Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc phân tử Virus Epstein Barr ở Việt Nam và quy trình sản xuất bộ sinh phẩm chẩn đoán

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƯỚC KC.10/06-10





BÁO CÁO TỔNG HỢP
VÀ CÁC SẢN PHẨM KHOA HỌC CÔNG NGHỆ


ĐỀ TÀI
NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC PHÂN TỬ
VIRUS EPSTEIN BARR Ở VIỆT NAM VÀ
QUI TRÌNH SẢN XUẤT BỘ SINH PHẨM CHẨN ĐOÁN
(MÃ SỐ ĐỀ TÀI: KC 10.31/06-10)





Cơ quan chủ trì đề tài :
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
Chủ nhiệm đề tài :
PGS.TS. NGUYỄN ĐÌNH PHÚC



8658

Hà nội - 2011

ĐỀ TÀI KHCN CẤP NHÀ NƯỚC
MÃ SỐ: KC 10.31/06-10
CN: PGS.TS. NGUYỄN ĐÌNH PHÚC
HÀ NỘI - 2011
B ÁO C ÁO TỔNG HỢP
VÀ CÁC SẢN PHẨM KHCN
NỘI DUNG

PHẦN 1 : BÁO CÁO TỔNG HỢP
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CẤU TRÚC PHÂN TỬ
VIRUS EPSTEIN-BARR Ở VIỆT NAM
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ TẠO KIT SINH HỌC PHÂN TỬ
CHƯƠNG 5: KẾT QUẢ TẠO NGUYÊN VẬT LIỆU CHO KIT
MIỄN DỊCH HỌC SẮC KÝ
CHƯƠNG 6: KẾT QUẢ TẠO KIT MIỄN DỊCH HỌC SẮC KÝ VÀ
THỬ NGHIỆM SỬ DỤ
NG KIT
CHƯƠNG 7: BÀN LUẬN VỀ ĐỘ NHẠY VÀ ĐỘ ĐẶC HIỆU CỦA
2 BỘ KIT
PHỤ LỤC
PHẦN 2: CÁC SẢN PHẨM KHOA HỌC CÔNG NGHỆ
1. BÁO CÁO ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC PHÂN TỬ CỦA CÁC
CHỦNG EBV Ở VIỆT NAM
2. QUI TRÌNH SẢN XUẤT BỘ KIT SINH HỌC PHÂN TỬ

3. QUI TRÌNH SỬ DỤNG BỘ KIT SINH HỌC PHÂN TỬ
4. TIÊU CHUẨN CƠ SỞ BỘ KIT SINH HỌC PHÂN TỬ
5. BÁO CÁO KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM, SỬ DỤNG BỘ KIT
SINH HỌC PHÂN TỬ
6. QUI TRÌNH SẢN XUẤT BỘ KIT MIỄN DỊCH HỌC SẮC KÝ
7. QUI TRÌNH SỬ DỤNG BỘ KIT MIỄN DỊCH H
ỌC SẮC KÝ
8. TIÊU CHUẨN CƠ SỞ BỘ KIT MIỄN DỊCH HỌC SẮC KÝ
9. BÁO CÁO KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM, SỬ DỤNG BỘ KIT
MIỄN DỊCH HỌC SẮC KÝ.














PHẦN 1
BÁO CÁO TỔNG HỢP



i

MỤC LỤC

MỤC LỤC i
CHỮ VIẾT TẮT viii
DANH MỤC HÌNH x
DANH MỤC BẢNG xiv
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1. DỊCH TỄ HỌC CỦA UNG THƯ VÒM MŨI HỌNG VÀ EBV 4
1.1.1. TẦN SỐ MẮC UTVMH VÀ YẾU TỐ ĐỊA LÝ CỦA EBV 4
1.1.2. VIRUS EPSTEIN BARR VÀ UNG THƯ VÒM MŨI HỌNG 4
1.1.3. SỰ NHÂN LÊN VÀ TÀNG NHIỄM GÂY UNG THƯ CỦA EBV 6
1.2. CẤU TRÚC VÀ ĐẶC TÍNH SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA EPSTEIN-BARR
VIRUS 8
1.2.1. CẤU TRÚC PHÂN T
Ử CỦA EBV 8
1.2.2. SINH HỌC PHÂN TỬ VÀ SẮP XẾP HỆ GEN CỦA EBV 9
1.3. CHẨN ĐOÁN EBV BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ 15
1.3.1. KỸ THUẬT PCR 15
1.3.2. KỸ THUẬT ĐIỆN DI 18
1.3.3. KỸ THUẬT TÁCH DÒNG 19
1.3.4. KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU 21
1.4. NGUYÊN TẮC CHẨN ĐOÁN DỰA TRÊN MIỄN DỊCH HỌC SẮC KÝ
(IMMUNO CHROMATOGRAPHIC ASSAY, ICA) VÀ QUI TRÌNH XÂY
DỰNG BỘ KIT ICT (IMMUNO CHROMATOGRAPHIC TEST) 21
1.4.1. TẦM QUAN TRỌNG CỦA ICA TRONG CHẨN ĐOÁN 21
1.4.2. NGUYÊN LÝ CH
ẨN ĐOÁN KIT ICA 24
1.4.3. THÀNH PHẦN TẠO KIT ICT 25
1.5. NGUYÊN TẮC CHẨN ĐOÁN DỰA TRÊN PHẢN ỨNG PCR VÀ QUI

TRÌNH XÂY DỰNG BỘ KIT SINH HỌC PHÂN TỬ( SHPT) 28
1.5.1. NGUYÊN LÝ CỦA KIT SINH HỌC PHÂN TỬ 28
1.5.2. NGUYÊN TẮC SỬ DỤNG VÀ ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ KIT SHPT 28
1.5.3. NGUYÊN TẮC XÂY DỰNG VÀ SẢN XUẤT BỘ KIT SHPT 29
1.6. TẦM QUAN TRỌNG CỦA NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC
PHÂN TỬ EBV Ở VIỆT NAM VÀ QUI TRÌNH SẢN XUẤT BỘ SINH
PHẨM CHẨN ĐOÁN 29
1.6.1. Chẩn đoán sớm UTVMH có thể phối hợp giữa lâm sàng và
xét nghiệm 30
1.6.2. Đề nghị có sự hợp tác chặt chẽ của nhiều chuyên ngành 30

ii
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU 34
2.1. NGUYÊN LIỆU PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU DỊCH TỄ HỌC PHÂN
TỬ 34
2.1.1. ĐỐI TƯỢNG THU MẪU BỆNH PHẨM NGHIÊN CỨU 34
2.1.2. PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN VÀ BẢO QUẢN MẪU UTVMH 34
2.1.3. PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ 34
2.1.4. PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI KIỂM TRA DNA TỔNG SỐ 34
2.1.5. PHƯƠNG PHÁP THIẾT KẾ MỒI ĐẶC HIỆU, THỰC HIỆN PCR VÀ
THU NHẬ
N GEN EBNA-1 35
2.1.6. PHƯƠNG PHÁP THIẾT KẾ MỒI ĐẶC HIỆU, THỰC HIỆN PCR VÀ
THU NHẬN GEN LMP-1 36
2.1.7. PHƯƠNG PHÁP TINH SẠCH SẢN PHẨM PCR GEN EBNA-1 VÀ
LMP-1 37
2.1.8. PHƯƠNG PHÁP TÁCH DÒNG THU NHẬN TOÀN BỘ SẢN
PHẨM GEN EBNA-1 VÀ LMP-1 38
2.1.9. PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ GEN EBNA -1 VÀ LMP-1 39

2.1.10. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VỊ TRÍ ACID AMIN 487 CỦA GEN
EBNA-1 ĐỂ XÁC ĐỊNH PHÂN TYP EBV 41
2.1.11. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH, XỬ LÝ TRÌNH TỰ CHUỖI GEN
EBNA-1, LMP-1 VÀ SO SÁNH ĐỐI CHIẾU VỚI CÁC CHỦNG EBV
TRÊN THẾ GIỚI 41
2.2. PHƯƠNG PHÁP TẠO KIT SINH HỌC PHÂN TỬ 42
2.2.1. XÁC ĐỊNH NGUYÊN LÝ CỦA KIT SINH HỌC PHÂN T
Ử 42
2.2.2. XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN CỦA KIT SINH HỌC PHÂN TỬ 42
2.2.3. PHƯƠNG PHÁP THIẾT KẾ, TỔNG HỢP MỒI ĐẶC HIỆU GEN
EBNA-1 CHO KIT SINH HỌC PHÂN TỬ 43
2.2.4. PHƯƠNG PHÁP TỐI ƯU HÓA NHIỆT ĐỘ BÁM MỒI VÀ CHU
TRÌNH NHIỆT CHO PCR CỦA KHUÔN DƯƠNG TÍNH ĐỂ SẢN
XUẤT KHUÔN ĐỐI CHỨNG DƯƠNG TÍNH 46
2.2.5. PHƯƠNG PHÁP THỬ NGHIỆM, KIỂM TRA BỘ KIT SHPT ĐỂ XÁC
ĐỊNH ĐỘ NHẠY, ĐỘ ĐẶC HIỆU CỦA KIT SHPT 47
2.2.6. PHƯƠNG PHÁP XÂY DỰNG QUI TRÌNH SẢ
N XUẤT KIT SINH
HỌC PHÂN TỬ 49
2.2.7. PHƯƠNG PHÁP XÂY DỰNG QUI TRÌNH SỬ DỤNG KIT SINH
HỌC PHÂN TỬ 50
2.2.8. PHƯƠNG PHÁP XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ KIT SHPT 50
2.3. PHƯƠNG PHÁP TẠO KIT MIỄN DỊCH HỌC SẮC KÝ (ICT) 50
2.3.1. XÁC ĐỊNH NGUYÊN LÝ, THÀNH PHẦN CỦA KIT ICT 50

iii
2.3.2. PHƯƠNG PHÁP THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN PROTEIN
KHÁNG NGUYÊN EBNA-1 (THIẾT KẾ MỒI, PCR, NHÂN
DÒNG, KIỂM TRA VÀ THU NHẬN PROTEIN EBNA-1) 51
2.3.3. PHƯƠNG PHÁP BIỂU HIỆN, TINH SẠCH PROTEIN

EBNA-1 53
2.3.4. PHƯƠNG PHÁP TẠO TẾ BÀO LAI MYELOMA-LYMPHO (BIỆT
HÓA KHÁNG NGUYÊN EBNA-1) 55
2.3.5. PHƯƠNG PHÁP NUÔI DƯỠNG, BẢO QUẢN PHÁT TRIỂN TẾ
BÀO LAI EBNA-1 (để sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp EBNA-1 và
kháng thể đơn dòng MAb EBNA-1) 58
2.3.6. PHƯƠNG PHÁP TẠO BÁNG CHO CHUỘT BẰNG TẾ BÀO
HYBRID, THU DỊCH, TINH SẠCH KHÁNG THỂ 60
2.3.7. PHƯƠNG PHÁP GẮN KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG EBNA-1 VÀO
HẠT NANO VÀNG 62
2.3.8. PHƯƠNG PHÁP CHẾ TẠO VÀ HOÀN CHỈNH BỘ SINH PHẨM
SẮC KÝ MIỄN DỊCH ICT 63
2.3.9. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐỘ NHẠY ĐỘ ĐẶ
C HIỆU CỦA BỘ
KIT SĂC KÝ MIỄN DỊCH (ICT) 67
2.3.10. TRÊN CƠ SỞ PHƯƠNG PHÁP TẠO KIT SẮC KÝ MIỄN DỊCH
(ICT), ĐÃ ĐƯỢC THỬ NGHIỆM THÀNH CÔNG, LÀ CƠ SỞ
KHOA HỌC ĐỂ XÂY DỰNG QUI TRÌNH SẢN XUẤT, SỬ
DỤNG, TIÊU CHUẨN CƠ SỞ VÀ SẢN XUẤT 100 BỘ KIT SẮC
KÝ MIỄN DỊCH CHẨN ĐOÁN EBV 68
2.4. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 70
2.4.1. DỤNG CỤ VÀ TRANG THIẾT BỊ MÁY MÓC 70
2.4.2. HÓA CHẤT 71
2.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG VÀ THU MẪU BỆNH PHẨM 73
2.5.1. QUI TRÌNH CHẨN ĐOÁN LÂM SÀNG VÀ MÔ BỆNH HỌC 73
2.5.2. QUI TRÌNH LẤY MẪU BỆNH PHẨM SINH THIẾT CHẨN ĐOÁN
GEN EBV 73
2.6. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊM CỨU 74
2.6.1. THU MÃU BỆNH PHẨM 74
2.6.2. NGHIÊN CỨU LABO 74

2.7. XỬ LÝ SỐ LIỆU 74
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CẤU TRÚC PHÂN TỬ
VIRUS EPSTEIN BARR Ở VIỆT NAM 76
3.1. KẾT QUẢ CHẨN ĐOÁN LÂM SÀNG VÀ THU MẪU BỆNH PHẨM 76

iv
3.2. KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT THU DNA TỔNG SỐ HỆ GEN EBV TỪ CÁC
MẪU BỆNH PHẨM 76
3.3. KẾT QUẢ THIẾT KẾ MỒI ĐẶC HIỆU GEN EBNA-1 VÀ LMP-1 76
3.3.1. KẾT QUẢ THIẾT KẾ MỒI ĐẶC HIỆU GEN EBNA-1 76
3.3.2. KẾT QUẢ THIẾT KẾ MỒI ĐẶC HIỆU GEN LMP-1 78
3.3.3. KẾT QUẢ CHẨN ĐOÁN SỰ CÓ MẶT EBV TRONG 50 MẪU
BỆNH PHẨM SINH THIẾT BẰNG PCR ĐẶC HIỆU GEN EBNA-1
(EBK1F và EBNA1R) 79
3.4. KẾT QU
Ả TÁCH DÒNG VÀ THU NHẬN GEN EBNA-1 VÀ LMP-1 80
3.5. KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ GEN EBNA-1 VÀ LMP-1 81
3.5.1. THU NHẬN TOÀN BỘ GEN EBNA-1 QUA GIẢI TRÌNH TỰ GEN
EBNA-1 81
3.5.2. THU NHẬN TOÀN BỘ GEN LMP-1 QUA GIẢI TRÌNH TỰ GEN
LMP-1 82
3.5.3. BÀN LUẬN VÀ KẾT LUẬN 82
3.6. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH, XỬ LÝ TRÌNH TỰ CHUỖI GEN ĐỂ XÁC ĐỊNH
CẤU TRÚC PHÂN TỬ GEN EBNA-1 VÀ LMP-1 CỦA CÁC CHỦNG EBV
Ở VIỆT NAM 84
3.6.1. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC GEN EBNA-1 84
3.6.2. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC GEN LMP-1 87
3.6.3. KẾT LUẬN 92
3.7. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CẤU TRÚC PHÂN TỬ CỦA CÁC CHỦNG EBV
Ở VIỆ

T NAM 92
3.7.1. ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC PHÂN TỬ EBV CỦA VIỆT NAM QUA ĐỐI
CHIẾU GEN EBNA-1 VỚI THẾ GIỚI 92
3.7.2. ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC PHÂN TỬ EBV CỦA VIỆT NAM QUA ĐỐI
CHIẾU GEN LMP-1 VỚI THẾ GIỚI 96
3.7.3. XÁC ĐỊNH PHÂN TYP EBV Ở VỊ TRÍ ACID AMIN 487 GEN
EBNA-1 102
3.7.4. BÀN LUẬN 104
3.7.5. KẾT LUẬN 107
CHƯƠNG 4 : KẾT QUẢ TẠO KIT SINH HỌC PHÂN TỬ
108
4.1. XÁC ĐỊNH NGUYÊN LÝ VÀ THÀNH PHẦN CỦA BỘ KIT SINH HỌC
PHÂN TỬ 108
4.1.1. XÁC ĐỊNH NGUYÊN LÝ CỦA BỘ KIT SINH HỌC PHÂN TỬ 108
4.1.2. XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN CỦA BỘ KIT SHPT 108
4.2. KẾT QUẢ THIẾT KẾ VÀ TỔNG HỢP MỒI ĐẶC HIỆU NHÂN GEN
EBNA-1 CHẨN ĐOÁN EBV 109
4.2.1. KẾT QUẢ THIẾT KẾ MỒI ĐẶC HIỆU CHO GEN EBNA-1 109

v
4.2.2. KẾT QUẢ PHẢN ỨNG PCR VÀ ĐIỆN DI KIỂM TRA VỚI CẶP MỒI
ĐẶC HIỆU NHÂN ĐOẠN GEN EBNA-1 111
4.2.3. BÀN LUẬN 111
4.3. KẾT QUẢ ĐIỀU CHỈNH THÔNG SỐ KỸ THUẬT PHÙ HỢP CHO PHẢN
ỨNG PCR 112
4.3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHỈNH THÔNG SỐ KỸ THUẬT
CHO PCR 112
4.3.2. KẾT QUẢ ĐIỆN DI SẢN PHẨM PCR VỚI CÁC THÔNG SỐ ĐÃ
ĐIỀU CHỈ
NH 113

4.3.3. KẾT QUẢ TỐI ƯU HOÁ NHIỆT ĐỘ BÁM MỒI VÀ CHU TRÌNH
NHIỆT 115
4.3.4. KẾT LUẬN 117
4.4. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH ĐỘ NHẠY, ĐỘ ĐẶC HIỆU CỦA PHẢN ỨNG PCR
ĐỂ XÂY DỰNG CÁC QUI TRÌNH BỘ KIT SINH HỌC PHÂN TỬ 117
4.4.1. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH ĐỘ NHẠY, ĐỘ ĐẶC HIỆU QUA PHA
LOÃNG NỒNG ĐỘ DNA TỔNG SỐ CỦA MẪU THỬ 117
4.4.2. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH ĐỘ ĐẶC HIỆ
U QUA KHẢO SÁT PCR VỚI
CẶP MỒI ĐẶC HIỆU GEN LMP-1 118
4.4.3. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH ĐỘ NHẠY, ĐỘ ĐẶC HIỆU QUA THỬ
NGHIỆM VỚI CÁC MẪU BỆNH PHẨM LÀ UNG THƯ VMH VÀ
KHÔNG UNG THƯ 119
4.5. KẾT QUẢ SẢN XUẤT 100 BỘ KIT SINH HỌC PHÂN TỬ VÀ XÂY
DỰNG QUI TRÌNH SẢN XUẤT, TIÊU CHUẨN CƠ SỞ, QUI TRÌNH SỬ
DỤNG ĐỂ CHẨN ĐOÁN EBV 128
4.5.1. NGUYÊN LÝ CỦA BỘ KIT SHPT 128
4.5.2. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 129
CH
ƯƠNG 5 : KẾT QUẢ TẠO NGUYÊN LIỆU CHO KIT MIỄN DỊCH
HỌC SẮC KÝ (ICT)
135
5.1. XÁC ĐỊNH NGUYÊN LÝ VÀ THÀNH PHẦN CỦA BỘ KIT MIỄN DỊCH
HỌC SẮC KÝ (ICT) 135
5.1.1. XÁC ĐỊNH NGUYÊN LÝ CỦA BỘ KIT MIỄN DỊCH HỌC SẮC
KÝ(ICT) 135
5.1.2. XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN CỦA BỘ KIT MIỄN DỊCH HỌC SẮC
KÝ(ICT) 135
5.2. KẾT QUẢ SẢN XUẤT KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP EBNA-1 136
5.2.1. KẾT QUẢ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN EBNA-1 136

5.2.2. KẾT QUẢ XỬ LÝ GEN EBNA-1, VECTOR pET22b(+) VỚI
ENZYME GIỚI HẠN XhoI, EcoRI VÀ NỐI GHÉP VỚI NHAU 137
5.2.3. KẾT QUẢ BIẾN NẠP VECTOR TÁI TỔ HỢP VÀO E. coli TG1 137

vi
5.2.4. KẾT QUẢ CHỌN DÒNG VECTOR TÁI TỔ HỢP MANG GEN EBNA-1 138
5.2.5. KẾT QUẢ BIỂU HIỆN, TINH SẠCH, THU PROTEIN EBNA-1 TÁI
TỔ HỢP VÀ KIỂM NGHIỆM ĐẶC TÍNH SINH HỌC 139
5.2.6. TINH SẠCH PROTEIN EBNA-1 TRÊN CỘT SẮC KÝ ÁI LỰC 146
5.2.7. KẾT LUẬN 147
5.3. KẾT QUẢ TẠO TỔ HỢP LAI MYELOMA-LYMPHO (BIỆT HOÁ KHÁNG
NGUYÊN EBNA-1) VÀ CHỌN LỌC, NUÔI CẤY, KIỂM NGHIỆM DÒNG
TẾ BÀO LAI 147
5.3.1. KẾT QUẢ GÂY MIỄN DỊCH CHO CHUỘT THUẦN CHUẨN DÒNG
BALB/C BẰNG PROTEIN EBNA1 147
5.3.2. KẾT QUẢ T
ẠO DÒNG TẾ BÀO LAI SINH KHÁNG THỂ ĐƠN
DÒNG ĐẶC HIỆU EBNA-1 148
5.4. KẾT QUẢ NUÔI DƯỠNG, BẢO QUẢN, KIỂM TRA, PHÁT TRIỂN TẾ
BÀO LAI EBNA-1 (ĐỂ SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG MAB
EBNA-1) 155
5.4.1. KẾT QUẢ KIỂM TRA ĐỘ ĐẶC HIỆU CỦA DỊCH NỔI CỦA 5
DÒNG TẾ BÀO 155
5.4.2. KẾT QUẢ NHÂN NUÔI LƯU GIỮ DÒNG TẾ BÀO LAI EBNA-1-1 157
5.5. KẾT QUẢ SÀNG LỌC VÀ SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG EBNA-
1 TRÊN CHUỘT BALB/C 160
5.5.1. KẾT QUẢ GÂY BÁNG CHO CHU
ỘT 160
5.5.2. KẾT QUẢ TINH SẠCH KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG EBNA-1 161
5.5.3. KẾT LUẬN 162

5.6. KẾT QUẢ TẠO PHỨC HỆ KHÁNG THỂ - HẠT NANO VÀNG 162
CHƯƠNG 6 : KẾT QUẢ TẠO KIT SẮC KÝ MIỄN DỊCH (ICT) VÀ THỬ
NGHIỆM SỬ DỤNG KIT
165
6.1. KẾT QUẢ CHUẨN BỊ NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ LẮP BỘ KIT 165
6.1.1. KẾT QUẢ CHUẨN BỊ NGUYÊN VẬT LIỆU SINH HỌC 165
6.1.2. KẾT QUẢ CHUẨN BỊ VẬT LIỆU CƠ HỌC 166
6.1.3. KẾT QUẢ CHUẨN BỊ THÀNH PHẦN PHỤ TRỢ CỦA KIT ICT 168
6.2. BAO GÓI BỘ KIT ICA (EBV-Ag/Fast KIT) 170
6.3. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH ĐỘ NHẠY, ĐỘ ĐẶC HIỆU CỦA KIT MIỄN DỊCH
HỌC ( ICT ) 171
6.3.1. XÁC ĐỊNH ĐỘ NH
ẠY, ĐỘ ĐẶC HIỆU QUA THỬ KIT VỚI 3 LOẠI
MẪU THỬ: MÔ UTVMH, MẪU TẾ BÀO BONG Ở THÀNH SAU
HỌNG, MẪU MÁU NGƯỜI BÌNH THƯỜNG 171
6.3.2. XÁC ĐỊNH ĐỘ NHẠY, ĐỘ ĐẶC HIỆU KIT ICT (EBV-Ag/FastKIT
®
)
QUA THỬ NGHIỆM Ở QUI MÔ VỪA VÀ SO SÁNH VỚI KIT SHPT
(EBV-PCRKIT) 173

vii
6.4. KT QU SN XUT 100 B KIT SC Kí MIN DCH ICT V XY
DNG TIấU CHUN C S 175
CHNG 7 : BN LUN V NHY V C HIU CA 2 B
KIT EBV-PCRKIT (SHPT) V EBV-Ag/FastKIT (ICA)
177
7.1. NHY 177
7.2. C HIU 180
7.3. BN LUN 182

KT LUN, NH GI CHUNG V NGH 186
TI LIU THAM KHO
PH LC
1. Phơng pháp nghiên cứu
2. Kết quả nghiên cứu và danh sách bệnh nhân nghiên cứu
3. Mẫu bệnh án nghiên cứu
4. Một số bộ kit lu hành trên thế giới
5. Phiếu kiểm định sinh học
6. Xét duyệt quyết toán ngân sách





viii
CHỮ VIẾT TẮT

AP1
Activator protein Protein kích hoạt
BARF
Bam HIA reading frames Protein xuất tiết gây nhiễm trùng
muộn trên đoạn gen Bam HIA
BL
Burkitt’s lymphoma U lympho xương hàm trên
CBH
Chân bướm hàm
CMV
Cytomegallovirus Cytomegalovirus
CTAR
C-terminal activating region Vùng hoạt động của đầu tận C

của gen LMP1
DNA
Desoxy ribonucleic acid DNA
DMCTNC
Danh mục công trình nghiên cứu
EA
Early antigen Kháng nguyên sớm
EBER
EB encoded latent infection
membran protein regulator
RNA
RNA của EBV điều chỉnh protein
màng gây nhiễm trùng tiềm tàng
EBNA
Epstein Barr virus nuclear
antigen
Kháng nguyên nhân EBV
EBV
Epstein Barr virus Virus Epstein Barr
Gp
Glycoprotein Glycoprotein
GPB
Giải phẫu bệnh
HD
Hodgkin disease Bệnh Hodgkin
HIV
Human immunodeficiency
virus
Virus gây bệnh AIDS
HLA

Humain leukocyte antigen Kháng nguyên bạch cầu người
HPV
Human papilloma virus Virus gây u nhú ở người
HSV
Herpes simplex virus Virus herpes thông thường
ICA
Immuno - chromatographic
Assay
Miễn dịch học sắc ký
ICT
Immuno - chromatographic
Test
Test miễn dịch học sắc ký
IR
Internal repeat Vùng lặp lại trong
IM
Infectious mononucleosis Bệnh tăng bạch cầu đơn nhân
nhiễm trùng
JNK C-JUN amino kinase Một protein kích hoạt
KB
Kilobase Kilobase

ix
KBMKSH
Ung thư biểu mô không sừng hóa
KBMSH
Ung thư biểu mô sừng hóa
LCL
Lymphoplastoid cell line Dòng tế bào lympho nhiễm trùng
muộn

LM
Lymphomalin Bệnh hạch ác tính
LMP
Latent membral protein Protein màng tiềm tàng
MA
Membral antigen Kháng nguyên màng
MAPK
Mitogen activated protein
kinase
Protein hoạt hóa hoạt động phân
bào
MBH
Mô bệnh học
MHC
Major histocompatibility class Yếu tố phù hợp tổ chức
NF-kB
Nuclear factor kappa in mature
B
Yếu tố nhân của chuỗi kappa
kích hoạt tế bào B
PCR
Polymerase chain reaction Phản ứng tổng hợp chuỗi
pRb
Protein retinoblast Protein gây retinoblastoma
RLTHN
Rố
i loạn tuần hoàn não
RNA Ribonucleic acid Ribonucleic acid
SHPT
Sinh học phõn tử

STAT
Signal transducer and activator
of transcription
Dấu hiệu dẫn truyền hoạt động
giải mã
TNMS
Tumor, Node, Metastasis,
Stade
Khối u, hạch, di căn xa, giai đoạn
US
Unique courte Vùng ngắn đơn độc
UL
Unique long Vùng dài đơn độc
UCNT
Undifferentiated carcinoma
nasopharyngeal type
Ung thư biểu mô không biệt hóa
vòm mũi họng
UTBM
Ung thư biểu mô
UTVMH
Ung thư biểu mô vòm mũi họng
VADS
Voie aero-digestif superieure Đường tiêu hóa và hô hấp trên
VCA
Viral capsid antigen Kháng nguyên vỏ capsid


x
DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Sơ đồ minh họa quá trình tiến triển của EBV
trong cơ thể bị nhiễm 7
Hinh 1.2. Sơ đồ cấu trúc phân tử của Herpesvirus 8
Hình 1.3. Cấu trúc hệ gen EBV 10
Hình 1.4. Thời điểm nhiễm EBV và thời gian biểu hiện gen có kháng
nguyên kích thích kháng thể trong cơ thể. 23
Hình 1.5. Nguyên lý của kit ICT 24
Hình 1.6. Các thành phần vật liệu cơ học và thành phần vật liệu sinh
học cấu tạ
o nên bộ sinh phẩm ICA và các yêu cầu kết quả
đánh giá 26
Hình 1.7. Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR gen EBNA-1 29
Hình 2.1. Thành phần vật liệu và lắp giáp hoàn chỉnh bộ kit ICT 69
Hình 2.2. Thành phần nguyên liệu sinh học của kit ICT 71
Hình 2.3. Các bộ phận của bộ kit ProPur Ni-IMAC spin column Kit 72
Hình 2.4. Bộ khung của kit ICT . 72
Hình 2.5. Máy tia kháng thể 73
Hình 3.1. Ảnh điện di DNA tổng số của mộ
t số mẫu UTVMH 76
Hình 3.2. Sơ đồ mồi bám trên trình tự EBNA-1 77
Hình 3.3. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR thu nhận đoạn 77
Hình 3.4. Sơ đồ mồiLMP1F và LMP1R bám trên trình tự LMP-1 78
Hình 3.5. Đoạn DNA gen LMP-1 kích thước khoảng 1,3 kb 79
Hình 3.6. Điện di sản phẩm PCR thu nhận đoạn gen EBNA-1 . 79
Hình 3.7. Ảnh minh hoạ các đĩa thạch nuôi cấy vi khuẩn
sau chuyển nạp 80
Hình 3.8. Điện di kiểm tra DNA plasmid tái tổ h
ợp gen EBNA-1. 80
Hình 3.9. Điện di kiểm tra DNA plasmid tái tổ hợp gen LMP-1 . 81

Hình 3.10. Trình bày kết quả truy cập Ngân hàng gen 81
Hình 3.11. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR thu nhận gen LMP-1 82
Hình 3.12. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR thu nhận gen LMP-1 82
Hình 3.13. Trình bày chuỗi nucleotide và amino acid gen EBNA-1 86
Hình 3.14. Minh hoạ sự cắt nối exon-intron (mRNA) 90

xi
Hình 3.15. Trình bày cấu trúc khung gen LMP-1 91
Hình 3.16. So sánh đối chiếu trình tự nucleotide của gen EBNA-1 93
Hình 3.17. Mối quan hệ nguồn gốc phả hệ giữa các chủng EBV Việt
Nam và thế giới 96
Hình 3.18. Minh họa so sánh chuỗi gen LMP-1 97
Hình 3.19. Cây phả hệ biểu hiện quan hệ phả hệ nguồn gốc
các chủng EBV của Việt Nam và thế giới 101
Hình 3.20. So sánh một phần trình tự acid amin EBNA-1 của 27 chủng . 103
Hình 4.1. Polypeptide của EBNA-1 109
Hình 4.2. So sánh chuỗi gen EBNA-1 110
Hình 4.3. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR thu nhận đoạn gen EBNA-1 .111
Hình 4.4. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR thu nhận đoạn gen EBNA-1
chưa bổ sung DMSO 114
Hình 4.5. Điện di kiểm tra phản ứng PCR bổ sung thành phần
phù hợp điều chỉnh thông số. 115
Hình 4.6. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR thực hiện tối ưu hóa
nhiệt độ bám mồi 116
Hình 4.7. Điện di kiểm tra sản phẩ
m PCR đoạn gen EBNA-1 từ khuôn
là DNA tổng số pha loãng theo hệ số 2. 118
Hình 4.8. Kiểm tra độ đặc hiệu băng PCR với mồi đực hiệu gen LMP-1 119
Hình 4.9. Vị trí bám mồi của EBK1F – EBVR trong chuỗi gen EBNA-
1 của phản ứng PCR bán lồng phát hiện EBNA-1 của bộ kit

SHPT 120
Hình 4.10. Hình ảnh điện di DNA tổng số của một số mẫu đại diện 121
Hình 4.11. Thử nghiệm KIT SHPT (Điện di kiểm tra sản phẩm PCR) 123
Hình 4.12. Thử nghi
ệm kit SHPT (Điện di kiểm tra sản phẩm PCR) 123
Hình 4.13. Thử nghiệm kit SHPT (Điện di kiểm tra sản phẩm PCR)
Hình 4.14. Thử nghiệm KIT SHPT (Điện di kiểm tra sản phẩm PCR
thực hiện tối ưu hóa nhiệt độ bám mồi) 124
Hình 4.15. Thử nghiệm KIT SHPT: Điện di kiểm tra sản phẩm PCR
thu nhận gen LMP-1 . 125
Hình 4.16. Tiêu chuẩn cơ sở, thành phần và qui trình sử dụng
và bảo quản bộ kit sinh học phân t
ử . 131

xii
Hình 4.17. Ảnh trình bày bộ kit sinh học phân tử chẩn đoán EBV 132
Hình 4.18. Sử dụng kit sinh học phân tử chẩn đoán EBV các mẫu thu
nhận từ bệnh nhân nhập viện tại các bệnh viện trong cả nước 132
Hình 4.19. Mô tả bộ kit sinh học phân tử phát hiện EBNA-1
từ các mẫu lâm sàng 134
Hình 5.1. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân gen EBNA-1 136
Hình 5.2. Kết quả biến nạp sản phẩm nối ghép giữa vector pET22b(+)
với gen EBNA-1 vào E. coli chủ
ng TG1 138
Hình 5.3. Kết quả kiểm tra DNA plasmid chọn dòng cùng
với DNA plasmid pET22b(+). 138
Hình 5.4. Kết quả điện di kiểm tra DNA plasmid tái tổ hợp của 5 khuẩn
lạc sau khi xử lý với hai enzyme giới hạn EcoRI và XhoI 139
Hình 5.5. Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E. coli BL21,
tất cả đều cho khuẩn lạc thuần nhất. 140

Hình 5.6. Điện di kiểm tra kết quả biểu hiện của gen EBNA-1
trong E. coli. 141
Hình 5.7. Lượng protein tái tổ
hợp kháng EBNA-1 được tổng hợp
theo thời gian 142
Hình 5.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng
biểu hiện của EBNA-1. 143
Hình 5.9. Ảnh hưởng của OD đến sự biểu hiện của gen EBNA-1. 144
Hình 5.10. Ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng
biểu hiện EBNA-1 145
Hình 5.11. Ảnh hưởng của IPTG đến khả năng biểu hiện của EBNA-1.
Hình 5.12. Điện di protein kháng nguyên EBNA-1 trên gel
polyacrylamid. 146
Hình 5.13. (A) T
ế bào Sp2/0 trước khi dung hợp; (B) Tế bào P3X
trước khi dung hợp, độ phóng đại 10×20 148
Hình 5.14. Tế bào lai giữa tế bào lympho B với tế bào myeloma Sp2/0
trên nền tế bào feeder, độ phóng đại 10×20 150
Hình 5.15. Các cụm tế bào lai (clone) đang phát triển,
độ phóng đại 10×20 và 10×10. 151
Hình 5.16. Kiểm tra tính đặc hiệu của kháng thể của các dòng tế bào

xiii
EBNA-1 với các kháng nguyên khác nhau
bằng phương pháp ELISA 155
Hình 5.17. Kiểm tra khả năng phát triển của tế bào sau khi đánh thức. 159
Hình 5.18. Gây báng cho chuột bằng cách tiêm tế bào lai chứa liên hợp
kháng thể đơn dòng EBNA-1 (dòng lai EBNA-1-1). 160
Hình 5.19. Kết quả tạo phức hệ kháng thể-hạt nano vàng (KT-Au)
và xác định phức hệ kháng thể - hạt nano vàng dưới kính

hiển vi với độ phóng đại 400 lần. 163
Hình 5.20. Kết quả xác định phổ hấp thụ của các phức hệ
kháng thể -
hạt vàng. 163
Hình 5.21. Biểu đồ kết quả xác định phổ hấp thụ của các phức hệ
kháng thể-hạt vàng ở bước sóng 540 nm 163
Hình 5.22. Sơ đồ phổ hấp thụ của phức hệ kháng thể-Au 164
Hình 6.1. Thành phần nguyên liệu sinh học (của kit ICT) 165
Hình 6.2. Máy tia kháng thể lên tấm màng nitrocellulose của hãng
Arista Biologicals đang thực hiện tia kháng thể đơn dòng
anti-EBNA1 và goat anti-mouse IgG do chúng tôi phối hợp
thực hiện 167
Hình 6.3. Máy tia kháng thể đang ho
ạt động 167
Hình 6.4. Bộ khung của kit ICT. 167
Hình 6.5. Các thành phần của bộ kit EBV-Ag/FastKIT 169
Hình 6.6. Nhãn mác của bộ kit EBV-Ag/FastKIT. 169
Hình 6.7. Hình dáng bao gói của bộ kit EBV-Ag/FastKIT 170
Hình 6.8. Bố trí đánh giá kiểm tra chất lượng tấm thử của kit EBV-
Ag/FastKIT . 171
Hình 7.1. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR đoạn gen EBNA-1 từ khuôn
là DNA tổng số pha loãng theo hệ số 2 178
Hình 7.2. Kiểm tra độ đặc hiệu bằng PCR với mồi đặc hiệu gen LMP-1 181






xiv

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Thành phần thực hiện phản ứng PCR 35
Bảng 2.2. Chu trình nhiệt của phản ứng 36
Bảng 2.3. Thành phần thực hiện phản ứng PCR 37
Bảng 2.4. Chu trình nhiệt của phản ứng 37
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng nối 38
Bảng 2.6.Thành phần cắt DNA plasmid tái tổ hợp bằng EcoRI 39
Bảng 2.7. Phản ứng giải trình tự 40
Bảng 2.8. Chu trình nhiệt của phản ứng giải trình tự 40
Bảng 2.9. Thành phần thực hiện phản ứng PCR 44
Bảng 2.10. Chu trình nhiệt của phản ứng 44
Bảng 2.11. Thành phần thực hiện phản ứng PCR được điều chỉnh lại 45
Bảng 2.12. Chu trình nhiệt của phản ứng 45
Bảng 2.13 Thành phần thực hiện phản ứng PCR của chứng dươ
ngtính 46
Bảng 2.14. Chu trình nhiệt của phản ứngPCR của chứng dương tính 46
Bảng 2.15. Thành phần của phản ứng được phối hợp theo đúng chỉ dẫn 48
Bảng 2.16. Thành phần dung môi 65
Bảng 3.1. Kết quả truy cập Ngân hàng gen sử dụng chuỗi gen EBNA-1
của chủng S1 (miền Nam, Việt Nam) (763 bp) 85
Bảng 3.2. Kết quả truy cập Ngân hàng gen sử dụng chuỗi gen LMP-1
của chủng S1 (miền Nam, Việt Nam) (1238 bp) 87
Bảng 3.3. Đặc đi
ểm cấu trúc gen LMP-1 của các chủng EBV
Việt Nam và thế giới 88
Bảng 3.4. Tỷ lệ (%) đồng nhất về nucleotide và amino acid 95
Bảng 3.5. Đặc điểm cấu trúc gen LMP-1 của các chủng EBV Việt Nam
và thế giới 98
Bảng 3.6. Kết quả xác định phân týp của các chủng EBV qua phân tích

acid amin tại vị trí 487 của EBNA-1 103
Bảng 4.1. Thành phần thực hiện phản ứng PCR 115
Bảng 4.2. Chu trình nhiệt của ph
ản ứng bố trí thử nghiệm so sánh 116
Bảng 4.3. Thành phần phản ứng 120
Bảng 4.4.Thành phần của phản ứng 122

xv
Bảng 5.1. Kết quả gây đáp ứng miễn dịch cho chuột 147
Bảng 5.2. Tỷ lệ giếng có tế bào lai trên tổng số giếng thực hiện dung
hợp 149
Bảng 5.3. Kết quả xác định các giếng có mặt kháng thể kháng EBNA-1 150
Bảng 5.4. Hiệu quả tách dòng bằng phương pháp pha loãng tới hạn 152
Bảng 5.5. Giá trị OD của dịch nổi các giếng có 1 dòng tế bào dương
tính 153
Bảng 5.6. Kiểm tra độ đặc hiệu củ
a dịch nổi của các dòng tế bào 156
Bảng 5.7. Ảnh hưởng của nồng độ FBS đến kết quả nuôi cấy tế bào lai
sinh kháng thể đơn dòng EBNA-1-1 157
Bảng 5.8. Tỉ lệ sống và sinh trưởng của tế bào EBNSA-1-1 sau các lần
cấy chuyển 158
Bảng 5.9. Khả năng sống sót của tế bào sau khi đánh thức 159
Bảng 5.10. Lượng dịch báng thu từ 7 chuột sản xuất kháng thể đơn
dòng 160
Bảng 6.1. Thành phần Dung môi 168
Bảng 6.2. So sánh độ nhạy kit SHPT (PCR) với kit miễn dịch học (ICA).179
Bảng 6.3. So sánh độ nhạy của 2 bộ kit và với cả số mẫu khác nhau của
PCR 179
Bảng 6.4. So sánh độ đặc hiệu của 2 bộ kit PCR và ICA 179
Bảng 6.5. So sánh độ nhạy của kit SHPT 180

Bảng 7.1. Kiểm định dộ nhạy của EBV-PCRKIT với kit Nam khoa
(Việt Nam) 177
Bảng 7.2. So sánh độ nhạy của kit SHPT (phát hiện kháng nguyên)
với mộ
t số nghiên cứu (phát hiện kháng thể trong máu) 179
Bàng 7.3. So sánh độ nhạy của 2 bộ kít và với cả số mẫu
khác nhau của PCR 179
Bảng 7.4. So sánh độ nhạy kit SHPT (PCR) với kit miễn dịch học (ICA).180
Bảng 7.5. Kết quả kiểm định độ đặc hiệu chạy PCR trên 30 mẫu DNA-
HBV (tách từ huyết tương bệnh nhân viêm gan B) cho EBV-
PCR KIT và so sánh đối chiếu với Kit Nam khoa 180
Bảng 7.6. So sánh độ đặc hiệu của 2 bộ kit PCR và ICA 181


1
ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư vòm mũi họng (nasopharyngeal carcinoma-NPC) là khối u ác
tính xuất phát từ biểu mô phủ của vùng vòm mũi họng. Loại ung thư này
được xếp vào các khối u biểu mô của đường tiêu hoá và hô hấp trên. Đây là
một trong 5 loại ung thư phổ biến nhất ở người Việt Nam và là loại hay gặp
nhất trong các ung thư vùng tai mũi họng, đầu cổ. Trên thế giới, ung thư
vòm cũng gặp nhiều ở các nước vùng Đông nam Á và nhiề
u hơn cả là ở
phía nam Trung Quốc [15],[16],[42],[43],[44],[62],[69],[71].

Về nguyên nhân của bệnh, có ba nhóm chủ yếu đó là do virus
Epstein-Barr, do di truyền và do các yếu tố môi trường, tập quán ăn uống,
hoá chất. Kể từ năm 1964 tìm ra virus Epstein-Barr (EBV) tới nay , đã có
rất nhiều công trình nghiên cứu của các tác giả trong nước cũng như quốc

tế về mối liên quan giữa EBV và ung thư vòm mũi họng (UTVMH). Các
nghiên cứu này đã cho thấy sự biểu lộ của các kháng nguyên virus , kháng
thể , ở trong các giai đoạn của b
ệnh, và vai trò quan trọng của virus
Epstein-Barr trong bệnh sinh cũng như trong quá trình sàng lọc chẩn đoán,
điều trị, theo dõi và tiên lượng bệnh. Qua nghiên cứu của các tác giả trong
và ngoài nước, đã phát hiện được hàng trăm chuỗi nucleotid và một số hệ
gen hoàn chỉnh của EBV trong các mô sinh thiết ung thư vòm mũi họng
thuộc các type EB (WT), EB (B95-8), EB (RAJI), EB (GD1), EB (CN)…
Các chủng virus này có phân bố khác nhau theo các bệnh lý và vùng địa lý
trên thế giới. Chúng có đặc tính gây bệnh khác nhau là IM,UTVMH,
BL.[2,46,51,64,88,82,89,94]. Ở Việt Nam, cho đến nay đã xác định đượ
c
chủng EBV giống chủng của châu Âu B95-8 , chủng QD1 (Nam Trung
Quốc) [9],[10],[12],[13],[14],[17],[18],[95].
Từ những năm 1997, nhóm nghiên cứu của chúng tôi thuộc Bộ môn
Tai mũi họng (Trường Đại học Y Hà nội – PGS.TS Nguyễn Đình Phúc) và

2
Phòng Miễn dịch (Viện Công nghệ sinh học – GS.TSKH Đái Duy Ban, TS
Phạm Công Hoạt, PGS.TS Lê Thanh Hòa ) đã phối hợp nghiên cứu về lâm
sàng và EBV (Nguyễn Đình Phúc, 2006). Từ đó cũng cho thấy sự liên quan
chặt chẽ giữa EBV và NPC, tỷ lệ mắc cao, chẩn đoán lâm sàng, điều trị muộn,
tiên lượng xấu của bệnh UTVMH [6],[8],[25],[27],[29],[30],[36],[40].
Tuy nhiên những nghiên cứu sâu sắc về sinh học phân tử và dịch tễ
học phân tử của EBV t
ại Việt Nam, cũng như những hướng ứng dụng công
nghệ sinh học phân tử trong chẩn đoán còn rất ít, ngoài một số công trình
của Do et al. (2008) [1],[3],[4],[6],[7],[11],[24],[52 ].
Xuất phát từ nhũng luận cứ khoa học và những yêu cầu cấp thiết về

nghiên cứu EBV trên đây chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài cấp nhà
nước:
“Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc phân tử Virus Epstein-Barr ở Việt
nam và xây dựng qui trình sản xuất b
ộ sinh phẩm chẩn đoán” mã số
KC.10.31/ 06-10, với 2 mục tiêu sau đây :
1. Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc phân tử EBV ở Việt nam
2. Xây dựng qui trình sản xuất, qui trình sử dụng, tiêu chuẩn cơ sở
bộ kit Sinh học phân tử và kit sắc ký miễn dịch học (ICA) đẻ chẩn
đoán EBV.
Đề tài có 5 Nội dung sau đây:
Nội dung 1: Thu thập mẫu ung thư vòm mũi họng ở Hà Nội (miền
Bắ
c), Huế, Đà nẵng (miền Trung), TP. HCM (miền Nam) và kiểm tra sự
có mặt của EBV. PGS TS Nguyễn Đình Phúc Chủ trì.
Nội dung 2: Nghiên cứu, xác định đặc điểm cấu trúc phân tử của các
chủng virus Epstein-Barr ở Việt Nam PGS.TS. Lê Thanh Hòa và Nguyễn
Đình Phúc Chủ trì.
Nội dung 3: Xây dựng qui trình công nghệ sản xuất, tiêu chuẩn cơ sở,
quy trình sử dụng bộ sinh phẩm chẩn đoán EBV bằng sinh học phân tử.

3
Thử nghiệm và báo cáo kết quả sử dụng. PGS.TS Lê Thanh Hòa và
Nguyễn Đình Phúc chủ trì .
Nội dung 4: Sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp EBNA-1 và kháng thể
đơn dòng (Mab-EBNA-1). PGS.TS Lê Thanh Hòa chủ trì
Nội dung 5: Xây dựng qui trình công nghệ sản xuất, tiêu chuẩn cơ sở
và quy trình sử dụng bộ sinh phẩm chẩn đoán kháng nguyên EBV theo
nguyên lý sắc ký miễn dịch học (ICA) và báo cáo kết quả sử dụng.
PGS.TS. Nguyễn Đình Phúc và PGS.TS. Lê Thanh Hòa chủ trì.

Trên cơ sở thực hiệ
n 5 nhiệm vụ trên chúng tôi đã hoàn thành được:
1- Đào tạo 1 Nghiên cứu sinh : PGS TS Lê Thanh Hòa đang hướng dẫn.
2- Đào tạo 1 Nghiên cứu sinh: PGS TS Nguyễn Đình Phúc đang hướng dẫn
3- Đào tạo 1 Cao học : PGS TS Nguyễn Đình Phúc hướng dẫn.
4- Đề tài cũng đã có 3 Đăng ký giải pháp hữu ích tại Cục Sở hữu trí tuệ
5- Đề tài đã có 6 bản quyển Đăng ký trên Genbank
6- Đề tài đã
đăng 05 bài báo: trên Tạp chí Y học Việt nam, Tạp chí Công
nghệ Sinh học, Tạp chí Tai mũi họng Việt nam, Kỷ yếu hội nghị Hóa
sinh Việt nam.
7- Đề tài đã có 03 bản báo cáo tại Hội nghị Tai mũi họng Việt Pháp, tại
Hội nghị Sinh học Việt nam, Hội nghị Học viện Quân Y – 103.
8- Đã tổ chức thành công 1 hội thảo khoa học.
9- Đã xuất bản 1 quyển sách.
10- Đã m
ở ra triển vọng hợp tác với Đại học North Carolina (Mỹ),
Dousselldorf (Đức), hãng công nghệ sinh học Arista Biologicals Inc. (Mỹ)



4
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. DỊCH TỄ HỌC CỦA UNG THƯ VÒM MŨI HỌNG VÀ EBV
1.1.1. TẦN SỐ MẮC UTVMH VÀ YẾU TỐ ĐỊA LÝ CỦA EBV
Có 3 vùng mắc UTVMH khác biệt nhau trên thế giới và cũng liên
quan chặt chẽ với EBV [39],[49],[56],[59],[61],[67],[70] là : Vùng có tần
số mắc cao là Đông Nam châu Á như: miền Nam Trung Quốc, Hồng

Kông, Singapore, miền Bắc Việt Nam, Philippine, Indonexia, Malaysia,
Thái Lan. Ngoài ra còn vùng Groenland (người Innuits), vùng Alaska
(người Eskimos, Indiens). Tỷ lệ mắc mới hàng năm vào khoảng 20-30 bệnh
nhân/100000 dân. Nó chiếm kho
ảng 1/5 của ung thư toàn cơ thể và khoảng
3/4 các khối u của đường tiêu hóa và hô hấp trên (VADS). Những người
Quảng Đông – Trung Quốc di cư sống ở Mỹ, Úc vẫn còn mắc UTVMH cao
cho tới thế hệ thứ 2 Vùng có tần số mắc trung gian gồm miền Đông, Bắc
Phi: Algérie, Maroc, Kenya, Tanzania, Ouganda, Soudan. Các nước ven
Địa Trung Hải như: Hy Lạp, Thổ Nhĩ Kỳ, Malte, Miền Nam nước Ý, Ai
Cập, Irak, Nigéria, Congo và Sénegal. Tỷ lệ mắc thay
đổi từ khoảng 1,5 –
12 bệnh nhân/100000 dân Vùng có tần số mắc thấp là những vùng còn lại
trên thế giới: Châu Âu, Châu Mỹ, Châu Úc… Tỷ lệ mắc mới hàng năm vào
khoảng 0,1 – 0,5 cho 100.000 dân. Nó chỉ chiếm khoảng 0,25% ung thư
toàn cơ thể và từ 1-3% của đường tiêu hóa và hô hấp trên Ở những vùng
mắc UTVMH ít , thì lại có tỷ lệ mắc IM cao – đếu là liên quan đến EBV
[1],[35],[37],[58],[60],[66],[77].
1.1.2. VIRUS EPSTEIN BARR VÀ UNG THƯ VÒM MŨI HỌNG
Epstein-Barr Virus (EBV) là virus thuộc họ Herpesviridae. EBV gây
nhiễm r
ộng trong cộng đồng, được nghiên cứu rất sớm từ những năm 1980
về bệnh sinh và dịch tễ học. Đến tuổi trưởng thành, gần như tất cả mọi

5
người đều có khả năng mang EBV. Ở các nước đang phát triển, trẻ em đã
nhiễm và EBV kích thích sinh kháng thể rất sớm (Biggar và cs, 1978; Ayan
và cs, 2003), ở các nước tiên tiến, EBV nhễm muộn hơn và kháng thể cũng
xuất hiện sau thường sau khi trưởng thành (Fry, 1980; Lennette, 1985;
Fleisher và cs, 1979). Tiếp theo giai đoạn mở đầu này, cho dù có hay không

biểu hiện lâm sàng, EBV tiến triển trạng thái nhiễm tiềm tàng, mãn tính
trong tế bào lympho-B và hầu như tồn tại suốt cuộc đời người nhi
ễm
(Merlin, 1986). EBV sử dụng tế bào biểu mô của họng miệng
(oropharyngeal epithelial cells) để thực hiện chu kỳ nhân lên và giải phóng
ra khỏi tế bào nhiễm , rồi bài xuất trong niêm dịch của miệng, họng: như
nước bọt . Ở hầu hết bệnh nhân với IM (Sixbey và cs, 1984), và hầu như
10-20% người lành có khả năng bài xuất EBV qua dịch tiết đường miệng,
tạo nên nguồn truyền lây virus rộng rãi trong cộng đồng (Crawford, 2001).
Tái hoạ
t hoá virus từ trạng thái tiềm tàng là hiện tượng được phát hiện
khi có sự tăng cường bài thải virus với mức độ mạnh, khi cơ thể bị suy
giảm miễn dịch ví dụ do HIV-AIDS, bị nhiễm Kaposi-sarcoma, bị suy dinh
dưỡng, bị bệnh hoặc khi người phụ nữ mang thai (Jones và cs, 1985;
DuBois và cs, 1984; Swaminathan, 2003; Bajaj và cs, 2007). Nhiễm EBV
mãn tính cho dù tiềm tàng, có hay không có biểu hiện lâm sàng trước đây
thường chưa được coi là nguyên nhân gây bệnh mà chỉ coi là liên quan như
một yếu t
ố hỗ trợ tiến triển bệnh đối với NPC, BL và khối u lymphoma ở
bệnh nhân suy giảm miễn dịch (Chang và cs, 1978; Lennette 1985; Hecht
và Aster 2000 ). Nhưng chắc chắn vai trò của EBV rất quan trọng trong tiến
triển IM, hoặc các trạng thái bệnh lý biến đổi tế bào lympho ((Rapp và cs,
1978; Tobi và cs, 1982; DuBois và cs, 1984; Jones và cs, 1985; Strauss và
cs, 1985, Crawford, 2001; Sitki-Green và cs, 2004. Những nghiên cứu mới
nhất đầu thế kỷ 21 càng khẳng định vai trò tiên quyết của EBV hoạt hoá
trong bệnh nhân IM, NPC hay BL (Hecht và Aster, 2000; Raab-Traub,

6
2002; Sitki-Green và cs, 2004; Landgren và Caporaso, 2007). Như vậy
EBV là 1 Virus gây ung thư đầu tiên ở loài người đã được tìm thấy và

nghiên cứu trên toàn cầu. Ba nhóm bệnh chủ yếu do EBV là : Ung thư
vòm mũi họng – NPC (Châu Á), khối u ác tính của xương hàm trên ở trẻ
em- BL (Châu Phi ), Bệnh Sốt và tăng Bạch cầu đơn nhân nhiễm trùng- IM
(châu Âu – Mỹ). Gần đây đã phát hiện EBV liên quan đến sốt kéo dài- suy
nhược, khối u ác tính hệ Lymphomalin của tế bào T-NK, các bệnh lý liên
quan đến cấy ghép các cơ quan nội t
ạng, các bệnh lý của hệ thần kinh
(liệt,viêm tủy…) [45],[68],[76],[78],[84],[87],[93] .
1.1.3. SỰ NHÂN LÊN VÀ TÀNG NHIỄM GÂY UNG THƯ CỦA EBV
Trong cơ thể, EBV có 3 hướng tiếp tục tiến triển được minh hoạ ở Hình 1.1:
• Xâm nhập vào tế bào biểu mô và nhân lên (Hình 1.1-(2 )).
• Gây sơ nhiễm và xâm nhập vào tế bào lympho B thực hiện sự nhân
lên (Hình 1.1-(1)/(3)/(6)/(7)/(8)/(9)).
• Tàng nhiễm và tiến triển ung thư khi có đủ điều kiện (Hình
1.1(3)/(4)).
• Ngoài ra, qúa trình nhiễm EBV cũng có khả nă
ng kích thích đáp ứng
miễn dịch, chủ yếu là loại hình miễn dịch trung gian tế bào có vai trò của
lympho T (Hình 1.1-(5)).
Đối với trường hợp nhất, EBV tìm thấy điều kiện thích ứng trong tế
bào biểu mô và sự nhân lên của EBV thuộc loại hình gây nhiễm có sinh sản
(productive infection) (Hình 1.1-(2)). EBV giải phóng ra tiếp tục các hướng
tiến triển như đã nêu ở trên. EBV có thể nhân lên trong tế bào biểu mô,
hoặc chuyển từ sơ nhi
ễm sang gây nhiễm thứ cấp bằng cách nhân lên mãnh
liệt trong lympho B giải phóng virus vào nước bọt; hoặc có thể chuyển từ
sơ nhiễm sang tàng nhiễm và tiến triển ung thư vòm họng (Murray và
Young, 2001).

7

Hình 1.1. Sơ đồ minh họa quá trình tiến triển
của EBV trong cơ thể bị nhiễm (Murray và Young, 2001).

Đối với trường hợp thứ hai, EBV sơ nhiễm sẽ tìm đến lympho B có
trong vùng họng, thực hiện sự xâm nhập và nhân lên trong các tế bào này.
Virus giải phóng ra hàng loạt bằng cách dung giải tế bào, xâm nhiễm vào
quần thể lympho B, gây nhiễm thứ cấp, mà kết quả là có một lượng lớn
EBV được tung ra, chúng có rất nhiều trong nướ
c bọt. Lúc này, EBV lại có
thể gây nhiễm các tế bào biểu mô khác (Hình 1.1-(7-9))
Đối với trường hợp thứ ba, EBV thực hiện sự gây nhiễm bán sinh sản
(semi-productive infection) và tàng nhiễm trong tế bào lympho B (Hình
1.1-(4)). Nhờ trợ giúp của một số sản phẩm protein sớm (EBNA-1) và
muộn (LMP-1), EBV thực hiện quá trình chuyển đổi lympho B, non hoá và
biệt hoá chúng tăng sinh và tiến triển ung thư. Tuy nhiên, quá trình ung thư
do EBV khởi phát còn chịu nhiều tác động hỗ trợ của rất nhiề
u yếu tố (co-
factor) mà về thực chất ngày nay còn chưa biết rõ.[47],[55],[72],[84].