucium (Leyss. Ex Fr.) Karst, Hồng chi có lồi mọc trên giá thể
gỗ Keo, Bồ Đề, Phượng Vĩ,… có cả những lồi mọc trên thân gỗ lim đã
mục, người ta gọi là nấm Lim xanh.
1.4.2. Đặc điểm thực vật và phân bố naams Lim xanh
- Nấm Lim xanh là một trong những loại nấm phá gỗ, nó thường ký sinh
trên các cây gỗ lâu năm, một số loài cây chết mục, thường gặp chúng trên cây
Lim. Nấm thường có ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Trong tự nhiên, nấm
thường chỉ có ở nơi rừng rậm, ít ánh sáng và có độ ẩm cao [12].
- Lim xanh có cấu tạo 2 phần: Phần cuống và mũ nấm. Cuống nấm biến
dị rất lớn, từ rất ngắn (0,5cm), rất mảnh (0,2cm) cho đến dài cỡ hàng 5-10 cm
hoặc rất dài 20-25cm. Cuống có thể đính ở bên hoặc đính gần tâm do q
trình lên tán mà thành.
- Mũ nấm dạng thận - gần trịn, đơi khi x hình quạt hoặc ít nhiều dị
dạng. Trên mặt mũ có vân gợn đồng tâm và có tia rãnh phóng xạ, màu vàng
nâu, vàng cam, đỏ cam, đỏ nâu, nâu tím hoặc nâu đen, nhẵn bóng như láng
vecni. Kích thước tán biến động từ 2 - 30cm, dày 0,8 - 2,5cm.


15

- Thịt nấm dày từ 0,4 - 1,8cm, màu vàng kem, nâu nhạt. Nấm mềm, dai khi
tươi và trở nên chắc cứng và nhẹ khi khô, đầu tận cùng của sợi phình hình chuỳ,
màng rất dày đan khít vào nhau tạo thành lớp vỏ láng phủ trên mũ và bao quanh
cuống [14].

Nấm Lim xanh được thu thập

Nấm Lim xanh được ni trồng tại

từ Thanh Hóa

Trường ĐH Nơng Lâm Thái Ngun

Hình 1.1: Hình thái quả thể nấm Lim xanh thu nhận từ Thanh Hóa và
ni trồng tại trường Đại học Nơng Lâm Thái Nguyên
1.5. Tổng quan về phân lập
Theo tác giả Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Thu Hằng và Lê Xuân Thám
trong phân lập nấm Vân chi, có nhiều cách để phân lập tạo giống gốc nhưng
hiệu quả nhất là phân lập từ quả thể. Vì đây là phương pháp nhân giống vơ
tính, trong khi tách hệ sợi nấm thì khơng rõ có đúng là nấm cần phân lập hay
nấm mốc, nấm dại khác. Cịn dùng bào tử nấm cũng khơng đơn giản vì đây là
giai đoạn sinh sản hữu tính, nên nấm hình thành có thể thay đổi đặc tính.
Ngồi ra phương pháp phân lập từ quả thể hạn chế được hiện tượng bị lẫn hay
nhiễm tạp các loại vi sinh vật khác do sử dụng trực tiếp các mô thịt nấm.
Nguyên tắc của phương pháp này là chọn tai nấm điển hình ở giai đoạn


16

trưởng thành để đánh giá chất lượng giống. Mô thịt nấm tách ở những vị trí
kín đáo, ít tiếp xúc với các nguồn bệnh nhất.
Môi trường phân lập là môi trường dinh dưỡng bao gồm ba thành phần
cơ bản: Đường: 2 – 3 %, thạch: 2% và chất bổ sung: Nước chiết (lấy từ các
nguồn tự nhiên như khoai tây, nước giá, cà rốt…) và hóa chất (chủ yếu là
các chất khống N, P, K…) [11].
Khi có được giống thuần, cấy sợi nấm từ môi trường phân lập vào ống
nghiệm chứa môi trường thạch nghiêng để giữ giống. Môi trường giữ giống
có thể giống với mơi trường phân lập. Khi giữ giống, bảo quản ống nghiệm
trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4 đến 10 độ C và mỗi tháng cấy lại một lần [3],[15].

1.6. Nuôi cấy sinh khối nấm Linh chi trong môi trường lỏng
1.6.1. Nuôi cấy hệ sợi nấm Linh chi trong mơi trường lỏng
Phương pháp lên men chìm đối với vi sinh vật.
Khái niệm: Là quá trình nhân ni vi sinh vật trong mơi trường lỏng có
sục khí để bổ sung thêm oxy hoặc nuôi tĩnh. Giống vi sinh vật sau khi cấy vào
mơi trường lên men thì bắt đầu phát triển ở giai đoạn tiềm phát (pha lag) rồi
chuyển sang phát triển qua pha lũy thừa (pha log). Trong pha lũy thừa, vi sinh
vật phát triển nhanh chóng và đạt cực đại, lượng vi sinh vật ngày càng tăng
lên nhưng dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy nếu khơng được bổ sung
thêm vào đó ở giai đoạn này thành phần môi trường dinh dưỡng giảm nhanh,
nhu cầu oxy tăng, nhiệt độ tạo ra cao đồng thời bề mặt mơi trường có thể trào
ra khỏi bình men, làm mất bớt dịch và tăng khả năng nhiễm vi sinh vật lạ
khơng mong muốn.
Vi sinh vật trong q trình lên men phát triển theo 4 pha: pha tiềm phát
(pha lag) pha lũy thừa (pha log), pha ổn định, pha suy vong.
Pha tiềm phát: Khi cấy các tế bào sinh vật từ môi trường này sang môi
trường khác, khoảng thời gian đầu số tế bào không thay đổi. Trong giai đoạn