Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men bia mới và cải tiến quy trình công nghệ để sản xuất một số sản phẩm bia mới chất lượng cao

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CÔNG TY CỔ PHẦN BIA VÀ NGK HẠ LONG

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ ĐỔI MỚI CÔNG NGHỆ
DO DOANH NGHIỆP THỰC HIỆN THEO NGHỊ ĐỊNH 119/1999/NĐ-CP


BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI


NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CHỦNG NẤM MEN BIA MỚI VÀ CẢI TIẾN
QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ ĐỂ SẢN XUẤT MỘT SỐ SẢN PHẨM BIA
MỚI CHẤT LƯỢNG CAO
(MÃ SỐ ĐỀ TÀI: 04/2009)



Cơ quan chủ trì đề tài/dự án:
Công ty cổ phần Bia và nước giải khát Hạ Long
Chủ nhiệm đề tài/dự án:
KS. Vũ Thị Minh Châu





9188

Hạ Long - 2011


MỞ ĐẦU
Công ty cổ phần Bia và Nước giải khát Hạ Long là đơn vị nhiều năm kinh nghiệm
trong sản xuất bia với thương hiệu sản phẩm bia Hạ Long có uy tín tại tỉnh Quảng Ninh
và nhiều tỉnh lân cận. Công ty đã nhiều năm kết hợp với Viện Công nghiệp Thực phẩm
trong việc nghiên cứu và triển khai các tiến bộ khoa học kỹ thuật nhằm duy trì chất lượng
bia luôn
ổn định để đáp ứng được nhu cầu thị trường nhằm mang lại sư phát triển bền
vững cho doanh nghiệp và đảm bảo công ăn việc làm cho người lao động. Tuy nhiên xuất
phát từ tình hình thực tế hiện nay của thị trường bia khi việc đầu tư mở rộng sản xuất của
các doanh nghiệp quá ồ ạt dẫn tới viêc cạnh tranh trên thị trường càng trở nên mạnh mẽ
thì muốn duy trì sản xuất ổn định và sản lượng sản xuất ngày càng gia tăng thì việc nâng
cao chất lượng và đa dạng hóa sản phẩm để mở rộng thị trường hướng tới các khách hàng
thu nhập cao hơn là điều rất cấp thiết. Hiểu được nhu cầu thực sự của thị trường, công ty
CP Bia và NGK Hạ Long quyết tâm tìm phương án nghiên cứu phát triển sản phẩm bia
mới có chất l
ượng cao hơn, đây là một điểm quan trọng trong định hướng phát triển
chung của công ty. Tuy nhiên việc đổi mới công nghệ cần phải được nghiên cứu khảo sát
chi tiết trong điều kiện cụ thể của Công ty để các kết quả nghiên cứu phải thực sự phù hợp
và có thể áp dụng triển khai ngay vào thực tiễn sản xuất. Do vậy việc nghiên cứu này cần
sự hỗ trợ
cả về mặt kỹ thuật của các nhà khoa học đúng chuyên môn và kinh phí nghiên
cứu. Rất may mắn khi Công ty đang thực sự có nhu cầu đó thì được biết Nhà nước đã có
chủ trương hỗ trợ các doanh nghiệp trong việc nghiên cứu khoa học và đổi mới công nghệ
thông qua Nghị định 119/1999/NĐ-CP ngày 18/09/1999 của Chính phủ về một số chính
sách và cơ chế tài chính khuyến khích các doanh nghiệp đầu tư vào hoạt động khoa họ
c
và công nghệ, do vậy Công ty CP Bia và NGK Hạ Long phối hợp với Viện Công nghiệp

Thực phẩm là đơn vị có đủ năng lực chuyên môn hỗ trợ cho Công ty về mặt khoa học
công nghệ để xây dựng đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men bia mới
và cải tiến quy trình công nghệ để sản xuất một số sản phẩm bia mới chất lượng cao” với
mong muốn là nhanh chóng tạo ra đượ
c các sản phẩm bia mới có chất lượng cao hơn sản
phẩm hiện có để có thể sản xuất đưa vào thị trường một sản phẩm mới đáp ứng nhu cầu
người tiêu dùng khi mà đòi hỏi về chất lượng sản phẩm ngày càng nâng cao.
Chất lượng bia chịu ảnh hưởng rất lớn của từng bước trong quy trình công nghệ
trong đó những ảnh hưởng sâu sắc nhất là ch
ủng giống nấm men dùng cho lên men bia,

ảnh hướng của thành phần dịch đường do công thức nguyên liệu và quy trình nấu quyết
định, ảnh hưởng của quá trình lên men và tàng trữ Thực tế sản xuất bia tại Việt Nam có
những đặc thù riêng do tỷ lệ nguyên liệu thay thế sử dụng thường cao, thời gian lên men
và tàng trữ ngắn Do vậy để nâng cao chất lượng bia thì chúng tôi tập trung vào việc lựa
chọn được chủng nấm men bia mới có các đặc tính công nghệ phù hợp, xác lập
được công
thức nguyên liệu và quy trình nấu phù hợp với sản phẩm bia mới, xác định được các điều
kiện phù hợp nhất cho quá trình lên men và tàng trữ, đây là yếu tố ảnh hưởng nhiều nhất
đến chất lượng bia do vậy để xây dựng được quy trình công nghệ sản xuất sản phẩm bia
mới thì nhất thiết phải xác lập được các thông số công nghệ này.
Để giải quyết được vấ
n đề đặt ra trong đề tài thì một số nội dung nghiên cứu chính
sau đã được thực hiện:
- Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm men bia mới phù hợp cho sản xuất bia chất lượng
cao.
- Xác định công thức nguyên liệu và quy trình nấu phù hợp cho sản xuất bia chất lượng
cao.
- Xác định các điều kiện phù hợp nhất cho quá trình lên men và tàng trữ cho chất lượng
bia tốt nhất.

- Xây dưựng quy trình công nghệ sản xuất sả
n phẩm bia mới và ứng dụng vào thực tiễn
sản xuất để tạo ra sản phẩm mới tại Công ty cổ phần Bia và nước giải khát Hạ Long.














I. TỔNG QUAN
1.1. Nấm men dùng trong sản xuất bia
1.1.1. Các đặc tính cơ bản của nấm men bia
Nấm men là một cá thể sống đơn bào có cấu tạo tương đối phức tạp. Để hiểu rõ
nấm men bia dùng trong nghiên cứu, ta xem xét một số đặc tính chính của nấm men thuộc
loài tế bào có nhân chuẩn (Eucaryote) và không có khả năng quang hợp. So với vi khuẩn
chúng có kích thước lớn hơn gấp nhiều lần và trung bình nấm men bia 7- 10 µm. Nấm
men rấ
t có ích cho con người và chúng được sử dụng rộng rãi trong trong công nghệ sản
xuất bia, rượu vang, rượi cồn và các hoạt chất sinh học khác. Tuy nhiên, nấm men cũng
là nguyên nhân gây hư hỏng thực phẩm, nước giải khát.Song bên cạnh đó có một số loài
nấm men, chúng có vai trò quan trọng trong lĩnh vực y học. Hiện nay có khoảng 700 loài
nấm men được phát hiện, nhưng chỉ có một số loài trong đó được xác định tính chất.

Mặc dù có rất nhiều khái niệ
m khác nhau về nấm men cùng tồn tại, nhưng định
nghĩa “nấm men là loại nấm đơn bào thuộc loài vi sinh vật có nhân điển hình (Eucaryote),
sinh sản bằng phương thức nảy chồi là chủ yếu” được mọi người xem là có tính thuyết
phục nhất hiện nay.
Nấm men thuộc nhóm vi sinh vật quan trọng được sử dụng rộng rãi với số lượng
lớn phục vụ các mục đích kinh tế và thươ
ng mại. Theo ước tính thì tổng sản lượng nấm
men được sản xuất hàng năm gần một triệu tấn, kể cả lượng sinh khối tạo thành trong quá
trình sản xuất bia , rượu và các sản phẩm chưng cất khác Một số nhà vi sinh vật học và
công nghệ lên men đã sử dụng thuật ngữ “nấm men” có khả năng lên men rượu thuộc chi
Sacharomyces và loài S. cerevisiae. Mặc dù các giống nấm men này có vai trò quan trọng
trong lĩnh v
ực kinh tế, hoá sinh và đã thu hút được phần lớn sự quan tâm của các nhà
nghiên cứu khoa học đi thế nào đi chăng nữa thì hiện nay đã xuất hiện nhiều giống nấm
men lai tạo có những tính chất tốt hơn cho các nghiên cứu thực nghiệm. Chính vì thế mà,
nấm men thuộc chi Sacharomyces được biết đến như một quần thể tế bào sống được con
người sử dụng và lưu truyề
n từ cổ xưa nhất. Thật vậy, quá trình phất triển của ngành sản
xuất rượu, bia, bánh mỳ đã gắn liền với hoạt động cuả nấm men này một cách ngẫu nhiên
từ thời tiền sử xa xưa. Nhiều loài Saccharomyces đã được thừa nhận là an toàn và được sử
dụng trong quá trình trao đổi chất để tạo ra hai loại sản phẩm chính là rượu etylic và khí
CO
2


Nấm men là loài vi sinh vật có khả năng sử dụng nhiều loại hydratcacbon và
đường khác nhau.Tuy thế , hiện nay trong số các loài nấm men đã phân lập được từ môi
trường tự nhiên vẫn chưa có loài nấm men nào được chứng minh là có khả năng hấp thụ
được tất cả các loại đường. Loài nấm men S.cerevisiae có thể hấp thụ một số loại đường

như : glucoza, fructoza, mannoza, galactoza, sacaroza, maltoza, maltotrioza và một phần
rafinoza ; ngoài ra nó còn có khả năng sử d
ụng các dextrin phân tử thấp và melibioza
Nấm men bia là loài hô hấp hiếu khí tuỳ tiện, nghĩa là chúng có thể phát triển khi
trong môi trường có dư hoặc thiếu oxy. Sự tạo thành rượu etylic theo cơ chế Emdeen-
Mayerhof-Partnas (quá trình đường phân Glycolitic), theo cơ chế này thì 1gam glucoza sẽ
tạo thành 0,51 gam rượu etylic và 0,49 gam CO
2
. Nhưng thực tế , do một phần nhỏ
glucoza đã được tiêu thụ cho sự sinh trưởng của tế bào (để tạo sinh khối ) nên 1 gam
glucoza chỉ tạo ra 0,46 gam rượu etylic và 0,44 gam CO
2
. Quá trình đường phân
Glycolytic hoạt động bằng cách chuyển hoá glucoza thành axit pyruvic và năng lượng
dưới dạng hợp chất cao phân tử NADH
+
( Glucoza + 2 ADP +2Pi+2NAD
+
+ 2H
+
>
2Pyruvat +2ATP +2NADH+ +2H
+
). Đây là phản ứng sinh nhiệt mà phần lớn năng lượng
sinh ra từ các phản ứng sinh hoá trong mỗi giai đoạn của quá trình đều bị hấp thụ bởi nấm
men và dự trữ dưới dạng ATP để sử dụng cho các phản ứng sinh tổng hợp sau này. Hầu
hết các chủng nấm men đều mẫn cảm với môi trường có độ axit cao, vì thế mà trong quá
trình tiến hoá tự bản thân chúng đã hình thành cơ ch
ế giải độc axit bằng cách chuyển hoá
axit pyruvic thành rượu etylic và CO

2
và tiếp theo hai chất này lại được bài tiết ra khỏi tế
bào nấm men, và kết quả của chuỗi phản ứng này là NADH được tạo thành trong quá
trình Glycolytic lại bị oxyhoá thành NAD
+
, và chất này sau đó lại xuất hiện trong quá
trình chuyển hoá glucoza tiếp theo. Bằng cách này mà nấm men có thể liên tục phát triển
và chuyển hoá đường và phản ứng tạo etylic có thể được viết như sau:
(dehydrozenaza) (Alcoholdehydrozenaza)
CH
3
COCOOH – > CO
2
+ CH
3
CHO > C
2
H
5
OH

Nấm men thuộc các loài khác nhau thường có hình dạng không giống nhau. Trong
cùng một loài, tế bào cũng thay đổi tuỳ thuộc vào điều kiện nuôi cấy và tuổi của nó.
Trong môi trường đặc hiệu thì nấm men có hình thái rất ổn định. Đa số nấm men thường
có hình ovan, hình bầu dục (Saccharomyces cerevisiae ), hình cầu ( Torulopsis utilis).

Ngoài ra nấm men còn tồn tại dưới nhiều hình dạng khác: hình tam giác, hình ống dài,
hình bình
Một số loài nấm men có tế bào nối tiếp nhau thành dạng sợi gọi là khuẩn ty
(Mycelium), hoặc khuẩn ty giả (Pseudomycelium). Ở khuẩn ty giả tế bào không nối liền

với nhau một cách chặt chẽ như ở khuẩn ty. Khuẩn ty và khuẩn ty giả thường có ở các
giống Endomyce, Endomycopsis, Candida Nhiều loài nấm men chỉ tạo nên khuẩn ty giả
khi số
ng trong môi trường thiếu oxy.
Kích thước của tế bào nấm men thay đổi rất nhiều tuỳ thuộc vào các loài khác nhau.
Một số chủng nấm men đơn bào được sử dụng nhiều trong công nghiệp thực phẩm
thường có kích thước vào khoảng 3 ÷ 5 x 5 ÷ 10 µm (tỷ lệ dài : rộng = 1 : 2 ). 1.1.2.
Dinh dưỡng nấm men
Nấm men bia có nhu cầu sử dụng (đồng hoá) các nguồn cacbon, nitơ, các vitamin
thiết yếu, các nguyên tố vi lượng và một lượ
ng nhỏ oxy. Các yếu tố này được cung cấp
dưới dạng các loại đường có thể lên men được (chủ yếu là maltoza), các aminoaxit, các
loại vitamin B từ malt, các nguyên tố vi lượng từ malt và nước sản xuất bia (chủ yếu là
các ion Ca, mg, Zn, SO
4
, PO
4
). Oxy phân tử được cung cấp trực tiếp bởi quá trình lên men
bia ngay từ giai đoạn đầu của quá trìng lên men. Đôí với một số nhà máy bia thường bổ
sung vào dịch đường hoá malt dịch chiết nấm men (cung cấp các vitamin), (NH
4
)
2
PO
4
và
ZnSO
4
. Trong môi trường dịch đường hoá malt, nấm men sử dụng các chất dinh dưỡng để
cung cấp nằng lượng (ATP) và tạo thành cồn và CO

2
. Năng lượng nay sẽ chuyển thành
dạng khử (nicotinamide adenin dinucleotide phosphat, NADPH) cho quá trình tổng hợp
các chất mới cho nấm men. Các chất dinh dưỡng được đồng hoá trực tiếp để tạo thành các
hợp chất mới cho tế bào nấm men và thường tạo thành các hợp chất trung gian cho quá
trình này. Sự tạo thành và sử dụng năng lượng có liên quan tới nhau mật thiết. Hơn nữa
chúng sẽ dẫn đến sự tổng hợp và tiết vào dịch lên men m
ột số lượng lớn các sản phẩm
trao đổi chất phụ, rất nhiều trong số này tạo ra hương vị đặc trưng cho bia.
Trong quá trình sinh sản và phát triển, nấm men đòi hỏi được cung cấp nguồn dinh
dưỡng khá phong phú như nitơ, cacbon, vitamin và các chất khoáng để xây dựng tế bào.
Môi trường đầy đủ chất dinh dưỡng là một trong những yếu tố thuận lợi giúp cho nấm
men giữ được độ thuần khi
ết ổn định cao, giảm khả năng thoái hoá và đột biến, đồng thời
nâng cao chất lượng sản phẩm.
1.1.2.1.Nguồn Nitơ

Nấm men có thể sử dụng nguồn nitơ vô cơ như (NH
4
)
2
SO
4
, urê và nitơ hữu cơ.
Trong dịch malt nitơ là nguồn dinh dưỡng quan trọng không thể thiếu được trong hoạt
đống sống của tế bào nấm men. Dịch đường chứa từ 65 ÷ 100 mg nitơ trong 100 ml.
Khoảng 30% trong số đó là các nitơ axit amin, khoảng 20% là các protein phân tử cao,
40% là các polypeptid, 10% còn lại là purin và các hợp chất chứa nitơ khác. Do hoạt tính
proteaza ở nấm men rất thấp nên các axit amin trong dịch đường hoá là nguồn nitơ chủ
yếu để nấm men hấ

p thụ.
Nấm men đồng hoá các hợp chất chứa nitơ bằng cách khử gốc amin và gốc
carboxyl của α - amino tạo thành NH
3
và CO
2
. Như vậy NH
3
là đầu mối các con đường
dinh dưỡng nitơ của nấm men. Nấm men bia có thể tiêu thụ đến 45% toàn bộ nguồn nitơ
trong dịch đường, có nghĩa là nấm men đã đồng hoá một phần di-peptid, tri-peptid trong
dịch đường, mặc dù tốc độ đồng hoá có thể chậm hơn so với tốc độ đồng hoá các axit
amin.
Khả năng hấp thụ axit amin của các chủng nấm men là tương đương nhau. Nấm
men cũng có thể
đồng hoá được các axit amin một cách trực tiếp. Quá trình hấp thụ trực
tiếp axit amin để xây dựng nên protein của nấm men có ý nghĩa rất quan trọng trong giai
đoạn đầu của quá trình lên men bia.
1.1.2.2. Nguồn cacbon
Nồng độ các loại đường có khả năng lên men và không lên men trong dịch nha rất
khác nhau, phụ thuộc vào chất lượng của malt, tỷ lệ nguyên liệu thay thế và công nghệ
nấu. Lượng carbonhydrat của dịch đường hoá chiếm xấp xỉ 90
÷ 92% lượng chất khô và
trong số này có đến 80% là đường có thể lên men được, trong đó khoảng 60÷70%,
glucoza và fructoza 6 ÷ 9%, saccaroza: 2 ÷ 6%.
Ngoại trừ một vài trường hợp đặc biệt, nói chung nấm men không thể lên men và
đồng hoá được các polysaccharit. Đường có khả năng lên men được coi là nguồn cacbon
mà nấm men cần sử dụng cho quá trình sinh sản và phát triển. Chẳng hạn chủng nấm men
Saccharomyces cerevisiae và Saccharomyces carlbergensis lên men đường glucoza,
fructoza, sacroza đầu tiên, sau đó là maltoza, maltotrioza. Maltotetroza hoàn toàn không

được lên men. Một vài chủng nấ
m men khác có khả năng lên men isomaltoza,
isomaltotrioza và panoza nhưng với tốc độ rất chậm so với các loại đường có liên kết
α−1,4glucozit.

Đường glucoza và fructoza được nấm men đồng hoá theo cùng một chu trình. Cơ
chế nấm men đồng hoá maltoza còn chưa được hiểu rõ. Một số ý kiến cho rằng maltoza đi
vào trong tế bào nhờ enzym permeasa xúc tác và sau đó bị thuỷ phân bởi enzym maltaza
trong tế bào. Quá trình lên men maltoza bị hạn chế có thể là do nồng độ enzym maltaza
trong tế bào thấp. Tuy nhiên ở một vài chủng nấm men bia người ta nhận thấy tốc độ lên
men maltoza xảy ra vẫn chậm mặc dù lượng maltaza trong tế bào dư
thừa. Vì lý do đó
người ta cho rằng quá trình đường hoá maltoza không phụ thuộc vào hàm lượng maltaza
trong tế bào.
Quá trình lên men maltotrioza được thực hiện sau maltoza. Một vài chủng nấm
men hoàn toàn không lên men maltotrioza. Loài nấm men nổi thể hiện khả năng lên men
maltotrioza yếu hơn so với nấm men chìm.
1.1.2.3. Vitamin và các chất khoáng
Các loài nấm men khác nhau có nhu cầu về vitamin hết sức khác nhau. Ngay trong
cùng một loài, nhu cầu này cũng thay đổi rất nhiều giữa giai đoạn phát triển và giai đoạn
lên men. Đa số các ch
ủng nấm men đang ở giai đoạn sinh sản đều cần inositol, canxi
pantothenat, thiamin, đặc biệt là biotin.
Trong môi trường tổng hợp, các chủng nấm men đang ở pha cân bằng không có
nhu cầu biotin, axit pantothenic hoặc inositol. Tuy nhiên đối với loài nấm men
Saccharomyces carlsbergensis, hiện tượng thiếu inositol luôn luôn ức chế cả quá trình
phát triển và quá trình lên men.
Trong môi trường thiếu axit pantothenic, một vài chủng nấm men bia có khả năng
tạo một khối lượng đáng kể H
2

S. Với 0,5 mg pantothenic trong 1 lít dịch đường, không
chủng nào sản sinh ra H
2
S. Biotin không chỉ duy trì quá trình phát triển của nấm men mà
còn có ảnh hưởng lớn đến tốc độ lên men.
Ngoài ra còn có một số loại vitamin khác được nấm men sử dụng trong quá trình
lên men. Trong thời gian lên men 7 ngày của chủng Saccharomyces carlsbergensis, hàm
lượng thiamin giảm từ 0,3 mg xuống gần như bằng không, hàm lượng biotin, pyrodoxyl,
inositol giảm một cách đáng kể, trong khi hàm lượng riboflavin hầu như không thay đổi.
Nhu cầu về vitamin của nấm men còn phụ thuộc vào nhiệt độ môi trườ
ng. Ở nhiệt
độ cao, nếu thiếu biotin, quá trình phát triển của nấm men sẽ bị hạn chế. Ở nhiệt độ thấp,

nấm men chỉ bị ức chế khi thiếu cả biotin và inositol, thiếu thiamin và pyridoxyl chỉ gây
ức chế một phần.
Nấm men thu nhận photphat từ môi trường dịch đường và tích luỹ dưới dạng các
hạt volutin. Sự phát triển của nấm men đi đôi với quá trình tích luỹ photphat và đạt đến 60
µg ở thời điểm cao nhất.
1.1.3. Bảo quản nấm men
Sự ảnh hưởng của điều ki
ện bảo quản và thời gian tái sử dụng men sữa đến chất
lượng bia là điều mà rất nhiều nhà sản xuất đặc biệt quan tâm.
Trong quá trình sản xuất bia, hiệu suất lên men, đặc tính và chất lượng bia thành
phẩm liên quan chặt chẽ với tình trạnh sinh lý nấm men. Điều kiện sinh lý của nấm men
ảnh hưởng đến hàm lượng este, rượu bậc cao, aldehyt và diaxetyl thông qua quá trình lên
men, tàng trữ và góp phần tạo nên tính chất cả
m quan của bia thanh phẩm. Để đánh giá
tình trạng sinh lý của nấm men trong quá trình lên men bia, người ta thường căn cứ vào
hai chỉ tiêu quan trọng nhất là khả năng sống của nấm men và hàm lượng glycogen tron tế
bào. Ngoài ra, chỉ số axit hoá (AP) thể hiện khả năng chuyển hoá glucoza nội bào của

nấm men cũng là chỉ số quan trọng khi xem xét chát lượng nấm men bia. Nấm men có tỷ
lệ tế bào sống cao, hàm lượng glycogen lớn và chỉ số AP cao là nấm men có tình trạ
ng
sinh lý tốt. Ngược lại, khi hàm lượng glycogen trong tế bào thấp, tỷ lệ tế bào chất cao và
chỉ số AP thấp là nấm me trong tình trạng sinh lý kém. Trong quá trình lên men, tình
trạng sinh lý của nấm men bị thay đổi qua từng thế hệ và nó phụ thuộc vào điều kiện và
quá trình xử lý nấm men và thời gian bảo quản nấm men trong quá trình sản xuất.
Trong quá trình bảo quản nấm men để sử dụng cho tái sản xuất, thì nhiệt độ và thời
gian b
ảo quản là hai yếu tố có ảnh hưởng đặc biệt quan trọng đến đặc tính sinh lý và khả
năng lên men của nấm men.
1.1.4. Các sản phẩm trao đổi chất của nấm men trong quá tình lên men bia
Các quá trình trao đổi chất là một loạt các chu trình hoá sinh. Tuy nhiên, sự tiếp
nối của các chu trình này lại rất quan trọng. Một vài các chu trình được tách từ những chu
trình khác. Một chu trình hóa sinh được biết đến là một loạt các phản ứng, mỗi phản ứng
trung gian đượ
c xúc tác bởi một enzym mà qua đó sản phẩm của phản ứng này là cơ chất
của phản ứng sau. Những chu trình này có mục đích chủ yếu là tạo ra năng lượng bởi sự
oxy hoá hoá học của các cơ chất. Quá trình oxy hoá thường được thực hiện bởi sự chuyển
một ion H
+
thành một đồng nhân tố enzym (NAD
+
nicotinamide adenin dinucleotide). Vì

vậy NAD
+
, dạng đã oxy hoá của đồng nhân tố, được tạo thành NADH, dạng khử. Các
phản ứng oxy hoá khử này được thực hiện bởi các enzym dehydrogenaza. Quá trình này
giải phóng ra năng lượng (một mẫu không có enzym được gia nhiệt mà lượng nhiệt này

đạt được bởi sự đốt cháy các loại dầu hoá thạch). Trong quá trình trao đổi chất, quá trình
oxy hoá được kiểm soát chặt chẽ vì một vài loại năng lượng giải phóng ra được giữ bởi tế
bào
ở dạng ATP (Adenin triphosphat). Phản ứng:
ADP + Phosphat vô cơ (P) → ATP
Tiêu thụ năng lượng được điều khiển bởi các hợp chất cao năng được hình thành trong
suốt quá trình trao đổi chất.
Phản ứng chuyển đổi(sự thuỷ phân ATP) giải phóng ra năng lượng mà năng lượng
này có thể sử dụng để tổng hợp ra các sản phẩm mới.
Các phản ứng chuyển đổi năng lượng thườ
ng không bao giờ đạt hiệu quả 100%,
năng lượng thừa (ở dạng nhiệt) luôn mất đi. Đây là nguồn nhiệt tạo ra trong suốt quá trình
lên men dịch đường. Ở dịch đường, lượng nhiệt dư thừa được tạo ra chủ yếu đủ để làm
tăng nhiệt độ của thiết bị lên men được cách nhiệt lên khoảng 17
0
C. Một thiết bị lên men
bia thường không cách nhiệt hoàn toàn, do vậy mà nhiệt dư thừa bởi quá trình trao đổi
chất cần được làm mát nếu quá trình lên men được kiểm soát. Ở thiết bị lên men lớn hơn
thì bề mặt của nó nhỏ hơn so với thể tích mà nó chứa. Do vậy mà các thiết bị lên men lớn
hơn cần có các hệ thống làm mát hiệu qủa hơn so với các thiết bị lên men nhỏ.
Các chu trình dị hoá được thự
c hiện để sản sinh ra năng lượng và tạo ra các hợp
chất trung gian cho các quá trình tổng hợp sinh học. Các chu trình đồng hoá sử dụng năng
lượng dạng khử. Sự kết nối hai chu trình này gọi là các phản ứng thoái biến hoàn toàn .
Các sản phẩm trung gian tổng hợp sinh học chủ yếu một vài chu trình (ví dụ chu trình
đường phân) có các quy luật quan trọng và cung cấp cả hai chức năng này được gọi là
lưỡng thể.
Các sản ph
ẩm trao đổi chất là những sản phẩm bài tiết chủ yếu của nấm men trong
khi lên men nước dịch đường hoá, cồn etylic ít có ảnh hưởng lên hương bia thành phẩm.

Chủng loại và nồng độ nhiều sản phẩm bài tiết khác do nấm men tạo ra trong lên men
nước dịch đường hoá đứng ở vị trí đầu tiên trong việc xác định hương của bia thành phẩm.
Sự hình thành nên những sản phẩm này phụ thuộc vào sự cân bằ
ng trao đổi chất tổng thể
của dịch men, và có nhiều yếu tố làm thay đổi nó và ảnh hưởng tới hương bia. Những yếu
tố đó là: chủng nấm men, nhiệt độ lên men, loại và mức độ các chất thay thế, thiết kế

thùng lên men, pH nước dịch đường hoá, khả năng đệm của nước dịch đường hoá, tỉ trọng
nước dịch đường hoá .v.v
Một số hợp chất bay hơi cực kì quan trọng và tham gia tích cực vào sự hình thành
nên hương bia, ngược lại một số khác lại quan trọng về phương diện tạo hương vị nền.
Người ta tìm thấy trong bia các nhóm chất sau: Amin và axit hữu cơ, este, cacbonyl, hợp
chất sunphua, amin, phenol và một số hợ
p chất hỗn hợp khác.
1.1.4.1. Axit béo và axit hữu cơ
Trong bia có 110 axit, cả axit hữu cơ lẫn axit béo mạch ngắn và trung bình. Các
axit hữu cơ có tác dụng làm cho pH môi trường giảm trong lúc lên men và nhiều axit có
vai trò tích cực trong việc tạo nên hương bia. Một phần các axit này sẵn có trong malt và
các nguyên liệu thay thế malt, nhưng một phần khác thì sinh ra và tăng lên trong lên men
nhờ kết quả của quá trình trao đổi chất của nấm men.
Các axit hữu cơ được tạo nên trong quá trình trao đổi chất là: pyruvat, succinat,
xitrat và axetat. Người ta dự
đoán rằng phần lớn các axit này tăng lên là do chu trình
tricacboxylic hoạt động không hoàn chỉnh dưới điều kiện yếm khí . Người ta đã quan sát
thấy pyruvat được bài tiết vào môi trường trong pha lên men tích cực đầu tiên và đến giai
đoạn sau, khi mà nấm men đã ngừng sinh trưởng thì pyruvat lại bị tiêu hao và xuất hiện
sự tích luỹ axetat. Do đó, trong điều kiện có nhiều sản phẩm glycolytic tạo ra thì sự tiêu
hao pyruvat sẽ xác định tốc độ của con đườ
ng. Các axit béo mạch trung bình ( C
6

- C
10
)
tăng lên là do tác dụng của enzim tổng hợp axit béo lên sự hình thành các axit béo mạch
dài hơn vốn đã được kể đến trong các nhóm khác nhau của lipid nấm men. Ngoài ra một
số lại bắt nguồn từ sự đồng hoá và trao đổi chất tiếp theo của các lipid trong nước dịch
đường hoá. Một số axit béo mạch trung bình và dài có thể liên quan tới vấn đề mất khả
năng sống và sự tự phân của tế bào nấm men xảy ra vào lúc tàng trữ s
ản phẩm.
Nồng độ các axit béo hình thành là kết quả của quá trình trao đổi chất nấm men.
Quá trình này tỉ lệ nghịch với tốc độ lên men. Do đó các thông số như nhiệt độ, tỉ lệ giống
có tác dụng làm tăng tốc độ lên men lại làm giảm sự tích luỹ các axit béo. Tuy nhiên, như
đã trao đổi trước đây, tuy nồng độ oxy tăng đã làm tăng tốc độ sinh trưởng nấm men
nhưng vẫn làm tă
ng sự tổng hợp các lipid ở màng tế bào. Điều đó làm cạn kiệt kho axetyl-
CoA cần cho việc tổng hợp các axit béo mạch trung. Hàm lượng nitơ rất quan trọng vì các
axit như isocaproic và isovaleric có thể được bài tiết ra như là các sản phẩm trung gian
của quá trình hình thành các axit amin leucin và valin.

1.1.4.2.Rượu bậc cao hay dầu Fusel
Hai con đường tạo ra rượu bậc cao: Trong thuật ngữ hương thơm, cồn bậc cao
(còn gọi là dầu fusel ) xuất hiện trong bia và nhiều đồ uống giầu cồn khác là n-propanol,
isobutanol, 2-metyl-1-butanol và 3-metyl-1-butanol. Ngoài ra còn có hơn 40 loại cồn khác
được phát hiện. Quy luật tổng hợp cồn bậc cao khá phức tạp bởi vì chúng có thể được tạo
nên từ quá trình trao đổi chất axit amin hoặc từ pyruvat sinh ra trong trao đổi chất
hy
đratcacbon.
Con đường dị hoá (là quá trình sinh hóa trong đó các hợp chất hữu cơ bị phân huỷ,
thường là quá trình giải phóng năng lượng ), trong đó keto-axit sinh ra nhờ chuyển amin
sẽ bị loại CO

2
và tạo ra andehyd rồi bị khử tiếp thành rượu nhờ sự xúc tác của enzim
NAD-dehydrogenaza. Theo cách này các loại rượu sau đây cũng được hình thành:
Isobutanol từ valin
3- metyl-1-butanol từ leucin
2-metyl-1-butanol từ iso leucin
Con đường đồng hoá (là quá trình sinh hóa bao gồm việc tổng hợp các hợp chất
hữu cơ, thường là quá trình tiêu hao năng lượng ) sử dụng cùng con đường tổng hợp các
axit amin. Tương tự như ở con đường dị hoá, chất trao đổi trung gian keto-axit bị loại
CO
2
biến thành andehyd rồi bị khử tiếp thành rượu.
Hai con đường nói trên đã tạo ra các loại rượu bậc cao đặc trưng. Vì không có axit
amin tương ứng nên dị hoá được coi là con đường duy nhất có thể tạo ra n-propanol. Nói
chung con đường dị hoá cơ bản diễn ra trong giai đoạn đầu của pha sinh trưởng khi mà
hàm lượng axit amin ngoại bào còn nhiều. Trong giai đoạn sau khi mà nước mu trở nên
nghèo nitơ có thể đồng hoá được, con đường dị hoá là con đường chủ yế
u tạo ra các rượu
bậc cao.
Tổng nồng độ cồn bậc cao tạo nên trong khi lên men tỷ lệ thuận với mức độ sinh
trưởng của nấm men. Do vậy, những điều kiện kích thích sinh trưởng như tăng nồng độ
oxy sẽ làm tăng sản sinh cồn bậc cao. Tương tự như vậy, bổ sung axit amin cho nước mu
để tăng sinh trưởng nấm men làm tăng việc tích luỹ cồn bậc cao. Trong tr
ường hợp này,
bản chất các axit amin trong nước mu sẽ được phản ánh trong thành phần cồn bậc cao của
bia thành phẩm. Lên men dưới áp suất có tác dụng hạn chế sự thải CO
2
làm ức chế sự sinh
sản của nấm men sẽ làm giảm mức độ tạo thành các loại rượu bậc cao.
Mối quan hệ giữa đồng hoá axit amin và cồn bậc cao:

Cơ chế Ehrlich: Ehrlich (1906-1912) đã thực hiện những bước quan trọng đầu tiên
để giải quyết vấn đề trao đổi chất nitơ của nấm men. Ông chỉ ra rằng nấm men sinh
trưởng dựa trên axit amin nào đó sẽ tạo ra rượu bậc cao đặc trưng và biểu diễn quá trình
có thể biểu diễn như sau:

R.CHNH
2
COOH + H
2
O R.CHOHCOOH + NH
3
(1)
axit amin axit α-hydroxy

R.CH
2
OH + CO
2
(2)
rượu bậc cao

NH
3
tạo nên từ phản ứng (1) phục vụ cho sự sinh trưởng của nấm men, còn axit α-
hydroxy bị loại CO
2
và biến thành cồn sơ cấp ( một thành phần của cồn bậc cao ) chứa
đựng một nguyên tử cacbon ít hơn axit amin ban đầu. Lấy L-leucin làm ví dụ, con đường
Ehrlich diễn ra như sau:

(CH
3
)
2
CHCH
2
CHNH
2
COOH + H
2
O (CH
3
)
2
CHCH
2
CHOHCOOH + NH
3

L- Lơxin Axit α-hydroxyisocaproic
- CO
2

(CH
3
)
2
CHCH
2
- CH

2
OH
Isoamylalcohol


Các công trình nghiên cứu khác về cơ chế Ehrlich
Sau Ehrlich nhiều tác giả đã tiến hành nhiều thí nghiệm nhằm kiểm nghiệm lại cơ
chế mà ehrlich đã nêu ra. Họ đã khám phá ra nhiều điều khá thú vị. Dưới đây là một vài
trong các nghiên cứu đã nói.
Đã tìm thấy dấu vết của sản phẩm trung gian của quá trình biến đổi phenylglycin
thành benzylacohol là axit phenylglyoxilic nhờ nấm men :

CHNH
2
COOH COCOOH CH
2
OH





Phenylglycin Axit phenylglyoxilic Benzylalcohol.

Do vậy họ đề xuất trật tự phản ứng như sau:

R.CHNH
2
- COOH + O R.CO- COOH + NH
3

R.CO - COOH R.CHO + CO
2
R.CHO + 2H R.CH
2
OH

Họ không thấy xuất hiện sản phẩm trung gian các axit α-hydroxyl. Điều này khẳng
định việc khử amin của các axit amin không theo con đường thuỷ phân như Ehrlich đã đề
xuất.
Đã khám phá ra enzim caboxylaza và cho rằng enzim này đã xúc tác phản ứng loại
CO
2
của các axit-keto mà ngày nay chúng ta đã biết khá tường tận.
Họ cho rằng trong lúc sinh trưởng trên môi trường chứa các axit amin, nấm men
khử amin của các axit này, sử dụng NH
3
tự do cho sinh trưởng và để lại gốc cacbon, gốc
cacbon bị loại CO
2
, rồi bị khử tiếp thành cồn bậc cao.
Trước hết Thorne (1937) dùng nấm men nổi S.cerevisiae lên men trong môi trường
tổng hợp dưới điều kiện gần với điều kiện lên men bia hơn là điều kiện mà Ehrlich đã sử
dụng và dùng từng loại axit amin như tyrosin, tryptophan, phenylalanin hoặc valin làm
nguồn cung cấp nitơ cho nấm men, tách được rượu bậc cao tương ứng tyrosol, tryptophan,
β-phennylethanol, isobutanol với hiệu suất 80%, 78%, 67% và 60% so vớ
i lý thuyết.
Tác giả cũng tiến hành thí nghiệm với cặp axit amin (glutamic và arginin) và nhận
thấy sản phẩm cuối cùng không phải cồn bậc cao tương ứng theo cơ chế Ehrlich mà là
axit sucinic. Lượng axit này sinh ra từ axit glutamic xấp xỉ bằng giá trị lý thuyết. Ở đây
Thorne cho rằng hai bước phản ứng đầu tiên ( tạo ra axit α-oxo-glutamic và khử CO

2
của
axit này tạo nên γ-aldehid-butyric diễn ra như đã đã biết. Aldehid sinh ra liền bị khử
thành axit succinic mà đáng ra theo Ehrlich phải thành axit γ-hydroxy-butyric.

CH
2
.CNH
2
.COOH CH
2
.CO.COOH
CH
2
.COOH CH
2
-COOH

Axit glutamic axit α-xeto-glutamic


CH
2
.CHO CH
2
.COOH
CH
2
.COOH CH
2

.COOH
(Axit γ - aldehid-butyric) axit sucinic
Đối với arginin phản ứng diễn ra cũng không theo cơ chế Ehrlich. Trong đó xuất
hiện hai sản phẩm cuối cùng là axit succinic và γ-butylen glycol với hiệu suất chuyển hoá
tương ứng 60% và 19%. Để giải thích hiện tượng này Thorne đề xuất các con đường sau:










Sau thí nghiệm của Thorne, ít ai nghiên cứu tiếp sự trao đổi chất argine ở nấm men.
Nhưng dưới ánh sáng của một số công trình nghiên cứu gầ
n đây thì dường như axit
succinic đã có thể tăng lên do axit glutamic, một axit thường hình thành từ arginin trong
nhiều hệ thống sinh học.
Sau Erhlich rất ít tác giả tiến hành nghiên cứu cơ chế trao đổi chất arginin.Nhưng
dưới ánh sáng của một số công tình nghiên cứu mới đây, hình như axit succinic đã tăng
lên từ axit glutamic, một loại axit thường sinh ra trong trao đổi chất arginin ở nhiều hệ
thống sinh hoá. Thực ra con đường phân giải arginin không có enzim arginaza như sơ
đồ
của Thorne, mà hơn thế arginin đã bị chuyển hoá thành ornithin nhờ enzim arginin
deiminaza vốn có ở nấm men (Roche và Lacombe, 1952; Korzenovsky, 1955);

NH:C. NH
2

arginin deiminaza
HN - C - NH
2


NH. (CH
3
)
3
. CHNH
2
. COOH
arginin

CO + NH
2
(CH
2
)
3
CHNH
2
. COOH
+ H
2
O
NH
2

NH
2
Urê ornithin

NH
2
(CH
2
)
3
. CHNH
2
.COOH CH
2
OH. CH
2
. CH
2
. CH
2
OH + CH
2
= COOH
Ornithin γ - butylen glycol axit succinic
CH
2
- COOH

NH.(CH
2

)
3
. CH. NH
2
. COOH + 2H
2
O
Arginin
NH
2
(CH
2
)
3
.CHNH
2
. COOH + CO
2
+ 2NH
3

ornithin




Họ đã tiến hành một số thí nghiệm với chủng nấm men bánh mỳ S.cerevisiae trong
điều kiện phòng thí nghiệm khác với điều kiện lên men ở nhà máy bia và phát hiện ra một
số điều có thể tóm tắt như sau:
1. Dung dịch nấm men đã rửa tạo ra tyrosol từ L-tyrosin dưới điều kiện yếm khí.

Trong đó phải có mặt glucoza, có lẽ là để cung cấp năng lượng cho sự chuy
ển dịch
tyrosin vào trong tế bào;
2. Chất chiết tế bào nấm men tạo nên glutamat, p-hydroxy-phenyl-axetaldehyd
(PHPA) và CO
2
từ 2-oxoglutarat và tyrosin dưới xúc tác của pyridoxalphosphat. Điều này
chứng tỏ trong quá trình biến đổi tyrosin thành tyrosol có vấn đề chuyển amin;
3. Chất chiết tế bào nấm men khử CO
2
của p-hydroxy phenylpiruvat ;
4. Chất chiết tế bào khử NAD khi có mặt của PHPA.

Những điều trên hoàn toàn có thể giải thích được bằng các phản ứng tổng quát nhờ xúc
tác của enzim transaminaza và alcoholdehydrogenaza.

Tyrosin + axit 2-oxoglutaric +NADH
2
tysosol + L-glutamic + CO
2
+ NAD
Các phản ứng riêng rẽ có thể như sau:
C
6
H
4
OH + CH
2
- CH
2

- COOH
CH
2
-CHNH
2
-COOH CO - COOH
Tyrosin axit 2-oxoglutaric

C
6
H
4
OH + CH
2
-CH
2
-COOH
CH-NH
2
-COOH CHNH
2
- COOH
axit p-hydroxy axit glutamic
phenylpirnvic


- CO
2

C
6
H
4
-OH + NADH
2

CH
2
- CHO - NAD C
6
H
4
OH
CH
2
-CH
2


P-hydroxy P-hydroxy - phenyl
phennyl axetaldehyd ethanol (tyrosol)


Các tác giả đã tinh chế enzim tyrosin-2-oxoglutarat transferata của nấm men và chỉ
rõ enzim này cần piridoxal-phosphat như là một co-enzim với tính đặc hiệu rất cao. Họ
phát hiện thấy các enzim-transferaza của aspartat, leucin, isoleucin, valin, norvalin,
methionin, phenyl-alamin và tyrosin trong các loại nấm men mà chất chiết của nó xúc tác
việc chuyển nhóm amin từ các axit amin vừa nói sang axit 2-oxoglutaric. Các phản ứng
với axit aspastic, leucin, phenylalanin, tyrosin và valin được kích thích bởi pividoxal

phosphat. Ngoài ra dịch chiết tế bào còn xúc tác sự giải phóng CO
2
khi được ủ với 2-
oxoglutarat và một trong các axit amin leucin, isoleucin, valin hoặc norvalin. Điều đó cho
thấy các axit oxo tương ứng tạo nên từ axit amin đã bị dịch chiết khử mất CO
2
. Bằng
chứng là các 2-oxoiso-valerat, 2-oxovalerat, 2- oxoiso caproat và 2-oxo aspartat đã nhanh
chóng bị dịch chiết tế bào và enzim cacboxylaza nấm men tinh chế khử CO
2
và biến thành
các aldehid tương ứng. Trong đó enzim cacboxylaza nấm men tinh khiết có hoạt lực yếu
hơn một chút .
Cuối cùng cũng đã chỉ rõ dịch chiết tế bào oxy hoá NADH
2
khi có mặt của p-
hydroxyphenylaxetaldehid, butyraldehid, isobutyr-aldehid, valeraldehid hoặc
isovaleraldehyd và tinh thể enzim alcohol-dehydrogenaza cũng có các tính chất tương tự.
Phản ứng theo chiều ngược lại của quá trình khử NAD khi đó mặt của cồn tương ứng
cũng được trình bày. Các bước chuyển amin nhờ enzim transaminaza, cacboxylaza và
alcoholdehydrogenaza theo cơ chế Ehrlich diễn ra đối với L-leucin diễn ra như sau:

CO- COOH transaminaza
(CH
3
)
2
- CH-CH
2
-CHNH

2
-COOH +
CH
2
-CH
2
-COOH
L-leucin Axit 2-oxoglutaric


CHNH
2
-COOH
(CH
3
)
2
- CHCH
2
-CO-COOH +
axit 2-oxoisocaproic CH
2
-CH
2
-COOH
Axit L-glutamic
Cacboxylaza
- CO
2

acohol dehydrogenaza
(CH
3
)
2
-CHCH
2
-CHO + NADH
2
(CH
3
)
2
-CHCH
2
-CH
2
OH + NAD
iso valeraldehyd isopentyl alcohol
(isoamylalcohol)
Sơ đồ trên chẳng những giải thích bản chất sự tạo ra cồn bậc cao từ axit amin và sự
thiếu vắng của NH
3
tự do trong phản ứng. Hơn thế, nó cũng thể hiện vai trò quan trọng
của quá trình chuyển amin trong trao đổi chất nitơ.Thật vậy nhờ axit L-glutamic tế bào
nấm men có thể tổng hợp nên nhiều axit amin khác từ các axit 2-oxo tương ứng sinh ra từ
trao đổi chất hydrat cacbon. Khả năng này rất quan trọng đối với S.cerevisiae, vì chúng có
khả năng tổng hợp nên tất cả hợp chất nitơ cần thiết cho tế bào t
ừ NH
3

dùng làm nguồn
nitơ duy nhất.
Người ta cũng đã chú ý tới tầm quan trọng của việc chuyển amin trong trao đổi
chất nitơ. Họ chỉ rõ nếu nấm men bia sinh trưởng trên môi trường dùng axit L-glutamic
làm nguồn nitơ duy nhất thì tiết ra khá nhiều 2-oxoglutarat tương ứng với lượng glutanic
đã hấp thụ; Tuy vậy rất ít 2-oxoglutarat được giải phóng nếu thay L-glutamic bằng các
loại axit amin khác thậm chí không tiết chút nào nếu thay bằng NH
3
hoặc methionin; Sự
tích luỹ L-glutarnat bị ức chế mạnh mẽ khi bổ sung L-aspartat hoặc NH
3
vào môi trường.
Những thí nghiệm này chứng tỏ tầm quan trọng của hệ thống chuyển amin glutamic-2-
oxoglutarat trong trao đổi chất nấm men và 2-oxoglutarat tạo nên từ L-glutamat được
dùng nhanh chóng vào phản ứng chuyển amin với các axit amin khác hoặc vào phản ứng
amin hoá cùng NH
3
nếu NH
3
được dùng làm nguồn nitơ duy nhất.
Công trình của Ayrapa
Ayrapaa có đóng góp quan trọng vào việc nghiên cứu sự hình thành cồn, trước hết
là β-phenylethanol. Năm 1961, ông tách loại cồn này từ bia bằng methanol-chloroform,

tinh chế bằng sắc ký cột và xác định các tính chất của nó bằng sắc ký khí , quang phổ tử
ngoại và điểm nóng chảy 3,5-dinitrobenzoate. Trong bia loại rượu này có nồng độ 10-
40µg/ml và thơm tương tự hoa hồng, góp phần vào sự hình thành nên hương và mùi của
bia. Năm 1962, Ayrapaa đã trình bày một phương pháp so màu tương đối đơn giản để xác
định β-phenylethanol sau khi chiết tách từ bia, phân tách trên máy sắc ký dùng nhôm-axit
silic làm pha tĩnh và diethyl ether làm pha động.

Trong các thí nghiệm với S.Carlsbergensis, phát triể
n yếm khí trong môi trường
chứa hỗn hợp axit amin với thành phần tương tự như trong nước đường để lên men, β-
phenylethanol cũng như các cồn bậc cao mạch thẳng đã sinh ra không những khi có mặt
của các axít amin tương ứng mà ngay cả khi hàm lượng axít amin đã cạn kiệt, thậm chí cả
khi sử dụng NH
3
làm nguồn đạm duy nhất (Ayrapaa ,1963 ). Số lượng tạo thành chủ yếu
phụ thuộc vào tỷ lệ nitơ có thể đồng hoá so với lượng đường có trong môi trường và đạt
hiệu suất cao khi nồng độ nitơ môi trường là 124 µg/ml ; Nếu tăng nồng độ nitơ đồng hoá
lên thì sản lượng β-phenylethanol lại giảm xuống.
Mối quan hệ trên cũng xẩy ra đối với rượu bậc cao có gốc cacbon m
ạch thẳng và
điều này cũng đúng với trường hợp sử dụng sunfat-amon và hỗn hợp các axít amin
thường có mặt trong nước đường để lên men hoặc hỗn hợp axít amin thiếu valin, leucin,
isoleucin, phenylalanin hay tyrosin làm nguồn cung cấp nitơ. Có điều ngạc nhiên là đối
với trường hợp nguồn nitơ chỉ gồm ( NH
4
)
2
SO
4
sản lượng β-phenylethanol và
amylalcohol chỉ thấp hơn trường hợp môi trường có hỗn hợp axít amin khoảng 20-40%.
Thêm phenylalanin vào môi trường chứa hỗn hợp các axít amin làm cho sản lượng β-
phenylethanol tăng lên nhưng không tỷ lệ thuận và nhiều nhất cũng chỉ có 30%
phenylalanin được chuyển hoá thành β-phenylethanol mà thôi. Trong cùng thời gian thêm
phenylalanin đã ức chế sự tạo cồn bậc cao cacbon mạch thẳng với mức độ khác nhau.
Các kết quả nghiên cứu khác c
ủa Ayrapaa chỉ rõ sự tạo thành rượu bậc cao ít có

quan hệ tới sự khử amin và ý kiến này trùng với ý kiến của nhiều tác giả đã cho rằng
rượu bậc cao được tạo thành trong suốt quá trình lên men , thậm chí ngay ở giai đoạn đầu
tiên trong lên men dịch đường trước khi các axit amin bị hấp thụ hết. Điều này kết hợp
với thực tế là rượu bậc cao vẫn được tạo ra trong môi trường lên men chỉ
có NH
3
là nguồn
nitơ duy nhất cho thấy có lẽ các thành phần của rượu bậc cao phải sinh ra do khử amin

của các axit amin mà tế bào đã tổng hợp được từ kho các axit oxo hoặc trực tiếp loại CO
2

rồi khử các axit oxo này.
Ayrapaa cho rằng sự hình thành β-phenylethanol diễn ra tương tự như sự tạo thành
rượu bậc cao cácbon mạch thẳng và có quan hệ đặc biệt với mức dinh dưỡng nitơ trong
môi trường, với các yếu tố chi phối việc tạo nên kho axit oxo và ngược lại. Mối quan hệ
mô tả ở trên phụ thuộc vào hai yếu tố :
Thứ nhất, lượng nitơ sẵn có cho quá trình chuyển amin và amin hoá. Các axit oxo
tạo nên trong hoàn c
ảnh thiếu nitơ sẽ bị biến đổi thành rượu tương ứng. Những axit oxo
này phải bắt nguồn từ sự trao đổi hydratcacbon, và chúng cũng phải là nguồn axit oxo và
cồn bậc cao khi nấm men sinh trưởng trong môi trường chỉ có nguồn nitơ duy nhất là
(NH
4
)
2
SO
4
.
Thứ hai, sự ức chế ngược của các axit amin lên các phản ứng tổng hợp nên các

mạch cacbon riêng biệt của chúng. Theo Ayrapaa hình dạng chung của hai đường biểu thị
amylalcohol và isobutanol ở sơ đồ có lí do cơ bản là sự ức chế ngược, nhưng không đúng
đối với β-phenylethanol vì có thể phenylalanin đã bị cạn kiệt.
Các công trình nghiên cứu của Ayrapaa không chứng minh ảnh hưởng của sự ức
chế ngượ
c mà cũng không đóng góp gì thêm cho cơ chế tạo rượu bậc cao từ axit amin của
Ehrlich. Tuy nhiên nó đã chỉ rõ : mối quan hệ giữa sự hình thành cồn bậc cao và mức dinh
dưỡng nitơ là giống nhau, bất kể nguồn nitơ dinh dưỡng là gì, là các axit amin hay
(NH
4
)
2
SO
4
; do đó sự ức chế ngược của các axit amin bổ sung từ bên ngoài có thể chỉ
đóng một vai trò thứ yếu nếu so với sự ức chế của lượng axit amin sẵn có cho việc
chuyển và amin hoá.
Khi dư thừa nitơ thì con đường sinh tổng hợp phát triển và khi thiếu nitơ thì con
đường amin hoá các axit oxo sẽ được đẩy mạnh làm cho khả năng hình thành cồn rượu
cao từ các axit oxo khác tăng lên. Ngược lại nếu bổ sung thêm lượ
ng nitơ dinh dưỡng từ
bên ngoài thì sự chuyển amin có khả năng tăng lên, các axit oxo bị dùng hết và do vậy
hình thành ít rượu bậc cao. Chỉ khi nào các axit amin có mặt với lượng vượt quá nhu cầu
của nấm men thì chúng mới bị khử amin và biến thành rượu bậc cao theo con đường
Ehrlich.
Trước đây Ayrapa cũng sử dụng chủng S.carlsbergesis sinh trưởng yếm khí ở 25
0
C
trong môi trường chứa hỗn hợp axit amin tương tự như có ở trong nước mu và bổ sung
14

C-phenylalanin . Tại mức axit amin thấp không đủ cung cấp cho sinh trưởng mạnh thì

phần lớn phenylalanin bị chuyển hoá thành phenylethanol. Tuy nhiên một số
phenylethanol cũng được hình thành theo con đường sinh tổng hợp. Tại môi trường có
nồng độ axit amin cao với lượng nitơ đồng hoá dư thừa người ta vẫn quan sát thấy có sự
hình thành cồn theo con đường sinh tổng hợp, mặc dầu nó lại bị giảm trong cùng điều
kiện và trong một thí nghiệm khác cho thấy việc tổng hợp bị phong toả hoàn toàn bởi
nồng độ
cao của phenylalanin.
Ayrapaa chỉ rõ khi các axit amin có khả năng tạo ra rượu bậc cao theo cơ chế
Ehrlich có mặt trong hỗn hợp cung cấp cho nấm men với lượng vừa phải thì lượng rượu
bậc cao tương ứng trong hỗn hợp lên men sẽ hơi lớn hơn lượng rượu bậc cao khi thiếu
các axit amin này. Do đó tác giả cho rằng sự tạo rượu bậc cao theo con đường tổng hợp
luôn là điều quan trọng nhất. Tuy nhiên theo công trình tiế
p theo với phenylalanin của tác
giả thì có thể tồn tại sự ức chế cơ chế tổng hợp bởi sự có mặt với nồng độ cao các axit
amin tương ứng trong môi trường. Do đó tác giả đề xuất một sự thay đổi, có thể coi là giả
thuyết như sau: Sự ức chế cơ chế tổng hợp có thể được bù trừ bởi sự tạo nên cùng loại cồn
con
đường Ehrlich. Giả dụ rằng hiệu số giữa tổng lượng phenylethanol sinh ra và lượng
phenylethanol tạo ra theo con đường tổng hợp là số phenylethanol tạo ra theo cơ chế
Ehrlich. Các thí nghiệm của Ayrapaa (1965) xác nhận rằng lượng phenylethanol tạo nên
theo cơ chế Ehrlich là ít nhất tại nồng độ axit amin cao nhất ( 800µgN/ml), và nhiều nhất
nằm trong khoảng nồng độ trung gian giữa 100 và 800µgN/ml. Như vậy, khi cung cấp
hỗn hợp các axit amin với lượng dư
thừa, hình như sự chuyển amin bị giảm đáng kể.
Thực vậy, phần phenylalanin được chuyển hoá thành phenylethanol tỉ lệ ngược với hàm
lượng nitơ tổng số của môi trường, nhưng ít phụ thuộc vào giá trị của phenylalanin tham
gia vào hàm lượng nitơ tổng số.
Cơ chế hình thành rượu bậc cao từ axit piruvic

Những điều trình bày ở trên chứng minh rằng cơ chế Ehrlich không phải là con
đường duy nhấ
t tạo ra rượu bậc cao nhờ nấm men. Ingraham (1965 ) đã đưa ra ý kiến trên
dựa vào các bằng chứng sau đây :
1. Trong lên men ở môi trường phức tạp , thành phần rượu bậc cao tạo ra không có
quan hệ mật thiết với thành phần các axit amin của môi trường khi chưa lên men
2. Mặc dầu các axit amin được nấm men hấp thụ một cách nhanh chóng, nhưng tốc
độ tạo rượu bậc cao ở thời kì hấp thụ nhanh không cao hơn ở thời kì sau khi môi tr
ường
hầu như không còn axit amin

3. Một trong hai thứ rượu bậc cao nào đó xuất hiện một cách tự nhiên, ví dụ n-
propanol và α-butanol từ α-aminobutyrat và norvalin;
4. Rượu bậc cao là sản phẩm lên men của tế bào nguyên trong môi trường không
chứa axit amin và được tạo nên trong môi trường tổng hợp, môi trường dùng NH
3
làm
nguồn nitơ duy nhất.
Do đó có dấu hiệu rõ ràng là rượu bậc cao có thể được tạo nên nhờ nấm men từ các
hợp chất cacbon sinh ra theo con đường trao đổi chất cacbonhydrat, gọi là tổng hợp cồn
bậc cao. Những hợp chất cacbon này, ví dụ như các axit 2-xeto thường là các sản phẩm
trung gian trong tổng hợp axit amin có khả năng kích thích sự chuyển amin với glutamat.






Ví dụ về sự hình thành isobutanol diễn ra như sau:

CH
3
CH
3
CH
3

acetyl-CoA
C = O C(OH)COOH CH
3
C OH
Xắp xếp lại
COOH COCH
3
HC(OH)COOH

axit piruvic axit α-axetolactic axit 2,3-dihydroxy-isovaleric

- H
2
O

CH
3
CH
3
CH
3
CH
3

CH
3
CH
3
Alcohol - CO
2

CH CH CH
dehydrogenaza
CH
2
OH CHO COCOOH


isobutanol isobutyratdehyd axit 2- oxoisovaleric

CH
3
CH
3

CH

CHNH
2
COOH
Valin

Các bước trong sơ đồ này từ axit 2-oxoisovaleric xảy ra một cách dễ dàng và trùng
với các bước trong con đường Ehrlich tạo ra isobutanol từ valin . Nếu thay piruvat bằng

2- oxobutyrat thì sau một chuỗi phản ứng sẽ dẫn tới isoleucin và sau đó qua 2-oxo-3-
methylvalerat mà thành amylalcohol hoạt hóa
2-oxobutyrat 2-axetichydroxybutyrat

2,3-dihydroxy-3-methylvalerat

2,3-oxo-3-methylvalerat L-isoleucin
- CO
2

pentanol hoạt hoá Methylbutyraldehyd

2-oxobutyrat không chỉ là tiền chất của pentanol hoạt hoá và isoleucin mà còn bị
biến đổi thành n-propanol (một loại rượu vốn không có một axit amin tương ứng nào )
nhờ loại CO
2
và phản ứng khử trong theo con đường Ehrlich. Tương tự, 2-oxovalerat
thường được biến đổi thành L-valin và L-leucin như đã trình bày ở trên

CoA
2-oxoisovalerat 3-cacboxy-3-hydroxyisocaproat

2-hydroxy-3-cacboxyisocaproat


- CO
2

- CO
2

isovaleraldehyd 2-oxoisocaproat L-leucin

isopentanol

Người ta đã dùng nấm men đột biến để nghiên cứu bản chất của sự hình thành
rượu bậc cao theo con đường tổng hợp đã phát hiện thấy nấm men đột biến không có khả
năng tổng hợp nên một axit amin nào đó, nhưng vẫn có thể tổng hợp nên hỗn hợp các loại
rượu bậc cao trừ loại rượu tương ứng với axit amin khiếm khuyế
t. Như vậy thì các nấm
men đòi hỏi isoleucin và leucin không hoặc chỉ sản sinh chút ít pentanol hoạt hoá và
isopentanol. Do đó dường như rượu bậc cao tạo nên nhờ nấm men không đột biến tăng
lên từ sản phẩm trung gian của quá trình sinh tổng hợp nên axit amin vốn không có ở nấm
men đã đột biến.

Rượu bậc cao trong bia
Bia lên men nổi thường có nhiều rượu bậc cao hơn bia lên men chìm. Thành phần
chủ yếu của rượu bậc cao là: isopentanol, pentanol hoạ
t hoá và isobutanol. Trong số 56
loại bia nổi đem phân tích thì 35 mẫu có hàm lượng rượu bậc cao trung bình 101 ppm
(khi dùng hệ thống skimming), 98 ppm (hệ thống Bunton Union) và 62 ppm (khi dùng hệ
thống Yorkshive Stone square). Phân tích liên tục các loại bia này thì thấy cồn bậc cao xê
dịch trong khoảng 52-101 ppm.
Môi trường bia nồng độ cao có nhiều rượu bậc cao hơn bia nồng độ thấp. Cao nhất
đạt tới 232 ppm. Bia lên men chìm rượu bậc cao cao từ 45÷ 83ppm. Hàm lượng rượu bậc
cao trong bia phụ thuộc các yếu tố sau:
- Chủ
ng loại giống nấm men
- Điều kiện lên men
- Thành phần nước mu

- Phương pháp lên men (nổi/chìm)
- Hệ thống lên men
Theo Hough và Steven đối với bia nổi
- Giai đoạn lên men đầu tiên, rượu bậc cao tăng tỷ lệ thuận nhẹ.

- Giai đoạn tiếp theo tăng nhanh
- Lượng rượu bậc cao từ dịch đường 18
0
Bx xê dịch 51-88ppm
- Rượu bậc cao tiếp tục được tạo ra ở giai đoạn lên men thứ hai, nhưng không xuất
phát từ nấm men tự phân.
- Khi lên men nước dịch đường hoá ở 25
0
C, bia nổi cho nhiều rượu bậc cao hơn
bia chìm. Nhưng khi lên men ở 10
0
C thì hàm lượng rượu bậc cao cả hai loại bia là ngang
nhau. Trong đó bia nổi bị ức chế, bia chìm có sự kích thích tăng nhẹ.
1.1.4.3. Este
Kiểm soát sự hình thành este trong lên men
Este là những cấu tử thơm quan trọng tạo ra mùi thơm tương tự quả hoặc hoa cho
bia, vang và rượu. Khi chúng có mặt với nồng độ phù hợp là điều mong đợi nhưng nếu
với nồng độ cao thì bia không thể chấp nhận được. Điều này, xảy ra khi các
điều kiện lên
men không khống chế được. Các este quan trọng có tác dụng trong cảm quan là ethyl
axetat, isoamyl axetat, isobutylaxetat, 2-phenylethyl axetat và ethyl caproat. Trong bia có
tất cả trên 90 loại este.
Ngoài chủng loại nấm men, còn nhiều yếu tố khác ảnh hưởng tới số lượng các este
tạo thành trong khi lên men bia. Những yếu tố đó là: Nhiệt độ lên men,phương pháp lên
men, tỉ lệ giống và sự thông gió.

- Nhiệt độ lên men: tăng từ 10 lên 25
0
C, nồng độ ethyl axetat sẽ tăng từ 12,5 lên
21,5 mg/lít;
- Phương pháp lên men: lên men bán liên tục và liên tục cho nồng độ este cao hơn
lên men gián đoạn;
- Tỷ lệ giống: tỷ lệ giống cao làm cho hàm lượng ethyl axetat giảm;
- Thông gió: thông gió thấp làm tăng khả năng sinh cồn bậc cao.
Este tăng là kết quả của phản ứng giữa cồn (bậc thấp và bậc cao) với axit béo và
acyl-CoA. Enzim alcohol-acetyl transferaza xúc tác phản ứng này . Thành phần acyl của
các axit béo hoạt hoá có thể là axetat sinh ra t
ừ phản ứng của piruvat-dehydrogenaza.
Enzim tổng hợp acyl-CoA-synthetaza có thể hoạt hoá trực tiếp axetat và các axit mạch dài
hơn.
Thành phần este sinh ra phụ thuộc phần lớn vào chủng loại nấm men. Điều này có
thể phản ánh qua sự có mặt của một loạt các alcohol axetyltransferaza với các đặc tính cơ
chất khác nhau. Hoạt tính tương đối của những enzim này phụ thuộc với mức độ nào đó