Nghiên cứu một số tác dụng sinh học của flavonoit chiết xuất từ lá nhãn (dimocarpus longan luor ) và lá vải (litchi chinensis sonn )

Liên hiệp các Hội Khoa học và Kỹ thuật Việt Nam
Viện Nghiên cứu Đào tạo và T vấn Khoa học Công nghệ



Báo cáo nghiệm thu





đề tài

Nghiên cứu một số tác dụng sinh học của
Flavonoit chiết Xuất từ lá nhãn (
Dimocarpus
Longan
Lour.) và lá vải
(Litchi chinensis
sonn.)








7508
15/9/2009

Hà Nội - 2009

MỤC LỤC

Tóm tắt thông tin về đề tài
Các ký hiệu viết tắt trong đề tài
Mở đầu
1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Cây vải thiều
1.2. Cây nhãn cùi
1.3. Nhóm hợp chất Flavonoit
2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng thực vật
2.1.2. Đối tượng động vật
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Chiết xuất và định lượng Flavonoit tổng số theo phương pháp của
B.C. Talli
2.2.2 Phân tích thành phần Flavonoit bằng sắ
c ký lớp mỏng, phổ quét và
quang phổ hấp phụ tử ngoại.
2.2.3 Xác định hoạt độ peroxydaza trong máu theo E. C. Xavron
2.2.4 Xác định hoạt tính chống oxy hóa in vitro của các chế phẩm
flavonoit thông qua quá trình peroxy hóa lipit tế bào gan chuột theo
phương pháp của C. G. Blagodorov và cộng sự
2.2.5 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của chế phẩm Flavonoit chiết xuất
từ lá Vải và lá Nhãn

2.2.6 Nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn của các chế phẩm Flavonoit
2.2.7 Xác định độc tính cấp củ
a các chế phẩm Flavonoit theo phương
pháp của A. Wallace Hayes
2.2.8 Bào chế, phân tích, kiểm nghiệm và xây dựng tiêu chuẩn cho sản
phẩm chức năng Agot – G (sản phẩm có sử dụng chế phẩm Flavonoit từ lá
Nhãn – FN)
2.2.9 Khảo sát tác dụng bảo vệ gan của sản phẩm Agot – G khi gây độc
gan chuột bằng Ethanol
2.2.10 Nghiên cứu ảnh hưởng của sản phẩm chức năng Agot – G lên hoạt
độ của một số enzym tiêu hoá tuyến tuỵ chó (Amylaza, lipaza, proteaza)
2.2.11 Xác
định độc tính cấp của sản phẩm chức năng Agot – G theo
Trang
1
3
4
6
6
6
7
19
19
19
19
19
20

21

22
22


23

24
25

26


26

27

31
phương pháp của A. Wallace Hayes
2.2.12 Xử lý số liệu theo phương pháp thống kê sinh học
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ HOÁ HỌC CỦA CÁC CHẾ PHẨM FLAVONOIT
3.1.1. Chiết xuất và định lượng Flavonoit tổng số từ lá Nhãn và lá Vải
3.1.2. Phân tích thành phần Flavonoit tổng số thu được bằng sắc ký lớp
mỏng và phổ tử ngoại.
3.1.3. Khảo sát test chống oxy hoá của các chế phẩm FN, FN
T
, FV, FV
T

thông qua hiệu lực kìm hãm phản ứng oxy hoá indigocarmin của enzym

peroxydase máu người.
3.2 NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG SINH HỌC
3.2.1 Nghiên cứu tác dụng chống oxy hoá (Antioydant)của các chế phẩm
Flavonoit chiết xuất từ lá Nhãn và lá Vải.
3.3.2 Nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn của chế phẩm FV và FN

3.3.3 Nghiên cứu độc tính cấp của chế phẩm FV và FN
3.3.4. Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của chế phẩm FN và FV

3.3. KIẾN NGHỊ VỀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CÁC CHẾ PHẨM FLAVONOIT
CHIẾT XUẤT TỪ LÁ NHÃN (FN) VÀ TỪ LÁ VẢI (FV)
3.3.1 Nghiên cứu sử dụng chế phẩm FN để hình thành sản phẩm Agot – G.
3.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của chế phẩm Agot - G lên hoạt động
của các enzym tiêu hoá tuyến tuỵ chó (amylaza, lipaza, proteaza)
3.3.3 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của sản phẩm Agot – G trên
chuột gây độc gan bằng Ethanol
3.3.4 Thử độc tính cấp của sản phẩm chức năng Agot – G
3.3.5 Phân tích, kiểm nghiệm và xây dựng tiêu chuẩn cho sản phẩm chức
năng Agot – G (sản phẩm có sử dụng chế phẩm Flavonoit từ lá Nhãn –
FN)
4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Tài liệu tham khảo




31
32
32
32

34

38


40
40

43
44
46
53

54
55

58

60
62


67
71

1
TÓM TẮT THÔNG TIN VỀ ĐỀ TÀI
1. Tên đề tài: “Nghiên cứu một số tác dụng sinh học của các hợp chất
Flavonoit chiết xuất từ lá Nhãn (Dimocarpus Longan Lour) và lá Vải (Litchi
Chinensis Sonn)
”
2. Cơ quan quản lý đề tài: Liên hiệp các hội khoa học và kỹ thuật Việt Nam
Địa chỉ: 53 Nguyễn Du, quận Hai Bà Trưng, Hà Nội
3. Cơ quan thực hiện: Viện Nghiên cứu, Đào tạo và Tư vấn khoa học công
nghệ
Địa chỉ: Số 201 A – B, phố Đội Cấn, quận Ba Đình – Hà Nội
Điện thoại: (04) 37222233
Fax: (04) 37222277
4. Chủ nhiệm đề tài: TS. Đào Thị Kim Nhung
Chức vụ: Phó Viện tr
ưởng Viện Nghiên cứu, Đào tạo và Tư vấn khoa
học công nghệ
Địa chỉ: Số 9, phố Đội Cung, quận Hai Bà Trưng, Hà Nội
Điện thoại: (04) 39761106
5.Mục tiêu của đề tài
Nghiên cứu, hướng tới khai thác và ứng dụng các hợp chất Flavonoit chiết
xuất từ lá Vải và lá Nhãn làm nguyên liệu mới dùng trong lĩnh vực Bảo vệ sức
khoẻ cộng đồng.
6. Nội dung chính của
đề tài: gồm 3 phần
Phần 1
: Chiết xuất, định lượng và phân tích thành phần hoá học của các
chất Flavonoit thu nhận được từ các nguyên liệu là lá Nhãn, lá Vải tươi và khô.
Phân tích sàng lọc hoạt tính chống oxy hoá của các chế phẩm Flavonoit thu

được.
Phần 2:
Nghiên cứu một số tác dụng sinh học của chế phẩm Flavonoit từ lá
Vải và lá Nhãn
-Nghiên cứu tác dụng chống oxy hoá
-Nghiên cứu về tính an toàn (độc tính cấp)

2
-Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn
- Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan
Phần 3
: Kiến nghị về khả năng ứng dụng các chế phẩm Flavonoit chiết xuất
từ lá Nhãn và lá Vải
-Nghiên cứu sử dụng chế phẩm FN để hình thành sản phẩm chức năng Agot - G
-Nghiên cứu một số hoạt tính sinh học của sản phẩm Agot - G (tác dụng bảo vệ
gan, ảnh hưởng lên hoạt động các enzym tiêu hoá của tuyến tuỵ, thử độc tính
cấp)
-Phân tích, kiểm nghi
ệm, xây dựng tiêu chuẩn cho sản phẩm chức năng Agot- G
7. Thời gian thực hiện: 24 tháng, từ 05/ 2007 đến 05/ 2009
8. Kinh phí thực hiện
- Kinh phí của đề tài được duyệt: 300.000.000 đ (ba trăm triệu đồng)
- Kinh phí thực nhận: 258.000.000 đ
Trong đó:
Năm thứ nhất: 150.000.000 đ
Năm thứ hai: 108.000.000 đ [kinh phí được duyệt là 120.000.000đ, trừ
10% (12.000.000đ) chi phí tiết kiệm].
9. Danh sách cán bộ tham gia đề tài
Họ và tên Cơ quan công tác
Thời gian làm việc

cho đề tài
TS. Đào Thị Kim Nhung Viện nghiên cứu, đào tạo và tư vấn
khoa học công nghệ
16 tháng
Ths. Đỗ Thị Gấm - nt - 16 tháng
Ths. Trần Thị Hiếu - nt - 8 tháng
TS. Hà Việt Sơn - nt - 8 tháng
CN. Trần Nam Thái - nt - 8 tháng
Ths. Trần Quỳnh Hoa Trung tâm nghiên cứu và phát triển
công nghệ hoá sinh
14 tháng




3

CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT TRONG ĐỀ TÀI
FV: chế phẩm Flavonoit chiết xuất từ lá Vải khô
FV
T
: chế phẩm Flavonoit chiết xuất từ lá Vải tươi
FN: chế phẩm Flavonoit chiết xuất từ lá Nhãn khô
FN
T
: chế phẩm Flavonoit chiết xuất từ lá Nhãn tươi
TLK: Trọng lượng khô tuyệt đối
ASTN: Ánh sáng tự nhiên
COOH: Chất chống oxy hoá
H

Đ: Hoạt độ
POL: Quá trình peroxy hoá lipit
HTCO: Hoạt tính chống oxy hoá
DAM: dialdehyl manonyl.
SKLM: Sắc ký lớp mỏng
DMSO: Dimethyl sulphoxide
MIC: Nồng độ ức chế tối thiểu ( Minimal inhibitory concentration)
MTT: 3 – (4,5 – dimethylthiazol – 2 - yl ) – 2,5 – diphenyl tetrazolium bromide
IC
50
: Nồng độ ức chế 50% lượng vi sinh vật (Inhibitory concentration 50%)
LD
50
: Liều gây chết 50% động vật thí nghiệm (Lethal dose 50%)
AST: Alanin amino transferase
ALT: Aspartate amino transferase
ACD: dung dịch Axit citrate dextrose









4
MỞ ĐẦU
Các hợp chất Flavonoit thiên nhiên có nhiều tác dụng sinh - dược học giá
trị, được phân bố rộng rãi trong thế giới thực vật, ít độc đối với cơ thể đang thu

hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới. Việc nghiên cứu về cấu
trúc hoá học, các đặc điểm lý – hoá – sinh học và khả năng ứng dụng của
Flavonoit vào các lĩnh vực khác nhau của đời sống (y dược, thực phẩm, m
ỹ
phẩm, sinh học phân tử ) đã trở thành một trường phái mạnh ở nhiều quốc gia
phát triển (Mỹ, Anh, Nga, Hàn Quốc, Trung Quốc ). Người ta đã tìm thấy hơn
4000 chất Flavonoit thực vật cùng hoạt tính sinh học của chúng liên quan đến
khả năng phòng ngừa và điều trị nhiều bệnh khác nhau ở người.
Năm 2006 Viện Nghiên cứu, Đào tạo và Tư vấn Khoa học Công Nghệ
đã công bố
công trình nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hoá (antioxydant) của
Flavonoit ở 48 cây trồng và cây mọc hoang dại; trong đó lá Vải và lá Nhãn là
những đối tượng nghiên cứu được chọn vào nhóm nguyên liệu có nhiều triển
vọng cho việc khai thác và ứng dụng.
Cây Vải (Litchi Chinensis Sonn) và cây Nhãn (Dimocarpus Longan Lour)
cùng thuộc họ Bồ hòn Sapindaceae, là những cây ăn quả lâu năm trồng phổ biến
ở miền Bắc Việt Nam. Hàng năm, sau mỗi vụ thu hoạch quả (Vải từ tháng 5 →
7, Nhãn từ tháng 8 →10) người trồng cây thường đốn lá để bắt đầu quy trình
chăm bón cây cho mùa vụ năm sau. Khối lượng khổng lồ lá bỏ đi có thể trở
thành nguồn nguyên liệu rất phong phú nếu được khai thác và sử dụng hợp lý.
Vì vậy, chúng tôi tiếp tục nghiên cứu trên đối tượng này với mong muốn phát
hiện một số tác dụng sinh học của các hợp chất Flavonoit chiết xuất từ lá Nhãn
và lá Vả
i góp phần hướng tới mục đích chăm sóc và bảo vệ sức khoẻ cộng
đồng.
Những nội dung chính của đề tài
Phần 1: Chiết xuất Flavonoit và phân tích hoá học
-Chiết xuất, định lượng và thu 4 chế phẩm Flavonoit tổng số từ lá Nhãn và lá
Vải (gồm hai loại lá tươi và khô)

5
-Dùng các phương pháp sắc ký và quang phổ để so sánh, đánh giá sự khác biệt
giữa các cặp Flavonoit tách ra từ nguyên liệu tươi và khô. Sơ bộ nhận dạng
thành phần Flavonoit chủ yếu (aglycon) của các chế phẩm Flavonoit thu được.
-Phân tích sàng lọc hoạt tính chống oxy hoá của các chế phẩm Flavonoit thu
được.
Phần 2:
Nghiên cứu một số tác dụng sinh học của chế phẩm Flavonoit từ lá
Vải và lá Nhãn
-Nghiên cứu tác dụng chống oxy hoá
-Nghiên cứu về tính an toàn (độc tính cấp)
-Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn
-Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan
Phần 3
: Kiến nghị về khả năng ứng dụng các chế phẩm Flavonoit chiết xuất
từ lá Nhãn và lá Vải
-Nghiên cứu sử dụng chế phẩm FN để hình thành sản phẩm chức năng Agot - G
-Nghiên cứu một số hoạt tính sinh học của sản phẩm Agot - G (tác dụng bảo vệ
gan, ảnh hưởng lên hoạt động các enzym tiêu hoá của tuyến tuỵ, thử độc tính
cấp)
-Phân tích, kiểm nghi
ệm, xây dựng tiêu chuẩn cho sản phẩm chức năng Agot- G

6
1. TNG QUAN Tài liệu
1.1. Cây vải thiều
Cây Vải thiều có tên khoa học là Litchi chinensis Sonn thuộc họ bồ hòn
Sapindaceae. Cây Vải đợc trồng ở khp Việt Nam và còn thấy ở Cămpuchia,
Lào, Trung Quốc, Thái Lan, phía bắc ấn Độ. Vải là một cây to, có thể cao tới 10
m. Cành thờng mọc ngang, lá kép chẵn, gồm 3 đến 4 đôi lá chét hình mác, hay
thuôn dài, hai đầu tù, dai, mặt trên bóng, mặt dới mờ. Hoa mọc thành chuỳ tận
cùng, trên cành mang hoa phủ đầy lông nâu nhạt. Hoa không cánh, 5 lá đài dính
nhau. Quả hình cầu, vỏ quả khô và mỏng, sần sùi chứa một hạt to bao bọc bởi
một áo hạt (cùi vải) trắng, mẫm, nhiều nớc, thơm ngọt và chua, ăn đợc. Quả
vải thờng thu hoạch vào tháng 5 -7 dùng ăn tơi hay sấy khô hoặc đóng hộp
dùng dần. Hạt vải thái mỏng phơi hay sấy khô dùng làm thuốc với tên lệ chi
hạch.
Thành phần hoá học của cây vải: trong áo hạt (tử y) ta thờng gọi là cùi
vải có chất đờng (chủ yếu là glucoza) 66%; protein 1,5%; chất béo 1,4%;
vitamin C (trung bình 40mg trong 100g dịch áo hạt); ngoài ra còn có các vitamin
A và B (2 loại vitamin này thờng chỉ thấy trong áo hạt tơi, khô thì thờng mất
đi); axit xitric.
Công dụng: cùi vải đợc dùng để ăn và làm thuốc. áo hạt có vị ngọt, chua,
tính bình hay ôn, không có độc, có tác dụng nuôi huyết, làm hết phiền khát, tiêu
thũng, chữa những bệnh mụn nhọt. Hạt vải (lệ chi hạch) cũng là một vị thuốc
đợc dùng từ lâu đời và theo đông y thì lệ chi hạch có vị ngọt, chát, tính ôn,
không có độc, có tác dụng tán hàn, thấp kết khí, là thuốc chữa âm nang sng đau
(thoát vị), chữa ỉa chảy ở trẻ con. Ngoài ra ngời ta còn dùng hoa, vỏ thân và rễ
của cây Vải sắc lấy nớc súc miệng chữa bệnh viêm họng, đau răng. Hạt vải

chữa đau dạ dày, ruột non, đau tinh hoàn (sắc uống ngày 6 -10g/ngày); vỏ quả
vải chữa đau bụng đi ngoài; lá vải dùng trị các vết cắn của động vật.
1.2. Cây Nhn cùi
Cây Nhãn cùi có tên khoa học là Dimocarpus longan Lour thuộc họ bồ
hòn Sapindaceae l cây ăn quả lâu năm, đợc trồng và mọc hoang ở khắp nơi
trong nớc ta: Hng yên, Phú thọ, Vĩnh phú, Nghệ an Cây nhãn cao 5 -12m,

7
thân gỗ to, cứng, vỏ xù xì, nhiều cành, nhiều lá um tùm, quanh năm xanh tốt. Lá
kép lông chim, mọc so le, gồm 5 -9 lá chét, dài 7 -9 cm, rộng 2-4 cm, hình bầu
dục dài, mép nhăn. Hoa nhỏ mọc thành chùm, màu vàng nhạt. Mùa hoa tháng 3-
4. Cây trồng từ 4 5 năm thì có quả, mùa quả thờng từ tháng 7 10; quả to
bằng hòn bi, hay hơn (đờng kính có khi tới 3 cm), vỏ ngoài hơi nháp, trong có
áo hạt mọng bao, bọc một hạt đen nhánh bên trong.
Thành phần hoá học : cùi nhãn tơi có các thành phần sau %: nớc 77%;
chất béo 0,13 %; protein 1,47%; hợp chất có chứa ni tơ tan trong nớc 20,55%;
ngoài ra còn có các vitamin A và B. Cùi nhãn khô chứa nớc 0,85%; chất tan
trong nớc 79,77%; chất không tan 19,39% ; tro 3,36%. Trong phần tan trong
nớc có chứa glucose 26,91%, saccharose 0,22; hợp chất có ni tơ 6,309%. Hạt
nhãn chứa tinh bột, saponin, chất béo và tanin. Lá nhãn có chứa quercetin,
quercetrin, tanin.
Cụng dng: theo y hc c truyn qu nhón cho cựi n hoc em ch bin
thnh long nhón; cựi nhón dung cha trớ nh suy gim hay quờn, mt ng, thn
kinh suy nhc, yu gan, t kộm, mỏu xu, rong kinh, suy nhc c th; lỏ nhón
nga si, cm l
nh, st rột, viờm rut, tr mt s bnh ngoi da, cha bnh v
thn; v cõy v v qu dựng cha bng, au rng (t tỏn thnh bt hay nu cao
dựng); ht qu tr au d dy, thoỏt v, mn nht, bng, chy mỏu (dựng ung
hoc bụi ngoi). R thng dựng cha dng chp niu, bch i, thng
phong.

Các kết quả nghiên cứu của dự án Khảo sát một số loại cây cỏ giàu
Flavonoit có hoạt tính chống oxy hoá - antioxydant cao để định hớng khai thác
làm thuốc phòng chữa bệnh do các cán bộ của Viện Nghiên cứu, Đào tạo và T
vấn khoa học công nghệ thực hiện, nghiệm thu năm 2006 đã cho thấy trong lá
Vải và lá Nhãn tích luỹ khá nhiều các hợp chất Polyphenol, trong đó hàm lợng
các hợp chất Flavonoit chiếm một tỷ lệ tơng đối cao; các chế phẩm Flavonoit
này có hoạt tính chống oxy hoá (HTCO) rất tốt là tiêu chuẩn cần thiết đối với
một hoạt chất tự nhiên có hoạt tính sinh dợc.
1.3. Nhóm hợp chất Flavonoit
Flavonoit là một nhóm hợp chất polyphenol, đa dạng về cấu trúc hóa học
và tác dụng sinh học. Chúng có hầu hết ở các bộ phận của cây, đặc biệt trong các

8
tế bào thực vật quang hợp. Các Flavonoit không đợc tổng hợp ở ngời và động
vật; chúng đợc tìm thấy ở động vật là do động vật ăn thực vật mà có.
-Flavonoit đợc cấu tạo bởi khung cacbon C
6
-C
3
-C
6
, gồm 2 vòng Benzen
(vòng A và B) và một vòng pyron (vòng C); trong đó vòng A kết hợp với vòng C
tạo thành khung Chroman.

OH
H O
o
O
A C

B
1
2
3
4
5
6
7
8
1'
2'
3'
4'
5'
6'

Khung cacbon của Flavonoit
-Trong thực vật Flavonoit tồn tại ở 2 dạng: dạng tự do (gọi là aglycon) và dạng
liên kết với đờng (glycozit). Các glycozit khi bị thủy phân bằng axit hoặc
enzym sẽ giải phóng ra đờng và aglycon. Tùy theo mức độ oxy hóa của mạch 3
cacbon, sự có mặt hay không của nối đôi giữa C
2
- C
3
và nhóm cacbonyl ở C
4
mà
phân loại các aglycon của Flavonoit thành các nhóm phụ sau:
+Flavon, Flavonol, Flavanon, Flavanonol, Catechin, Leucoanthoxyanidin,

Anthoxyanidin, Chalcon, Auron.
+Ngoài ra còn có các dẫn xuất
Izoflavonoit (vòng B nối với vòng C ở vị trí C
3
)
Neoflavonoit (vòng B nối với vòng C ở vị trí C
4

Biflavonoit (2 phân tử Flavonoit liên kết với nhau).
-Mỗi vòng A, B, C của phân tử Flavonoit đều có mức độ hydroxyl hóa, methoxyl
hóa khác nhau; vì vậy hoạt tính sinh hóa của các Flavonoit và các chất chuyển
hóa của chúng phụ thuộc vào cấu trúc hóa học và sự định hớng của các phần tử
khác nhau trên phân tử. Cấu trúc của các Flavonoit là nền tảng của nhiều giả
thuyết về tác động sinh lý của chúng.
1.3.1. Tính chất hoá học
Flavonoit đa dạng về cấu trúc hoá học, vì vậy khả năng phản ứng hoá học
của chúng rất lớn. Hoá tính của flavonoit phụ thuộc vào nhiều yếu tố: các nhóm
hydroxyl, nhóm cacbonyl, nối đôi C
2
- C
3
, sự có mặt và vị trí các nhóm thế trong
phân tử. Cấu trúc lập thể cũng quyết định rất lớn tính chất hoá học của chúng.

9
Khả năng tham gia nhiều phản ứng đặc hiệu đã tạo nên hoạt tính sinh học đa
dạng của lớp chất này.
Flavonoit là một polyphenol, do đó chúng có đủ các tính chất hoá học của
phenol, ngoài ra, chúng còn có thêm một số tính chất do cấu tạo đặc thù tạo nên.
* Phản ứng của nhóm hydroxyl (OH)

-Phản ứng oxy hoá
-Phản ứng với kiềm
-Khả năng tạo các liên kết hydro
-Phản ứng este hoá
* Các phản ứng của vòng thơm
-Phản ứng thế
-Phản ứng diazo và azo hoá
*Phản ứng của nhóm cacbonyl
-Phản ứng Shinoda (phản ứng shinoda đặc trng cho các nhóm flavonoit
có nhóm cacbonyl ở vị trí C
4
)
-Phản ứng tạo phức với kim loại
Các flavonoit có nhóm cacbonyl ở vị trí C
4
và nhóm hydroxyl ở vị trí C
3

hoặc C
5
đều dễ tạo phức với kim loại.
Flavonoit có hai nhóm hydroxyl ở vị trí C
3'
và C
4'
cũng tạo phức với kim
loại
Tính hoạt động hóa học cao của các Flavonoit biểu hiện ở ái lực khi kết
hợp với các Polymer sinh học, các ion kim loại nặng cũng nh khả năng xúc tác
cho sự vận chuyển điện tử và bẫy các gốc tự do (Antioxydant). Những Flavonoit

có hoạt tính sinh học đợc gọi là Bioflavonoit.

Dới đây là một số dẫn liệu về tác dụng sinh - dợc học tiêu biểu của
Flavonoit đã đợc công bố trên các kênh thông tin quốc tế (sách chuyên ngành,
tạp chí, hội nghị ).
1.3.2. Hoạt tính sinh học của Flavonoit

(1). Tác dụng chống oxy hóa (antioxydant)
Một trong những cơ sở sinh hóa quan trọng nhất để Flavonoit thể hiện
đợc hoạt tính sinh học của chúng là khả năng kìm hãm các quá trình oxy hóa

10
dây chuyền sinh ra bởi các gốc tự do hoạt động. Hoạt tính này thể hiện mạnh hay
yếu phụ thuộc vào đặc điểm cấu tạo hóa học của từng chất Flavonoit cụ thể.
Bình thờng các gốc superoxyt (

2
O ) đợc sinh ra trong quá trình hô hấp
tế bào chuyển thành nớc (H
2
O) theo phản ứng của các enzym superoxyt
dismutaza (SOD), catalaza hoặc glutathion peroxydaza. Từ anion gốc superoxyt
(O
2

-
) đợc sinh ra ban đầu sẽ sản sinh ra hàng loạt gốc:
1
O
2

,

OH, và các gốc
tự do khác. Các gốc này đợc gọi là các dạng oxy hoạt động: chúng ít bền và có
khả năng phản ứng rất lớn, là thủ phạm gây bệnh tật. Phản ứng của gốc tự do là
nguyên nhân sinh ra quá trình peroxy hóa các chất hữu cơ. Các gốc

OH và oxy
đơn bội
1
O
2
thờng là tác nhân khơi mào phản ứng. Tiếp đó các gốc thứ cấp phản
ứng với các phân tử mới khác ở gần tạo ra phản ứng dây chuyền , cứ thế nhân
mãi lên, không dừng lại và kéo dài cho tới khi tiêu tốn hết cơ chất (không có
enzym tham gia) ứng với thời kỳ này, các cơ quan tổ chức bị phá hoại nghiêm
trọng, gây nên những biến đổi bệnh lý nh ung th, hoại tử, rối loạn chuyển
hóa Đến giai đoạn dập tắt mạch, các gốc phản ứng với nhau tạo ra những sản
phẩm bền, trung tính.
Thí dụ: R
1
+ R
1


R
1
-R
1
Hậu quả là xảy ra quá trình polyme hóa. Thí dụ, ở ngời già, các tổ chức

bị xơ chai, không mềm mại, bởi vì phản ứng gốc tự do đã làm cho các gốc liên
hợp lại với nhau. Nh vậy, sự tăng số lợng các gốc tự do hoạt động trong tế bào
làm cho các phân tử sinh học bị biến đổi, những protein bất thờng xuất hiện
trong cơ thể, đó là nguyên nhân phát sinh nhiều bệnh nguy hiểm và sự già của cơ
thể.
Ngoài các gốc tự do sinh ra trong quá trình sinh lý bình thờng, cơ thể còn
bị ảnh hởng của các dạng oxy hoạt động phát sinh bởi các yếu tố từ bên ngoài
nh tia phóng xạ, tia cực tím, bức xạ mặt trời, thuốc trừ sâu diệt cỏ, các chất
nitro hữu cơ, các phẩm nhuộm, các chất độc hớng gan nh CCl
4
, hydrocacbon
đa vòng, các chất màu azo, các stress
Các gốc tự do độc hại lại liên quan đến nhiều bệnh hiểm nghèo nh bệnh
tim mạch, ung th, thần kinh, thoái hoá, lão hoá, rối loạn chuyển hoá cơ bản



11

Những trạng tháI bệnh lý chính liên
quan đến Gốc tự do

Để chống lại tác hại gây ra bởi các gốc tự do đó, mỗi cơ thể sống có
những hệ thống chống oxy hóa nội sinh, ngoài ra còn có những chất antioxydant
khác đợc đa vào cơ thể theo dạng thức ăn, thức uống Ngày nay, nhiều nhà
hóa - sinh học cho rằng Flavonoit là chất antioxydant lý tởng đối với con ngời.
Do bản chất cấu tạo polyphenol nên Flavonoit ở trong tế bào thực vật hoặc
trong cơ thể động vật và ngời chịu tác động của các biến đổi oxy hóa- khử, bị
oxy hóa từng bớc và tồn tại ở các dạng hydroquinon, semiquinon, quinon.
Những Flavonoit có các nhóm hydroxyl sắp xếp ở vị trí ortho dễ dàng bị oxy hóa
Tim
Nhi mỏu
Tiờu cc nghn mch
Bnh c tim
Nóo
Sc
Parkinson
X cng ct bờn teo c
Alzh

e
im
e
r

Phi
Hen
Hi chng suy hụ hp
ngi trng thnh
Thn
Ghộp thn
Suy

t
h

n m
ó
n
a ph tng
Viờn ty
Ng c
Bi tớch st
Ung th
AIDS
Lóo hoỏ
Nghin ru
ỏi thỏo ng
Mt

c thu tinh th
Bnh vừng mc
Thoỏi hoỏ im vng
Khp
Tờ thp
Th thao
Mch

Va x
Tng huyt ỏp
Stress oxy
hoỏ gc t do
Rut
Viờm tu
Loột
Bnh Crohn
Thiu mỏu cc b
X nang tu
Da
Bng
Lóo hoỏ
Vy nn
U
n
g

t
h

Hng cu

Thiu mỏu
St rột

12
dới tác dụng của các enzym polyphenoloxydaza và peroxydaza có trong tế bào
động, thực vật; phản ứng nh sau:
1. O
2
+ Flavonoit (khử)







xydazapolyphenol
Flavonoit (bị oxy hóa) + H
2
O
(Hydroquinon) (Semiquinon hoặc Quinon)
2. H
2
O
2
+ Flavonoit (khử)

peroxydaza
Flavonoit (dạng bị oxy hóa) + H
2
O
(Hydroquinon) (Semiquinon hoặc Quinon)
Semiquinon hoặc quinon là những gốc tự do bền vững, có thể nhận điện tử
và hydro từ những chất cho khác nhau để trở lại dạng hydroquinon. Các chất này
có khả năng phản ứng với các gốc tự do hoạt động để triệt tiêu chúng.
Nh vậy, khi đa Flavonoit vào cơ thể sẽ sinh ra gốc tự do bền vững hơn
các gốc tự do đợc hình thành trong quá trình bệnh lý (viêm nhiễm, ung th, lão
hóa ), chúng có khả năng giải tỏa các điện tử trên mạch vòng của nhân thơm và
hệ thống nối đôi liên hợp, làm triệt tiêu các gốc tự do hoạt động. Các gốc tự do
tạo nên bởi Flavonoit phản ứng với các gốc tự do hoạt động và trung hòa chúng
nên không tham gia vào dây chuyền phản ứng oxy hóa tiếp theo. Vì vậy
Flavonoit đợc gọi là "Những tác nhân thu dọn và hủy diệt" các gốc tự do độc
hại.
Ngoài cơ chế trên, Flavonoit còn kìm hãm sự phát sinh các gốc tự do hoạt
động do có khả năng tạo phức với các ion kim loại chuyển tiếp nh Fe
++
, Cu
++

để chúng không thể xúc tác cho phản ứng Fenton sinh ra các gốc hoạt động nh

OH,
1
O
2

.
Khi phân tích mối liên hệ giữa cấu trúc Flavonoit và hoạt tính chống oxy
hóa, ngời ta thấy rằng các phân tử Flavonoit với nhiều nhóm hydroxyl ở vòng A
và B, có nối đôi ở vị trí C
2
= C
3
, có nhóm hydroxyl tự do ở vị trí C
3
và nhóm bán
xeto ở vị trí C
4
thờng thể hiện đặc tính chống oxy hóa mạnh.
(2). Tác dụng đối với enzym
Các Flavonoit có khả năng tác động đến hoạt động của nhiều hệ enzym
động vật trong các điều kiện in vitro và in vivo. Khả năng tơng tác với protein
là một trong những tính chất quan trọng nhất của các hợp chất phenol, quyết
định hoạt tính sinh học của chúng. Phản ứng xảy ra giữa nhóm oxyphenolic và
oxycacbonyl của các nhóm peptit để tạo thành liên kết hydro.


13




(3). Tác dụng kháng sinh, chống viêm nhiễm
Tác dụng chống viêm nhiễm và kháng khuẩn của Flavonoit đã đợc nhiều
công trình nghiên cứu trên thế giới chứng minh. Một số tác giả nghiên cứu tác dụng
của 24 anthoxyanin, leucoanthoxyanin và axit phenolic lên Salmonella (vi khuẩn

thơng hàn) và thấy có tác dụng kìm hãm rõ rệt. Hầu hết các chất này đều có khả
năng kìm hãm sự hô hấp hay phân chia của vi khuẩn khi có mặt glucoza. Tác
dụng kháng virut của Flavonoit cũng đã đợc khẳng định; Chang-Qi Hu và cộng
sự đã nghiên cứu khả năng ức chế virut HIV ở các tế bào H9 của 35 Flavonoit
chiết xuất từ thực vật và tổng hợp - đã thấy rằng các hợp chất có nối đôi ở vị trí
C
2
= C
3
và có nhóm OH ở C
6
và C
4
thể hiện hoạt tính cao hơn.
Cơ chế tác dụng kháng sinh của Flavonoit còn rất ít đợc nghiên cứu, các
tác giả đa ra một số giả thuyết sau:
- Flavonoit ức chế enzym transpeptidaza làm cho mucopeptit - yếu tố đảm bảo
cho thành tế bào vi khuẩn vững chắc không tổng hợp đợc.
- Gắn lên màng bào tơng của vi khuẩn, làm thay đổi tính thấm chọn lọc của
màng nguyên sinh chất. Vì vậy làm một số chất cần thiết cho đời sống vi khuẩn
nh nucleotit, pyrimidin, purin lọt qua màng bào tơng ra ngoài.
-Tác động lên quá trình tổng hợp protein của vi khuẩn theo 2 kiểu: phong bế
mạch peptit của vi khuẩn bằng cách phong bế enzym transferaza chuyển axit
amin từ ARN vào mạch làm mạch không kéo dài thêm đợc hoặc tạo ra protein
bất thờng vô dụng với đời sống của vi khuẩn làm chúng không sử dụng đợc.
- ức chế tổng hợp axit nucleic.
- Flavonoit có thể tác động vào ADN khuôn, ức chế tổng hợp ARN của vi khuẩn.
(4). Tác dụng đối với các bệnh tim mạch
Tác động bảo vệ của các Flavonoit đối với tim mạch có thể do khả năng
của chúng trong việc ngăn ngừa sự oxy hóa các lipoprotein tỷ trọng thấp, phòng

ngừa sơ vữa động mạch, chặn sự kết tụ huyết khối, điều hòa nhịp tim, ngăn ngừa
bệnh mạch vành và nhồi máu cơ tim, điều hòa huyết áp
O H CO R
NH

14
Các Flavonoit có tác dụng làm bền thành mạch tơng đơng với hoạt tính
vitamin P. Năm 1936, Szent Gyorgy và cộng sự đã tìm thấy một số dấu hiệu của
bệnh chảy máu và vitamin C đơn thuần không cầm đợc, nhng lại đợc chữa
khỏi bằng nớc chanh. Szent Gyorgy đã tách chiết chất này và đặt tên là citrin.
Đó là một hỗn hợp các dẫn xuất Flavonoit; chúng không tác dụng lên bệnh
Scocbut nhng có tác dụng trên thành mạch. Về sau, chất citrin này đợc đặt tên
là Vitamin P (Vitamin de Permiabilite). Lavollay, Neumann, Porrot đã chứng
minh: catechin có tác dụng mạnh hơn vitamin C trong việc giữ bền thành mạch.
Tiếp sau đó, các tác giả phát hiện rằng vitamin P là tập hợp của nhiều loại sắc tố
thực vật gốc Flavonoit. Đại diện điển hình là catechin và leucoanthoxyan, rồi đến
Flavonol (rutin, quercetin), flavanon (hesperidin) và một số chalcon Những
Flavonoit trên có tác dụng làm tăng sức bền và tính đàn hồi của thành mao mạch,
chủ yếu là do khả năng điều hòa, làm giảm tính thấm mao mạch, ngăn cản
không cho protein của máu thẩm dịch qua các mô khác; có tác dụng dự phòng vỡ
mao mạch, gây xuất huyết, gây phù thũng.
(5). Tác dụng bảo vệ gan
Tính chất chống oxy hoá của Flavonoit đóng vai trò rất quan trọng trong
sự ngăn chặn quá trình huỷ hoại cấu trúc và chức năng của gan trong nhiều trạng
thái bệnh lý, làm tăng nhanh quá trình tái sinh và phục hồi chức năng của tế bào
gan. Flavonoit đóng vai trò chủ yếu trong những liệu pháp phức tạp để điều trị
viêm gan cấp và mạn tính, sơ gan.
Trong y văn, có rất nhiều tài liệu nghiên cứu hoạt tính bảo vệ gan của một
Flavolignan là cilibinin (cilimarin) trong những mô hình bệnh lý thực nghiệm.
Chất này ngăn cản sự peroxi hoá lipit màng tế bào gan, ngăn cản sự tạo thành

quá thừa các axit béo và cholesteron, tăng cờng quá trình sửa chữa các sai lệch,
loại trừ tác dụng ức chế của galactosamin trong sự tổng hợp protein của
microsom và glycoprotein của gan, và đẩy nhanh quá trình acetyl hoá chất này.
Trong trờng hợp viêm gan ở chuột tạo nên bởi CCl
4
, cilibinin ngăn cản sự tích
luỹ trong gan các hợp chất dien liên hợp maloyl dialdehyd và các base Schifs,
làm hoạt hoá hệ thống oxy hoá tự nhiên của gan và ổn định màng các vi thể.
Trong viêm gan chuột do CCl
4
, chế phẩm convaflavin (flavonoit toàn phần
của cây huệ chuông Convallaria majalis L), chế phẩm caleflon (hỗn hợp các
polyphenol của cây xu xi Calendula officinalis L) tỏ ra có tác dụng tốt. Cơ chế

15
tác dụng của các chế phẩm đó là sự điều hoà sinh tổng hợp glycogen, điều hoà
chuyển hoá lipit và điều hoà hoạt độ các enzyme của gan.
Khi nghiên cứu so sánh tác dụng bảo vệ gan của các chế phẩm Flavonoit:
liquiriton, ascortin, quercetin và cả bột hoa cây dâm bụt giấm (Hibiscus
sabdarifla L) mà thành phần chủ yếu là các glycoside cyanidin và đelfinidin và
các Flavonoit: quercetin, hibiscin, myricitin, gossipetin, gossipetrin, sapdaretin,
hibiscetin. Trên mô hình viêm gan chuột do CCl
4
, ngời ta thấy có sự khác nhau
rõ rệt giữa tác dụng của các chế phẩm đó qua các chỉ tiêu: hàm lợng các lipid
trong máu, sự đọng lipit ở tổ chức gan và sự huỷ hoại tế bào ở gan. Về chỉ tiêu hạ
thấp hoạt độ aminotransferase và hàm lợng lipit trong huyết tơng và trong gan
thì từng chế phẩm nói trên đều không thua kém cilimarin. Điều đó nói lên là với
mục đích điều trị, điều trị hợp lý là không dùng riêng từng Flavonoit mà là dùng
hỗn hợp nhiều Flavonoit một lúc.

(6). Tác dụng đối với ung th
Các nghiên cứu trên động vật thực nghiệm và các số liệu dịch tễ đã chỉ ra
rằng các nhân tố thức ăn đóng một vai trò quan trọng đối với sức khỏe động vật
và con ngời liên quan tới sự phát triển của một số bệnh kể cả ung th. Quả và
rau tơi giàu vitamin A, C, E, - caroten, Flavonoit và các thành phần khác đã
đợc nghiên cứu nh các nhân tố ngăn ngừa ung th. Nhiều mô hình tế bào nuôi
cấy và động vật thực nghiệm đã chỉ ra rằng hoạt tính chống ung th mạnh của
một số polyphenol gián tiếp thông qua một số cơ chế khác nhau. Khi đa ra một
số chất Flavonoit vào vật chủ mang khối u thì ngời ta thấy chúng có tác dụng
nh những tác nhân hóa trị liệu nhng hầu nh không độc hại (với liều lợng xác
định). Các chất này có tác dụng kìm hãm các enzym oxy hóa khử, kìm hãm quá
trình glycolyse và hô hấp, kìm hãm quá trình giảm phân, hạn chế sự phá vỡ cân
bằng của các quá trình trao đổi chất bình thờng trong tế bào.
L.B. Kukushkina và cộng sự đã thử nghiệm dùng chất ionol và propylgalat
điều trị cho chuột gây ung th báng nớc và ung th gan bằng chủng tế bào ung
th 22a. Phơng pháp điều trị bằng cách cho uống và tiêm trực tiếp thuốc vào
khoang bụng. Kết quả đợc đánh giá thông qua theo dõi lâm sàng và phơng
pháp đánh dấu L- C
14
aminoaxit để theo dõi quá trình tổng hợp protein. Dung
dịch Serrer và Darell đợc dùng để nghiên cứu ARN từ những tế bào u báng. Kết

16
quả chứng minh khả năng kìm hãm sự phát triển của khối u phụ thuộc nồng độ
thuốc. Sự phụ thuộc ấy liên quan chặt chẽ với hiệu lực kìm hãm tổng hợp protein
và ARN ở tế bào u.
Các công trình nghiên cứu của Racker và cộng sự cho biết các tế bào ác
tính gây bởi virut (kiểu Rous sarcoma virus) có liên quan đến tác dụng của các
kinaza. Khi ủ các tế bào ung th nuôi cấy với Flavonoit, các tế bào ác tính trở lại
thành các tế bào bình thờng do Flavonoit đã làm thay đổi hoạt tính của các

kinaza.
Với nỗ lực nhằm nghiên cứu khả năng chống ung th của các hợp chất
Flavonoit, gần đây nhiều tác giả trên thế giới đã tiếp tục thử nghiệm tác dụng in
vitro và in vivo của Flavonoit lên các dòng tế bào ung th khác nhau, Dyung-Zun
Ahn và Gyn-Yong Song đã nghiên cứu tác dụng của 46 flavon tổng hợp lên các
dòng tế bào ung th khác nhau và rút ra nhận xét các hợp chất 2'-benzyloxy-5
metoxyflavon, 2'-benzoloxy - 5,7-dimetoxyflavon, 2'-benzyloxy - 5,7,8 -
trimetoxyflavon, 2'-benzyloxy - 5 hydroxyflavon thể hiện tính gây độc tế bào
đối với dòng tế bào LI 210 và HL- 60. Tác dụng chống khối u gây bởi dòng tế
bào ung th S -180 trên chuột đối với 5'2'-dihydroxy - 6, 7, 8, 6' -
tetrametoxyflavon chiết xuất từ Scutellaria baicallensis đã đợc chứng minh bởi
B. Ahnn và cộng sự
.
(7). Tác dụng đối với chuyển hóa và trên lâm sàng
Các Flavonoit đợc hấp thụ theo đờng dạ dày - ruột ở ngời và động vật,
và đợc bài tiết nguyên dạng hoặc dới dạng chất chuyển hóa của chúng qua
nớc tiểu và phân. Một vài Flavonoit dạng glycozit bị deglycosyl hóa bởi các
enzym trong các loại mô của ngời trong khi các chất còn lại không bị biến đổi.
Tốc độ và phạm vi deglycosyl hóa phụ thuộc vào cấu trúc Flavonoit và vị trí, bản
chất của gốc đờng bị thay thế. Phép đo khả năng chống oxy hóa của huyết
tơng và nớc tiểu sau khi tiêu hóa. Chè xanh đã cho thấy sự hấp thụ các chất
oxy hóa trong chè xanh diễn ra nhanh, các chất chống oxy hóa đi vào vòng tuần
hoàn ngay sau khi uống vào làm cho lợng chất chống oxy hóa trong huyết
tơng tăng lên đáng kể. Benzie và cs (1999) đã cho thấy rằng sự tăng hàm lợng
Flavonoit chè xanh trong huyết tơng có thể làm giảm sự thiệt hại do oxy hóa
gây ra và vì thế làm giảm nguy cơ mắc ung th.

17
Các Flavonoit có tác động sâu sắc lên chức năng của các tế bào miễn dịch
và tế bào viêm. Trongcác nghiên cứu trên động vật hai este methyl EGCG tách

chiết từ Chè ôlong gây kìm hãm đáng kể lên các phản ứng dị ứng trên chuột.
Gaby (1998) đã chỉ ra rằng quercetin có thể có giá trị trong điều trị hen suyễn và
tốt cho các bệnh nhân tiểu đờng và nhiễm HIV (human immunodeficiency
virus). Flavonoit baicalin trong các nghiên cứu gần đây cho thấy có hoạt tính
chống viêm và chống HIV - 1 theo cơ chế gây cản trở sự tơng tác giữa các
protein vỏ của HIV-1 với các receptor và ngăn chặn HIV-1 tấn công vào các tế
bào đích.
(8). Một số ứng dụng của bioFlavonoit trong y học
- Bảo vệ thnh mạch, phòng chống nguy cơ chảy máu
- Chống dị ứng
- Chống viêm loét, kháng khuẩn
- Điều trị các bệnh gan, mật
- Phòng và chữa một số bệnh liên quan đến chuyển hoá
- Bệnh tim mạch: huyết áp, cholesterol và triglyxerol trong máu cao, điều
hoà nhịp tim, điều hoà chuyển hoá canxi
- Một số bệnh liên quan đến nội tiết và điều hoà cân bằng sinh học của cơ
thể
- Hỗ trợ cơ thể khi dùng nhiều kháng sinh hoặc sống trong môi trờng có
nhiều bức xạ ion
- Miễn dịch: kích thích lympho bào sản xuất interferon, chống virut xâm
nhập vào cơ thể và kìm hãm sự nhân lên của virut
- Giảm đau do tác dụng chống co thắt, giãn cơ trơn. Làm giảm các đám
xuất huyết nhỏ trong bệnh đái đờng.
- Một số Flavonoit có tác dụng chống khối u lành và ác tính
- Làm tăng tạo máu do làm tăng tổng hợp axit folic của vi khuẩn đờng
ruột, tăng số lợng hồng cầu và tỷ lệ hemoglobin
- Loại trừ rối loạn thần kinh cơ do thiếu vitamin C

Với cơ sở sinh học trên, nhiều chất Flavonoit đợc sử dụng nh những
chế phẩm thuốc đặc trị cho một số bệnh và đợc thế giới công nhận là một

trong những hợp chất tự nhiên có tác dụng làm chậm sự hoá già của cơ thể
và chống đột biến tế bào.
1.4. Một số công trình nghiên cứu trong nớc về flavonoit
Việt Nam có thảm thực vật nhiệt đới phong phú về chủng loại, có điều
kiện sinh thái thuận lợi (nhiều ánh nắng) cho quá trình sinh tổng hợp các chất
Flavonoit. Đấy là nguồn tài nguyên vô cùng lớn lao cần đợc nghiên cứu khai

18
thác để phục vụ dân sinh và phát triển kinh tế - xã hội. ở nớc ta việc nghiên cứu về
các hợp chất Bioflavonoit còn rất ít; chỉ những năm gần đây mới xuất hiện một số công
trình nghiên cứu của trờng Đại học Dợc Hà Nội, Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại
học Quốc gia Hà Nội, Viện Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên, Viện Dợc liệu, Viện
Y học Cổ truyền, Viện Nghiên cứu Đào tạo và T vấn KHCN (thuộc Liên hiệp hội)
Tuy nhiên, các nghiên cứu còn lẻ tẻ cha có hệ thống; Các nhà nghiên cứu và sản xuất
cha quan tâm đúng mức đến giá trị và tầm quan trọng của việc nghiên cứu khai thác
nhóm chất này từ thiên nhiên để phục vụ tích cực cho đời sống cộng đồng (có thể sử
dụng Flavonoit trong nhiều lĩnh vực nh y - dợc, thực phẩm, mỹ phẩm, hóa công
nghiệp).
-Công trình nghiên cứu của Vũ Quỳnh Trang, Trần Thị Long và Nguyễn Quốc Khang
(Đại học Khoa học Tự Nhiên) đã chiết xuất thu các chế phẩm Polyphenol, Flavonoit,
Alkaloit của lá cam canh vùng đồng bằng và vùng đồi. Tiến hành khảo sát tác dụng
kháng khuẩn của các chế phẩm này trên 7 chủng vi sinh vật kiểm nghiệm các kết quả
thu đợc bớc đầu cho thấy: các chế phẩm đều thể hiện hoạt tính kháng khuẩn tốt, và
thể hiện hoạt tính mạnh nhất đối với Shigella flexneri, yếu nhất đối với Escherichia.
Coli (Báo cáo hội nghị khoa học Hoá Sinh Y Dợc năm 2006)
-Công trình nghiên cứu của Hà Thị Thanh Bình, Nguyễn Quốc Khang (2002) đã khảo
sát tác dụng hạn chế sự phát triển ung th cơ đùi chuột bởi dòng tế bào ung th S-180
của chế phẩm Flavonoit từ lá chè Tân Cơng (Tạp chí Dợc học, số 8, tr 23-24/30).
Tác nhân gây bệnh là chủng tế bào ung th Sarcoma - 180. Kết quả cho thấy có sự hạn
chế phát triển u đùi, hạn chế di căn ung th tới gan và phổi rõ ràng.

-Các nghiên cứu (2006) của Trần Thị Thanh Hơng (Viện 69 Bộ t lệnh Lăng) và
Nguyễn Thị Hà, Tạ Thành Văn (Bộ môn Hóa Hóa Sinh ĐH Y HN) cho thấy: bột
chiết polyphenol và Flavonoit (EGCG) chè xanh có tác dụng ức chế sự phát triển tế bào
của dòng tế bào ung th phổi LU-1 và dòng tế bào ung th gan Hep G2, tác dụng rõ
nhất trên dòng LU 1 với giá trị IC50 là 3,84
àM của EGCG chè xanh. Bớc đầu phát
hiện sự tăng hoạt độ của enzym caspase 3 trên dòng tế bào LU -1 đợc bổ sung
EGCG chè xanh vào môi trờng nuôi cấy

- Năm 2006 nhóm cán bộ khoa học của Viện Nghiên cứu, Đào tạo và T vấn Khoa học
Công nghệ đã nghiên cứu thành công đề tài "Khảo sát một số loại cây cỏ giàu
Flavonoit có hoạt tính chống oxy hóa (antioxydant) cao để định hớng khai thác
làm thuốc phòng chữa bệnh" (đề tài cấp Bộ - Liên hiệp hội); Các tác giả đã nghiên
cứu có hệ thống về thành phần Flavonoit ở 48 loài cây; định tính, định lợng, chiết
xuất, dùng các phơng pháp sắc ký và quang phổ để phân tích Flavonoit, xác định đặc
điểm Flavonoit đặc trng của từng loài; sử dụng phơng pháp invitro và invivo trên
động vật thực nghiệm để đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của Flavonoit từng cây
nghiên cứu, trên cơ sở đó đã chọn ra 10 loại có triển vọng nhất, trong đó có lá vải và lá
nhn.
c bit lá Vải và lá Nhãn lá những đối tợng đặc biệt giàu Flavonoit, có nguồn
nguyên liệu lớn có thể khai thác trên quy mô rộng và là đối tợng nghiên cứu còn khá
mới mẻ.

19
2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.1. Đối tượng thực vật
Đối tượng thực vật dùng để nghiên cứu trong đề tài:
- Cây Nhãn cùi (Dimocarpus Longan Luor): bộ phận sử dụng là lá bánh tẻ. Thu
hái vào tháng 8- 10, tại Hải Dương.

- Cây Vải
thiều (Litchi Chinensis Sonn): bộ phận sử dụng là lá bánh tẻ. Thu hái
vào tháng 5 – 7, tại Lục Ngạn - Bắc Giang.
Mẫu được thu hái vào các thời điểm thích hợp với từng loại cây, sau đó
được sấy khô ở 60
0
C và tán nhỏ mẫu thu bột nguyên liệu và bảo quản trong lọ
đựng mẫu kín.
Cây Vải thiều – Litchi chinensis Sonn
Cây Nhãn cùi – Dimocarpus longan Luor
2.1.2 Đối tượng động vật
a. Máu người: máu tươi toàn phần của người khoẻ mạnh được chống đông bằng
ADC do khoa huyết học của bệnh viện Việt - Đức cung cấp. Dùng cả 4 nhóm
máu A, B, AB, O.
b. Động vật
- Chuột nhắt trắng Swiss: do Viện Vệ sịnh d
ịch tễ cung cấp, 6 tuần tuổi, trọng
lượng từ 20 – 22 gam, trạng thái sinh lý bình thường.
- Các chủng Vi khuẩn kiểm định: do Viện Vệ sinh dịch tễ cung cấp

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

20
2.2.1 Chiết xuất và định lượng Flavonoit tổng số theo phương pháp của
B.C. Talli [20]
a. Qui trình chiết (B.C. Talli)
Tách chiết Flavonoit tổng số theo qui trình của B.C. Talli, các bước trong
qui trình được mô tả chi tiết dưới đây

Hình 1: Qui trình B.C. Talli

b. Định lượng Flavonoit tổng số
Chiết bằng Ethanol
96
0
trên máy siêu âm
Hoạt chất trong dịch chiết nước
Chiết bằng nước cất nóng
(chỉnh pH = 3 - 4)
Dịch chiết Ethylaxetat
Chiết bằng Ethylaxetat
Chiết bằng clorofooc
(loại tạp)
Bột nguyên liệu
Bột nguyên liệu sấy khô
Dịch chiết clorofooc
Dịch chiết Ethanol
Cô cạn ở áp suất giảm
Cao Ethanol
Cô cạn kiệt, áp suất giảm trên máy cất quay
Chế phẩm
Flavonoit ở dạng
b
ộ
t vô đ
ị

nh hình
Đông khô
Flavonoit
toàn phần
Dùng Ethanol 96
0
hoà tan
Chế phẩm Flavonoit hoà
tan trong Ethanol
(dùng
để n
g
hiên cứu
)


21
Cân chính xác 10g bột nguyên liệu, chiết bằng clorofooc trên máy siêu
âm; chiết trong 3 giờ để loại hết nhựa, chất béo, caroten và clorofooc. Lấy phần
bột nguyên liệu ra, sấy cho bay hết clorofooc rồi tiếp tục chiết bằng Ethanol 96
0

trên máy siêu âm đến khi dịch chiết không còn cho phản ứng Shinoda. Dịch
chiết Ethanol được xác định thể tích chính xác và bảo quản trong bình thuỷ tinh
màu nâu có nút nhám kín.
Lấy 50 ml dịch chiết Ethanol 96
0
đem cô cạn ở điều kiện áp suất thấp trên
máy cất quay chân không, sau đó chiết lại bằng nước cất nóng. Dịch chiết nước
sau khi đã lọc và chỉnh pH = 3 – 4 được cho vào phễu chiết, dùng Ethylaxetat

chiết nhiều lần, sau đó đuổi kiệt dung môi trên máy cất quay chân không tới
trọng lượng không đổi. Cân xác định trọng lượng Flavonoit tổng số.
Hàm lượng Flavonoit chứa trong mẫu phân tích được tính theo công thức:

X % = [(M
2
– M
1
) x V/v x 10] / 100
Trong đó:
V: thể tích dịch chiết Ethanol từ 10 g bột nguyên liệu
v: thể tích dịch chiết Ethanol lấy ra để định lượng (50 ml)
M
2
: trọng lượng khi cân cặn Flavonoit cả bì
M
1
: trọng lượng bì
Để định lượng, thí nghiệm được lặp lại 5 lần (n = 5), các kết quả được xử lý
thống kê.
2.2.2 Phân tích thành phần Flavonoit bằng sắc ký lớp mỏng, phổ quét và
quang phổ hấp phụ tử ngoại [ 6,13]
a. Sắc ký lớp mỏng
- Bản mỏng Silicagel F 254 của Merk
- Chạy sắc ký một chiều từ dưới lên với hệ dung môi triển khai TEAF
(Toluen: Ethylaxetat: Axeton: Axit Focmic = 5: 2: 2:1).
- Quan sát sắc ký đồ ở các điều ki
ện khác nhau như: ở ánh sáng tự nhiên;
phun các thuốc thử đặc trưng (FeCl
3

, NaOH, KOH, AlCl
3
, Willson, Diazo,
Vanillin, NH
4
OH ); quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 và 365 nm.
b. Đo phổ quét trên máy Shimazu CS – 9001 PC – Chromatogram (đo ở bước
sóng 270 nm)

22
c. Đo phổ tử ngoại trên máy Shimazu CS – 9001 PC – Spectrum (đo phổ liên
tục từ bước sóng 200 đến 400 nm)
2.2.3 Xác định hoạt độ peroxydaza trong máu theo E. C. Xavron [ 20]
-Dựa trên nguyên tắc: xác định tốc độ của phản ứng oxy hoá cơ chất
indigocarmin bởi H
2
O
2
trong môi trường axit yếu khi có sự tham gia của enzym
peroxydaza. Hoạt tính enzym peroxydaza được tính bằng thời gian phản ứng
oxy hóa indigocarmin. Thời gian càng nhanh hoạt tính enzym càng cao và
ngược lại. Hoạt tính enzym peroxydaza ở mẫu đối chứng (không có mẫu thử) là
100%, khi có mẫu thử hoạt tính enzym sẽ thay đổi. Nồng độ mẫu thử (trong thí
nghiệm này là chế phẩm Flavonoit) càng cao thì thời gian phản ứng càng kéo
dài, nghĩa là hoạt độ enzym bị giảm.Thí nghiệm được tiến hành trên cả 4 nhóm
máu O, A, B, AB với các n
ồng độ flavonoit thay đổi khác nhau.
- Nguyên liệu thí nghiệm:
Bốn nhóm máu (A, B, AB, O) người khoẻ mạnh, do khoa huyết học và
truyền máu - bệnh viện Việt Đức cung cấp.

Mẫu thử là các chế phẩm Flavonoit chiết xuất từ lá Vải và lá Nhãn.
2.2.4 Xác định hoạt tính chống oxy hóa in vitro của các chế phẩm flavonoit
thông qua quá trình peroxy hóa lipit tế bào gan chuột theo phương pháp
của C. G. Blagodorov và cộng sự [ 7, 10]
- Nguyên tắc: Bằng các thí nghiệm in vitro hoặc in vivo để đánh giá khả năng chống
oxy hoá của một chất nào đó thông qua quá trình peroxy hoá lipit tế bào gan chuột dựa
trên nguyên tắc: các gốc tự do của oxy sinh ra trong gan chuột là những tác nhân chính
gây ra phản ứng peroxy hóa các chất hữu cơ (chủ yếu là các axit béo chưa no ở màng
tế bào). Một trong những sản phẩm của quá trình này là dialdehyt malonyl (DAM).
Chất này phản ứng với axit thiobarbituric tạo ra phức có màu hồng bền ở λ =532 nm.
Đo cường độ màu của phức (OD) có thể biết lượng DAM sinh ra nhiều hay ít. Hoạt
tính chống oxy hóa (HTCO) là tỷ lệ % lượng DAM giảm đi ở mẫu thử so với mẫu đối
chứng. Thí nghiệm được tiến hành với các nồng độ Flavonoit khác nhau.
-Nguyên liệu động vật: Gan tươi của chuột nhắt trắng chủng Swiss khoẻ mạnh,
nặng 22 ± 2 g.