NGHIÊN cứu QUÁ TRÌNH TÁCH CHIẾT và TINH SẠCH sơ bộ ENZYM CELLULASE từ TRICHODERMA VIRIDE (2)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
----    ----

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH TÁCH CHIẾT VÀ
TINH SẠCH SƠ BỘ ENZYM CELLULASE TỪ
TRICHODERMA VIRIDE

GVHD: Ths. Huỳnh Quang Phước
SVTH : Huỳnh Thị Hồng Sương
MSSV : 105110096

Tp. HCM, tháng 08 năm 2009
i


Luận văn tốt nghiệp

GVHD: Ths. Huỳnh Quang Phước

LỜI CẢM ƠN

Đề tài tốt nghiệp là một công trình nhỏ nhưng lại mang ý nghĩa lớn lao đối với sinh
viên ngành công nghệ thực phẩm. Nó được đúc kết từ những kiến thức suốt 4 năm học cũng
như những kinh nghiệm thực tế. Đóng góp vào công trình này là sự quan tâm không nhỏ của
rất nhiều người.
Nhân đây, tôi xin đặc biệt cảm ơn: sự tận tâm hướng dẫn của thầy Huỳnh Quang Phước,
cùng thầy cô Khoa công nghệ thực phẩm Trường đại học kỹ thuật công nghệ Thành phố Hồ

Chí Minh.
Sự hỗ trợ nhiệt tình từ giáo viên quản lý và các bạn nghiên cứu chung tại phòng thí
nghiệm vi sinh.
Cuối cùng là lời cảm ơn sâu sắc đến mẹ người đã động viên chia sẻ và giúp đỡ con
trong suốt thời gian qua.
Một lần nữa xin chân thành cảm ơn.
TP. Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 8 năm 2009
Sinh viên
HUỲNH THỊ HỒNG SƯƠNG

SVTH: Huỳnh Thị Hồng Sương

ii


Luận văn tốt nghiệp

GVHD: Ths. Huỳnh Quang Phước

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN PHẢN BIỆN

...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................

...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................

SVTH: Huỳnh Thị Hồng Sương

ii


Luận văn tốt nghiệp

GVHD: Ths. Huỳnh Quang Phước

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẨN

...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................

...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................

SVTH: Huỳnh Thị Hồng Sương

ii


Luận văn tốt nghiệp

GVHD: Ths. Huỳnh Quang Phước

MỤC LỤC
Đề mục

Trang

Trang bìa lót ..............................................................................................................................i
Nhiệm vụ đồ án
Lời cảm ơn............................................................................................................................... ii
Tóm tắt.................................................................................................................................... iii
Mục lục ....................................................................................................................................iv
Danh mục hình vẽ.....................................................................................................................v
Danh mục bảng biểu ................................................................................................................vi
Danh mục các từ viết tắt ........................................................................................................ vii
CHƯƠNG 1: LỜI MỞ ĐẦU..................................................................................................1
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...............................................................................2

2.1. Giới thiệu về cellulose.......................................................................................................3
2.1.1. Cấu tạo cellulose.........................................................................................................3
2.1.2. Đặc tính của cellulose.................................................................................................4
2.2. Giới thiệu sơ lược về enzym..............................................................................................5
2.2.1. Giới thiệu về enzym cellulase.....................................................................................8
2.2.2. Vi sinh vật tổng hợp cellulase ..................................................................................15
2.3. Vai trò của giống trong công nghệ sản xuất enzym .......................................................18
2.4. Yêu cầu của giống trong công nghệ sản xuất enzym .....................................................18
2.5. Nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp cellulase..........................................................................19
2.5.1. Sinh tổng hợp enzym cảm ứng .................................................................................19
2.5.2. Ảnh hưởng của các yếu tố dinh dưỡng đến quá trình STH cellulase .......................20
2.6. Giới thiệu phương pháp lên men bề mặt .........................................................................21
2.6.1. Ưu nhược điểm của phương pháp lên men bề mặt...................................................21
2.6.2. Phương pháp lên men thu nhận enzym từ T. viride..................................................22
2.7. Tách và tinh sạch chế phẩm enzym .................................................................................23
2.8. Ứng dụng của cellulase ...................................................................................................24
SVTH: Huỳnh Thị Hồng Sương

iv


Luận văn tốt nghiệp

GVHD: Ths. Huỳnh Quang Phước

2.8.1. Tăng chất lượng các sản phẩm thực phẩm và thức ăn gia súc..................................24
2.8.2. Thủy phân gỗ và các phế liệu gỗ ..............................................................................25
2.8.3. Phá vỡ thành tế bào...................................................................................................25
CHƯƠNG 3: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................26
3.1. Nguyên vật liệu ...............................................................................................................26

3.1.1. Giống vi sinh vật ......................................................................................................26
3.1.2. Nguyên liệu ..............................................................................................................26
3.1.3. Môi trường nuôi cấy .................................................................................................27
3.1.4. Thiết bị nghiên cứu...................................................................................................27
3.2. Các phương pháp nghiên cứu ..........................................................................................27
3.2.1. Phương pháp phân tích hóa lý, hóa sinh..................................................................27
3.2.2. Phương pháp phân tích vi sinh ................................................................................35
3.3. Bố trí thí nghiệm ..........................................................................................................37
3.3.1. Thí nghiệm 1- Khảo sát một số chỉ tiêu của nguyên liệu ........................................37
3.3.2. Thí nghiệm 2- Khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm môi trường nuôi cấy đến khả năng
STH cellulase...........................................................................................................37
3.3.3. Thí nghiệm 3- Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng STH
cellulase ...................................................................................................................38
3.3.4. Thí nghiệm 4- Khảo sát tỷ lệ nước cất và đệm acetate tối ưu để tách chiết enzym 38
3.3.5. Thí nghiệm 5- Khảo sát tỷ lệ cồn, aceton, muối để tủa enzym ...............................39
3.3.6. Thí nghiệm 6- Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của chế phẩm enzym ...43
3.3.7. Thí nghiệm 7- Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của chế phẩm .......43
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN..........................................................................44
4.1. Kết quả khảo sát một số chỉ tiêu của bã khoai mì ..........................................................44
4.2. Kết quả chọn chủng có hoạt lực cellulase mạnh ............................................................44
4.2.1. Kết quả lựa chọn sơ bộ bằng thạch đĩa.....................................................................44
4.2.2. Kết quả lựa chọn bằng phương pháp lên men định lượng hoạt độ cellulase............46
4.3. Kết quả sát định đường cong tăng trưởng của nấm mốc T.viride ..................................46

SVTH: Huỳnh Thị Hồng Sương

iv


Luận văn tốt nghiệp

GVHD: Ths. Huỳnh Quang Phước

4.4. Kết quả ảnh hưởng của độ ẩm môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp cellulase
của T. viride ............................................................................................................................47
4.5. Kết quả ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp cellulase........48
4.6. Kết quả nghiên cứu tỷ lệ nước cất và đệm acetate tối ưu để tách chiết enzym ..............49
4.6.1. Kết quả khảo sát tỷ lệ nước cất tối ưu để chiết enzym ............................................50
4.6.2. Kết quả khảo sát tỷ lệ acetate tối ưu để chiết enzym...............................................51
4.6.3. Kết quả hoạt tính cellulase của dịch chiết thô .........................................................52
4.7. Kết quả nghiên cứu quá trình tinh sạch enzym bằng phương pháp tủa...........................53
4.7.1. Kết quả khảo sát tỷ lệ cồn dùng để tủa enzym .........................................................53
4.7.2. Kết quả khảo sát tỷ lệ aceton dùng để tủa enzym.....................................................54
4.7.3. Kết quả khảo sát tỷ lệ muối ammonium sulfate dùng để tủa enzym ........................55
4.7.4. So sánh kết quả của 3 phương pháp tủa ...................................................................56
4.8. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến chế phẩm enzym cellulase ..............................57
4.9. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến chế phẩm enzym cellulase......................60
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................................64
5.1. Kết luận ...........................................................................................................................64
5.2. Kiến nghị .........................................................................................................................64
Tài liệu tham khảo .................................................................................................................... I
PHỤ LỤC ............................................................................................................................... II

SVTH: Huỳnh Thị Hồng Sương

iv


Luận văn tốt nghiệp

GVHD: Ths. Huỳnh Quang Phước

DANH MỤC BẢNG BIỂU
1.

Bảng 2.1: Hàm lượng cellulose trong một số loại thực vật ....................................................3

2.

Bảng 2.2: Đặc tính cấu trúc của exoglucanase .....................................................................10

3.

Bảng 3.1: Thành phần hóa học bã khoai mì .........................................................................26

4.

Bảng 3.2: Môi trường nuôi cấy nấm mốc.............................................................................26

5.

Bảng 3.3: Chuẩn bị dựng đường chuẩn glucose...................................................................33

6.

Bảng 3.4: Chuẩn bị dựng đường chuẩn protein....................................................................35

7.

Bảng 3.5: Tỷ lệ giữa nước cất và canh trường nuôi cấy để chiết enzym .............................38

8.

Bảng 3.6: Tỷ lệ giữa đệm acetate và canh trường nuôi cấy để chiết enzym ........................39

9.

Bảng 3.7: Tỷ lệ giữa dung môi ethanol và dịch chiết enzym dùng để tủa enzym................40

10. Bảng 3.8: Tỷ lệ giữa dung môi aceton và dịch chiết enzym dùng để tủa enzym .................41
11. Bảng 3.9: Tỷ lệ giữa dung dịch muối và dịch chiết enzym dùng để tủa enzym...................42
12. Bảng 4.1: Thành phần hóa học của bã khoai mì ..................................................................44
13. Bảng 4.2: Hoạt lực cellulase của các chủng nấm mốc .........................................................44
14. Bảng 4.3: Hoạt lực cellulase bằng phương pháp định lượng đường khử.............................47
15. Bảng 4.4: Hàm lượng sinh khối khô của T.viride theo thời gian .........................................45
16. Bảng 4.5: Kết quả hoạt tính cellulase theo độ ẩm môi trường nuôi cấy ..............................47
17. Bảng 4.6: Kết quả hoạt tính cellulase theo thời gian môi trường nuôi cấy ..........................48
18. Bảng 4.7: Kết quả chiết enzym cellulase bằng nước cất ......................................................50
19. Bảng 4.8: Kết quả chiết enzym cellulase bằng acetate.........................................................51
20. Bảng 4.9: Hoạt tính và làm lượng protein của dịch chiết enzym thô ...................................52
21. Bảng 4.10: Hoạt tính enzym trong các phân đoạn tủa cồn ....................................................53
22. Bảng 4.11: Hoạt tính enzym trong các phân đoạn tủa aceton ................................................54
23. Bảng 4.12: Hoạt tính enzym trong các phân đoạn tủa muối ..................................................55
24. Bảng 4.13: So sánh kết quả của các mẫu tủa..........................................................................56
25. Bảng 4.14: Kết quả ảnh hưởng của pH đến hoạt tính chế phẩm enzym cellulase .................57
26. Bảng 4.19: Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính chế phẩm enzym cellulase .........58

SVTH: Huỳnh Thị Hồng Sương

vi

Luận văn tốt nghiệp

GVHD : Ths. Huỳnh Quang Phước

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

CT: canh trường
NC: nước cất
DC: dịch chiết
CMC:carboxymethyl cellulose
HL: hàm lượng
HT: hoạt tính
HTR: hoạt tính riêng
VSV: vi sinh vật
STH: sinh tổng hợp
T. viride: Trichoderma viride
A. oryzae: Aspergllus oryzae

SVTH : Huỳnh Thị Hồng Sương

vii


Luận văn tốt nghiệp

GVHD : Ths. Huỳnh Quang Phước

DANH MỤC HÌNH VẼ

1. Hình 2.1: Cấu tạo phân tử cellulose ................................................................................... 4
2. Hình 2.2: Cấu trúc cellulose và các vị trí cắt của enzym ................................................. 14
3. Hình 2.3: Hình thái nấm mốc Trichoderma Viride .......................................................... 18
4. Hình 4.1: Vòng tròn phân giải cellulose của A. oryzae .................................................... 45
5. Hình 4.2: Vòng tròn phân giải cellulose của T. viride...................................................... 45
6. Hình 4.3: Đường cong tăng trưởng của T. viride trên môi trường lỏng ........................... 46
7. Hình 4.4: Đồ thị biểu diễn hoạt tính cellulase theo độ ẩm ............................................... 48
8. Hình 4.5: Đồ thị biểu diễn hoạt tính cellulase theo thời gian ........................................... 49
9. Hình 4.6: Đồ thị biểu thị hoạt tính và protein của dịch chiết enzym bằng nước cất ........ 50
10. Hình 4.7: Đồ thị biểu thị hoạt tính và protein của dịch chiết enzym bằng đệm acetate .. 52
11. Hình 4.8: Đồ thị hoạt tính enzym từ các phân đoạn tủa cồn ............................................ 53
12. Hình 4.9: Đồ thị hoạt tính enzym từ các phân đoạn tủa aceton........................................ 55
13. Hình 4.10: Đồ thị hoạt tính enzym từ các phân đoạn tủa muối .......................................... 56
14. Hình 4.11: Đồ thị biểu thị hoạt tính enzym cellulase theo pH của chế phẩm enzym......... 57
15. Hình 4.12: Đồ thị biểu thị hoạt tính enzym cellulase theo nhiệt độ của chế phẩm enzym 58

SVTH : Huỳnh Thị Hồng Sương

v


Luận văn tốt nghiệp

GVHD: Ths. Huỳnh Quang Phước

TÓM TẮT ĐỒ ÁN

Cellulase được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, trong nông nghiệp enzym này
dùng chế biến thức ăn cho vật nuôi, bên cạnh đó chúng còn được ứng dụng cho sản xuất phân

hữu cơ. Trong công nghiệp thực phẩm, cellulase là tác nhân thủy phân nguyên liệu giàu
cellulose (rơm, rạ, gỗ vụn, mạt cưa, dăm bào…) để tạo thành glucose, mật đường thay thế dần
cho thủy phân bằng acid. Việc tinh sạch enzym cellulase là một trong những bước tiến quan
trọng của lĩnh vực công nghệ enzym. Kỹ thuật này đã công cấp lượng enzym sạch phục vụ
cho rất nhiều lĩnh vực, đặc biệt là trong y học. Nắm bắt được nhu cầu của thị trường tôi tiến
hành nghiên cứu việc thu nhận và tinh sạch sơ bộ enzym cellulase từ Trichodema viride lên
men từ bã khoai mì.
Đề tài gồm những nội dung chính sau đây:
- Nuôi cấy và khảo sát một số yếu tố như: độ ẩm, thời gian để thu được chế phẩm
enzym có hoạt lực cao.
- Chiết xuất enzym cellulase thô từ canh trường nuôi cấy Trichoderma viride.
- Tinh sạch sơ bộ bằng cách tủa phân đoạn enzym bằng một số tác nhân tủa: dung dịch
muối ammonium sulfate bão hòa, ethanol lạnh, aceton lạnh.
- Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ phân giải cellulose từ bã khoai mì.
Kết quả đạt được như sau:
-Độ ẩm tối ưu để nuôi cấy nấm mốc trên bã khoai mì là 60%.
-Thời gian thích hơp để nấm mốc phát triển trên môi trường bã khoai mì thu được
enzym có hoat lực cao nhất là: 3 ngày.
-Thu nhận enzym bằng phương pháp tủa cồn và aceton tối ưu nhất ở tỷ lệ 1:4, tủa
muối tối ưu nhất ở phân đoạn thứ 5.
- Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH: nhiệt độ tối ưu để thực hiện phản ứng là:
o

40 C, pH tối ưu để thực hiện phản ứng là pH = 5.

SVTH : Huỳnh Thị Hồng Sương

iii

Luận văn tốt nghiệp

GVHD: Ths. Huỳnh Quang Phước

Chương 1: LỜI MỞ ĐẦU
Công nông nghiệp ngày càng phát triển, lượng chất hữu cơ thải ra càng nhiều. Tận dụng
phụ phế liệu này làm nguồn carbon để sản xuất enzym cellulase bằng cách nuôi cấy nấm sợi
trên môi trường lên men bán rắn đã thu hút được sự quan tâm của nhiều nước trên thế giới
trong đó có Việt Nam. Cơ chất thường được sử dụng nhiều nhất là bã mía, bã mì, do có hàm
lượng cellulose cao. Đây là cơ chất rẻ tiền và ổn định nên có tiềm năng sử dụng để sản xuất
cellulase ở quy mô lớn.
Việt Nam là một nước nhiệt đới, có nền nông nghiệp khá phong phú, đa dạng và đang
trên đà phát triển. Lượng phế phẩm và phụ phẩm nông nghiệp, công nghiệp cũng rất dồi dào
nhưng lại không nhận được sự quan tâm đúng mức. Theo đó chất thải hữu cơ cũng tăng lên
rất nhiều. Trong đó phụ liệu của ngành sản xuất tinh bột khoai mì là một ví dụ điển hình và
chiếm khoảng ½ khoai nguyên liệu. Nếu công suất nhà máy tinh bột khoai mì là 200 tấn/ ngày
thì mỗi ngày nhà máy thải ra môi trường khoảng 20 tấn bã khoai mì gây ô nhiễm nghiêm
trọng chính vì thế đã và đang có nhiều hướng giải quyết lượng bã khoai mì sau sản xuất như
phơi khô làm thức ăn gia súc nhưng chưa khả thi do không thực sự đảm bảo nguồn dinh
dưỡng, và không tận dụng triệt để nguồn phế phẩm. Nguồn phế phẩm này để lâu sẽ bị vi sinh
vật tấn công gây hư hỏng tạo mùi khó chịu gây ô nhiễm môi trường và hao tốn diện tích.
Trong bã khoai mì có hàm lượng cellulose cao nên ta có thể tận dụng bã khoai mì như nguồn
cacbon để cảm ứng cho vi sinh vật tổng hợp enzym cellulase.
Cellulase được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, trong nông nghiệp enzym này
dùng chế biến thức ăn cho vật nuôi, bên cạnh đó chúng còn được ứng dụng cho sản xuất phân
hữu cơ. Trong công nghiệp thực phẩm, cellulase là tác nhân thủy phân nguyên liệu giàu
cellulose (rơm, rạ, gỗ vụn, mạt cưa, dăm bào…) để tạo thành glucose, mật đường thay thế dần
cho thủy phân bằng acid.
Việc tinh sạch enzym cellulase là một trong những bước tiến quan trọng của lĩnh vực
công nghệ enzym. Kỹ thuật này đã công cấp lượng enzyme sạch phục vụ cho rất nhiều lĩnh

vực, đặc biệt là trong y học.
Nắm bắt được nhu cầu của thị trường tôi tiến hành nghiên cứu việc thu nhận và tinh
sạch sơ bộ enzym cellulase từ canh trường nuôi cấy Trichodema viride trên bã khoai mì.
Trong phạm vi nghiên cứu của đề tài này chúng tôi cố gắng giải quyết các vấn đề sau:

SVTH: Huỳnh Thị Hồng Sương

1


Luận văn tốt nghiệp

GVHD: Ths. Huỳnh Quang Phước

- Chọn chủng nấm mốc thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp enzym cellulase.
- Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym cellulase.
- Tách chiết enzym thô.
- Tinh sạch sơ bộ enzym thô.
- Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến chế phẩm enzym sau khi tinh sạch sơ bộ.

SVTH: Huỳnh Thị Hồng Sương

2


Luận văn tốt nghiệp

GVHD: Ths. Huỳnh Quang Phước

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về cellulose [16]
2.1.1. Cấu tạo cellulose
- Cellulose là polyanhydroglucose có mức độ trùng hợp khoảng 14000, có dạng hình
sợi. Nhiều phân tử celluose liên kết với nhau tạo thành chùm gọi là micelle nhờ liên kết
hydro. Mỗi mixen thường có khoảng 60 phân tử cellulose. Sợi cellulose không hòa tan chính
là do các phân tử cellulose được xếp song song, sát lại với nhau và phía ngoài được bao bằng
lớp vỏ chung có chứa sáp và pectin.

Bảng 2.1: Hàm lượng cellulose trong một số loại thực vật
Stt

Loài thực vật

Cellulose (%)

1

Tế bào nhu mô ở lá

15-20

2

Cây một lá mầm

25-40

3

Cây hạt trần

45-50

4

Cây hạt kín

40-55

5

Sợi bông

80-95

- Nghiên cứu cấu trúc Rontgen người ta thấy rằng trong cellulose có xen kẻ các phần
tinh thể và vô định hình. Ở những phần tinh thể, các mạng cellulose kết với nhau theo một trật
tự đều đặn nhờ liên kết hydro nối với hydroxyl thứ nhất của mạch này với nhóm hydroxyl của
carbon thứ ba của mạch khác. Những phần vô định hình thì các mạch tập hợp lại với nhau nhờ
lực Van der Waals.

SVTH: Huỳnh Thị Hồng Sương

3


Luận văn tốt nghiệp

GVHD: Ths. Huỳnh Quang Phước

Hình 2.1: Cấu tạo của phân tử cellulose

- Trong phân tử cellulose có nhiều nhóm hydroxyl tồn tại ở dạng tự do, hydro của
chúng dễ dàng bị thay thế bởi một số gốc hóa học ví dụ như metyl, hoặc các gốc acetyl hình
thành nên các gốc ete hoặc este của cellulose. Mặt khác, cũng có nhiều dẫn xuất của cellulose
có ý nghĩa quan trọng trong nhiều ngành công nghiệp. Ví dụ như các dẫn xuất nitrocellulose,
acetylcellulose trong kỹ nghệ sợi nhân tạo, da nhân tạo, kỹ nghệ chất nổ, chất dẻo. Đặc biệt
trong thời gian gần đây, các dẫn xuất cellulose như carboxymetyl cellulose, dietylaminoetyl
cellulose được dùng rất hiệu quả trong các phương pháp sắc ký trao đổi ion để phân chia hỗn
hợp protein.
- Cellulose không có ý nghĩa về mặt dinh dưỡng đối với con người nhưng ngược lại ở
gia súc đó là nguồn cung cấp năng lượng chính yếu vì chúng có thể tiêu hóa cellulose một
cách dễ dàng nhờ vi khuẩn cộng sinh trong dạ cỏ có khả năng tiết ra enzym cellulase để phân
giải cellulose thành chất dinh dưỡng.
2.1.2. Đặc tính của cellulose
2.1.2.1. Tính chất vật lý
- Cellulose là chất rắn không màu, không mùi, không vị, không tan trong nước ( chỉ
phồng lên nếu hấp thụ nước), không tan trong các dung môi hữu cơ, không có trạng thái nóng
chảy. Khi đun trong chân không thì bị phân hủy thành glucose.

SVTH: Huỳnh Thị Hồng Sương

4


Luận văn tốt nghiệp

GVHD: Ths. Huỳnh Quang Phước

- Cellulose bị phân hủy ở nhiệt độ thường hoặc nhiệt 40-500C do sự thủy phân

cellulose bởi enzym cellulase.
- Cellulose bị thủy phân khi đun nóng với acid hoặc kiềm ở nồng độ khá cao.
- Trong tế bào thực vật, cellulose liên kết chặt chẽ với hemicellulose, pectin và lignin.
Điều này ảnh hưởng đến sự phân hủy cellulose của enzym cellulase.
2.1.2.2. Tính chất hóa học
- Cellulose có thể hòa tan trong dd [ Cu(NH3)4] (OH)2, tan trong dung dịch H2SO4 đậm
đặc.
- Khi tác dụng với chất oxy hóa, mạch cellulose tạo thành hỗn hợp phức tạp. Tính bền
hóa học của cellulose sau khi bị oxy hóa, khi bị tẩy trắng giảm đi nhiều.
- Khi bị tác dụng với kiềm đặc, cellulose tạo thành sản phẩm tương tự ancolat gọi là
muối cellulose kiềm, muối này dễ bị thủy phân cho ra cellulose ở dạng hydrat cellulose, dạng
này giống cellulose về thành phần nhưng kém bền hơn, hút nước hơn, dễ nhuộm hơn.
- Cellulose còn có tác dụng với anhydric acetic tạo sợi diacetat hay tác dụng với acid
nitrit tạo ra nitro cellulose có nhiều ứng dụng trong công nghiệp thuốc nổ.
2.2. Giới thiệu sơ lược về enzym [10,11]
- Pavlov đã nói: “ hoạt động của enzym là biểu hiện đầu tiên của hoạt động sống.
Không có sự sống nào lại không có quá trình enzym”. Điều này càng làm sáng tỏ định nghĩa
của Ăng- Ghen: “Sự sống đó chính là phương thức tồn tại của thể protein”. Như vậy enzym
có bản chất là protein có hoạt tính xúc tác chỉ được tạo thành trong tế bào sinh vật.
- Trong cơ thể sinh vật, các phản ứng sinh hóa được xảy ra liên tục. Nhờ có phản ứng
như thế các cơ thể sinh vật mới tồn tại và phát triển được. Thực hiện và điều khiển các phản
ứng này lại hoàn toàn do enzym.
- Enzym có mặt trong mọi mô, mọi tế bào, nhưng mỗi tế bào, mỗi loại mô thường có
những hệ thống enzym đặc biệt, và cùng một enzym có trong các mô khác nhau hoặc thậm chí
ở các bộ phận khác nhau của cùng một loại tế bào cũng có thể khác nhau về lượng và có khi
cả về chất.
- Các loại enzym trong cơ thể được tổng hợp, hoạt động một cách rất hài hòa để sao
cho các chất ban đầu được chuyển hóa đến sản phẩm cuối cùng thành một mắt xích hoàn

SVTH: Huỳnh Thị Hồng Sương

5


Luận văn tốt nghiệp

GVHD: Ths. Huỳnh Quang Phước

chỉnh. Sự trục trặc nào đó ở trong toàn bộ mắt xích này sẽ làm cho rối loạn cả hệ thống. Trong
khi đó điều khiển tổng hợp và hoạt động của enzym lại do gen.
- Các enzym không chỉ tham gia các phản ứng xúc tác sinh hóa trong cơ thể vi sinh vật
mà còn tham gia các phản ứng ngoài cơ thể do quá trình trao đổi chất của vi sinh vật. Quá
trình trao đổi chất này được sự tham gia của các enzym tạo ra được các sản phẩm. Các sản
phẩm trao đổi chất được chia thành hai loại: loại sản phẩm trao đổi chất bậc 1 (các sản phẩm
phục vụ trực tiếp trong xây dựng tế bào) và loại trao đổi chất bậc 2 (các sản phẩm trao đổi
chất hoặc dư thừa hoặc không tham gia trực tiếp vào quá trình xây dựng tế bào).
- Các enzym xúc tác hầu hết cho các phản ứng hóa học xảy ra trong cơ thể sống. Bảo
đảm cho các quá trình chuyển hóa các chất trong cơ thể sống tiến hành với tốc độ nhịp nhàng
cân đối, theo những chiều hướng xác định. Enzym đảm bảo cho sự thay đổi thường xuyên
giữa cơ thể sống và môi trường ngoài, nghĩa là đảm bảo tiên quyết cho sự tồn tại của cơ thể
sống.
- Enzym không những hoạt động xúc tác trong tế bào mà còn ngoài tế bào vi sinh vật,
chính điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc ứng dụng enzym vào nhiều lĩnh vực khác của
công nghiệp và đời sống.
- Enzym có hiệu suất xúc tác cực kì lớn, hoạt động xúc tác của enzym lớn gấp hàng
trăm hàng nghìn hoặc hàng triệu lần các chất xúc tác vô cơ và hữu cơ khác. Ví dụ như trong
phản ứng thủy phân saccharose nếu dùng saccharase làm xúc tác tốc độ phản ứng tăng gấp
2x1012 lần so với khi dùng acid làm chất xúc tác.
- Điều quan trọng là enzym có thể thực hiện hoạt động xúc tác trong điều kiện nhẹ
nhàng, ở áp suất và nhiệt độ bình thường của cơ thể, pH môi trường gần pH sinh lý. Hơn nữa

enzym lại có khả năng lựa chọn cao đối với phản ứng mà nó xúc tác cũng như đối với chất mà
nó tác dụng.
- Vì enzym là những chất không thể chế biến được bằng phương pháp tổng hợp hóa
học nên người ta thường thu chúng từ các nguồn sinh học. Enzym có trong tất cả các cơ quan,
mô của động vật, thực vật cũng như trong tế bào vi sinh vật.
- Enzym được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau: từ động vật (pepsin từ dạ dày,
trypsin từ tụy tạng…), từ thực vật (amylase từ thóc nảy mầm, bromelin từ thơm…). Tuy nhiên
không thể dùng hai nguồn này để làm nguyên liệu sản xuất với quy mô công nghiệp lớn các
chế phẩm enzym nhằm thỏa mãn các nhu cầu của nền kinh tế quốc dân. Như vậy, trong các

SVTH: Huỳnh Thị Hồng Sương

6


Luận văn tốt nghiệp

GVHD: Ths. Huỳnh Quang Phước

nguồn nguyên liệu sinh học thì nguồn nguyên liệu vi sinh vật (nấm men, nấm mốc, vi
khuẩn…) là dồi dào và đầy hứa hẹn. Viện sỹ viện hàn lâm khoa học Liên Xô A.A.Imsenetxki
đã nhấn mạnh: “Số lượng, tính đa dạng và hoạt tính enzym của vi sinh vật là vô cùng đặc biệt,
động vật và thực vật không tài nào so sánh được”. Enzym thu nhận từ nguồn vi sinh vật có
nhiều ưu điểm nổi bật và có tính độc đáo vượt xa các enzym từ động vật và thực vật.
- Vi sinh vật là nguồn nguyên liệu vô tận để sản xuất enzym với một lượng lớn và có
thể mở rộng để sản xuất tới phạm vi cần thiết, đồng thời việc thu chế phẩm cũng dễ dàng và
có thể thỏa mãn trong một mức độ lớn nhu cầu của các ngành công nghệ khác nhau.
- Hệ enzym vi sinh vật vô cùng phong phú. Từ vi sinh vật không những chỉ có thể thu
được một số lượng lớn các enzym khác nhau, mà từ một số rất lớn vi sinh vật đã biết luôn
luôn có thể tìm được những vi sinh vật có phức hệ thích ứng tốt hơn nhiều với điều kiện của

sản xuất. Vi sinh vật có thể đồng hóa bất kỳ chất nào trong thiên nhiên. Trong lúc đó có nhiều
chất mà động vật và thực vật không thể đồng hóa được.
- Enzym của vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh, vượt xa các vi sinh vật khác. Do vậy chỉ
cần sử dụng một lượng nhỏ enzym có thể chuyển hóa một lượng lớn cơ chất. Người ta tính
rằng trong 24 giờ, vi sinh vật có thể chuyển hóa một lượng lớn thức ăn gấp 30-40 lần so với
trong lượng cơ thể của chúng.
- Vi sinh vật sinh sản với tốc độ cực kỳ nhanh chóng, khối lượng lại nhỏ, kích thước
bé nhưng tỉ lệ enzym trong tế bào tương đối lớn nên trong quá trình sản xuất chế phẩm enzym
khá dễ dàng, thao tác thuận lợi, hiệu suất thu hồi cao. Trong một thời gian ngắn, với qui mô
nhỏ cũng có thể sản xuất được enzym. Đối với một số trường hợp có thể dùng 100% sinh khối
vi sinh vật làm nguồn enzym.
- Phần lớn thức ăn dùng để nuôi vi sinh vật dễ kiếm và rẻ tiền. Đa số vi sinh vật cho
enzym thường có khả năng phát triển trên môi trường đơn giản rẻ tiền như các phụ phế liệu,
phế phẩm của các ngành sản xuất.
- Ưu việt lớn của sự thu enzym từ vi sinh vật là có khả năng tăng cường sinh tổng hợp
các enzym nhờ chọn giống khi tạo được những biến chủng có hoạt lực cao. Vi sinh vật rất
nhạy cảm với tác động của môi trường, có khả năng thích ứng với nguồn dinh dưỡng. Vì vậy,
khi thay đổi điều kiện sống của vi sinh vật hoặc tác động lên chúng bằng các tác nhân khác
nhau có thể thay đổi dễ dàng hệ enzym cũng như hoạt tính của chúng và tăng tối đa sự sinh

SVTH: Huỳnh Thị Hồng Sương

7


Luận văn tốt nghiệp

GVHD: Ths. Huỳnh Quang Phước

tổng hợp các enzym trong vi sinh vật nuôi cấy. Điều đó cho phép ta có thể tạo được những

enzym theo ý muốn, dễ dàng thu được enzym có độ thuần khiết cao.
2.2.1. Giới thiệu về enzym cellulase [11]
2.2.1.1 Định nghĩa
- Cellulase là hệ enzym xúc tác cho quá trình chuyển hóa cellulose thành sản phẩm
hòa tan. Phức hệ enzym cellulase khá phức tạp. Một mặt chúng như một enzym cảm ứng (mà
ở đây cellulose là một chất cảm ứng không chặt chẽ), một mặt chúng lại chịu tác động bởi cơ
chế điều khiển sản phẩm cuối và chịu kiểm soát bởi cơ chế kiềm chế dị hóa.
- Cellulose là một loại homopolyme của β-D-1,4- glucan. Hệ thống enzym thủy phân
cellulose bao gồm ít nhất 3 enzym khác nhau: endoglucanase (1,4-β-D-glucan-4glucanohydrolase,EC.3.2.1.4), exoglucanase (1,4-β-D-glucan-cellobiohydrolase, EC.3.2.1.91)
và β-glucosidase (β-D-glucosid glucohydrolase, β-glucosidase). Các enzym này có tính đặc
hiệu khác nhau và hoạt động hỗ trợ cho nhau. Đầu tiên, exoglucanase phá vỡ liên kết
hydrogen trong phân tử cellulose, sau đó endoglucanase tiếp tục thủy phân cellulose và sau
cùng là β-glucosidase phân cắt cellobiose thành glucose.
2.2.1.2. Phân loại
Theo phân loại của hội sinh học phân tử và sinh hóa quốc tế (IUBMB-International
Union of Biochemistry and Molecular Biology) hệ thống thủy phân cellulose gồm có enzym:
endoglucanase có ký hiệu EC 3.2.1.4, exoglucanase có ký hiệu EC 3.2.1.91 và β-glucosidase
có ký hiệu EC 3.2.1.21.
 Endoglucanase EC 3.2.1.4
- Tên thường gọi là cellulase
- Tên hệ thống: 1,2-(1,3:1,4)- β-D-glucan-4- glucanohydrolase
- Đôi khi người ta cũng có thể gọi enzym này bằng những tên khác : endo-1,4- β-Dglucanase; β-1,4- glucanase; cellulase A; endoglucanase D; alkali cellulase;cellulase A3;
celludextrinase…Enzym này thường thủy phân các kiên kết 1,4-β-D-glucosid trong cellulose
và các β-D-glucan của ngũ cốc.

SVTH: Huỳnh Thị Hồng Sương

8

Luận văn tốt nghiệp

GVHD: Ths. Huỳnh Quang Phước

 Exoglucanase EC.3.2.1.91
- Tên thường gọi là cellulase 1,4-β-cellobiosidase
- Tên hệ thống: 1,4- β-D-glucan cellobiohydrolase.
- Các tên khác: exo- cellobiohydrolase; exoglucanase; CBH1; C1 cellulase; exo- β1,4-glucan-cellobiohydrolase…
- Enzym này có tác dụng thủy phân các liên kết 1,4-β-D-glucosid trong cellulose và
cellotetraose từ đầu không khử.
 β-glucosidase EC 3.2.1.21.
- Tên thường gọi là β-glucosidase
- Tên hệ thống: β-D-glucosid glucohydrolase
- Các tên khác: cellobiase; β-glucosid glucohydrolase; β-1,6-glucosidase; salicilinase;
arbutinase…
- Enzym này thủy phân các gốc β-D-glucosid. Một số trường hợp cũng thủy phân β-Dgalactosidase, β-D-fucoside; β-D-xyloside; α-L- arabinoside.
2.2.1.3. Cấu tạo của cellulase
- Cellulase có bản chất là protein được cấu tạo từ các đơn vị acid amin, các acid amin
này được nối với nhau bởi liên kết peptid –CO-NH-, tuy nhiên trong cấu trúc có gắn những
phần phụ khác. Cấu trúc không gian cellulase bao gồm một trung tâm xúc tác và một đuôi
không gian, phần đuôi này xuất phát từ trung tâm xúc tác nhưng được gắn thêm đuôi vùng
glycosil hóa và cuối đuôi này là vùng gắn kết với cellulose. Vùng gắn kết với cellulose có cấu
tạo khác với liên kết thông thường của protein và việc thay đổi chiều dài của vùng glycosil
hóa có ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzym.
- Trọng lượng của enzym cellulase thay đổi từ 30-110 KDal. Cấu trúc không gian
khoảng 280-600 acid amin nhưng chiều dài cellulase thường khoảng 300-450 acid amin và
trung tâm xúc tác có khoảng 250 acid amin.
- Bằng cách bẽ gãy các liên kết β-1,4-glucan, hệ enzym cellulase đã thủy phân
cellulose thành sản phẩm cuối cùng là glucose. Trong đó exoglucanase là enzym chính trong
quá trình thủy phân cellulose.

SVTH: Huỳnh Thị Hồng Sương

9


Luận văn tốt nghiệp

GVHD: Ths. Huỳnh Quang Phước

- Exoglucanase là một enzym chứa hai vùng xúc tác nối với một vùng gắn cellulose
qua một vùng liên kết được glycosil hóa cao. Exoglucanase gồm có 2 chuỗi gọi là chuỗi A và
chuỗi B. Cả hai chuỗi đều có 434 acid amin gốc nhưng giữa chúng cũng có sự khác nhau để
phân biệt.
Bảng 2.2 : Đặc tính cấu trúc của exoglucanase 1
Đặc điểm cấu trúc

Chuỗi A

Chuỗi B

Số bản xoắn

9

9

Số sợi

33

33

Số xoắn

10

10

Số nối β

64

65

Số nối γ

4

3

Số bóng β

8

8

Số kẹp tóc β

11

11

Số đơn vị β-α-β

1

1

Số cầu disulfide

10

10

Số ion Ca

1

1

Số ion I

2

2

Số ligand NAG

2

2

Số ligand IBZ-GLC

2

2

Các xoắn β không song song tạo bề mặt chung với nhau và tạo nên một thể tích lớn
được bao bọc bên ngoài bởi các chuỗi kỵ nước và một phần nhỏ ưa nước.

SVTH: Huỳnh Thị Hồng Sương

10


Luận văn tốt nghiệp

GVHD: Ths. Huỳnh Quang Phước

Hai bản xoắn β không song song dựng chụm vào nhau mặt đối diện tạo một kẹp β.
Phần còn lại bao gồm các vòng ngắn được cố định bởi các cầu disulfide và nối các sợi β với
nhau và có 4 xoắn α trong cấu trúc.
Có một nguyên tử Ca2+ ở cà hai chuỗi A và B của cellulose và ở mỗi chuỗi có kết hợp
với glu 295 và glu 325. Một phân tử nước được gắn vào Ca2+.
2.2.1.4. Tính chất
 Tính đặc hiệu
Cellulase thủy phân các liên kết 1,4- β-D-glucosid trong cellulose và gốc β-D-glucan
của ngũ cốc. Người ta cho rằng đầu tiên exoglucanase tác động lên trên các đầu chuỗi mới tạo

thành để sản xuất chủ yếu là cellobose, β-glucosidase thủy phân các gốc β-D-glucose cuối
cùng từ các đầu của phân tử cellulose.
 Đặc tính hóa lý và hóa sinh
Theo nghiên cứu hầu hết các cellulase có pH tối ưu, tính hòa tan và thành phần các
acid amin giống nhau. Độ bền nhiệt và tính đặc hiệu cơ chất có thể khác nhau. Bên cạnh hoạt
tính cellulase, các chế phẩm cellulase thường chứa các hoạt động khác của enzym và các hoạt
động này có ảnh hưởng đến đặc tính của chế phẩm.
- Nhiệt độ tối ưu: 40-50oC
- pH tối ưu: 4-5
2.2.1.5. Các chất ức chế
Cellulase bị ức chế bởi các sản phẩm phản ứng của nó như glucose, cellobiose. Ion
2+

Hg ức chế cellulase hoàn toàn, trong khi các ion khác như Mn2+, Ag+, Zn2+ ức chế nhẹ.
2.2.1.6. Cơ chế tác dụng
- Quá trình thủy phân cellulose tự nhiên nhờ enzym được thực hiện dưới sự tác động
của một phức hệ cellulase, bao gồm chủ yếu là các enzyme C1, Cx, và các glucosidase.
- Enzyme C1 là một enzym không đặc hiệu. Dưới tác dụng của enzyme này các loại
cellulose tự nhiên (bông, giấy lọc…) bị trương lên và chuẩn bị cho tác động của các enzym
khác thủy phân tiếp theo. Hiện nay có nhiều tác giả cho rằng enzym C1 không phải là một
enzym mà chỉ là một yếu tố C1 có tác dụng làm biến đổi celluose , nhưng khi tách riêng ra thì
tác dụng này không còn nữa.

SVTH: Huỳnh Thị Hồng Sương

11


Luận văn tốt nghiệp

GVHD: Ths. Huỳnh Quang Phước

- Để xác định hoạt tính enzym C1 người ta thường sử dụng các loại cellulose tự nhiên
nhất là sợi bông thấm nước.
- Enzym Cx còn gọi là enzyme β-1,4-glucanase. Enzym này thủy phân các cellulose
thành cellobiose, chữ x cho ta biết đây là loại enzym có nhiều thành phần khác nhau. Người ta
thường chia Cx thành 2 loại:
- Exo-β-1,4-glucanase: xúc tác việc tách ra một cách liên tiếp các đơn vị glucose từ
đầu không khử của chuỗi cellulose.
- Endo- β-1,4-glucanase: có khả năng phân cắt liên kết β-1,4-glucosid ở bất kỳ chổ nào
bên trong chuỗi cellulose phân tử.
- Để xác định hoạt tính enzym Cx người ta thường sử dụng CMC (cacboxymetyl
cellulose) hay HEC (hydroxyetyl cellulose).
Theo Ogawa và Toyama (1967) cho rằng còn có một enzym khác có tác dụng trung gian giữa
C1 và Cx. Enzym C2 tác động vào các cellulose đã bị C1 làm trương lên và thủy phân chúng
thành những loại cellulosedextrin hòa tan. Enzyme Cx sẽ tiếp tục thủy phân các loại này thành
cellobiose.
Enzyme β-glucosidase là những enzym rất đặc hiệu, enzym này thủy phân cellobiose thành
cellohexose (D-glucose).
 Cơ chế tác động của cellulose được nêu ra bởi nhiều tác giả khác nhau:


Theo Wakabayasi và Nisizawa (1964).

Cellulose tự nhiên

cellulose kết tinh có

glucose

mức cao phân tử thấp
Endoenzyme


Exoenzyme

Theo Mandels và Reese (1964).

Cellulose

Cellulose

Cellobiose

Glucose

phản ứng
C1

SVTH: Huỳnh Thị Hồng Sương

Cx

β- glucosidase

12


Luận văn tốt nghiệp



GVHD: Ths. Huỳnh Quang Phước

Theo Iwasaki và các đồng sự (1965).

Cellulose

Cellodextrin

Glucose

C1

Cx

Endoenzyme

Exoenzyme



Theo Ogawa và Toyama (1967).

Cellulose

Cellulose

tự nhiên

không tan
C1

SVTH: Huỳnh Thị Hồng Sương

Các sản phẩm hòa tan

C2

13

Cellobiose


Luận văn tốt nghiệp

GVHD: Ths. Huỳnh Quang Phước

Hình 2.2: Sơ đồ cấu trúc cellulose và các vị trí cắt của enzym
2.2.2. Vi sinh vật tổng hợp cellulase [12,13]
2.2.2.1. Giới thiệu chung về các nhóm vi sinh vật tổng hợp cellulase
Cellulase có mặt trong các hạt thực vật bậc cao, hạt lúa mạch, giun đất, sâu róm, ốc
sên. Tuy nhiên, vi sinh vật là nguồn cung cấp cellulase khá phong phú gồm các loại xạ khuẩn,

SVTH: Huỳnh Thị Hồng Sương

14