nghiên cứu phát triển vaccine thực vật dùng qua đường miệng cho gia cầm phòng chống bệnh h5n1 ở việt nam

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
NHIỆM VỤ HỢP TÁC QUỐC TẾ VỀ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
THEO NGHỊ ĐỊNH THƯ VỚI VƯƠNG QUỐC BỈ
(Giai đoạn 2007 – 2009)








BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI





Nghiên cứu phát triển vaccine thực vật dùng qua đường
miệng cho gia cầm phòng chống bệnh H5N1 ở Việt Nam
(Development of a plant-based veterinary oral vaccine to
combat avian influenza in Vietnam)





Chủ nhiệm đề tài: TS. Lê Văn Sơn

8032


Hà Nội, 12/2009


BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
NHIỆM VỤ HỢP TÁC QUỐC TẾ VỀ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
THEO NGHỊ ĐỊNH THƯ VỚI VƯƠNG QUỐC BỈ
(Giai đoạn 2007 – 2009)





BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI


Nghiên cứu phát triển vaccine thực vật dùng qua đường
miệng cho gia cầm phòng chống bệnh H5N1 ở Việt Nam
(Development of a plant-based veterinary oral vaccine
to combat avian influenza in Vietnam)




Chủ nhiệm đề tài: TS. Lê Văn Sơn

Cơ quan chủ trì: Viện Công nghệ sinh học
Địa chỉ: Nhà A10, 18 Hoàng Quốc Việt, Hà Nội
Điện thoại: 37562368 E-mail:





Hà Nội, 12/2009
 Báo cáo tổng kết đề tài – Lời cảm ơn
Thời gian thực hiện 2007-2009
i
LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đề tài nghiên cứu này, chủ nhiệm đề tài xin chân thành cảm
ơn:
 Bộ Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã cấp kinh phí thực hiện.
 Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, Ban Kế hoạch tài chính -
Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ và tạo điều
kiện tốt để đề tài thực hiện đúng tiến độ̣.
 Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ
gen - Viện Công nghệ
sinh học đã thực hiện việc giải trình tự gen.
 Trại sinh học thực nghiệm Cổ Nhuế - Viện Công nghệ sinh học
đã hỗ trợ ra cây ngoài nhà lưới.
 Phòng Miễn dịch học – Viện Công nghệ sinh học đã thực hiện
việc kiểm tra mức độ đáp ứng miễn dịch trên động vật.


Chủ nhiệm đề tài

TS. Lê Văn Sơn

1

VIỆN KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
__________________
CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

Hà Nội, ngày tháng năm 20


BÁO CÁO THỐNG KÊ
KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI


I. THÔNG TIN CHUNG
1. Tên đề tài:
Tiếng Việt: “Nghiên cứu phát triển vaccine thực vật dùng qua đường
miệng cho gia cầm phòng chống bệnh H5N1 ở Việt Nam”
Tiếng Anh: “Development of a plant-based veterinary oral vaccine to
combat avian influenza in Vietnam”
Thuộc: Nhiệm vụ hợp tác quốc tế về khoa học và công nghệ theo nghị định
thư với Vương quốc Bỉ
2. Chủ nhiệm đề tài:

Họ và tên: Lê Văn Sơn
Ngày, tháng, năm sinh: 22/01/1967 Nam/ Nữ: Nam
Học hàm, học vị: Tiến sỹ
Chức danh khoa học: Chức vụ:
Điện thoại: Tổ chức: 043 7562368 Mobile: 0915570750
E-mail:
Tên tổ chức đang công tác: Viện Công nghệ
sinh học
Địa chỉ tổ chức: 18 Hoàng Quốc Việt, Cầy Giấy, Hà Nội
Địa chỉ nhà riêng: xóm 4B, Cổ Nhuế, Từ Liêm, Hà Nội


2
3. Tổ chức chủ trì đề tài/dự án:
Tên tổ chức chủ trì đề tài: Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ
Việt Nam
Điện thoại: 37562790 Fax: 38363144
E-mail:
Website:

Địa chỉ: 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội
Họ và tên thủ trưởng tổ chức: PGS. TS. Trương Nam Hải
Số tài khoản: 931.01.064
Ngân hàng: Kho bạc nhà nước Ba Đình, Hà Nội
Tên cơ quan chủ quản đề tài: Bộ Khoa học và Công nghệ

II. TÌNH HÌNH THỰC HIỆN
1. Thời gian thực hiện đề tài/dự án:
- Theo Hợp đồng đã ký kết: từ tháng 06 năm 2007 đến tháng 05 năm 2009
- Thực tế thực hiện: t

ừ tháng 06 năm 2007 đến tháng 12 năm 2009
- Được gia hạn :
- Lần 1: từ tháng 05 năm 2009 đến tháng 12 năm 2009
(Quyết định số 2312/BKHCN-XHTN, ngày 14/9/2009 của Bộ Khoa học và Công
nghệ)
2. Kinh phí và sử dụng kinh phí:
a) Tổng số kinh phí thực hiện: 950 tr.đ, trong đó:
+ Kính phí hỗ trợ từ SNKH: 950 tr.đ.
+ Kinh phí từ các nguồn khác: 0 tr.đ.
b) Tình hình cấp và sử dụng kinh phí từ nguồn SNKH:



3
Theo kế hoạch Thực tế đạt được
Số
TT
Thời gian
(Tháng, năm)
Kinh phí
(Tr.đ)
Thời gian
(Tháng, năm)
Kinh phí
(Tr.đ)
Ghi chú
(Số đề nghị
quyết toán)
1 2007 500 2007 463, 383 524 463, 383 524
2 2008 450 2008 388, 216 476 388, 216 476

3 2009 98, 400 000 98, 400 000

Cộng 950 950



c) Kết quả sử dụng kinh phí theo các khoản chi:
Đơn vị tính: Triệu đồng
Theo kế hoạch Thực tế đạt được
Số
TT
Nội dung
các khoản chi
Tổng SN
KH
Nguồn
khác
Tổng SN
KH
Nguồn
khác
1 Trả công lao động
(khoa học, phổ
thông)
193,7 193,7 0 213,700000 213,700000 0
2 Nguyên, vật liệu,
năng lượng
469,8 469,8 0 497,518075 497,518075 0
3 Thiết bị, máy móc 0 0 0 0 0 0
4 Xây dựng, sửa chữa

nhỏ
16,0 16,0 0 16,000000 16,000000 0
5 Chi khác 270,5 270,5 0 222,781925 222,781925 0

Tổng cộng 950 950 0 950 950 0
- Lý do thay đổi (nếu có): điều chỉnh tiền đoàn ra, bổ sung cho nghiên cứu trong
nước

3. Các văn bản hành chính trong quá trình thực hiện đề tài/dự án:

Số
TT
Số, thời gian ban
hành văn bản
Tên văn bản Ghi chú

4
1 95/QĐ-BKHCN
ngày 18/1/2007
QĐ thành lập Hội đồng KHCN xét duyệt đề
cương NC

2 823/QĐ-BKHCN
ngày 22/5/2007
QĐ phê duyệt các nhiệm vụ hợp tác QT 2007
3 29/823/2007/HĐ-
NĐT ngày
6/12/2007
HĐ và Phiếu thẩm định thực hiện nhiệm vụ hợp
tác KHCN theo Nghị định thư

4 1116/KHCNVN-
HTQT ngày
8/8/2007
Thay đổi chủ nhiệm nhiệm vụ hợp tác KHCN
theo Nghị định thư

5 2312/QĐ-
BKHCN-XHTN
ngày 14/9/2009
Gia hạn thời gian thực hiện nhiệm vụ hợp tác
KHCN theo Nghị định thư

6 2976/QĐ-
BKHCN-XHTN
ngày 26/11/2009
Thay đổi nội dung-kinh phí của nhiệm vụ hợp
tác KHCN theo Nghị định thư

7 3157/QĐ-
BKHCN-XHTN
ngày 19/12/2009
Điều chỉnh kinh phí mua vật tư hóa chất của
nhiệm vụ hợp tác KHCN theo Nghị định thư

8 564a/QĐ-CNSH
25/12/2009
Thành lập hội đồng nghiệm thu quy trình
KHCN

9 564/QĐ-CNSH
25/12/2009
Thành lập hội đồng nghiệm thu cơ sở của đề tài


4. Tổ chức phối hợp thực hiện đề tài, dự án:

Số
TT
Tên tổ chức
đăng ký theo
Thuyết minh
Tên tổ chức đã
tham gia thực hiện
Nội dung
tham gia chủ yếu
Sản phẩm chủ
yếu đạt được
1 Trung tâm thú
y vùng Cần
Thơ/ TT kiểm
nghiệm thuốc
thú y TƯ
Phòng Miễn dịch
học, Viện Công nghệ
sinh học
Kiểm tra hiệu quả
sản phẩm trên gia
cầm
Kiểm tra miễn

dịch trên gia
cầm

5
2 Trường Đại
học Tự do
(VUB), Vương
quốc Bỉ
Trường Đại học Tự
do (VUB), Vương
quốc Bỉ
- Thiết kế vector
- Chuyển gen
- Phân tích cây
chuyển gen
- Kiểm tra hiệu
quả sản phẩm
Đào tao, hợp tác
nghiên cứu
3 Trung tâm Thú
y và Nông
nghiệp (VAR-
CODA-
CERVA),
Vương quốc
Bỉ
Trung tâm Thú y và
Nông nghiệp (VAR-
CODA-CERVA),
Vương quốc Bỉ

Kiểm tra hiệu quả
sản phẩm trên gia
cầm

- Lý do thay đổi (nếu có):

5. Cá nhân tham gia thực hiện đề tài, dự án:
(Người tham gia thực hiện đề tài thuộc tổ chức chủ trì và cơ quan phối hợp, không quá 10 người kể cả chủ nhiệm)

Số
TT
Tên cá nhân
đăng ký theo
Thuyết minh
Tên cá nhân đã
tham gia thực
hiện
Nội dung tham gia
chính
Sản phẩm chủ
yếu đạt được
1 TS Lê Văn Sơn TS Lê Văn Sơn Chủ nhiệm đề tài Tổng hợp phân
tích kết quả
2 GS. TS Lê Trần
Bình
GS. TS Lê Trần
Bình
Phân tích cây
chuyển gen
Chọn các dòng

chuyển gen
3 TS Nguyễn
Trung Nam
TS Nguyễn
Tường Vân
Chuyển gen vào
arabidopsis
Cây arabidopsis
chuyển gen
4 CN Phan Trọng
Hoàng
CN Phan Trọng
Hoàng
Chuyển gen vào
thuốc lá
Cây thuốc lá
chuyển gen
5 TS Nguyễn Bá
Thành
KS Bùi Phương
Thảo
Tối ưu quy trình
chuyển gen đậu
tương
Quy trình chuyển
gen
6 Prof. Dr. Geert
Angenon
TS Chu Hoàng
Hà

Thiết kế vector Các vector
chuyển gen
7 Dr. Tran Thanh
Thu
CN Ngô Thị
Thu Hương
Phân tích cây
chuyển gen
Phân tích các
dòng cây c.gen
8 Dr. Thierry van ThS Đoàn Thị Kiểm tra hiệu quả Đánh giá hiệu

6
den Berg Thanh Hương sản phẩm trên gia
cầm
lực kháng
nguyên của hạt
chuyển gen
9 Prof. Dr. Geert
Angenon
Chủ nhiệm phía Bỉ Tổng hợp phân
tích kết quả
10 Dr. Tran Thanh
Thu
Chuyển gen và
phân tích cây c. gen
Cây arabidopsis
chuyển gen
- Lý do thay đổi ( nếu có):

6. Tình hình hợp tác quốc tế:
Số
TT
Theo kế hoạch

Thực tế đạt được

1 2007: 01 cán bộ sang VUB, Bỉ để
thực tập nghiên cứu, kinh phí đi lại
phía VN cấp
2007: 01 cán bộ sang VUB, Bỉ để
thực tập nghiên cứu, kinh phí đi lại
phía VN cấp
2 2008: 03 cán bộ sang VUB, Bỉ để
thực tập và hội thảo, kinh phí đi lại
phía VN cấp
2008: 01 cán bộ sang VUB, Bỉ để
hội thảo, kinh phí đi lại phía VN cấp
3 2008: 04 chuyên gia Bỉ sang VN để
trao đổi đề tài, kinh phí sinh hoạt
phía VN cấp
2008: 04 chuyên gia Bỉ sang VN để
trao đổi đề tài, kinh phí sinh hoạt
phía VN cấp
4 2009: 02 chuyên gia Bỉ sang VN để
trao đổi đề tài, kinh phí sinh hoạt
phía VN cấp
2009: 01 chuyên gia Bỉ sang VN để
trao đổi đề tài, kinh phí sinh hoạt
phía VN cấp

- Lý do thay đổi (nếu có): Phia đối tác không bố trí được thời gian

7. Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị:
Số TT Theo kế hoạch Thực tế đạt được
1 Hội thảo về thực hiện đề tài
tại Hà Nội
Hội thảo thảo luận kết quả thực hiện đề tài
tại phòng CNTBTV, Viện CNSH
- Lý do thay đổi (nếu có):


7
8. Tóm tắt các nội dung, công việc chủ yếu:
Thời gian
Số
TT
Các nội dung, công việc
chủ yếu
Theo kế
hoạch
Thực tế
đạt được
Người,
cơ quan
thực hiện
1 Thiết kế vector dùng cho chuyển
gen
6/2007-
12/2007

6/2007-
12/2007
Viện CNSH
2 Xây dựng tối ưu quy trình chuyển
gen vào Arabidopsis và cây đậu
tương
6/2007-
3/2008
6/2007-
3/2008
Viện CNSH
3 Tạo các dòng cây chuyển gen 4/2008-
12/2008
4/2008-
4/2009
Viện CNSH
4 Phân tích mức độ phân tử các
dòng cây chuyển gen
10/2008-
12/2008
1/2009-
8/2009
Viện CNSH
5 Đánh giá sơ bộ hiệu lực của
kháng nguyên
1/2009-
5/2009
5/2009-
11/2009
Phòng Miễn

dịch học -Viện
CNSH
- Lý do thay đổi (nếu có): Thời vụ cây trồng không thuận lợi và phía bạn (đối tác
Bỉ) có sự thay đổi về tổ chức nên không theo đúng kế hoạch được

III. SẢN PHẨM KH&CN CỦA ĐỀ TÀI, DỰ ÁN
1. Sản phẩm KH&CN đã tạo ra:
a) Sản phẩm Dạng I:
(Mẫu (model, maket); sản phẩm (là hàng hoá, có thể được tiêu thụ trên thị trường); vật liệu;
thiết bị, máy móc; dây chuyền công nghệ; giống cây trồng; giống vật nuôi và các loại khác)
Số lượng Số
TT
Tên sản phẩm và chỉ
tiêu chất lượng chủ yếu
Đơn
vị đo
Theo kế hoạch Thực tế đạt được
1 Các vector chuyển gen có
mang các gen của H5N1
vector 7 7
2 Các dòng đậu tương dòng 1-2 3

8
chuyển gen
3 Các dòng cây chuyển gen dòng 5 dòng
arabidopsis
7 dòng
arabidopsis
6 dòng thuốc lá

b) Sản phẩm Dạng II:
(Nguyên lý ứng dụng; phương pháp; tiêu chuẩn; quy phạm; phần mềm máy tính; bản vẽ
thiết kế; quy trình công nghệ; sơ đồ, bản đồ; số liệu, cơ sở dữ liệu; báo cáo phân tích; tài
liệu dự báo (phương pháp, quy trình, mô hình, ); đề án, qui hoạch; luận chứng kinh tế-kỹ
thuật, báo cáo nghiên cứu khả thi và các sản phẩm khác)
Yêu cầu khoa học cần đạt Số
TT
Tên sản phẩm

Theo kế hoạch Thực tế đạt được
1 Quy trình chuyển gen vào cây đậu
tương
1 1
2 Kết quả phân tích khả năng gây
miễn dịch của sản phẩm trên đối
tượng gia cầm
1 1
c) Sản phẩm Dạng III:
(Bài báo; Sách chuyên khảo; và các sản phẩm khác. Tình hình công bố kết quả nghiên cứu
(bài báo, ấn phẩm, ) ở các tạp chí có uy tín trong, ngoài nước và mức độ trích dẫn)
Yêu cầu khoa học cần đạt Số
TT
Tên sản phẩm

Kế hoạch Đạt được
Số lượng, nơi công bố
(Tạp chí, nhà xuất bản)
1 Bài báo trong
tạp chí chuyên
ngành

1-2 6 (1) Tạp chí Công nghệ sinh
học
(3) Hội nghị KHCN toàn
quốc Thái Nguyên 2009
(1) Hội nghị khoa học toàn
quốc lần 4
(1) Tạp chí Khoa học
ĐHQGHN, Khoa học Tự
nhiên và Công nghệ


9
2 Báo cáo hội
nghị quốc tế
0 2 (1) The Third International
Conference on Plant-Based
Vaccines & Antibodies -
University of Verona, Italy
- 15-17 June, 2009
(1) BPBA symposium on
“Secondary Metabolites and
Molecular Farming" Gent-
Belgium 7th Nov 2008


d) Kết quả đào tạo:
Số lượng
Số
TT
Cấp đào tạo, Chuyên

ngành đào tạo
Theo kế hoạch Đạt được
Ghi chú
(Thời gian kết
thúc)
1 Thạc sỹ 1 1 2009
2 Tiến sỹ 0 1 2012

2. Đánh giá về hiệu quả do đề tài, dự án mang lại:
a) Hiệu quả về khoa học và công nghệ:
(Nêu rõ danh mục công nghệ và mức độ nắm vững, làm chủ, so sánh với trình độ công nghệ so với khu vực
và thế giới…)
- Quy trình chuyển gen qua mô phân sinh ở nách lá mầm đậu tương ĐT12 là cơ
sở để chuyển các gen vào các giống đậu tương - đối tượng được cho là tương đối
khó để chuyển gen, nhằm tạo ra những giống đậu tương có phẩm chất tốt, khả năng
chống chịu cao, đáp ứng nhu cầu của sản xuất.
- Hệ thống vector biểu hiện tốt trong hạt thực v
ật sẽ tạo thuận lợi cho việc biểu
hiện các protein tái tổ hợp khác, làm cơ sở cho công nghệ nền farming. Có thể ứng
dụng hệ thống vector này cho các tính trạng khác, như: chống chịu điều kiện bất lợi,
chống chịu sâu bệnh, nâng cao năng suất và chất lượng,….
- Với kết quả sơ bộ về khả năng đáp ứng miễn dịch trên độ
ng vật có thể khẳng
định rằng kháng nguyên biểu hiện trong hạt chuyển gen có khả năng gây đáp ứng

10
miễn dịch qua đường miệng. Kết quả này mở ra một hướng đi mới trong sản xuất
vaccine chống virus cúm H5N1 ở gia cầm nói riêng và vaccine dùng qua đường
miệng nói chung.
- Đào tạo các cán bộ khoa học trẻ nắm vững các kỹ thuật trong việc nghiên cứu

chuyển gen thực vật cũng như trong việc sản xuất vaccine ăn được theo con đường
thực vật. Đồng thời góp phần đưa nền khoa h
ọc nước ta từng bước hội nhập khu
vực và quốc tế trên các lĩnh vực về công nghệ sinh học thực vật.
b) Hiệu quả về kinh tế xã hội:
(Nêu rõ hiệu quả làm lợi tính bằng tiền dự kiến do đề tài, dự án tạo ra so với các sản phẩm cùng loại trên thị
trường…)
- Hạt cây chuyển gen có mang các kháng nguyên HA và epitope đã được chứng
minh là có khả năng gây miễn dịch ở động vật. Vì vậy việc tạo ra các dòng cây
chuyển gen có mang các kháng nguyên này sẽ là tiền đề cho sản xuất vaccine ăn
được chống virus cúm H5N1 ở gia cầm, từ đó đem lại hiệu quả kinh tế nổi bật như
sản xuất đơn giản, giá thành thấp, hiệu quả cao trong phòng bệnh và có độ an toàn
cao. Vaccine sản xuấ
t từ thực vật được xem là hướng đi phù hợp với những nước
đang phát triển vì mục đích chăm sóc sức khoẻ cộng đồng
- Vaccine cúm gia cầm H5N1 trên cây trồng chuyển gen sẽ là nguồn vaccine đặc
hiệu chống cúm gia cầm ở Việt Nam, luôn chủ động trong công tác phòng chống
dịch cúm. Việc sản xuất vaccine cúm gia cầm trên cây trồng chuyển gen sẽ thúc đẩy
và làm cơ sở để phát triển các loại vaccine khác.

3. Tình hình thực hiện chế độ báo cáo, kiểm tra của đề tài, dự án:
Số
TT
Nội dung
Thời gian
thực hiện
Ghi chú
(Tóm tắt kết quả, kết luận chính, người chủ trì…)
I Báo cáo định kỳ
II Kiểm tra định kỳ

Lần 1 27/3/2009 -Nội dung nghiên cứu còn lớn, cần tổ chức
thực hiện
-Liên hệ với bạn để thực hiện tốt hơn

11
-Giải trình thêm về kinh phí
Người chủ trì
: TS. Nghiêm Xuân Minh –
Vụ trưởng Vụ Khoa học xã hội và tự nhiên
– Bộ Khoa học và Công nghệ
III Nghiệm thu cơ sở 4/2/2010 Bổ sung biên bản nghiệm thu quy trình,
báo cáo tóm tắt, sửa chữa theo phản biện
và hội đồng
Người chủ trì
: PGS. TS. Trương Nam Hải
– Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học


Chủ nhiệm đề tài
(Họ tên, chữ ký)






TS. Lê Văn Sơn
Thủ trưởng tổ chức chủ trì
(Họ tên, chữ ký và đóng dấu)

 Báo cáo tổng kết đề tài - Danh mục các từ viết tắt
Thời gian thực hiện 2007-2009
ii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

AS Acetosyrigone
A. tumefaciens Agrobacterium tumefaciens
BAP 6-benzyladenine
bp Base pair
DNA Deoxyribonucleic acid
dNTP Deoxynucleoside triphosphate
DTT Dithiothreitol
EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid
E. coli Escherichia coli
GA3 Gibberellic acid
gus Gen mã hóa enzyme β-Glucuronidase
IAA Indoleacetic acid
IBA Indole-3-butyric acid
kb Kilo base
LB Luria and Bertani
MES 2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid
MS Murashige and Skoog (1962)
NAA α-Naphthaleneacetic acid
OD Optical density
PCR Polymerase Chain Reaction
PPT Phosphinothricin
SDS Sodium dodecylsulfat
Taq Thermus aquaticus DNA
T-DNA Transfer –DNA

Ti- plasmid Tumor inducing plasmid
v/p vòng/phút
X-gluc 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide
YEP Yeast extract peptone

 Báo cáo tổng kết đề tài - Danh sách các thành viên tham gia đề tài
Thời gian thực hiện 2007-2009
iii
DANH SÁCH CÁN BỘ THAM GIA THỰC HIỆN ĐỀ TÀI
STT Họ và tên
Trách nhiệm
trong đề tài
Học hàm,
học vị
Số tháng
làm việc
1 Lê Văn Sơn Chủ nhiệm ĐT TS 18 tháng
2 Lê Trần Bình Thành viên GS. TS 6 tháng
3 Chu Hoàng Hà Thành viên TS 12 tháng
4 Nguyễn Tường Vân Thành viên TS 12 tháng
5 Bùi Phương Thảo Thành viên KS 18 tháng
6 Phan Trọng Hoàng Thành viên CN 12 tháng
7 Ngô Thị Thu Hương Thành viên CN 18 tháng
8 Đoàn Thị Thanh Hương Thành viên ThS 6 tháng

Và một số người khác
 Báo cáo tổng kết đề tài - Mục lục
Thời gian thực hiện 2007-2009
iv
MỤC LỤC

Trang
LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

DANH SÁCH CÁN BỘ THAM GIA THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

MỞ ĐẦU
1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. CÚM VÀ VIRUS CÚM H5N1
3
1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CÚM H5N1 Ở VIỆT NAM
4
1.3. VACCINE VÀ BIỆN PHÁP PHÒNG CHỐNG DỊCH CÚM A/H5N1
7
1.4. CÂY ĐẬU TƯƠNG
10
1.5. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN VÀO CÂY ĐẬU TƯƠNG
11
1.6. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI
11
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
13
2.1. VẬT LIỆU 13
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14
2.2.1. Các phương pháp sử dụng trong xây dựng mô hình tái sinh và chuyển gen in
vitro
14
2.2.2. Các phương pháp thiết kế vector chuyển gen

18
2.2.3. Các phương pháp phân tích cây biến nạp
23
2.2.4. Kiểm tra khả năng đáp ứng miễn dịch với hạt chuyển gen trên động
vật
24
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
30
3.1. TỐI ƯU QUY TRÌNH CHUYỂN GEN VÀO CÂY ĐẬU TƯƠNG
30
3.1.1 Tối ưu thời gian khử trùng hạt
30
3.1.2. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo đa chồi từ lá mầm hạt chín
32
3.1.3. Ảnh hưởng của hocmon sinh trưởng (GA
3
, IAA) tới khả năng kéo dài
chồi
34
3.1.4. Ảnh hưởng của IBA đến hiệu quả tạo rễ
37
3.1.5. Xác định giá thể thích hợp cho ra cây in vitro
39
3.1.6. Ngưỡng sống sót của cây đậu tương in vitro trên môi trường chứa
kanamycin
41
 Báo cáo tổng kết đề tài - Mục lục
Thời gian thực hiện 2007-2009
v
3.1.7. So sánh khả năng tái sinh phục vụ chuyển gen của 2 giống đậu tương

ĐT12 và DT84
45
3.1.8. Kết quả chuyển gen gus
47
3.2. THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN
50
3.2.1. Thiết kế và tổng hợp gen HA
50
3.2.2. Thiết kế vector biểu hiện đặc trưng trong hạt
52
3.2.3. Thiết kế vector biểu hiện mạnh trong toàn bộ cây
60
3.3. CHUYỂN GEN
63
3.3.1. Biến nạp các cấu trúc vào A.thaliana
63
3.3.2. Biến nạp vào cây thuốc lá
66
3.3.3. Biến nạp vào cây đậu tương
68
3.4. KIỂM TRA MỨC ĐỘ ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH TRÊN ĐỘNG VẬT
73
3.4.1 Kiểm tra khả năng ngưng kết hồng cầu của kháng nguyên
73
3.4.2. Kiểm tra sơ bộ khả năng đáp ứng miễn dịch trên chuột
73
3.4.3. Kiểm tra khả năng đáp ứng miễn dịch trên gà
74
CHƯƠNG 4. TỔNG QUÁT HÓA VÀ ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ ĐỀ TÀI
78

4.1. KẾT QUẢ VỀ KHOA HỌC 78
4.2. KẾT QUẢ NỔI BẬT VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG 79
4.3. ĐÀO TẠO 80
4.4. DANH SÁCH CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 80
4.5. QUYẾT TOÁN KINH PHÍ 81
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
83
TÀI LIỆU THAM KHẢO
85
PHỤ LỤC














 Báo cáo tổng kết đề tài - Mục lục
Thời gian thực hiện 2007-2009
vi
MỤC LỤC BẢNG

Trang

Bảng 1.1. Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam từ năm 2001 đến 2006 10
Bảng 2.1. Thành phần phản ứng PCR 18
Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR 19
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng ghép nối 20
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng LR 21
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng cắt bằng enzyme hạn chế 22
Bảng 2.6. Danh sách các mẫu huyết thanh gà thu được 27
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến khả năng nảy mầm hạt 30
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của BAP tới khả năng tạo đa chồi 32
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của GA
3
đến khả năng kéo dài chồi 34
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của IAA tới khả năng kéo dài chồi 36
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ 38
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của giá thể tới hiệu quả ra cây cây đậu tương 40
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của kanamycin tới quá trình phát triển chồi 42
Bảng 3.8. Đánh giá khả năng tạo chồi của 2 giống đậu tương 45
Bảng 3.9. Đánh giá khả năng kéo dài chồi của 2 giống đậu tương 46
Bảng 3.10. Đánh giá khả năng ra rễ của 2 giống đậu tương trên môi trường RM
có bổ sung các kháng sinh diệt khuẩn
47
Bảng 3.11. Các primer đã được thiết kế đặc hiệu gen và sử dụng 53
Bảng 3.12. Kết quả chuyển các cấu trúc SLHEP, HA, M1 đậu tương ĐT12 69
Bảng 3.13. Kết quả ELISA trên chuột 74
Bảng 3.14. Kết quả chuẩn độ kiểm tra kháng nguyên 8 HA 75
Bảng 3.15. Kết quả xét nghiệm HI trên các mẫu huyết thanh gà đã được gây đáp
ứng miễn dịch
76







 Báo cáo tổng kết đề tài - Mục lục
Thời gian thực hiện 2007-2009
vii
MỤC LỤC HÌNH


Trang
Hình 1.1a. Virus cúm với các yếu tố kháng nguyên H và N, lớp màng bao
(envelop), protein liên kết (matrix protein M1), ribonucleoprotein (RNP)
3
Hình 1.1b. Influenza A virus, loại virus gây bệnh cúm gia cầm. (Ảnh chụp những
tiểu phần virus được nhuộm âm tính trên kính hiển vi điện từ truyền qua)
3
Hình 1.2. Mức độ tương đồng của genom virus H5N1 chủng Việt Nam so với các
chủng trong khu vực và trên thế giới
6
Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát 14
Hình 2.2. Sơ đồ thí nghiệm tái sinh và chuyển gen vào cây đậu tương 16
Hình 3.1. Hạt nảy mầm sau các thời gian khử trùng khác nhau 31
Hình 3.2. Cụm chồi hình thành trên môi trường có BAP 2 mg/l (SIM4) và 2,5 mg/l
(SIM5)
33
Hình 3.3. Chồi kéo dài trên môi trường có nồng độ GA
3
khác nhau 35
Hình 3.4. Chồi phát triển trong môi trường không có (SEM1) và có (SEM1

1
) IAA 37
Hình 3.5. Ảnh hưởng của IBA tới việc hình thành rễ cây in vitro 39
Hình 3.6. Cây đậu tương sinh trưởng trên các giá thể khác nhau 41
Hình 3.7. Cụm chồi hình thành trên các môi trường có các nồng độ kanamycin 43
Hình 3.8. Chồi kéo dài trên môi trường có các nồng độ kanamycin 43
Hình 3.9. Rễ cây phát triển trên môi trường có các nồng độ kanamycin 44
Hình 3.10. Cụm chồi tạo được sau 4 tuần nuôi cấy trên SIM 45
Hình 3.11. Cụm chồi trên môi trường kéo dài SEM 46
Hình 3.12. Phân tích biểu hiện của gen gus trong đậu tương ĐT12 48
Hình 3.13: Trình tự amino acid của gen HA tách từ chủng H5N1 Việt Nam
(AJ867074)
50
Hình 3.14. Trình tự và cấu trúc của đoạn gen nhân tạo (SLHEP) 51
Hình 3.15. Kiểm tra gen SLHEP trong p201-SLHEP 52
Hình 3.16. Cấu trúc của epitopes, HA, NA và M1 trong p201-SLHEP 54
Hình 3.17. Kiểm tra cấu trúc SLHEP-HA trong plasmid p201-SLHEP-HA 55
Hình 3.18. Kiểm tra cấu trúc SLHEP-NA trong plasmid p201-SLHEP-NA 56
 Báo cáo tổng kết đề tài - Mục lục
Thời gian thực hiện 2007-2009
viii
Hình 3.19. Kiểm tra cấu trúc SLHEP-M1 trong plasmid p201-SLHEP-M1 bằng
PCR với primer EcoRI/HindIII-HA
56
Hình 3.20. Sơ đồ thiết kế cấu trúc SLHEP vào vector chuyển gen pPhaso-dest 57
Hình 3.21. Kiểm tra gen SLHEP trong vector pPhaso-SLHEP 58
Hình 3.22. Kiểm tra gen SLHEP-HA trong vector pPhaso-SLHEP-HA 58
Hình 3.23. Kiểm tra gen SLHEP-NA trong vector pPhaso-SLHEP-NA 59
Hình 3.24. Kiểm tra gen SLHEP-M1 trong vector pPhaso-SLHEP-M1 59
Hình 3.25. Kiểm tra vector biến nạp trong chủng Agrobacterium C58 bằng PCR 60

Hình 3.26. Cấu trúc gen biểu hiện trong toàn bộ cây 61
Hình 3.27. Kiểm tra vector tái tổ hợp bằng cắt enzyme hạn chế HindIII 61
Hình 3.28. Kiểm tra dòng A. tumefaciens CV58C1 mang gen biến nạp bằng PCR 62
Hình 3.29. PCR kiểm tra cây Arabidopsis chuyển gen SLHEP 63
Hình 3.30. Kết quả phân tích Southern các dòng cây T0 chuyển gen 64
Hình 3.31. Kết quả phân tích Western các dòng cây T0 chuyển gen 65
Hình 3.32. Hạt của các dòng cây A. thaliana chuyển gen thế hệ T1 được chọn lọc
trên môi trường chứa kháng sinh (A) và trồng trên bầu đất (B)
65
Hình 3.33. Kết quả tinh sạch protein tái tổ hợp SLHEP 66
Hình 3.34. Kết quả chuyển đoạn gen vào cây thuốc lá 66
Hình 3.35. PCR kiểm tra cây thuốc lá chuyển gen HA, NA và M1 67
Hình 3.36. Biểu hiện protein tái tổ hợp trong lá cây thuốc lá biến nạp 67
Hình 3.37. Hình ảnh minh họa quá trình chuyển gen 69
Hình 3.38. Kết quả điện di sản phẩm ADN tổng số của các dòng cây chuyển gen 70
Hình 3.39. Kiểm tra cây đậu tương T0 chuyển gen SLHEP (hàng trên) và HA
(hàng dưới) bằng PCR
71
Hình 3.40. Các cây đậu tương chuyển gen thế hệ T1 được trồng trong nhà lưới 71
Hình 3.41. Kiểm tra cây đậu tương T1 chuyển gen SLHEP bằng PCR 72
Hình 3.42. Kiểm tra khả năng ngưng kết hồng cầu của protein hạt cây chuyển
gen
73
Hình 3.43. Kết quả đọc ELISA kháng thể SLHEP trong huyết thanh chuột 74
 Báo cáo tổng kết đề tài – Mở đầu
Thời gian thực hiện 2007-2009
1
MỞ ĐẦU
Cúm là một căn bệnh nguy hiểm gây tử vong cao trên khắp thế giới. Hằng
năm dịch cúm đã làm cho nửa tỷ người mắc bệnh, chủ yếu là trẻ em. Hiện nay, cúm

H5N1- chủng virus nguy hiểm nhất trên gia cầm đã lan truyền trên 40 quốc gia ở
Châu Á, Trung Đông, Châu Âu và Châu Phi. Chủng này mới xuất hiện gần đây
nhưng là một loại subtype có độc lực cao, được chứng minh là có khả năng lây
nhiễm từ độ
ng vật sang người và gây bệnh trên người trong các vụ dịch cúm gà
những năm 1996-2005. Ở nước ta, dịch cúm gia cầm H5N1 xảy ra từ những tháng
cuối năm 2003 và đã gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi gia cầm và
người. Theo tổng kết của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), Việt Nam là nước có số
người mắc bệnh và tử vong cao nhất trong số 8 nước có dịch xảy ra ở Châu Á.
Dịch cúm gia cầm hàng nă
m diễn biến ngày càng phức tạp vì hệ gen của
virus cúm A luôn biến đổi và thích ứng, cũng như nguồn tàng trữ và lây lan bệnh là
chim di cư và thuỷ cầm rất khó khống chế. Hiện nay, việc phòng chống virus cúm A
nói chung và H5N1 nói riêng, ngoài các biện pháp phòng chống dịch một cách tiên
quyết như tiêu độc, xử lý gà bệnh, thanh lý gà nhiễm hoặc nguy cơ nhiễm, tìm kiếm
và sử dụng vaccine vẫn là hướng thiết yếu nhất để khống chế và ng
ăn chặn lây lan
sang người. Có nhiều loại vaccine đang được sử dụng và nghiên cứu bao gồm cả
vaccine truyền thống và vaccine thế hệ mới được tạo ra bằng các phương pháp tái tổ
hợp và di truyền ngược. Tuy nhiên các loại vaccine này vẫn có những nhược điểm
khó khắc phục như giá thành cao, khó bảo quản và không an toàn. Do vậy các nhà
khoa học trên thế giới vẫn đang tiếp tục phát triển những loại vaccine mới có tính
ưu việt hơn, rẻ hơn, dễ bảo quản và phân phối hơn, an toàn và hiệu quả hơn.
Vaccine ăn được có nguồn gốc từ thực vật sẽ là nguồn vaccine đáp ứng được các
yêu cầu đó và sẽ đem lại nhiều hứa hẹn.
Vaccine ăn được là vaccine tác động vào thể dịch, kích thích cả hệ thống
miễn dịch thể dịch và miễn dịch tế bào. Vaccine ă
n được nguồn gốc thực vật có
hoạt tính tương tự như vaccine thông thường, chỉ khác là vaccine này được thực vật
sản xuất trong những phần ăn được như lá, củ, quả và hạt. Vaccine này có một số

ưu điểm nổi bật so với các loại vaccine khác gồm vaccine có thể ăn tươi hoặc nấu
chín; dễ dàng sản xuất khối lượng lớn bằng cách tăng diện tích trồ
ng cây chuyển
 Báo cáo tổng kết đề tài – Mở đầu
Thời gian thực hiện 2007-2009
2
gen có khả năng sản xuất kháng nguyên; vaccine này có tính ổn định an toàn cao, dễ
bảo quản, sử dụng và kinh tế.
Như vậy để tiến tới sản xuất được vaccine ăn được phục vụ cho việc phòng
chống bệnh dịch như dịch cúm gà hiện nay thì cần phải có một chiến lược, một kế
hoạch nghiên cứu để đưa ra quy trình công nghệ sản xuất. Trong những năm gầ
n
đây, với sự phát triển của công nghệ sinh học nói chung và công nghệ tế bào thực
vật nói riêng, nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới đã thành công tạo ra một số sản
phẩm y dược trong cây trồng chuyển gen.
Từ sự cấp thiết của tình hình hiện nay và trên cơ sở một số thành công trong
tạo cây chuyển gen trên một số cây trồng, chúng tôi hợp tác với trường Đại học Tự
do (Vương quốc Bỉ
) tiến hành thực hiện nhiệm vụ: “Nghiên cứu phát triển vaccine
thực vật dùng qua đường miệng cho gia cầm phòng chống bệnh H5N1 ở Việt
Nam”.
 Báo cáo tổng kết đề tài – Chương 1. Tổng quan tài liệu
Thời gian thực hiện 2007-2009
3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. CÚM VÀ VIRUS CÚM H5N1
Cúm là một căn bệnh nguy hiểm gây tử vong cao trên khắp thế giới. Hằng
năm dịch cúm đã làm cho nửa tỷ người mắc bệnh, chủ yếu là trẻ em (Bardiya et al.,
2005). Hiện nay, cúm H5N1- chủng virus nguy hiểm nhất hiện nay đã lan truyền
trên 40 quốc gia ở Châu Á, Trung Đông, Châu Âu và Châu Phi. Chủng này mới

xuất hiện gần đây nhưng là một loại subtype có độc lực cao, được chứng minh là có
khả năng lây nhi
ễm từ động vật sang người và gây bệnh trên người trong các vụ
dịch cúm gà những năm 1996-2005. Theo tổng kết của Tổ chức Y tế thế giới
(WHO), Việt Nam là nước có số người mắc bệnh và tử vong cao nhất trong số 8
nước có dịch xảy ra ở châu Á.



Hình 1.1a. Virus cúm với các yếu tố
kháng nguyên H và N, lớp màng bao
(envelop), protein liên kết (matrix
protein M1), ribonucleoprotein (RNP).
Hình 1.1b. Influenza A virus, loại virus gây
bệnh cúm gia cầm. (Ảnh chụp những tiểu
phần virus được nhuộm âm tính trên kính
hiển vi điện từ truyền qua)

Virus cúm gây bệnh thuộc họ Orthomyxoviridae, có vỏ bọc với cấu trúc bao
gồm 7 protein ở bên trong và 2 glycoprotein (hemagglutinin (HA) và neuraminidase
(NA)) ở bên ngoài (Tamura et al., 2005). Dựa vào sự khác nhau của các kháng
nguyên bên trong NP và M, virus bệnh cúm được phân loại thành các type A, B và
C. Cúm gia cầm (avian flu) thuộc type A là virus RNA, chứa hệ gen là RNA sợi
đơn âm (ss(-)RNA) bao gồm 8 phân đoạn, trong đó, phân đoạn 4 mã hoá cho
 Báo cáo tổng kết đề tài – Chương 1. Tổng quan tài liệu
Thời gian thực hiện 2007-2009
4
protein HA và phân đoạn 6 mã hoá cho protein NA là những protein nằm trên bề
mặt có tính kháng nguyên và gây bệnh. Trong tự nhiên, virus cúm A tồn tại trong
các subtype khác nhau, đó là kết quả tái tổ hợp của 15 HA (H1-15) và 9 NA (N1-9).

Gần đây, người ta phát hiện thêm 1 subtype HA mới (H16) từ chim hải âu đầu đen
tại Thuỵ Điển. Các subtype này gây nhiễm cho hầu như phần lớn mọi loài sinh vật
bao gồm các loài lông vũ (gà và thuỷ cầm), lợn, ngựa, chim, chồn đất, hải cẩu, cá
voi và loài ngườ
i.
Trên cơ sở trình tự gen và sắp xếp gen trong hệ gen, virus cúm A có 8 phân
đoạn, có độ dài tổng số khoảng 13.500 nucleotide. Phân đoạn 1-3 mã hoá cho
protein PB1, PB2 và PA; có chức năng là enzym polymerase, điều khiển tổng hợp
ribonucleic acid nguyên liệu cho hệ gen và RNA thông tin. Phân đoạn 4 mã hoá cho
HA là protein “độc”, mang tính gây bệnh, có tính kháng nguyên và có khả năng
ngưng kết với hồng cầu gà. Phân đoạn 5 mã hoá cho nucleoprotein (NP), là protein
có trách nhiệm bao bọc hệ gen. Phân đoạn
6 là gen chịu trách nhiệm tổng hợp
protein NA, cắt thụ thể giải phóng virus khỏi tế bào, sau chu kỳ nhân lên của chúng.
Phân đoạn 7 mã hoá cho 2 tiểu phần protein đệm M1 và M2 (matrix protein), có
chức năng tập hợp virus và tạo kênh chuyển vận i-on qua màng nhân. Phân đoạn 8
mã hoá cho 2 tiểu phần protein không cấu trúc NS1 và NS2 (non-structural
protein), đa chức năng.
1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CÚM H5N1 Ở VIỆT NAM
Dịch cúm gia cầm H5N1 xảy ra ở nước ta từ nh
ững tháng cuối năm 2003 với
các đợt dịch cao điểm vào các tháng đầu năm 2004, đầu năm 2005, cuối năm 2005
và đầu năm 2006, gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi gia cầm, trong đó
trên 50 triệu (2004) và trên 2 triệu gia cầm (2005) đã bị tiêu huỷ và đã gây thiệt hại
lớn cho người với 92 người mắc bệnh, trong đó đã có 43 trường hợp tử vong
(WHO).
Ngay sau khi dịch cúm xảy ra, Bộ Chính trị đã ban hành Chỉ
thị số 35-
CT/TW, ngày 06-02-2004 về triển khai các biện pháp cấp bách ngăn chặn dịch cúm
gia cầm và cúm A (H5N1) trên người. Tổ chức Y tế thế giới và các nhà khoa học đó

cảnh báo về khả năng có thể xảy ra một đại dịch cúm trên người làm hàng triệu
người tử vong. Việt Nam được coi là nơi virus H5N1 có khả năng biến đổi để có thể
gây nên đại dịch toàn cầu. Trên bản đồ dịch cúm gia cầm củ
a thế giới, nước ta là
một điểm nóng vì đã trải qua gần 2 năm có dịch cúm gia cầm, mầm bệnh vẫn còn