SẢN XUẤT SINH KHỐI LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS ĐỂ BỔ SUNG VÀO THỨC ĂN CHO TÔM VÀ XỬ LÝ MÔI TRƯỜNG AO NUÔI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT
KHOA SINH HỌC
LỚP CSK31
BÁO CÁO THỰC TẬP CHUYÊN ĐỀ
SẢN XUẤT SINH KHỐI
LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS
ĐỂ BỔ SUNG VÀO THỨC ĂN CHO
TÔM VÀ XỬ LÝ MÔI TRƯỜNG AO
NUÔI
Nhóm thực hiện: Nhóm 3
1
TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT
KHOA SINH HỌC
LỚP CSK31
SẢN XUẤT SINH KHỐI
LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS ĐỂ
BỔ SUNG VÀO THỨC ĂN CHO TÔM
VÀ XỬ LÝ MÔI TRƯỜNG AO NUÔI
GVHD: CN. NGUYỄN VĂN GIANG
SVTH: PHẠM NGỌC CHÚC
LÊ ĐOÀN VY HẠ
NGUYỄN THỊ KHÁNH LY
NGUYỄN THỊ THỦY NGÂN
ĐẶNG VĂN NGHỊ
NGUYỄN XUÂN TOÀN
ĐÀM HUYỀN TRANG
TRẦN THỊ QUỲNH TRANG
2
TRẦN THỊ THÙY TRANG
3
LỜI CẢM ƠN

Với vốn kiến thức hạn hẹp, kỹ năng thực nghiệm chưa thành thạo, để
hoàn thành đề tài thực tập này, chúng tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ.
Xin chân thành cảm ơn ban chủ nhiệm khoa Sinh học cùng toàn thể
các thầy cô đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức, kinh
nghiệm quý báu cho chúng tôi và tạo điều kiện cho chúng tôi hoàn thành đề
tài thực tập này
Xin gửi lời cảm ơn đến thầy Nguyễn văn Giang, người đã tận tình
hướng dẫn, tạo điều kiện về mọi mặt cho chúng tôi trong suốt quá trình làm
đề tài.
4
DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1. Thu nhận sinh khối tế bào
Hình 2: Chủng Lactobaccilus acidophilus được hoạt hóa
Hình 3. Hình thái khuẩn lạc Lactobaccilus acidophilus
Hình 4. Sinh khối trên bề mặt thạch
Hình 5. Dịch sinh khối tế bào
Hình 6. Sinh khối tế bào
Hình 7. Sinh khối được cố định trên tá dược
Hình 8. Nhuộm soi tế bào vi khuẩn
5
Mục lục
LỜI MỞ ĐẦU………………………………………………………1
Phần 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Probiotic…………………………………………………………4
1.1.1 Các nhóm vi sinh vật chủ yếu trong probiotic………………….4
1.1.2 Công dụng của Probiotic trong NTTS…………………………4
1.1.3 Tác hại của probiotic………………………………………….6
1.2 Vi khuẩn Lactic…………………………………………………6
1.2.1 Phân loại vi khuẩn Lactic……………………………………….7
1.2.2 Đặc điểm hình thái……………………………………………7

1.2.3 Đặc điểm sinh lý- sinh hóa…………………………………….8
1.2.3.1 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic……………………8
1.2.3.2 Quá trình trao đổi chất ……………………………………10
1.2.4 Những ứng dụng của vi khuẩn lactic…………………………10
1.2.4.1 Những ứng dụng trong công nghệ thực phẩm………………10
1.2.4.2 Chế biến các sản phẩm sữa…………………………………10
1.2.4.3 Sản xuất bánh mỳ đen………………………………………11
1.2.4.4 Ủ thức ăn gia súc…………………………………………….11
1.2.4.5 Muối chua rau quả…………………………………………11
1.2.4.6 Sản xuất acid lactic và muối lactat………………………….11
1.2.4.7 Sản xuất men tiêu hóa cho người và động vật………………11
1.2.4.8 Một số ứng dụng khác của vi khuẩn lactic…………………12
1.3 Lactobacillus acidophilus 12
1.3.1 Phân loại……………………………………………………….12
1.3.2 Đặc điểm hình thái……………………………………………13
6
1.3.3 Đặc tính nuôi cấy……………………………………………13
1.3.4 Tác dụng của Lactobacillus acidophilus ……………………13
Phần II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Thời gian, địa điểm nghiên cứu………………………………14
2.2. Đối tượng, dụng cụ, thiết bị……………………………………14
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu………………………………………14
2.2.2. Dụng cụ và thiết bị……………………………………………14
2.2.3. Môi trường nuôi cấy ………………………………………….14
2.2.4. Khử trùng thiết bị, dụng cụ…………………………………15
2.3. Phương pháp nghiên cứu……………………………………….15
2.3.1. Phương pháp phục hồi chủng……………………………….15
2.3.2. Phương pháp phân tách khuẩn lạc………………………… 15
2.3.3. Phương pháp nhân giống……………………………………15
2.3.4. Phương pháp lên men…………………………………………15

2.3.5. Phương pháp nhuộm gram……………………………………15
2.3.6. Phương pháp thu nhận sinh khối……………………………16
2.3.7. Định lượng sản phẩm…………………………………………16
Phần III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Kết quả hoạt hóa chủng Lactobaccilus acidophilus……………17
3.2. Quá trình tách khuẩn lạc………………………………………17
3.2.1. Quá trình cấy ria………………………………………………17
3.2.2.Hình thái khuẩn lạc………………………………………….17
3.3. Quá trình nhân giống cấp 1…………………………………….18
3.4. Quá trình lên men………………………………………………18
3.5. Quá trình thu nhận sinh khối……………………………………18
3.6. Cố định sinh khối tế bào trên tá dược…………………………20
3.7. Nhuộm gram tế bào vi khuẩn 20
3.8. Định lượng sản phẩm 21
Phần IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận 22
Kiến nghị 23
TÀI LIỆU THAM KHẢO 24
7
LỜI MỞ ĐẦU
Hiện nay nuôi trồng thủy sản (NTTS) là ngành phát triển rất mạnh trên
thế giới, nó đem lại hiệu quả kinh tế cao. Ở Việt Nam, năm 2002 chính phủ
quyết định thủy sản là ngành kinh tế ưu tiên, trong đó ngành nuôi tôm là
ngành mũi nhọn, nhằm mục đích: tăng kim ngạch xuất khẩu, chuyển đổi cơ
cấu kinh tế kém hiệu quả, giảm áp lực khai thác ven bờ, nâng cao hiệu quả
sử dụng đất và tạo công ăn việc làm cho người lao động.Tổng giá trị xuất
khẩu thủy sản Việt Nam không ngừng tăng trong suốt mấy thập niên vừa
qua. Tuy nhiên, đầu tư kí thuật để nâng cao sản lượng thủy sản vẫn chưa đáp
ứng kịp với nhu cầu phát triển, ngành NTTS đang gặp khó khăn lớn dẫn đến
thất bại ở nhiều cơ sở nuôi trồng. Nguyên nhân chính là do ô nhiễm môi

trường nước ao nuôi, dịch bệnh và hệ thống sinh thái bị phá hủy. Vấn đề ô
nhiễm nước ao nuôi là do lượng thức ăn thừa tôm không sử dụng được lớn,
tôm bài tiết, lột xác nhiều và xác của những động vật thủy sinh phù du trong
môi trường nhiều. Khi ao nuôi bị ô nhiễm là cơ hội cho những nhóm vi sinh
vật có hại phát triển mạnh mẽ, không kiểm soát được và hậu quả là vật nuôi
bị bệnh. Vì vậy, việc xử lý môi trường trong quá trình nuôi nhằm cải thiện
môi trường nước và phòng bệnh là cấp thiết.
Trước đây, người nuôi thường sử dụng hóa chất, kháng sinh để xử lý
môi trường ao nuôi và phòng bệnh. Nhưng dùng nhiều hóa chất và kháng
sinh gây ảnh hưởng lớn đến môi trường và con người. Ngoài ra, việc lạm
dụng thuốc kháng sinh còn gây ra vấn đề về dư lượng kháng sinh trong vật
nuôi vi phạm vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm. Do đó, cần chọn một giải
pháp thích hợp để giải quyết vấn đề này là rất quan trọng. Phương pháp sử
dụng chế phẩm sinh học có chứa những vi sinh vật mang những đặc tính có
lợi – Probiotic : phân hủy các chất hữu cơ thừa, đối kháng với vi khuẩn gây
bệnh…đã được áp dụng. Một trong những loài vi khuẩn có những đặc tính
này là vi khuẩn lactic.
Vi khuẩn lactic mang nhiều những đặc tính có lợi cho người và vật nuôi:
hỗ trợ tiêu hoá, tăng cường khả năng miễn dịch, kích thích sự phát triển của
vật nuôi…Ngoài ra chúng còn giúp điều trị các bệnh về đường tiêu hoá như:
tiêu chảy, táo bón, loạn khuẩn…Bên cạnh đó, vi khuẩn lactic còn có khả
8
năng kìm hãm, ức chế các vi sinh vật gây bệnh: Candida albicans, Bacillus
cereus, Staphylococcus aureus…do chúng sinh các chất: bacteriocin, acid
lactic….
Với nhiều những đặc tính có lợi như vậy chúng tôi đưa vi khuẩn lactic
vào ứng dụng làm chế phẩm cho NTTS. Trong sản xuất công nghiệp với
mục tiêu thu sinh khối lớn chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Sản xuất sinh
khối Lactobacillus acidophilus để bổ sung vào thức ăn cho tôm và xử lý
môi trường ao nuôi”

Đề tài được triển khai với các nội dung chính là:
+ Thử nghiệm để hoàn thiện quy trình sản xuất sinh khối Lactobacillus
acidophilus ở quy mô phòng thí nghiệm.
+ Đánh giá các điều kiện thích hợp cho sự phát triển của Lactobacillus
acidophilus
Trong điều kiện thời gian hạn hẹp, không tránh khỏi những sai sót.
Kính mong thầy cô và các bạn đóng góp ý kiến để đề tài được hoàn thiện
hơn
9
Phần I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
10
1.1 Probiotic
Theo nghĩa gốc, “biotic” hay “biosis” từ chữ “life” là đời sống, và “pro”
là thân thiện, nên probiotic có thể dịch sát là cái gì thân thiện với đời sống.
Định nghĩa sát hơn, là chất bổ sung dinh dưỡng chứa những vi khuẩn hay vi
nấm có ích.
Theo định nghĩa của tổ chức lương nông quốc tế hay tổ chức y tế thế
giới, probiotic là những vi sinh vật còn sống khi đưa vào cơ thể một lượng
đầy đủ sẽ có lợi cho sức khỏe của ký chủ[ ]
1.1.1 Các nhóm vi sinh vật chủ yếu trong probiotic
Nhiều nhóm vi sinh vật probiotic – lactic và probiotic – non lactic đã
được sử dụng sản xuất các chế phẩm này. Vi khuẩn dùng rộng rải nhất và
được thử nghiệm lâm sàng nhiều nhất, là các loại Lactobacillus (như L.
acidophilus, L. rhamnosus, L. bulgaricus, L. reuteri và L. casei); nhiều
chủng Bifidobacterium và Saccharomyces boulardii là những vi nấm không
gây bệnh.Công dụng của Probiotic trong NTTS
Các nhóm vi sinh vật nói trên có những khả năng đặc biệt: tổng hợp
các chất hữu cơ có khả năng phân hủy, diệt khuẩn và là nguồn dinh dưỡng
nên rất có lợi khi sử dụng để làm thức ăn và cải tạo môi trường nuôi trồng

thủy sản
Sau khi được sử dụng trên diện tích NTTS, probiotic sẽ phát huy công
dụng theo những quá trình sau: khống chế sinh học (những nhóm vi sinh vật
có ích tác động đối kháng lên nhóm vi sinh vật gây bệnh) và xử lý sinh học
(phân hủy các chất hữu cơ trong nước bằng sản phẩm tổng hợp của chúng)
Probitic được bổ sung vào thức ăn chăn nuôi cho động vật trên cạn từ
những năm 1970, cho thấy hiệu quả rõ rệt trong tăng trưởng và hệ miễn dịch
của vật nuôi
Tuy nhiên, việc sử dụng probitic trong NTTS chỉ mới được đề cập đến
trong những năm gần đây
Yasudo và Taga (1980) đã chỉ ra rằng một loài vài vi khuẩn có ích
không chỉ là thức ăn mà còn là yếu tố kiểm soát các dịch bệnh trên cá và
11
hoạt động tích cực tái tạo các chất dinh dưỡng trong môi trường. Những
nghiên cứu sau đó tiếp tục gia tăng
Kennedy (1998) sử dụng probiotic đối với ấu trùng cá đã nhận thấy có
sự gia tăng sức sống, tính đồng nhất và tỉ lệ tăng trưởng
Trong 1 báo cáo của Rengpipat (2003) ghi nhận sự tăng trưởng và khả
năng chống lại Vibrio của tôm sú đen khi sử dụng probiotic trong quá trình
nuôi
Trong báo cáo CHIẾN LƯỢC QUẢN LÝ VÀ DINH DƯỠNG LÀM
TĂNG SỨC KHỎE CON TÔM – công ty TNHH công nghệ sinh học ATC
đề cập những cơ chế ghi nhận hiệu quả của chế phẩn sinh học đối với sức
khỏe tôm bao gồm: (1) loại bỏ vi khuẩn mang bệnh trong ruột non; (2) thành
phần màng tế bào của các vi khuẩn trong chế phẩm sinh học kích thích hệ
miễn dịch bẩm sinh của tôm; (3) các enzym và các thành phần kháng khuẩn
tạo ra từ chế phẩm sinh học sẽ triệt hại các vi khuẩn truyền bệnh.
Douilett (1998) sử dụng probiotic trong môi trường nước nuôi cá và
động vật giáp xác đã nhận xét probiotic làm sạch môi trường nước bằng cách
giảm nồng độ các chất hữu cơ (organic materials – OM) và amoniac.

Một số probiotic hiện đang được sử dụng trong các trang trại nuôi tôm
ở Indonexia như Multi bacter, Enviro star, Super NB… với mục đích phân
giải các hợp chất hữu cơ từ phân và thức ăn thừa (Supryadi, 2000)
Theo Boyd (1995), các lý do để sử dụng probiotic trong môi trường
nước bao gồm sự ngăn mùi, giảm thành phần tảo lục, tảo lam, giảm nitrate,
nitrite, amoniac và phosphate, tăng lượng oxy hòa tan và nâng cao khả năng
phân hủy chất hữu cơ
Qua những nghiên cứu và báo cáo đã được công bố, có thể tổng hợp
những công dụng của probitic trong NTTS như sau:
- Đối với động vật thủy sinh:
+ Kích thích hệ miễn dịch, tăng sức đề kháng dịch bệnh
+ Cạnh tranh, đối kháng, tiêu diệt các vi sinh vật gây bệnh
12
+ Phân giải thức ăn trong hệ tiêu hóa của động vật thủy sinh làm tăng
cường khả năng hấp thụ
- Đối với môi trường nước trong ao nuôi:
+ Phân hủy các chất hữu cơ là các chất thải của động thực vật thủy
sinh. Kết quả là làm giảm đáng kể lớp bùn, nhớt trong ao
+ Làm tăng lượng oxy hòa tan, giảm COD, BOD
+ Hạn chế sự phát triển của các vi sinh vật gây ô nhiễm, tạo màu, gây
mùi trong ao nuôi, kết quả là làm giảm màu và mùi hôi
+ Làm giảm lượng chất độc sinh ra do quá trình phân hủy không triệt
để các hợp chất hữu cơ
1.1.2 Tác hại của probiotic
Hiện nay chưa có báo cáo nào về tác hại của probiotic khi sử dụng
trong NTTS.
Thông thường, trong NTTS, một hàm lượng kháng sinh nhất định
được bổ sung vào trong thức ăn và trong nước để diệt vi sinh vật gây bệnh
và kích thích tăng trưởng của vật nuôi. Trong trường hợp lượng chất kháng
sinh và hóa chất sử dụng dư thừa thì các chất này sẽ tích tụ trong thủy sản

gây hại đến sức khỏe người tiêu dùng. Probiotic là các sinh vật có lợi cho cả
động vật và con người, do đó sản phẩm sau khi NTTS có sử dụng probiotic
không có hại cho người
1.2 Vi khuẩn Lactic
Một trong những nhóm vi sinh vật được sử dụng phổ biến trong
probiotic là vi khuẩn Lactic
Vi khuẩn lactic thuộc họ Lactobacillaceae. Các chủng vi khuẩn thuộc
nhóm này có đặc điểm sinh thái khác nhau nhưng đặc tính sinh lý tương đối
giống nhau. Tất cả đều có đặc điểm có đặc điểm chung là vi khuẩn Gram
dương, không tạo bào tử, không di động, kỵ khí tùy nghi hay vi hiếu khí và
không chứa các enzyme hô hấp như citochrom và catalase
13
Chúng thu nhận năng lượng nhờ quá trình phân giải hydrat cacbon và
sinh ra axit lactic
Sinh sản bằng hình thức phân đôi tế bào.
1.2.1 Phân loại vi khuẩn Lactic
Nhóm vi khuẩn lactic bao gồm nhiều giống khác nhau: Streptococcus,
Pediococcus, Lactobacillus, Leuconostoc. Ngày nay người ta bổ sung vào
nhóm vi khuẩn lactic những chủng vi khuẩn thuộc giống Bifidobacterium.
Trong giống Lactobacillus đã phân lập được các loài sau:
Lactobacillus acidophilus
Lactobacillus brevis
Lactobacillus casei
Lactobacillus catenaforme
Lactobacillus crispatus
Lactobacillus fermentum
Lactobacillus gassert
Lactobacillus iners
Lactobacillus jensenll
Lactobacillus jeichmannll

Lactobacillus oris
Lactobacillus parocasei spp.parocasei
Lactobacillus plantarum
Lactobacillus rhamnosus
Lactobacillus ult
Lactobacillus vaginals
1.2.2 Đặc điểm hình thái
14
Tùy thuộc vào hình dạng tế bào mà người ta chia vi khuẩn lactic thành
dạng hình cầu và hình que. Kích thước của chúng thay đổi tùy từng loài.
- Giống Streptococcus có dạng hình tròn hoặc hình ovan, đường kính tế
bào 0.5-1µm. Sau khi phân chia theo một phương chúng thường tồn tại ở
dạng đơn bào, song cầu hoặc chuỗi ngắn.
- Giống Leuconostoc có hình dạng hơi dài hoặc hình ovan, đường kính
từ 0.5-0.8µm và chiều dài khoảng 1.6µm. trong một số điều kiện chúng cũng
có dạng hơi tròn, chiều dài khoảng 1-3µm. Sau khi phân chia chúng thường
sắp xếp thành chuỗi, không tạo thành đám tập trung.
- Giống Lactobacillus có dạng hình que. Tùy vào điều kiện của môi
trường sống mà hình dạng của chúng thay đổi từ hình que ngắn đến dài. Sắp
xếp thành chuỗi hay đứng riêng lẽ.
- Giống Pedicoccus là những tứ cầu khuẩn hoặc song cầu khuẩn. Có
hoạt tính thủy phân protein rất yếu.
- Giống Bifidobacterium là những trực khuẩn, khi mới phân lập có thể
phân nhánh dạng chữ Y, V và tập hợp thành khối. Sau nhiều lần cấy chuyền
chúng trở thành dạng trực khuẩn dạng thẳng hoặc hơi uốn cong
1.2.3 Đặc điểm sinh lý- sinh hóa
1.2.3.1 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic
Các loại vi khuẩn lactic khác nhau thì có nhu cầu dinh dưỡng khác
nhau. Chúng không chỉ có nhu cầu về các nguồn cơ chất chứa các nguyên tố
cở bản như cacbon, nitơ, photphat và lưu huỳnh mà còn có nhu cầu về một

số chất cần thiết khác như vitamin, muối vô cơ…
1. nhu cầu dinh dưỡng cacbon:
Vi khuẩn lactic có thể sử dụng nhiều loại hydrat cacbon từ các
monosaccarit ( glucoza, fructoza, manoza ), các disaccarit ( saccaroza,
lactoza, maltoza ) cho đến các polysaccarit ( tinh bột, dextrin )
Chúng sử dụng nguồn cacbon này để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu
trúc tế bào và làm cơ chất cho quá trình lên men tổng hợp các acid hữu cơ
15
2. Nhu cầu dinh dưỡng nitơ
Phần lớn vi khuẩn lactic không thể sinh tổng hợp được các hợp chất
chứa nitơ. Vì vậy để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển chúng phải sử
dụng các nguồn nitơ có sẵn trong môi trường.
Các nguồn ni tơ vi khuẩn lactic có thể sử dụng như: cao thịt, cao nấm
men, trypton, dịch thủy phân casein từ sữa, pepton,…Hiện nay cao nấm men
là nguồn ni tơ được sử dụng nhiều nhất và có hiệu quả nhất. tuy nhiên ở quy
mô công nghiệp không thể sử dụng nguồn nitơ này vì rất tốn kém.
3. Nhu cầu về Vitamin:
Vitamin đóng vai trò là các coenzyme trong quá trình trao đổi chất của
tế bào, nên rất cần thiết cho hoạt động sống. Tuy nhiên, đa số các loài vi
khuẩn lactic không có khả năng sinh tổng hợp vitamin. Vì vậy cần bổ sung
vào môi trường các loại vitamin. Các chất chứa vitamin thường sử dụng như
nước chiết từ khoai tây, ngô, cà rốt hay dịch tự phân nấm men…
4. Nhu cầu các hợp chất hữu cơ khác:
Ngoài các axit amin và vitamin, vi khuẩn lactic còn cần các hợp chất
hữu
cơ khác cho sự phát triển như các bazơ nitơ hay các axit hữu cơ
Một số axit hữu cơ có ảnh hưởng thuận lợi đến tốc độ sinh trưởng của
vi khuẩn lactic như acid citric, acid oleic. Nên hiện nay người ta sử dụng các
muối citrat, dẫn xuất của acid oleic làm thành phần môi trường nuôi cấy,
phân lập và bảo quả các chủng vi khuẩn lactic.

Tương tự như hai acid hữu cơ trên, acid acetic cũng có những tác động
quan trọng đến sự sinh trưởng của tế bào. Nên người ta thường sử dụng acid
acetic dưới dạng các muối acetat để làm chất đệm cho môi trường khi nuôi
cấy vi khuẩn lactic.
5. Nhu cầu các muối vô cơ khác
Để đảm bảo cho sinh trưởng và phát triển đầy đủ, vi khuẩn lactic rất
cần các muối vô cơ. Nhằm cung cấp các nguyên tố khoáng như đồng, sắt,
16
natri, kali, photpho, lưu huỳnh, magie đặc biệt là mangan, vì mangan giúp
ngăn ngừa quá trình tự phân và ổn định cấu trúc tế bào
1.2.3.2 Quá trình trao đổi chất
Quá trình trao đổi chất và năng lượng của vi khuẩn lactic thực hiện
thông
qua việc lên men lactic.
Dựa vào khả năng lên men lactic người ta chia vi khuẩn lactic làm hai
nhóm:
- Vi khuẩn lên men lactic đồng hình: thực hiện quá trình lên men tạo ra
sản phẩm chủ yếu là acid lactic. Do trong hệ enzyme của chúng có chứa
aldolase và triosephotphatizomerase nên quá trình lên men này xảy ra theo
con đường EMP (hay đường phân)
- Vi khuẩn lên men lactic dị hình: thực hiện quá trình lên men, ngoài
acid lactic chúng còn tạo ra các sản phẩm phụ khác như acid acetic, rượu
etylic, CO2, một số chất thơm, Đây là quá trình lên men rất phức tạp, không
theo con đường EMP vì chúng không có hai enzyme cơ bản là aldolase và
triosephotphatizomerase.
1.2.4 Những ứng dụng của vi khuẩn lactic.
Nhờ khả năng tạo ra acid lactic từ các nguồn cacbon hidrat khác nhau
mà các chủng vi khuẩn lactic đã được ứng dụng trong nhiều ngành sản xuất
và chế biến.
1.2.4.1 Những ứng dụng trong công nghệ thực phẩm.

Trong công nghệ thực phẩm, việc sử dụng quá trình lên men lactic
không chỉ nhằm mục đích bảo quản mà còn nhằm đưa ra thị trường các loại
thực phẩm có tính chất và hương vị mong muốn. Các ứng dụng chủ yếu
gồm:
1.2.4.2 Chế biến các sản phẩm sữa
17
Ngoài khả năng lên men làm cho sữa không bị hư hỏng, các chủng vi
khuẩn lactic còn có nhiều khả năng đặc biệt khác. Nhờ đó mà người ta đã
sản xuất hàng loạt các sản phẩm từ nguồn nguyên liệu sữa ban đầu. Như lợi
dụng khả năng làm đông tụ sữa của vi khuẩn Streptococcus lactic để sản
xuất sữa chua hay khả năng tạo ra các mùi vị, tạo các chất thơm của
chủngLeuconostoc để sản xuất bơ, phomat…
1.2.4.3 Sản xuất bánh mỳ đen
Đây là loại bánh mỳ có chất lượng cao bên cạnh quá trình lên men bởi
nấm men tạo rượu etylic và CO2. Người ta còn sử dụng quá trình lên men
của vi khuẩn lactic để tạo vị chua và hương thơm đặc trưng cho sản phẩm.
1.2.4.4 Ủ thức ăn gia súc
Đây là phương pháp được sử dụng phổ biến trong các trang trại chăn
nuôi. Thức ăn khi ủ không những giảm được sự tổn thất giá trị dinh dưỡng
mà còn bổ sung nhiều loại vitamin do vi sinmh vật tổng hợp. Phương pháp
này dựa vào sự chuyển hóa đường có sẵn trong nguyên liệu của vi khuẩn
lactic.
Để khối ủ chua thức ăn gia súc có chất lượng tốt, người ta thường sử
dụng vi khuẩn lactic thuần khiết như:Lactobacillus plantarm,
Thermobacterium cerealle.
1.2.4.5 Muối chua rau quả
Cũng như ủ chua thức ăn gia súc, vấn đề muối chua rau quả cũng nhằm
thực hiện hai mục đích:
- Bảo quản nguyên liệu
- Làm tăng giá trị dinh dưỡng và giá trị cảm quan

Đây là phương pháp vừa chế biến vừa bảo quản rau quả rất phổ biến,
được sử dụng nhiều trong gia đình cũng như trong kĩ nghệ đồ hộp. Hiện nay
có nhiều sản phẩm muối chua được sản xuất và sử dụng rộng rãi như dưa cải
muối chua, dưa chuột muối chua
1.2.4.6 Sản xuất acid lactic và muối lactat
18
Ngoài việc ứng dụng trong các sản phẩm lên men, người ta còn sử
dụng các chủng lactic như Lactobacterium coaglulans và Lactobacillus
delbrueckii để sản xuất ra một lượng lớn axit lactic và muối lactat dùng làm
chất phụ gia thực phẩm.
1.2.4.7 Sản xuất men tiêu hóa cho người và động vật
Latobacillus và Bifidobacterium là 2 loại vi khuẩn có ích trích từ hệ vi sinh
đường ruột có khả năng ngăn chặn sự xâm nhập của các vi khuẩn gây bệnh,
tăng cường khả năng tiêu hóa, kích thích hệ miễn dịch. Do đó, chúng được
sử dụng sản xuất các chế phẩm vi sinh cho người và động vật
1.2.4.8 Một số ứng dụng khác của vi khuẩn lactic
- Ứng dụng trong y học
- Ứng dụng trong ngành công nghệ vật liệu
- Ứng dụng trong ngành mỹ phẩm
Ngoài những mặt có lợi được ứng dụng và phát huy, vi khuẩn lactic
còn gây ra những tác dụng có hại. Gây ra hiện tượng vẫn đục và bị chua
trong công nghệ sản xuất bia, nước ngọt, rượu vang, làm ảnh hưởng xấu đến
chất lượng của sản phẩm. Do đó chúng ta cần phải có biện pháp phòng và
chống lại những ảnh hưởng xấu đó.
1.3 Lactobacillus acidophilus
Lactobacillus acidophilus tồn tại tự nhiên trong hệ tiêu hóa của người và
động vật
Ngoài ra chúng còn tồn tại trong thực phẩm như sữa chua, rau quả muối
chua…
1.3.1 Phân loại

Có rất nhiều chủng Lactobacillus acidophilus đã được phân lập,
chúng giống nhau về đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa nhưng khác nhau
về một hay một số hoạt tính
Một số chủng Lactobacillus acidophilus
Chủng Người phát hiện
19
Lactobacillus acidophilus DDS-1 Nebraska Cultures
Lactobacillus acidophilus LA-5 Chr. Hansen
Lactobacillus acidophilus NCFM Danisco
1.3.2 Đặc điểm hình thái
Lactobacillus acidophilus là trực khuẩn gram dương, không sinh bào tử,
kỵ khí tùy nghi hay vi hiếu khí
Thường tồn tại ở trạng thái đơn bào hoặc kết thành chuỗi, kích thước nhỏ
từ 0,3 – 1 µm
Khuẩn lạc dạng R, màu trắng sữa, hình tròn có răng cưa
Tồn tại ở pH từ 5 – 8, tăng trưởng tốt tại các giá trị pH thấp, nhiệt độ tăng
trưởng tối thích 30 – 37
o
C
Thời gian giữa 2 lần phân chia tế bào từ 25 phút đến vài trăm phút
Thuộc nhóm lên men lactic đồng hình, lên men mạnh đường lactose tạo
sản phẩm chính là acid lactic
Trong quá trình sinh trưởng và phát triển lactobacillus acidophilus còn
sản sinh ra các chất diệt khuẩn như lactocidin, bacterioxin
1.3.3 Đặc tính nuôi cấy
Thích hợp với môi trường giàu dinh dưỡng như môi trường MRS (De Man,
Rogosa, Sharpe), pH 7,5, nhiệt độ 37
o
C
Sau 4 – 6 giờ nuôi cấy, L acidophilus làm đục môi trường, tạo váng trên bề

mặt nuôi cấy, khi lắc váng không tan
1.3.4 Tác dụng của L.acidophilus
- Đối với hệ tiêu hóa của người và động vật
Khi vào ống tiêu hóa, L.acidophilus gắn vào thành ruột phát triển và chống
lại vi khuẩn gây bệnh theo các cơ chế sau:
+ Cạnh tranh chỗ trú đóng với vi khuẩn gây hại
20
+ Tạo ra pH acid nhờ tiết ra aicd lactic, đây là môi trường thuận lợi cho hệ vi
sinh lên men đường phát triển, ngược lai các vi khuẩn như:E.coli,
samonelle, shigella, staphyococcus,clostridium bị chế ngự bởi môi trường
acid này.
+ Tiết các chất có tính kháng khuẩn và kháng sinh như lactocidin,
acidophilin
+ Tiết ra kháng thể enterotoxin ( nội độc tố enterotoxin do các vi khuẩn gây
bệnh tiêu chảy như E.coli, staphylococcuus, ….tiết ra)
+ Kích thích miễn dịch của niêm mạc: tăng sự tổng hợp IgA.
+ Kích thích hoạt động của các enzym tiêu hóa thức ăn.
+ Có khả năng tổng hợp vitamin K
Nhờ những cơ chế trên L.acidophilus giúp cân bằng hệ vi sinh vật
đường ruột, ngăn ngừa sự tấn công của vi sinh vật gây bệnh, làm giảm độc
tính của các độc tố, tăng khả năng hấp thụ thức ăn, tăng cường chắc năng
bảo vệ niêm mạc ruột
- Đối với môi trường nước:
+ Có khả năng phân hủy các hợp chất hữu cơ từ thức ăn thừa và chất
thải của động thực vật thủy sinh
+ Có tính cộng sinh cao với động thực vật thủy sinh, khả năng sống
đáy (độ lắng), khả năng bám dính và tạo khuẩn lạc trên nhiều cơ chất nhầy,
rắn do đó tăng khả năng phân hủy chất hữu cơ
+ Cạnh tranh, đối kháng với các vi sinh vật gây ô nhiễm, gây màu,
gây mùi và tạo điều kiện thích hợp cho các chủng vi sinh vật có lợi giúp làm

cân bằng hệ vi sinh trong môi trường nước
Do vậy, L.acidophilus khi được bổ sung vào môi trường nước NTTS sẽ làm
giảm lượng bùn đáy, tồn đọng các chất thải hữu cơ, tăng lượng oxy hòa tan,
giảm COD, BOD , giảm lượng vi sinh vật gây bệnh, làm trong màu nước,
giảm mùi hôi, giảm chu kỳ thay nước của ao nuôi
21
Phần II
Đối tượng và phương pháp
nghiên cứu
22
2.1. Thời gian, địa điểm nghiên cứu:
- Thời gian nghiên cứu: từ ngày 16/07/2010 đến ngày 26/07/2010
- Địa điểm nghiên cứu: phòng thí nghiệm A11.301, khoa sinh học, trường
Đại học Đà Lạt.
2.2. Đối tượng, dụng cụ, thiết bị:
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu: chủng Lactobacillus acidophilus
2.2.2. Dụng cụ và thiết bị
- Bình tam giác, ống nghiệm, đĩa petri, roux.
- Các micropipet, đèn cồn, banh khui, bơm kim tiêm tủ ấm, tủ sấy.
- Cân kỹ thuật, máy li tâm, máy đo pH, box cấy.
2.2.3. Môi trường nuôi cấy:
2.2.3.1. Môi trường MRS đặc:
- Proteose peptone 61 g
- Meat extract 30.5 g
- Yeast extract 10.5 g
- Glucose 91.5 g
- Sodium acetate 15.25 g
- Magne sulphate 0.305 g
- Mangan sulphate 0.1525 g
- Diamonium hydrogencitrate 6.1 g

- Dipotasium hydrogen phosphate 6.1 g
- Agar 73.2 g
- Nước cất 6.1 l
2.2.3.2. Môi trường MRS lỏng:
Tương tự môi trường MRS đặc nhưng không bổ sung agar.
2.2.3.3. Nước muối sinh lí:
- Nước cất 1000ml
- NaCl 8.5g
Môi trường được khử trùng bằng Autoclave ở 121
o
C, thời gian 20 phút
2.2.4. Khử trùng thiết bị, dụng cụ:
- Dụng cụ thủy tinh: khử trùng ở nhiệt độ 180
o
C trong 2 giờ
- Đầu hút: khử trùng ướt ở nhiệt độ 121
0
C trong 30 phút
- Box cấy: bật tia cực tím 15 phút, sau đó trước khi sử dụng lau lại tủ cấy
bằng cồn 90
0
23
2.3. Phương pháp nghiên cứu:
2.3.1. Phương pháp phục hồi chủng Lactobacillus acidophilus.
Chủng giống Lactobacillus acidophilus đông khô được hoạt hóa trên
môi trường MRS lỏng, pH = 7.5, nhiệt độ 37
o
C, thời gian 5 giờ.
2.3.2. Phương pháp phân tách khuẩn lạc.
Chủng Lactobacillus acidophilus đã được phục hồi được phân lập bằng cách

cấy ria để tách khuẩn lạc từ hỗn hợp giống.?tg
2.3.3. Phương pháp nhân giống.
Nhân giống cấp 1 chủng Lactobacillus acidophilus để tạo chủng sản xuất.
2.3.4. Phương pháp lên men.
Khi lượng giống nhân lên đủ cho yêu cầu sản xuất, tiến hành lên men bề mặt
trong các roux.?
2.3.5. Phương pháp nhuộm gram.
Tiến hành nhuộm gram tế bào vi khuẩn để phân loại vi khuẩn. nó cho
phép ta phân biệt hai nhóm vi khuẩn tùy theo phản ứng với thuốc nhuộm?.
2.3.6. Phương pháp thu nhận sinh khối.
Thu nhận sinh khối từ các roux bằng nước muối sinh lí, sau đó đem li tâm ở
tốc độ 3000 vòng/ phút/ 10 phút, thu lấy phần tế bào lắng.
2.3.7. Định lượng gián tiếp vi sinh vật bằng phương pháp đếm số lượng
khuẩn lạc trên môi trường đặc.?
24
Phần III
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
25