Đồ án tốt nghiệp: Nhân nhanh plb mẫn thiên hồng (doritaenopsis sp.) trong một số hệ thống khác nhau

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
O0O
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
NHÂN NHANH PLB MÃN THIÊN HỒNG
(Doritaenopsis sp.)
TRONG MỘT SỐ HỆ THỐNG
NUÔI CẤY KHÁC NHAU
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ SỐ NGÀNH: 111
GVHD:CN. BÙI VĂN THẾ VINH
SVTH: TRẦN XUÂN NGỌC HUY
TP. HỒ CHÍ MINH, THÁNG 07 NĂM 2010
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
ĐẠI HỌC KTCN TP. HCM ĐỘC LẬP – TỰ DO – HẠNH PHÚC
KHOA: MT & CNSH
BỘ MÔN: CÔNG NGHỆ SINH HỌC NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
HỌ VÀ TÊN: TRẦN XUÂN NGỌC HUY MSSV: 106111012
NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC LỚP: 06DSH
1. Đầu đề đồ án tốt nghiệp
NHÂN NHANH PLB MÃN THIÊN HỒNG (Doritaenopsis sp.) TRONG MỘT SỐ HỆ
THỐNG NUÔI CẤY KHÁC NHAU.
2. Nhiệm vụ (yêu cầu về nội dung và số liệu ban đầu):
• Xác định môi trường tối ưu nhất để nhân nhanh PLB Mãn Thiên Hồng
(Doritaenopsis sp.).
• So sánh khả năng nhân nhanh PLB Mãn Thiên Hồng (Doritaenopsis sp.) trong một
số hệ thống nuôi cấy khác nhau: rắn, lỏng tĩnh, lỏng lắc.
• Bước đầu thực hiện nhân nhanh PLB Mãn Thiên Hồng (Doritaenopsis sp.) bằng hệ
thống Bioreactor tự tạo.
3. Ngày giao Đồ án tốt nghiệp: ngày 01/04/2010.
4. Ngày hoàn thành Đồ án: 28/06/2010.

5. Họ tên người hướng dẫn Phần hướng dẫn
CN. Bùi Văn Thế Vinh Toàn bộ Đồ án
Nội dung và yêu cầu LVTN đã được thông qua Bộ môn
Ngày …… tháng …… năm 2010
CHỦ NHIỆM BỘ MÔN NGƯỜI HƯỚNG DẪN CHÍNH
(Ký và ghi rõ họ tên) (Ký và ghi rõ họ tên)
PHẦN DÀNH CHO KHOA, BỘ MÔN
Người duyệt (chấm sơ bộ):…………………………….
Đơn vị:…………………………………………………
Ngày bảo vệ:…………………………………………
Điểm tổng kết:…………………………………………
Nơi lưu trữ Đồ án tốt nghiệp:………………………….
LỜI CẢM ƠN
Em xin chân thành cảm ơn:
Ban Giám hiệu Trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ
Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Khoa Môi
Trường & Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả Thầy Cô đã
truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tập
tại Trường.
Thầy Bùi Văn Thế Vinh đã tận tình hướng dẫn, truyền
đạt kinh nghiệm và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực
hiện đề tài, cũng như khoảng thời gian bốn năm em được
học tại Trường.
Thầy Cô quản lý phòng thí nghiệm: Thầy Huỳnh Văn
Thành, Thầy Nguyễn Trung Dũng, Cô Vũ Ngọc Yến Ly
đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em hoàn thành tốt Đồ
án này.
Xin gửi lời cảm ơn đến bạn Nguyễn Thị Phương Thảo,
Nguyễn Thị Thu Thảo, Nguyễn Hoài Mỹ, Dương Thúy
Vy, Thiều Quang Thiên Lý cùng tất cả các bạn trong lớp

06DSH đã gắn bó, giúp đỡ em trong suốt bốn năm qua.
Con xin vô cùng biết ơn Bố Mẹ, Các Chị cùng Em gái đã
động viên, khuyên bảo và cổ vũ tinh thần để con hoàn
thành tốt bốn năm đại học và Đồ án tốt nghiệp này.
Sinh viên thực hiện:
Trần Xuân Ngọc Huy
MỤC LỤC
Lời cảm ơn
Mục lục
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình vẽ, các đ62 thỊ, các bản vẽ
M UỞ ĐẦ 1
Ch ng 1: T NG QUAN TÀI LI Uươ Ổ Ệ 3
Ch ng 2: V T LI U VÀ PH NG PHÁP NGHIÊN C Uươ Ậ Ệ ƯƠ Ứ 27
Ch ng 4: K T LU N VÀ NGHươ Ế Ậ ĐỀ Ị 40
4.1. K t lu n:ế ậ 40
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ADN: acid deoxynucleotide
ABA: abscisic acid
BA: 6 - benzyladenine
BAP: N
6
- benzylaminopurine
CĐHSTTV: chất điều hòa tăng trưởng thực vật.
Dtps: Doritaenopsis
IAA: indole – 3 – acetic acid
GA
3
: gibberellic acid

KNA: potassium α naphtaleneacetate
MS: Murashige và Skoog
NAA: α – naphtaleneacetic acid
PLB: protocorm – like - body
Phal: Phalaenopsis
2,4-D : 2,4 – dichlorophenoxyacetic acid
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Danh sách các loài Mãn Thiên Hồng trên thị trường.
Bảng 2.1: Môi trường MS ½ bổ sung BA và NAA ảnh hưởng lên sự nhân
nhanh PLB Mãn Thiên Hồng.
Bảng 3.1: Ảnh hưởng của các môi trường nuôi cấy khác nhau đến sự tăng
sinh PLB Mãn Thiên Hồng Doritaenopsis sp.
Bảng 3.2: Ảnh hưởng của BA lên sự tăng sinh PLB Mãn Thiên Hồng.
Bảng 3.3: Ảnh hưởng của NAA lên sự tăng sinh PLB Mãn Thiên Hồng.
Bảng 3.4: Ảnh hưởng của các hệ thống nuôi cấy khác nhau lên sự hình thành PLB
Mãn Thiên Hồng.
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, CÁC ĐỒ THỊ, CÁC BẢN VẼ
Hình 1.1: Mãn Thiên Hồng
Hình 1.2: Một số loài Mãn Thiên Hồng thương mại
Hình 1.3: Một số loài Mãn Thiên Hồng thương mại.
Hình 1.4: Hình thái PLB được quan sát dưới kính hiển vi soi nổi.
Hình 1.5: PLB được nhân nhanh trong môi trường rắn
Hinh 1.6: Hai dạng bioreactor phổ biến
Hình 3.1: Hệ thống bioreactor tự tạo.


Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
MỞ ĐẦU
1. Mục đích nghiên cứu:
Ngày nay, sự đam mê thưởng thức cây cảnh của người dân ngày càng một

gia tăng, để đáp ứng nhu cầu đó, cùng với sự tiến bộ và phát triển của khoa học
kỹ thuật, đặc biệt là công nghệ sinh học đã lai tạo ra nhiều loại hoa quý có nhiều
màu sắc đa dạng và phong phú. Việc nhân giống bằng kỹ thuật thông thường
như trước đây chưa cung cấp số lượng cây con cho thị trường tiêu thụ nên đòi
hỏi phải có một kỹ thuật mới ra đời, đó là nhân giống vô tính in – vitro.
Phong Lan Mãn Thiên Hồng là một trong những cây cảnh được mọi người
ưa chuộng nhiều vì hoa có màu sắc đẹp, phát hoa có nhiều hoa, lâu tàn, dễ dàng
chăm sóc và có thể đặt ở những nơi ít ánh sáng. Chính vì thế, rất tiện lợi khi
trồng trong nhà, nên rất thích hợp cho việc trồng thưởng thức của người dân ở
Thành Phố.
Cây Phong Lan Mãn Thiên Hồng (Doritaenopsis sp.) có giá trị kinh tế cao
ở trong nước cũng như nước ngoài. Trong tự nhiên cây Phong Lan Mãn Thiên
Hồng tăng trưởng chậm. Thông thường, việc tạo cây con trong tự nhiên được
thực hiện bằng hạt và bằng cách tách chiết, tuy nhiên với phương pháp này thời
gian nhân giống rất dài và hệ số nhân giống rất thấp, hơn nữa cây con tạo thành
có sức sống không cao.
Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học,
ngành vi nhân giống cây trồng, đặc biệt trên đối tượng cây hoa lan từng bước
phát triển, nhiều đơn vị nhà nước cũng như tư nhân đã mạnh dạn đầu tư để sản
xuất cây giống phục vụ cho nông dân. Tuy nhiên việc phát triển sản xuất hoa lan
trong nước còn gặp nhiều khó khăn đặc biệt là cây giống. Các cơ sở sản xuất cây
giống trong nước không đủ đáp ứng nhu cầu sản xuất, các nhà vườn phải nhập
cây giống từ nước ngoài bằng nhiều hạn nghạch khác nhau. Điều này rất khó
khăn cho việc kiểm soát dịch bệnh và gây thụ động trong sản xuất hoa thương
phẩm. Vì vậy, việc tập trung phát triển sản xuất cây giống trong sản xuất là cấp
thiết ở nước ta hiện nay. .
Đề tài “Nhân nhanh PLB Mãn Thiên Hồng (Doritaenopsis sp.) trong một
số hệ thống nuôi cấy khác nhau” nhằm mục đích tìm ra môi trường thích hợp
1
Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh

nhất để nhân PLB Mãn Thiên Hồng Doritaenopsis sp. nhằm đạt hiệu suất nhân
giống cao nhất, đồng thời xác định với hệ thống nuôi cấy nào sẽ cho hiệu suất
nhân nhanh cao nhất. Đồng thời bước đầu thử nghiệm trên hệ thống Bioreactor
tự tạo.
2. Ý nghĩa thực tiễn:
Hiện nay để nhân giống các loại Lan, giai đoạn nhân PLB – một giai đoạn
chuyển tiếp từ hạt sang phôi – được ứng dụng rộng rãi và sử dụng phổ biến. Nó
không những ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất và chất lượng cây giống mà còn
ảnh hưởng đến chất lượng hoa thương phẩm. Việc nhân PLB chất lượng cao là
tiền đề thúc đẩy phát triển cây Lan giống trong nước, góp phần khắc phục hiện
tượng thiếu hụt cây giống trong sản xuất hiện nay, từng bước nâng cao trình độ
kỹ thuật nhân giống và thu nhập cho người sản xuất, hạn chế sự lây lan nguồn
bệnh từ nước ngoài qua con đường nhập cây giống.
2
Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Sơ lược về Phong Lan Mãn Thiên Hồng:
1.1.1. Phân loại cây Phong Lan Mãn Thiên Hồng:
 Cây Phong Lan Mãn Thiên Hồng (Doritaenopsis sp.) là loài cây đơn
thân, sống biểu sinh, thuộc:
Ngành: Magnoliophyta
Lớp : Liliopsida
Bộ : Orchidales
Họ : Orchidaceae
Hình 1.1: Mãn Thiên Hồng
 Mãn Thiên Hồng là một loại lan lai. Chúng
được lai từ Lan Hồ Điệp (Phalaenopsis sp.)
và Kim Hồ Điệp (Doritis sp.). Do đó Mãn
Thiên Hồng được mang cả hai ưu điểm của cây cha và mẹ như hoa
nhiều, to, đẹp và cây dễ trồng, rất khỏe chịu đựng được nhiều mức độ

khí hậu khác nhau.
1.1.2. Sự sinh trưởng và phát triển của Mãn Thiên Hồng ngoài tự nhiên:
 Cơ quan dinh dưỡng:
Cơ quan dinh dưỡng bao gồm một trục đơn thân, tạo ra bởi một đỉnh
sinh trưởng hoạt động liên tục, có hai hàng lá, xếp đối diện, cách nhau
bởi những đốt thân rất ngắn, không có giả hành.
Lá hơi mọng nước hình dạng đơn giản (elipe thuôn dài, ngọn giáo), có
bẹ ôm thân, lá dưới cùng héo rụng thì lá mới mọc lên từ ngọn. Tổng
quan một cây có từ 4 – 5 lá hoạt động.
Mỗi trục lá có hai chồi xếp chồng, chồi bên trên cho một trục phát hoa
sau khi cảm ứng ra hoa, chồi bên dưới cho ra một cây con trong trường
hợp có sự cố về hoạt động của đỉnh sinh trưởng ngọn.
Rễ bất định khí sinh được mọc từ gốc của thân xuyên qua bẹ lá. Rễ rất
nhiều và phân nhánh, rễ mập, dầy nạc, sự phân nhánh này tùy thuộc vào
sự sinh trưởng của cây. Rễ bám chặt trên giá thể.
Cây hút hơi nước trong không khí và những khoáng chất từ những cây
mà nó sống bám trên đó, màu xanh của rễ cho thấy chắc chắn chúng có
hoạt động quang hợp.
 Cơ quan sinh sản:
Sự tạo thành trục phát hoa sớm được phân biệt với sự phát triển của
rễ. Sự xuất hiện của đầu trục phát hoa tạo thành một khe thẳng xuyên
3
Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
qua bao vỏ lá, trục phát hoa bên, đơn giản hay phân nhánh, mang hoa ở
hai bên, hoa đính vào trục nhờ cuống hoa. Trong khi ấy, sự xuất hiện
của rễ được ghi nhận bởi một sự mở vòng tròn.
Khi một hay hai trục phát hoa sinh ra từ những chồi bên. Chúng sẽ
cạnh tranh các chất dinh dưỡng của cây. Trong trường hợp hai phát hoa
xuất hiện cùng một lúc, thì sự phát triển của nó tùy thuộc vào thứ tự
ngọn, nhưng không phải lúc nào cũng có trường hợp trên.

Trong giai đoạn trổ hoa, sự phát triển của cơ quan dinh dưỡng có phần
bị chậm lại, nhưng nếu cây được tưới nước và dinh dưỡng đầy đủ thì cây
vẫn tiếp tục tăng trưởng tốt.
Những đoạn lóng mang các mầm hoa có chiều dài thay đổi rất khác
nhau, tùy thuộc vào giống và chế độ trồng trọt (Troll, 1974) (trích từ Võ
Thị Bạch Mai, 1996). Các mầm bên trên của nhánh phát hoa được bao
bởi những lá thu nhỏ lại, mỗi mầm sẽ phát triển thành chồi dinh dưỡng
hoặc chồi sinh sản sau khi xử lý chất điều hòa sinh trưởng thực vật
(CĐHSTTV).
Cây Mãn Thiên Hồng không có giai đoạn nghỉ, khi nhiệt độ thấp sự
tăng trưởng của cây hoàn toàn chậm lại để cảm ứng ra hoa. Dưới cùng
một chế độ cảm ứng như cùng một vĩ tuyến, vào mùa đông các cây trồng
trong nhà kính thì thời kì trổ hoa tùy theo loài.
Đối với những giống lai, giai đoạn trổ hoa khó có thể xác định một
cách chính xác.
Sau khi được thụ phấn, bầu noãn lớn dần, khoảng tám đến chín tháng
sau thì trái chín. Trái chứa rất nhiều hạt, hạt nhỏ li ti, không có phôi nhũ,
phôi không phân hóa.
1.1.3. Cây Mãn Thiên Hồng trên thị trường:
Bảng 1.1. Danh sách các loài Mãn Thiên Hồng trên thị trường.
Tên Nguồn gốc Đặc điểm
Doritaenopsis Phalaenopsis Tom
Boy x Doritaenopsis
(Mt Beauty x Hama
Lip)
Cành hoa dài, cánh
hoa màu trắng. Môi
màu đỏ, đôi khi có
ánh hồng.
Doritaenopsis Dtps (Minho Princess

x Nobby's Purple)
Hoa màu hồng với
những đường kẻ sọc
4
Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
màu hồng, đôi khi có
chấm.
Doritaenopsis Dtps [I-Hsin Actor x
(Tom Boy x Mount
Beauty)]
Hoa màu trắng với
màu với môi màu đỏ
tương phản.
Doritaenopsis Dtps (Purple Gem x
Taisuco Jewel)
Hoa màu hồng và gần
giống với Queen
Beer.
Doritaenopsis Dtps [Tom Boy x
(Mount Beauty x
Hama Lip) x I-Hsin
Actor]
Hoa màu trắng trong
suốt với các môi màu
hồng đến màu đỏ
Doritaenopsis Dtps I-Hsin Model
"KH6079" x (Sogo
Davis x Minho
Valentine) 86-3#1"
Được nhân giống

nhiều. Hoa có màu
hồng đậm.
Doritaenopsis Dtps (Sweet
Strawberry x Luchia
Smile)
Cành hoa dài phân
nhánh với những bông
hoa màu hồng, đỏ
tươi.
Doritaenopsis Chain
Xen Pearl
Phal Ching Hua
Spring x Dtps Nobby's
Pink Lady
Hoa màu hồng với
những chấm nhỏ màu
trắng trên nền cánh
hoa sẫm màu
Doritaenopsis Fuchsia
Princess
Dtps pulcherima x P
Coral Gleam
Hoa màu sáng bóng
với những cánh môi
sẫm màu
Doritaenopsis Han
Ben's Girl 'HB728'
Dtps (Tom Boy x Han
Ben's Lip)
Những bông màu trắng,

lớn. Tương phản với
những cánh môi màu
đỏ.
Dtps. I-Hsin Black Phal Golden Peoker x Hoa màu trắng sữa
5
Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
Jack"KH5686#100" Dtps Leopard Prince với những đường sọc
kẻ màu hồng.
Dtps. I-Hsin Black
Jack"KH5706’
Phal Golden Peoker x
Dtps Leopard Prince
Hoa màu tím, cứng.
cánh môi màu trắng
Doritaenopsis I-Hsin Golden Prince
Phal Golden Sun x
Dtps Leopard Prince
Hoa màu trắng được
tô điểm them những
chấm màu trắng.
Doritaenopsis I-Hsin Idol Phal Chih
Shang's Stripes x Dtps
Minho Princess
Đẹp nhất, dễ trồng.
Có hoa màu hồng.
Doritaenopsis I-Hsin Purple Jewel
Dtps Purple Gem x
Dtps Taisuco Jewel
Cành hoa trãi rộng với
những bông hoa màu

đỏ tươi
Doritaenopsis I-Hsin
Sesame"KH5783#1"
Phal Ching Her
Buddha x Dtps
Leopard Prince
Hoa màu trắng
Doritaenopsis I-Hsin
Spring
Dtps (Minho Stripes x
Leopard Prince)
Hoa màu hồng đôi khi
cũng có loài màu
trắng với những chấm
đỏ.
Doritaenopsis Minho Venus Dtps
Minho Valentine x
Phal New Cinderella
Canh hoa dài, phân
nhánh. Chứa đến 11
hoa màu hồng tối.
Doritaenopsis Sogo
Vivien 'Golden
Vivien'
Dtps Sogo Alice x
Phal Zuma's Pixie
Hoa màu tím với
những đường viền
màu trắng kem.
Doritaenopsis Taida

Salu ‘Taida’
Dtps (Salu Spot x
Happy Beauty)
Hoa màu đỏ tươi với
những đường viền
cánh hoa màu vàng
kem.
6
Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
7
Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
Hình 1.2: Một số loài Mãn Thiên Hồng thương mại
8
Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
Hình 1.3: Một số loài Mãn Thiên Hồng thương mại.
1.1.4. Các kỹ thuật nhân giống Mãn Thiên Hồng:
 Nhân giống in – vivo:
9
Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
Nhân giống Mãn Thiên Hồng bằng cách tạo cây con trên cọng phát
hoa. Chồi của Mãn Thiên Hồng được tạo ra ngay trên đốt hoa có mang
mầm ngủ bằng cách bao quanh đốt một lớp rêu nước để giữ ẩm (Shara,
1938, 1952) (trích trong Arditti và Ernst, 1993) [10]. Rêu nước cũng có
thể được sử dụng tạo cây con từ các phần phát hoa cắt rời bằng phương
pháp bán vô trùng (semiaseptic method) (Grimes, 1987)[13]. Trong
những năm gần đây, chất điều hòa sinh trưởng thực vật được sử dụng để
cảm ứng tạo cây con trên phát hoa trong in – situ. Cytokinin được trộn
với chất mang và xử lý trực tiếp lên phát hoa (Võ Thị Bạch Mai, 1996 )
[9] hay ở dạng bột nhão quấn quanh đốt hoa (McFarlane, 1977; Brasch
và Kocsis, 1980). Để cho kết quả tốt nhất, vật liệu sử dụng là cây Mãn

Thiên Hồng đã ra hoa chứa cả nụ hoa và hoa đã nở (Arditti và Ersnt,
1993).
 Nhân giống in – vitro:
Đốt phát hoa có mang mầm ngủ của cây Mãn Thiên Hồng được cắt
thành những đoạn có kích thước 65mm được khử trùng và đặt trên môi
trường biến đổi Vacin – Went. Kết quả là chồi được hình thành sau một
tháng nuôi cấy. Hầu hết chồi đều có rễ khỏe sau hai tháng. Kết quả ghi
nhận được từ nuôi cấy đoạn phát hoa có mang mầm ngủ của nhiều tác
giả cho thấy từ các mầm ngủ gần cuối cùng của đoạn phát hoa sẽ phát
triển tạo thành cây con trực tiếp còn các mầm ở vị trí trên sẽ phát triển
tạo thành phát hoa thứ cấp, khi dùng phương pháp này không phá hủy
và gây nguy hiểm đến cây mẹ, nhưng không được thuận lợi là sự hình
thành mô sẹo rất khó xảy ra. Phương pháp này bị giới hạn chỉ có giá trị
cho nhân giống tạo chồi từ đốt hoa nên hệ số nhân giống không cao
(Arditti và Ersnt, 1993)[10].
Để cải thiện sự tăng trưởng chồi từ đốt thân Hồ Điệp người ta sử dụng
các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong môi trường nuôi cấy, BAP
kích thích tốt sự tăng trưởng chồi từ mầm ngủ (Koch, 1974)[14] . Khi
tăng BA trong khoảng 0.1 – 3 mg/l, trọng lượng chồi cũng tăng theo.
NAA hiện diện trong môi trường nuôi cấy làm giảm sự hình thành chồi
(Tse và cộng sự, 1971). IAA, KNA (auxin – potassium α
10
Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
naphtaleneacetate) và 2,4-D làm tăng chiều dài của sơ khởi chồi nhưng
lại ức chế các giai đoạn sau đó (Koch, 1974). Để kích thích tăng số
lượng chồi thì các mầm ngủ trên các đoạn phát hoa được cảm ứng khi
nuôi cấy trên môi trường REM có bổ sung 25mg/l BA. Rễ được cảm
ứng hình thành khi chuyển chúng sang môi trường không chứa chất điều
hòa sinh trưởng thực vật nhưng có chứa 10% w/v dịch chiết chuối
(Arditti và Ernst, 1993).

Nhân giống lan Mãn Thiên Hồng thông qua việc gây vết thương trên
các chồi con được tạo thành từ phát hoa. Một vài chồi thân hoa lan Mãn
Thiên Hồng không tăng trưởng tiếp tục mà được cảm ứng để tạo thành
mô sẹo (Tse và cộng sự, 1971; Hackett và cộng sự, 1973) [17]. Mỗi đốt
mang chồi trước khi đặt vào môi trường Knudson C hay môi trường
Mureshige – Skoog có hoặc không có bổ sung 2,0 mg/l NAA, phải gây
vết thương bằng cách hoặc cắt theo hướng chéo và song song với trục
thân hoặc đâm vào đỉnh chồi mầm ngủ bằng dao cấy vô trùng. Kết quả
mô sẹo được hình thành (Arditti và Ernst, 1993)[10].
Trong môi trường Murashige – Skoog biến đổi, lá Mãn Thiên Hồng
vừa mới nhú lên từ chồi con, được tách rời và cấy vào môi trưởng lỏng
Vacin – Went biến đổi có bổ sung 2,5mg/l BAP và chứa 20% (v/v) nước
dừa, kết quả là tạo được PLBs từ mô cấy (Tanaka và Sakanashi, 1978)
[18].
Ngoài ra, có thể dùng môi trường MS lỏng có bổ sung IAA – ala và
BAP để tạo ra số lượng lớn PLB từ chồi con có hai lá được phát triển từ
mầm ngủ. Kết quả PLB được phát triển từ phần gốc lá (Arditti và Ernst,
1993) [10].
1.2. Tiền củ:
Theo Edwin F. George Ph.D. năm 1993 cho rằng hạt lan chứa một phôi nhỏ
có đường kính khoảng 0,1 mm và chúng không có nội nhũ dự trữ. Khi hạt nảy
mầm, phôi tăng rộng để hình thành một cấu trúc nhỏ giống như là corm và được
gọi là protocorm (tiền củ) và chúng phát triển thành một cực chồi và một cực rễ
đối diện nhau. Trong tự nhiên, protocorm có màu xanh và tích tụ carbonhydrate
thông qua quang hợp. Sự tích tụ dự trữ chất hữu cơ với mục đích là giúp cực
chồi và cực rễ tăng trưởng thành cây hoàn chỉnh. Việc tạo somatic protocorm
11
Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
trong nuôi cấy in – vitro thì không tương tự như ở hạt, chính vì thế nhiều nhà
nuôi cấy mô dùng thuật ngữ “protpcorm – like body (PLBs)” đại diện cho

somatic protocorm.
Champagnat và Morel (1972) và Norstog (1979) xem sự tạo PLB như là một
giai đoạn đặc biệt trong con đường phát triển phôi. Như vậy, protocorm đại diện
như là một giai đoạn sinh phôi sớm. Sự tạo thành protocorm ở họ lan được xem
như là đại diện cho sự sinh phôi trực tiếp (protocorm hình thành từ mô cấy mà
không qua giai đoạn tạo mô sẹo) hoặc sinh phôi gián tiếp (protocorm hình thành
từ mô sẹo có khả năng sinh phôi)(Edwin F. George Ph. D., 1993)
Tiền củ (protocorm) là thuật ngữ chỉ riêng cho họ orchidaceae. Chúng ta
dùng thuật ngữ tiền củ để chỉ cho tất cả các giai đoạn mà khối mô chưa hình
thành lá. Tiền củ không có hình dạng rõ ràng và chúng không có một cấu trúc
hình thái rõ ràng như ở thân và rễ.

Hình 1.4: Hình thái PLB được quan sát dưới kính hiển vi soi nổi.
Hình 1.5: PLB được nhân nhanh trong môi trường rắn
1.3. Kỹ thuật nhân giống in vitro (nuôi cấy mô tế bào thực vật):
1.3.1. Ưu và nhược điểm của kỹ thuật nhân giống in vitro:
 Ưu điểm:
Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao: Trong hầu hết các trường hợp,
công nghệ vi nhân giống đáp ứng tốc độ nhân nhanh cao, từ một cây trong
vòng 1 – 2 năm có thể tạo thành hàng triệu cây.
12
Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
Sản phẩm cây giống đồng nhất: Vi nhân giống về cơ bản là công nghệ
nhân dòng. Nó tạo ra quần thể có độ đồng đều cao dù xuất phát từ cây mẹ có
kiểu gen dị hợp hay đồng hợp.
Tiết kiệm không gian: Vì hệ thống sản xuất hoàn toàn trong phòng thí
nghiệm, không phụ thuộc vào thời tiết và các vật liệu khởi đầu có kích thước
nhỏ. Mật độ cây tạo ra trên một đơn vị diện tích lớn hơn rất nhiều so với sản
xuất trên đồng ruộng và trong nhà kính theo phương pháp truyền thống.
Nâng cao chất lượng cây giống: Nuôi cấy mô là một phương pháp hữu

hiệu để loại trừ virus, nấm khuẩn khỏi các cây giống đã nhiễm bệnh. Cây
giống sạch bệnh tạo ra bằng cấy mô thường tăng năng suất 15 - 30% so với
giống gốc.
Lợi thế về vận chuyển: Các cây con kích thước nhỏ có thể vận chuyển
đi xa dễ dàng và thuận lợi.
 Nhược điểm:
Hạn chế về chủng loại sản phẩm: Trong điều kiện kỹ thuật hiện nay,
không phải tất cả cây trồng đều được nhân giống thương phẩm bằng vi nhân
giống. Nhiều cây trồng có giá trị kinh tế hoặc quý hiếm vẫn chưa thể nhân
nhanh để đáp ứng nhu cầu thương mại hoặc bảo quản nguồn gen. Nhiều vấn
đề lý thuyết liên quan đến nuôi cấy và tái sinh tế bào thực vật in vitro vẫn
chưa được giải đáp.
Chi phí sản xuất cao: Vi nhân giống đòi hỏi nhiều lao động kỹ thuật
thành thạo. Do đó, giá thành sản phẩm còn khá cao so với các phương pháp
truyền thống như chiết, ghép và nhân giống bằng hạt.
Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình: Cây con nuôi cấy mô có
thể sai khác với cây mẹ ban đầu do hiện tượng biến dị tế bào soma. Kết quả
là cây con không giữ được các đặc tính quý của cây mẹ. Tỷ lệ biến dị thường
thấp ở giai đoạn đầu nhân giống, nhưng sau đó có chiều hướng tăng lên khi
nuôi cấy kéo dài và tăng hàm lượng các chất điều hòa sinh trưởng. Hiện
13
Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
tượng biến dị này cần được lưu ý khắc phục nhằm đảm bảo sản xuất hàng
triệu cây giống đồng nhất về mặt di truyền.
1.3.2. Các giai đoạn trong quy trình nhân giống vô tính in vitro:
Nhân giống vô tính cây trồng thường trải qua các bước sau:
 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng
 Tạo thể nhân giống in – vitro
 Nhân giống in – vitro
 Tái sinh thành cây hoàn chỉnh in – vitro

 Chuyển cây ra vườn ươm để thuần hóa
 Nhân giống in – vitro
 Tạo cây con bầu đất.
 Đưa các cây ra đồng ruộng
 Chọn lọc cây đầu dòng.
• Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng:
Mẫu được nuôi cấy thường còn ở giai đoạn non, quá trình phân
chia và phân hóa mạnh. Đỉnh sinh trưởng và chồi bên được sử dụng ở
hầu hết các loại cây trồng. Ngoài ra, chồi đỉnh và chồi non của hạt mới
nảy mầm cũng được sử dụng. Đỉnh sinh trưởng nhỏ được tách bằng kính
lúp. Môi trường được sử dụng rộng rãi trong nhân giống hiện nay là môi
trường Murashige và Skoog. Đối với mẫu dễ bị hóa nâu môi trường
thường được bổ sung than hoạt tính hay ngâm mẫu với hỗn hợp ascorbic
acid và citric acid (25-150 mg/l)
• Tạo thể nhân giống in – vitro:
Mẫu nuôi cấy được cấy trên môi trường chọn lọc đặc biệt nhằm
mục đích tạo thể nhân giống in – vitro. Có hai thể nhân giống in – vitro :
thể chồi (multiple shoot) và thể cắt (cutting) đốt ngoài ra còn có tiền củ
(protocorm). Tạo thể nhân giống in –vitro dựa vào đặc điểm nhân giống
ngoài tự nhiên của cây trồng. Tuy nhiên có những cây trồng không có
khả năng nhân giống người ta thường nhân giống bằng cách tạo cụm chồi
bằng mô sẹo. Để tạo thể nhân giống trong môi trường thường bổ sung
Cytokinin, Auxin, GA
3
và các chất hữu cơ khác.
• Nhân giống in – vitro:
14
Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
Là giai đoạn quan trọng trong việc nhân giống cây trồng bằng
phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật nhằm mục đích tăng sinh khối

thể nhân giống. Vật liệu nuôi cấy là những thể chồi, đôi khi nồng độ chất
sinh trưởng giảm thấp cho phù hợp với quá trình nuôi cấy kéo dài. Điều
kiện nuôi cấy thích hợp giúp cho quá trình tăng sinh được nhanh chóng.
Cây nhân giống in – vitro có trạng thái sinh lý trẻ và được duy trì trong
thời gian vô hạn.
• Tái sinh cây hoàn chỉnh in – vitro:
Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân lá và rễ
chuẩn bị chuyển ra vườn ươm. Cây con phải khỏe mạnh nhằm đảm bảo
sức sống khi ra ngoài môi trường bên ngoài. Các chất có tác dụng tạo
chồi được loại bỏ thay vào đó là các chất kích thích quá trình tạo rễ. Điều
kiện nuôi cấy tương tự với quá trình nuôi cấy ngoài tự nhiên, một bước
thuần hóa trước khi được tách ra khỏi điều kiện in – vitro. Thường dùng
các chất thuộc nhóm auxin kích thích ra rễ.
• Chuyển cây in – vitro ra vườn ươm:
Đây là giai đoạn khó khăn nhất trong quá trình nhân giống vô tính.
Cây in - vitro được nuôi cấy trong điều kiện ổn định về dinh dưỡng, ánh
sáng, nhiệt độ. Khi chuyển ra đất với điều kiện tự nhiên hoàn toàn khác
hẳn cây con dễ bị mất nước, mau bị héo. Để tránh tình trạng này, vườn
ươm nuôi cấy mô phải mát, cường độ chiếu sáng thấp, nhiệt độ không
khí mát, độ ẩm cao… Cây con thường được cấy trong luống ươm có cơ
chất dễ thoát nước, tơi xốp giữ được ẩm. Trong những ngày đầu cần
được phủ nilon để giảm quá trình thoát hơi nước. Rễ được tạo ra trong
quá trình nuôi cấy mô sẽ dần lụi đi và rễ mới xuất hiện. Cây con thường
được xử lý với chất kích thích ra rễ bằng cách ngâm hay phun lên lá để
rút ngắn thời gian ra rễ.
• Nhân giống ex – vitro:
Cây con sau khi được chuyển ra luống ươm hay cấy vào bầu đất
sau 7-10 ngày thì bắt đầu ra rễ. sau đó được phun dinh dưỡng với hỗn
hợp N, P, K (1g/l cho mỗi loại). Tuy nhiên do quá trình nhân giống in
15

Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
vitro có nhiều tốn kém thì cây con được sử dụng như là cây mẹ và được
tiếp tục nhân giống trên luống ươm. Điều kiện nhân giống trên luống
ươm phải tiếp tục đảm bảo cây mẹ ở trạng thái tốt nhất bằng cách giảm
dinh dưỡng, duy trì độ ẩm cao, nhiệt độ không khí thấp…Hệ số nhân
giống trên luống ươm càng cao giúp cho việc giảm giá thành càng có ý
nghĩa.
• Cây con bầu đất:
Cây con từ ống nghiệm hay được nhân giống trên luống ươm được
cấy trên luống đất 15-20 ngày cho cây ra rễ và phát triển khỏe, sau đó
được cấy vào bầu đất (cây chuối). Bầu đất có cơ chất xốp đầy đủ chất
dinh dưỡng tỉ lệ đất/phân là 1/1, ngoài ra hàng tuần được phun dinh
dưỡng khoáng 1-2 lần/tuần thường dùng phân khoáng có tỉ lệ N- P- K:
20-20-20. Thời gian cây con ở giai đoạn bầu đất phụ thuộc đặc điểm cây
trồng khoảng 20 ngày (khoai tây) đến 2,5 tháng (cây chuối). Cây bầu đất
được đặt ở nơi có nhiều ánh sáng, độ ẩm cao, nhiệt độ không khí mát để
cây phát triển nhanh và khỏe.
• Trồng cây ra ruộng:
Cây con sau khi đạt được kích thước về chiều cao, số lá đường
kính thân thích hợp sẽ được chuyển ra trồng ở đồng ruộng. Duy trì độ ẩm
cao trong giai đoạn này giúp cây thích nghi dần với điều kiện tự nhiên,
các nhân tố nông học khác được tác động giống như cây trồng tập quán.
• Chọn lọc cây đầu dòng:
Là vấn đề quan trọng đối với cây ăn trái nhằm tạo ra một quần thể
đồng đều có năng suất cao và ổn định. Những cây được chọn đầu dòng
được đưa vào nhân giống trở lại bằng nuôi cấy mô.
Hiện tại công nghiệp nhân giống được ứng dụng nhiều trong kinh tế để
giải quyết nhu cầu về giống cho sản xuất, giống cho cây lâm nghiệp,
trồng rừng, rau, ngũ cốc, cây ăn trái, hoa và cây dược liệu.
1.3.3. Các vấn đề liên quan đến nhân giống in – vitro:

1.3.3.1. Ảnh hưởng của mẫu cấy và môi trường đến nhân giống in – vitro:
 Mẫu nuôi cấy:
16
Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
Các nhân tố khi chọn mẫu bao gồm kiểu gen, cơ quan được chọn, tuổi
sinh lý, mùa vụ, giai đoạn sinh trưởng, độ khỏe của mẫu và nguồn mẫu.
• Kiểu gen: ảnh hưởng sâu sắc đến quá trình nuôi cấy, số lượng chồi tạo
được, sự khác nhau về tăng sinh chồi, sự khác nhau về khả năng phát
sinh phôi.
• Chọn cơ quan: hết các loại cơ quan và mô đều có khả năng sử dụng
nuôi cấy in – vitro. Ví dụ: Nuôi cấy thân mầm cây để tạo protoplast có
khả năng phát sinh phôi. Nuôi cấy lát cắt mỏng ở mô lá cây thuốc lá
có thể tái sinh các cơ quan khác nhau như chồi và rễ phụ thuộc vào
lớp mỏng tế bào ở bộ phận nào của cây được nuôi cấy và các hocmon
được sử dụng.
• Tuổi và sinh lý: Tuổi thực của mẫu nuôi cấy và tuổi theo mùa trong
năm của mẫu nuôi cấy có ảnh hưởng quan trọng đến sự biệt hóa tế
bào. Tùy vào đối tượng cây thì có tuổi sinh lý khác nhau. Ví dụ: Khả
năng tái sinh cao ở lá cây trưởng thành so với lá cây còn non. Ngược
lại mẫu non cắt cành của Hedora helix dễ ra mẫu hơn so với mẫu
trưởng thành và nuôi cấy lá non phát sinh cơ quan tốt hơn so với nuôi
cấy lá trưởng thành.
• Sức sống của mẫu: Mẫu cây mẹ có ảnh hưởng rất quan trọng đến nuôi
cấy in – vitro . Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng để loại virus sản xuất ra cây
sạch bệnh.
 Ảnh hưởng của môi trường:
Môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) được sử dụng phổ biến
nhất trong nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Nhưng các loài khác nhau có thể đòi
hỏi môi trường nuôi cấy khác nhau. Samartin (1989) đã sử dụng 6 công thức
muối đa lượng khác nhau đối với cây trà Camelia japonica và thấy rằng môi

trường MS cho tốc độ sinh trưởng nhanh nhất khi thu mẫu từ cây non. Môi
trường MS đã chứng tỏ không thích hợp cho mẫu lấy từ cây già, trong khi
môi trường muối loãng hơn (Heller, 1953) lại cho kết quả khá.
Tính độc của môi trường MS cũng được quan sát ở một số loài
(Sommer, 1982; Vieitez, 1983) do môi trường này chứa hàm lượng muối đa
lượng cao, có thể gây độc cho tế bào in – vitro, nhất là protoplast. Phương
17