BƯỚC đầu PHÂN lập và ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH các CHỦNG AZOTOBACTER ở HUYỆN đơn DƯƠNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT
KHOA SINH HỌC

NGUYỄN THỊ SONG TỨ
BƯỚC ĐẦU PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH
CÁC CHỦNG AZOTOBACTER Ở HUYỆN ĐƠN DƯƠNG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC KHÓA 33
NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Đà Lạt, năm 2013
TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT
KHOA SINH HỌC

BƯỚC ĐẦU PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH
CÁC CHỦNG AZOTOBACTER Ở HUYỆN ĐƠN DƯƠNG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC KHÓA 33
NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
GVHD : Th.S NGUYỄN KHOA TRƯỞNG
SVTH : NGUYỄN THỊ SONG TỨ
Đà Lạt, năm 2013
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đề tài khóa khóa luận do chính bản thân tôi nghiên cứu dưới sự
hướng dẫn của thầy Nguyễn Khoa Trưởng. Các số liệu, kết quả trong khóa luận là
trung thực không hề sao chép lại dưới mọi hình thức. Tôi xin hoàn toàn chịu trách
nhiệm trước nhà trường về sự cam đoan này.
Nguyễn Thị Song Tứ
LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Đà Lạt, Ban
chủ nhiệm Khoa Sinh học đã tạo điều kiện, hỗ trợ thời gian và tài chính cho em theo
học và hoàn thành khóa học này.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến Th.S Nguyễn Khoa Trưởng đã trực
tiếp hướng dẫn, động viên nhắc nhở và giúp đỡ em trong suốt quá trình làm khóa luận.

Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô đã tận tình giảng dạy, truyền đạt những
kiến thức quý báu cho em trong suốt quá trình học tập tại trường.
Cuối cùng em xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ em trong suốt
quá trình thực hiện đề tài này.
Nguyễn Thị Song Tứ
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT 1
TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT 2
MỤC LỤC 3
MỞ ĐẦU 1
2.2. Vật liệu và môi trường nuôi cấy 14
2.2.1. Môi trường thạch Ashby 14
2.2.2. Môi trường lỏng Ashby 14
2.2.3. Môi trường thạch nước chiết giá đỗ 15
2.2.4. Môi trường lỏng nước chiết giá đỗ 15
2.2.5. Thuốc nhuộm Gram 15
2.2.5.2. Lugol 15
2.2.5.3. Fuchsin 15
2.2.6. Hóa chất 16
2.3.2. Phương pháp cấy chuyền 16
2.3.3. Phương pháp nhân giống 16
2.3.4. Phương pháp nhân sinh khối vi khuẩn Azotobacter 16
2.3.5. Phương pháp xác định số lượng tế bào vi khuẩn cố định đạm 16
2.3.6. Phương pháp nhuộm Gram 17
2.3.7. Định lượng nitơ tổng số bằng phương pháp kjeldall 17
2.3.8. Phương pháp cố định tế bào vi khuẩn Azotobacter 18

2.3.9. Phương pháp xác định số lượng vi khuẩn Azotobacter được cố định trên giá thể alginate 19
2.3.10. Khảo sát sự ảnh hưởng của dịch nuôi cấy vi khuẩn Azotobacter trên đối tượng cây trồng
19
2.3.10.1. Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy vi khuẩn đến tỉ lệ nảy mầm của hạt đậu đen 19
2.3.10.2. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung chế phẩm vi khuẩn Azotobacter lên
khả năng sinh trưởng của rau xà lách 19
2.3.11. Phương pháp xử lí số liệu 20
3.1. Mật độ phân bố của vi khuẩn cố định nitơ sống tự do trong đất trồng rau ở
Đơn Dương 21
3.2. Đặc điểm khuẩn lạc, hình thái tế bào của các chủng vi khuẩn Azotobacter
phân lập được 21
3.5. Kết quả khảo sát khả năng kích thích nảy mầm hạt đậu đen từ dịch nuôi cấy
các chủng giống 26
3.6. Kết quả đánh giá độ sống của vi khuẩn Azotobacter trong hạt alginate 28
3.7. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của chế phẩm vi khuẩn Azotobacter cố định
trên giá thể alginate lên khả năng sinh trưởng của rau xà lách và mật độ vi khuẩn
trong đất trồng rau xà lách 28
3.7.1. Ảnh hưởng của chế phẩm lên sự tăng trưởng của rau xà lách 28
3.7.2. Ảnh hưởng của chế phẩm đến mật độ vi khuẩn Azotobacter trong đất trồng 29
KẾT LUẬN 30
TÀI LIỆU THAM KHẢO 31
DANH MỤC BẢNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT 1
TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT 2
MỤC LỤC 3
MỞ ĐẦU 1
KẾT LUẬN 30
TÀI LIỆU THAM KHẢO 31
DANH MỤC HÌNH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT 1

TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT 2
MỤC LỤC 3
MỞ ĐẦU 1
KẾT LUẬN 30
TÀI LIỆU THAM KHẢO 31
MỞ ĐẦU
Trong cuộc sống hiện nay, cùng với sự phát triển của công nghệ thông tin, công
nghệ sinh học cũng được coi là một trong những ngành công nghệ hàng đầu của thế
giới. Trong đó, công nghệ vi sinh ngày càng được chú trọng phát triển. Công nghệ vi
sinh nghiên cứu về nhiều lĩnh vực trong đời sống, một trong số đó có việc nghiên cứu
các chủng vi khuẩn, vi nấm để sản xuất chế phẩm sinh học, ứng dụng trong sản xuất
nông nghiệp.
Như chúng ta đã biết, đạm đóng vai trò quan trọng đối với nhu cầu dinh dưỡng
của cây trồng. Trong tự nhiên, lượng đạm dễ tiêu mà cây có thể hấp thu được là rất
nhỏ.Vì thế, để cung cấp lượng nitơ cần thiết cho sự phát triển của cây trồng người ta
thường sử dụng các loại phân bón hóa học. Tuy nhiên, việc sử dụng quá nhiều phân
bón hóa học không những làm tiêu tốn khá nhiều chi phí, làm suy thoái chất lượng đất
trồng mà còn gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng đến sức khỏe con người và mất cân
bằng sinh thái. Vấn đề đặt ra hiện nay là phải nghiên cứu ra một số loại phân bón vi
sinh để góp phần khắc phục các hạn chế trên mà vẫn cung cấp được hàm lượng đạm
cần thiết cho cây trồng. Các nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu và sử dụng các
dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm để sản xuất phân bón vi sinh.
Phân bón vi sinh có nhiều ưu điểm, ngoài tác dụng nâng cao năng suất và chất
lượng cây trồng, giảm chi phí sản xuất thì phân bón vi sinh còn góp phần quan trọng
trong việc bảo vệ môi trường và phát triển nền nông nghiệp bền vững. Tuy nhiên, tình
hình sản xuất ở nước ta vẫn chưa đáp ứng đủ nhu cầu thực tiễn sản xuất của nền nông
nghiệp do quy mô sản xuất nhỏ, chất lượng sản phẩm chưa hoàn thiện và ổn định. Do
đó, nghiên cứu để hoàn thiện và nâng cao chất lượng phân bón vi sinh là việc làm hết
sức cần thiết. Trong đó, việc tuyển chọn, đánh giá hoạt tính của các chủng vi sinh vật
là khâu đầu tiên và quan trọng để làm tiền đề cho quá trình sản xuất chế phẩm.

Cho đến nay đã phát hiện ra nhiều chủng vi khuẩn có khả năng cố định đạm
như: vi khuẩn sống cộng sinh trong nốt sần cây họ Đậu Rhizobium, vi khuẩn kị khí
Clostridium, vi khuẩn sống tự do trong đất Azotobacter, Beijerinckii. Tuy nhiên, vi
khuẩn Azotobacter hiếu khí sống tự do và phân bố rộng trong đất có khả năng cố định
nitơ cao. Ngoài ra nó còn có khả năng sinh tổng hợp và tiết ra một số chất kích thích
sinh trưởng và phát triển cho cây trồng như: Auxin (IAA), Giberellin, Thymine, acid
nicotinic, acid pantotenic, Biotin, vitamin nhóm B,…
Trong các huyện của tỉnh Lâm Đồng, Đơn Dương là một vùng đất chủ yếu
trồng rau quanh năm. Việc sản xuất các loại phân bón vi sinh cố định đạm sẽ góp phần
cải tạo đất, tăng số lượng vi sinh vật có khả năng cố định đạm, nâng cao năng xuất và
chất lượng cây trồng ở địa phương nhằm đem lại hiệu quả kinh tế. Đồng thời cũng góp
phần tích cực vào việc bảo vệ môi trường và cân bằng hệ sinh thái.
Xuất phát từ các nhu cầu trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Bước
đầu phân lập và đánh giá hoạt tính các chủng Azotobacter ở huyện Đơn Dương”.
1
Để thực hiện đề tài này chúng tôi tiến hành nghiên cứu những nội dung sau:
1. Khảo sát mật độ phân bố của vi khuẩn Azotobacter trên một số vùng đất
trồng rau tại khu vực Đơn Dương.
2. Phân lập, đánh giá hoạt tính các chủng vi khuẩn Azotobacter phân lập được.
3. Khảo sát môi trường nhân giống và giá thể cố định vi khuẩn Azotobacter.
4. Bước đầu thử nghiệm hiệu quả của chế phẩm trên đối tượng cây trồng.
2
1.1. Tầm quan trọng của quá trình cố định nitơ phân tử
Ngày nay cùng với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, con người càng ý thức
được vai trò của nguyên tố nitơ đối với sự sống. Theo khía cạnh tiến hóa thì nitơ là
nhân tố chính tạo nên sinh giới trên trái đất, trong quá trình sinh trưởng và phát triển
của sinh vật. Giới động vật lấy thức ăn trực tiếp hoặc gián tiếp từ thực vật thông qua
các chuỗi dinh dưỡng khác nhau của các loài, còn giới thực vật lại tạo chất sống giàu
nitơ từ nguồn nitơ vô cơ có trong tự nhiên, hoặc sử dụng nguồn nitơ do các nhóm vi
sinh vật tổng hợp [2].

Hàm lượng nitơ trong không khí rất lớn (chiếm 78,16% thể tích không khí
tương đương với khối lượng là 4.10
15
tấn nitơ. Trên tầng không khí ứng với mỗi hecta
đất có tới 80.000 tấn nitơ, nhưng thực vật không thể sử dụng nguồn nitơ này vì chúng
chỉ có thể hấp thu các dạng nitơ hợp chất chủ yếu là: nitrat và amôn [2].
Theo vòng tuần hoàn nitơ trong tự nhiên, nitơ ở dạng nitrat và amôn thiếu hụt
trong quá trình sản xuất nông nghiệp thường xuyên được bổ sung bằng 4 con đường
sau đây:
- Dưới tác dụng của sấm sét hằng năm có khoảng 3-30kg nitơ dạng NH
4
được tạo
ra từ không khí trên mỗi hecta đất.
- Nitơ từ quá trình phân giải xác thực vật và động vật nhờ khu hệ vi sinh vật đất.
- Các dạng phân đạm hóa học mà con người bón cho đất.
- Quá trình cố định nitơ phân tử của vi sinh vật.
Lượng nitơ tổng số dự trữ trong đất không nhiều, chỉ vào khoảng 8-15 tấn/ha.
Ngoài lượng nitơ mà thực vật hấp thu, lượng nitơ trong đất còn bị hao hụt do các quá
trình khác như: quá trình phản nitrat hóa, quá trình rửa trôi, xói mòn,…[3].
Theo tính toán trong 1 năm trên toàn thế giới lượng nitơ có mặt trong cây trồng
đạt tới 2.10
8
tấn. Trong khi đó tính đến năm 1970 sản lượng nitơ hóa học của toàn thế
giới chỉ đáp ứng được 25% nhu cầu. Riêng đối với nước ta hiện đang còn phải tốn
nhiều ngoại tệ để nhập phân bón hóa học. Ví dụ năm 1999 nước ta phải chi phí 464
triệu USD để nhập 1,9 triệu tấn phân nitơ hóa học, trong nước chỉ sản xuất được
50.000 tấn.
Vì vậy, việc sử dụng nguồn nitơ có sẵn trong tự nhiên bằng cách tăng khả năng
cố định nitơ phân tử nhờ vi sinh vật là một vấn đề cấp thiết của thế giới, trong đó có
nước ta.

Từ năm 1964 việc nghiên cứu quá trình cố định nitơ luôn được coi là một trong
những vấn đề quan trọng. Cho đến nay, người ta đã xác định được quá trình cố định
nitơ phân tử từ khí quyển chủ yếu được thực hiện bởi đại diện của nhóm vi sinh vật
nguyên thủy Procaryote, trong đó có vi khuẩn Azotobacter [4].
1.2. Cơ chế của quá trình cố định nitơ phân tử
Việc cố định nitơ phân tử trong một thời gian dài vẫn là một bí mật đầy hấp dẫn
của tự nhiên.
Trong không khí hàm lượng nitơ chiếm khoảng 78.16% (theo thể tích trong
không khí). Thế nhưng ngoài nhóm vi sinh vật cố định nitơ phân tử thì tuyệt đại đa số
các cơ thể sống không có khả năng này. Nguyên nhân chủ yếu là do phân tử nitơ tồn
tại ở trạng thái liên kết hai nguyên tử nitơ lại với nhau nhờ ba dây nối rất bền vững
(N≡N). Năng lượng của ba dây nối này vào khoảng 255kcal/M. Vào năm 1905, lần
3
đầu tiên con người tìm được phương pháp phá vỡ các dây nối này làm cho N
2
liên kết
với các canxi để tạo thành một phân tử nitơ hóa học đầu tiên là canxi xianamit. Muốn
thực hiện phản ứng này người ta phải duy trì ở nhiệt độ cao 1000-1100
0
C. Điều này
làm hạn chế về mặt hiệu quả kinh tế cho người sử dụng. Trong khi đó, tế bào vi sinh
vật phá vỡ mối liên kết này chỉ bằng một phản ứng enzyme đơn giản, ở điều kiện nhiệt
độ, áp suất bình thường.
Nếu khám phá ra được cơ chế của quá trình cố định nitơ nhờ vi sinh vật thì rõ
ràng có thể mở ra một triển vọng hết sức to lớn đối với việc cải tiến toàn bộ các quy
trình sản xuất phân đạm hóa học thành sản xuất phân đạm vi sinh.
Chu trình tuần hoàn nitơ trong tự nhiên là điều kiện rất quan trọng mà thiếu nó
sự sống trên hành tinh chúng ta không thể có được. Để thực hiện chu trình này cần
phải tồn tại một mối quan hệ phức tạp giữa tất cả các cơ thể sống. Điều quan tâm lớn
nhất hiện nay là sự cố định nitơ phân tử (N

2
) thành các hợp chất hữu cơ, đặc biệt tạo
thành các aminoacid để cuối cùng tạo ra các protein ở thực vật bậc cao. Bộ phận này
của chu trình nitơ được đảm bảo bởi mối quan hệ chặt chẽ giữa vi sinh vật và thực vật
bậc cao. Giai đoạn đầu tiên của cố định nitơ là biến đổi nitơ phân tử thành ammoniac,
được thực hiện bởi một số vi sinh vật có khả năng cố định nitơ phân tử trong khí
quyển.
Người ta nhận thấy rằng trong tế bào của các vi sinh vật cố định đạm có chứa
một hệ thống enzyme, nhờ sự xúc tác của chúng mà nitơ không khí có thể thực hiện
các phản ứng liên kết với hidro hoặc oxy trong không khí. Ở Azotobacter và nhóm vi
sinh vật cố định nitơ hiếu khí khác thì ATP được sinh ra trong quá trình hô hấp.
Azotobacter là loại vi khuẩn hiếu khí, chúng chỉ phát triển được khi có nhiều
oxy, trong đó quá trình cố định nitơ lại được thực hiện trong các tế bào của chúng với
những điều kiện khử rất nghiêm ngặt. Sở dĩ, có sự phối hợp giữa hai điều kiện hoàn
toàn trái ngược nhau này là nhờ trong tế bào Azotobacter có rất nhiều màng
lipoprotein, phía ngoài màng có các enzyme hô hấp.Những enzyme này hoạt động một
mặt sẽ sinh ra ATP, mặt khác sẽ tiêu thụ nhiều oxy, ở đây có enzyme nitrogenase làm
nhiệm vụ xúc tác quá trình khử N
2
[2].
Inavo (1966) cho rằng quá trình cố định nitơ là một quá trình hô hấp nitơ. Ở các
loài vi khuẩn hiếu khí cố định nitơ cũng như oxy được hoạt hóa và bị khử nhờ các
cytochrome trên dây chuyền vận chuyển electron cuối cùng. Nitơ được hoạt hóa bởi
enzyme nitrogenase. Hiện nay có thể xác định được rằng qúa trình cố đinh nitơ là quá
trình khử N
2
thành NH
3
và enzyme nitrogenase đã xúc tác cho một khâu của quá trình
khử này kèm theo sự thủy phân ATP và sự tham gia của các ion kim loại hóa trị II

(Mg
2+
…).
N
2
+ AH
2
+ ATP → NH
3
+ A + ADP + Pvc
Tuy nhiên quá trình khử N
2
thành NH
3
được X.N.Vinogratski nêu lên lần đầu
tiên vào năm 1894. Về sau người ta đã dùng những phương pháp hiện đại để nghiên
cứu và hoàn toàn xác nhận giả thuyết này [1].
Về nguồn cung cấp năng lượng ở các nhóm vi sinh vật khác nhau thì khác nhau.
Đối với Azotobacter và một số loài vi sinh vật cố định nitơ khác thì ATP được sinh ra
trong qúa trình hô hấp.
Enzyme nitrogenase được tách ra từ các vi sinh vật cố định nitơ khác nhau (các
loại vi sinh vật, tảo lam, vi khuẩn nốt sần cây họ đậu, vi khuẩn cố định đạm sống tự
do) nhưng cấu trúc và cơ chế hoạt động của chúng tuân theo một quy luật chung.
4
Một phức hệ enzyme nitrogenase được cấu tạo từ hai tiểu phần khác nhau:
Tiểu phần I: Tiểu phần protein – sắt (pro-Mo-Fe). Trọng lượng phân tử khoảng
220.000, chứa 2 nguyên tử Mo, 32 nguyên tử sắt và 25-30 nguyên tử lưu huỳnh. Tiểu
phần I gồm 2 phần dưới đơn vị hợp thành. Trung tâm hoạt động của enzyme
nitrogenase nằm trong tiểu phần I do các nguyên tử Mo tạo nên.
Tiểu phần II: được gọi là tiểu phần protein sắt (viết tắt là pro-Fe) có trọng lượng

phân tử khoảng 60.000.
Trong phức hệ nitrogenase người ta nhận thấy tỉ lệ giữa pro-Fe và Mo-pro-Fe là
2:1. Tiểu phần I và II kết hợp với nhau tạo thành phức hệ enzyme nitrogenase còn có
sự tham gia hoạt động của 3 nhân tố khác: Feredoxin, Adenozin, Triphosphate (ATP)
và hệ enzyme hydrogenase.
Electrone của chất khử (Feredoxin) đi vào trung tâm có chứa chất sắt của thành
phần pro-Fe (tiểu phần II) và tiếp tục chuyển cho tiểu phần I (pro-Mo-Fe). Electron đã
được hoạt hóa đi theo mạch phân tử Fe để đến nhân Mo. Tại đây Mo bị khử sẽ chuyển
sang trạng thái hoạt động và sẵn sang tham gia phản ứng khử nitơ.
Phân tử nitơ đi qua một khe có kích thước 4-5Å vào thẳng vùng trung tâm hoạt
động gắn với phân tử Mo và bị khử bằng cách bẻ gãy hai cầu liên kết. Cầu nối thứ 3
được phá vỡ nhờ hệ thống enzyme vận chuyển hydro, tức là nhờ phức hệ enzyme
hydrogenase.
Quá trình khử theo 3 giai đoạn được biểu diễn như sau:
N ≡ N→ NH = NH
2
→ NH
2
→ 2NH
3
NH
3
là sản phẩm đầu tiên của quá trình này, sau đó NH
3
hoặc các sản phẩm khử
khác được sinh ra sẽ liên kết với các ketoacid để tạo thành các aminoacid.
Hydrogenase là một enzyme hoạt hóa và vận chuyển hydro, nhưng ở đây nó thể
hiện cả hoạt tính khử nitơ.Ngược lại, nitrogenase là một enzyme khử nitơ, nhưng ở
đây lại thể hiện cả hoạt tính hydrogenase [2].
Có thể biểu diễn quá trình cố định nitơ của vi khuẩn cố định nitơ hiếu khí theo

sơ đồ sau:[5]
Hydrogenase tham gia hoạt hóa hydro thành ion rồi chuyển ion này đến
feredoxin, đồng thời tham gia bẻ gãy 1 trong 3 cầu nối của phân tử nitơ. Federoxin làm
5
nhiệm vụ chất cho điện tử. Để khử một phần tử protein có trọng lượng phân tử thấp
khoảng 6.000 có chứa Fe không có nhóm hemin hoặc flavin.
Federoxin làm nhiệm vụ chất cho điện tử. Để khử một phân tử nitơ thành NH
3
cần phải sử dụng 6 điện tử. Để vận chuyển 1 điện tử ít nhất cần một phân tử ATP,
trong thực tế 2 phân tử ATP, người ta kết luận rằng có 12 phân tử ATP được sử dụng
trong qúa trình đồng hóa một phân tử nitơ. Phương trình chung của quá trình khử nitơ
như sau:
N
2
+ 6 H
+
+ 6e
-
+ 12 ATP + 12 H
2
O → 2 NH
3
+12 ADP +12 Pi
Trong quá trình cố định nitơ, mỗi loại vi sinh vật khác nhau sử dụng cơ chất
khác nhau: vi khuẩn hiếu khí sống tự do có nguồn cho điện tử và hydro là NAD
+
, năng
lượng lấy trong qúa trình hô hấp, còn vi khuẩn kị khí sống tự do. Nguồn điện tử và
hydro là pyruvate và thiosulphate.
Ngày nay nhiều nhà khoa học đã chứng minh NH

3
, vừa là sản phẩm của quá
trình cố định nitơ phân tử vừa là nhân tố điều hòa hoạt tính của enzyme
nitrogenase.NH
3
không tham gia điều hòa trực tiếp mà thông qua một protein khác là
enzyme glutamine synthetase. Khi môi trường có nhiều NH
3
thì enzyme này bị
adenine hóa nên ở trạng thái bất hoạt.Ngược lại môi trường với nồng độ NH
3
thấp
hoặc không có thì không bị adenine hóa hệ enzyme sẽ ở dạng hoạt động. Khi ở trạng
thái hoạt động nó sẽ hoạt hóa hệ gen chịu trách nhiệm tổng hợp nitrogenase.
Đi sâu nghiên cứu cấu trúc phân tử của vật chất di truyền tổng hợp nên enzyme
nitrogenase, các nhà nghiên cứu đã phát hiện ra hệ thống Nif-operon.
Khi môi trường có NH
3
với nồng độ cao glutamine synthetase vẫn được tổng
hợp nhưng ở dạng adenine hóa nên bất hoạt, hệ gen tổng hợp trên bị đóng. Ngược lại
khi môi trường không có hoặc có ít NH
3
gen O tổng hợp glutamin synthetase ở dạng
không andenin hóa, hệ gen tổng hợp các thành phần của phức hệ nitrogenase ở trạng
thái mở [7].
1.3. Đặc điểm các nhóm vi khuẩn cố định nitơ sống tự do trong đất
Ngoài vi khuẩn nốt sần là vi sinh vật cố định nitơ sống cộng sinh trong đất còn
có nhóm vi sinh vật sống tự do, không cộng sinh với thực vật như:
1.3.1. Vi khuẩn Beijerinskii
Vi khuẩn Beijerinkii là loài vi khuẩn hiếu khí có khả năng cố định nitơ được

Stăckê (1930) phân lập được trên ruộng lúa có độ acid khá cao. Về sau Decx (1950)
phân lập được chúng từ đất của một vườn thực vật ở Java. Vi khuẩn thuộc giống
Beijerinskii có hình cầu, hình bầu dục hoặc hình que. Khi còn non kích thước khoảng
0,2- 0,5 × 1,0-4,5µm, có loại di động được, không sinh bào tử. Phần lớn các loài
Beijerinskii sinh trưởng được trên môi trường vô đạm chứa glucose. Khuẩn lạc nhầy,
lồi, không màu, khi về già có màu tối [2].
Vi khuẩn thuộc giống Beijerinskii thường có thể cố định được từ 16 – 20mg
nitơ phân tử khi đồng hóa hết 1gram thức ăn cacbon. Vi khuẩn Beijerinskii có khả
năng đồng hóa tốt các loại đường monosaccharide, disaccharide, đồng hóa tinh bột và
acid hữu cơ kém. Khác với Azotobacter,Beijerinskii có tính chống chịu cao với phản
ứng acid. Chúng có thể phát triển tốt ngay ở đất có giá trị pH=3,0. Chúng chịu đựng
được trong môi trường đất có nồng độ Al và Fe cao. Chúng có thể phát triển được cả
trong đất trung tính hay hơi kiềm.
Vi khuẩn Beijerinskii phân bố rộng rãi trong đất ở các nước nhiệt đới. Người ta
còn thấy chúng có mặt trên lá của một số cây ở Indonexia [1].
6
1.3.2. Vi khuẩn kị khí Clostridium
Năm 1893, lần đầu tiên Vinogradxki phát hiện được một loài vi khuẩn kị khí
sống tự do có khả năng cố định nitơ phân tử. Đó là loài Clostridium pasteurianum.
Tế bào của C. pasteurianum có kích thước khoảng 2,5-7,5 × 0,7-1,3µm, có thể
đứng riêng rẽ, xếp thành đôi hay xếp thành chuỗi ngắn. Khi còn non có tế bào chất
đồng đều, có khả năng di động. Khi già, tế bào chất có cấu tạo hạt, tế bào mất khả
năng di động. Bào tử thường có hình bầu dục hay hình kéo dài nằm ở giữa hay gần
một đầu của tế bào. Bào tử có kích thước lớn hơn bề rộng của tế bào dinh dưỡng.do đó
khi mang bào tử tế bào thường có hình con thoi. Kích thước của bào tử khoảng 1,3 ×
1,6 µm.
Clostridium có khả năng đồng hóa các monosaccharide, disaccharide và một số
polysaccharide (như tinh bột, dextrin). Chúng có thể đồng hóa cả nhiều rượu bậc cao
và một số hợp chất chứa cacbon khác nữa. Khi lên men hidrat cacbon, Clostridium
thường làm tích lũy acid hữu cơ, butanol, etanol, acetone CO

2
, H
2
,…. Thành phần và tỉ
lệ của các sản phẩm lên men phụ thuộc vào từng loài vi khuẩn cũng như phụ thuộc vào
hai pha khác nhau của quá trình lên men. Chẳng hạn C. acetobytylcium thường làm
tích lũy trong pha đầu acid acetic, acid butyric và trong pha sau butanol, acetone và
etanol [2].
Bào tử của Clostridium có sức đề kháng rất cao đối với nhiệt độ cao và sự khô
hạn. Một số nghiên cứu cho biết bào tử của loại vi khuẩn này có thể sống được đến 5
giờ ở nhiệt độ 75
0
C và 1 giờ ở nhiệt độ 80
0
C. Bào tử của một số chủng Clostridium
chịu nhiệt ngay ở nhiệt độ 100
0
C vẫn có thể sống được đến 30 phút [2, 3].
1.3.3. Vi khuẩn Azotobacter
Vi khuẩn Azotobacter được phân lập đầu tiên vào năm 1901 do M. W. Beijerck
phát hiện ra. Vi khuẩn thuộc chi Azotobacter có hình dạng tế bào từ hình cầu đến hình
que, có kích thước khoảng 2,0 – 7,0 × 1,0 – 2,5µm. Gram (-) không sinh bào tử, có khả
năng cố định nitơ phân tử. Tế bào sinh sản theo lối phân cắt đơn giản.
Từ đó đến nay người ta phát hiện ra nhiều loài khác và hiểu biết khá đầy đủ về
hình thái, đặc điểm nuôi cấy cũng như các đặc tính sinh lý, sinh hóa của chúng.
Vi khuẩn Azotobacter khi nuôi cấy trong các môi trường nhân tạo thường biểu
hiện tính đa hình. Khi tế bào non thường có tiêm mao và có khả năng di động, ngoài
các tiêm mao khá dài khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử còn thấy rõ những sợi tiêm
mao rất nhỏ bé. Khi già tế bào Azotobacter thường được bao bọc trong một lớp vỏ dày
và tạo thành nang xác, gặp điều kiện thuận lợi nang xác sẽ nứt ra và tạo thành các tế

bào mới [1, 6].
Trong môi trường có chứa etanol là nguồn cacbon duy nhất, Azotobacter giữ
được trạng thái hình que di động trong thời gian khá dài. Trên môi trường đặc, khuẩn
lạc Azotobacter có dạng nhầy, đàn hồi, khá lồi, có khi có dạng nhăn nheo, khi già có
màu vàng lục, màu hồng hay màu nâu đen.
Azotobacter rất mẫn cảm với pH của môi trường. Nói chung chúng có thể phát
triển được ở pH = 4,5 – 9,0. Tuy nhiên quá trình cố định nitơ chỉ thực hiên trong phạm
vi pH khá hẹp, khoảng 5,5 – 7,2. Nhưng pH thích hợp nhất với chúng là pH = 7,2 –
8,2. Môi trường acid rất bất lợi đối với sự phát triển và hoạt động của Azotobacter.
Ngược lại trong môi trường từ trung tính đến kiềm yếu luôn luôn có nhiều vi khuẩn
Azotobacter trong đất.
7
Azotobacter thuộc loại vi khuẩn có khả năng chịu nồng độ muối khá cao. Người
ta nhận thấy Azotobacter có thể phát triển trong các môi trường chứa 2,5 – 3,0% NaCl
đã phân lập được những nòi Azotobacter ưa mặn. Nhưng nồng dộ NaCl thích hợp nhất
là 3 – 5%. Thậm chí chúng có thể chịu được ngay cả ở nồng độ 9% NaCl.
Tế bào Azotobacter có áp suất thẩm thấu thấp hơn so với tế bào nấm và xạ
khuẩn. Nhu cầu về độ ẩm của Azotobacter tương tự như nhu cầu của cây trồng.
Azotobacter là loài ưa ẩm. Nhiệt độ thích hợp nhất đối với Azotobacter là 25 – 30
0
C,
nhưng chúng cũng có khả năng chống chịu rất tốt đối với nhiệt độ thấp.
Azotobacter có khả năng tích lũy trong dịch nuôi cấy nhiều chất hoạt động sinh
học (vitamin B1,B6, acid nicotinic, biotin,auxin,…) và còn có khả năng tổng hợp các
chất kháng sinh chống nấm thuộc nhóm anixomixin.
Phần lớn các nòi Azotobacter phân lập được từ tự nhiên có khả năng cố đinh
được trên 10mg nitơ/1gram hợp chất cacbon. Một số nòi trong điều kiện thích hợp có
thể đồng hóa được đến 30gram N/1gram hợp chất hữu cơ [2].
Khả năng cố định của Azotobacter không những phụ thuộc vào từng nòi vi
khuẩn mà còn phụ thuộc vào thành phần môi trường nuôi cấy, pH, nhiệt độ nuôi cấy,

sự tồn tại của các hợp chất chứa nitơ, tính chất của các thức ăn cacbon, sự có mặt của
các nguyên tố vi lượng và các chất hoạt động sinh học. Bên cạnh đó sự tồn tại của các
loài vi sinh vật đất cũng ảnh hưởng tích cực hoặc tiêu cực đến khả năng cố định nitơ
của Azotobacter. Nhiều nghiên cứu cho biết khi phát triển chung với một số vi sinh vật
khác Azotobacter có hoạt tính cố định nitơ cao hơn so với khi nuôi cấy riêng.
Ngoài khả năng cố định nitơ phân tử Azotobacter còn có khả năng đồng hóa
muối amôn và urê. Một số nòi Azotobacter còn có khả năng sử dụng nitrit và nitrat.
Hai loại aminoacid thích hợp nhất với nhu cầu dinh dưỡng của Azotobacter là acid
Glutamic và asparaginic.
Bên cạnh đó cũng còn nhiều yếu tố nữa cũng ảnh hưởng đến khả năng cố định
nitơ của chúng như các loài vi sinh vật đất và tùy thuộc vào từng yếu tố mà có thể ảnh
hưởng tích cực hay tiêu cực đến khả năng đó của chúng.
Dựa vào màu sắc của khuẩn lạc, sắc tố tạo thành, đặc điểm hình thái tế bào
phân loại chi Azotobacter gồm các loài chủ yếu sau:
-Azotobacter chroococcum: tế bào có kích thước khoảng 3,1 × 2µm, có khả năng
sinh vỏ nhầy. Di động khi còn non hoặc khi nuôi cấy trên môi trường có etanol. Có
khả năng hình thành nang xác. Khi già sinh sắc tố nâu đen, sắc tố không có khả năng
khuếch tán vào môi trường, không tan trong nước, đồng hóa tinh bột, manitol, có chu
mao. Azotobacter có khả năng sinh ra một số chất chống nấm.
- Azotobacter beijereinckii: tế bào có kích thước từ 2,4 × 4,6 µm có khả năng tạo
vỏ nhầy, không có khả năng di động, khi già sinh sắc tố từ màu vàng đến màu nâu
sáng, không khuếch tán sắc tố vào môi trường. Có khả năng đồng hóa manitol,
ramnose, không có khả năng đồng hóa tinh bột.
- Azotobacter agilis: tế bào có kích thước khoảng 1,5 × 3 µm. Không có khả
năng tạo vỏ nhầy, di động được trong môi trường. Khi già sinh sắc tố màu vàng lục
phát huỳnh quang màu trắng, sắc tố có khả năng khuếch tán vào môi trường, không tan
trong nước. Không có khả năng đồng hóa manitol, ramnose, benzoat natri. Có chu
mao, thường sống trong nước ngọt.
- Azotobacter vinellandii: tế bào có kích thước khoảng 1,5 × 3µm. Có khả năng
tạo vỏ nhầy. Khi còn non di động được trong môi trường. Khi già khuẩn lạc sinh sắc tố

8
màu lục phát huỳnh quang, có khả năng khuếch tán vào môi trường, có khả năng đồng
hóa được manitol, ramnose, benzoat natri 5% [1,7].
1.4. Nhu cầu dinh dưỡng của Azotobacter
Hai loại aminoacid thích hợp nhất đối với nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn
Azotobacter là acid glutamic và acid asparaginic. Nguồn dinh dưỡng hidro cacbon cần
cho sự phát triển của vi khuẩn rất đa dạng bao gồm monosaccharide (glucose, fructose,
lactose,…); disaccharide (saccharose, maltose, xenlobiose,…); trisaccharide (rafinose,
meliciitora,…); polysaccharide (tinh bột, dextrin, glycogen, ); glycerin, manit, sorbit
và các hợp chất thơm.
Azotobacter không có khả năng đồng hóa chất mùn. Chúng chỉ có khả năng
phát triển mạnh trong những đất có nhiều chất hữu cơ dễ đồng hóa. Có khả năng đồng
hóa nhiều loại đường khác nhau, nhất là các sản phẩm phân giải cellulose. Đất có bón
phân xanh, phân chuồng, cày vùi rơm rạ, rác có tác dụng tạo điều kiện thuận lợi cho sự
phát triển nhanh chóng của Azotobacter trong đất. Khi trong môi trường có muối amôn
hay nitrat sẽ làm hạn chế sự cố định N
2
của Azotobacter[2].
Sự phát triển và khả năng cố định đạm của Azotobacter chịu ảnh hưởng rất lớn
của sự có mặt các hợp chất photpho trong môi trường.Azotobacter có thể đồng hóa
nhiều loại hợp chất hữu cơ và vô cơ chứa photpho. Sự mẫn cảm cao của Azotobacter
với hợp chất photpho trong môi trường cho phép người sử dụng chúng như loại vi sinh
vật chỉ thị để định lượng photpho dễ tiêu trong đất, trong phân lợn.
Canxi cũng ảnh hưởng rất lớn đối với sự phát triển của Azotobacter. Người ta
cũng đã sử dụng thành công biện pháp dùng Azotobacter làm vi sinh vật chỉ thị để xác
định nhu cầu bón vôi của từng loại đất. Khi thiếu canxi tế bào Azotobacter sẽ tạo thành
nhiều không bào, ảnh hưởng xấu đối với việc tổng hợp ATP và sự tạo thành
polyphosphate.
Magiê (Mg) được Azotobacter cần với số lượng cao hơn sắt (Fe) khoảng 10 lần.
Nhiều ý kiến không giống nhau về nhu cầu của Azotobacter đối với đồng (Cu). Nhiều

tác giả cho biết ngay ở những nồng độ rất nhỏ Cu đã ảnh hưởng xấu đến sự phát triển
của Azotobacter. Trong khi đó nhiều tác giả khác lại cho rằng Cu là nguyên tố vi
lượng cần thiết đối với Azotobacter.
Asen ở nồng độ rất nhỏ (10 – 20 mg muối asen trong 1kg đất) có tác dụng kích
thích sự phát triển của Azotobacter.
Nhiều nguyên tố vi lượng khác có ảnh hưởng xấu đối với sự phát triển của
Azotobacter. Brom (Br) dẫn đến việc ức chế quá trình cố định nitơ, nhôm (Al) cũng
làm ức chế sự phát triển của Azotobacter.
Các nguyên tố vi lượng (B, Mo, Fe, Mn) cũng rất cần thiết đối với Azotobacter.
Chúng giúp cho quá trình cố định nitơ tiến hành được thuận lợi. Các chủng Azotobacter
được phân lập từ loại đất chứa nhiều một nguyên tố vi lượng nào đó sẽ đòi hỏi phải đưa
nguyên tố vi lượng đó vào môi trường nuôi cấy với số lượng khá cao [1].
Các nguyên tố phóng xạ (radium, torium, uranium) có khả năng kích thích sự
phát triển của Azotobacter và quá trình cố định nitơ của chúng Azotobacter có khả
năng tổng hợp các chất sinh trưởng khác nhau như: vitamin (B1, B2, B12), biotin,….
[2]
1.5. Quan hệ giữa đất trồng và vi khuẩn Azotobacter
Thành phần và chất lượng đất ảnh hưởng trực tiếp đến sự phát triển và hoạt
động sống của vi khuẩn Azotobacter. Theo Misuxtin và cộng sự thì không phải trong
9
bất cứ loại đất nào vi khuẩn Azotobacter cũng sống và phát triển được. Tác động của
Azotobacter đối với cây trồng trước hết phụ thuộc vào tính chất của đất. Cũng theo
Misuxtin và Naumova thì khi bón Azotobacter vào đất bình thường thì năng suất tăng
tương đối ít nhưng nó lại có hiệu lực rất lớn khi bón cho rau trồng ở đất màu mỡ. Đất
giàu chất dinh dưỡng hữu cơ sẽ làm tăng nhanh số lượng tế bào vi khuẩn Azotobacter.
Ở lớp đất có cỏ hay lớp đất có bón phân chuồng, vi khuẩn Azotobacter có thể phát
triển trong thời gian dài. Ngược lại khi đất có độ chua cao hoặc có chứa chất độc như
Al chẳng hạn, vi khuẩn Azotobacter không thể phát triển. Có thể dùng vôi bón cho đất
để khử chua, khử độc, khi đó vi khuẩn Azotobacter lại bắt đầu sống và phát triển.
Khác với nhiều loại vi sinh vật khác, vi khuẩn Azotobacter không phát triển

mạnh ở ngay trên bề mặt rễ cây mà lại phát triển mạnh ở khu vực xung quanh rễ. Điều
này nói lên vi khuẩn Azotobacter là vi sinh vật vùng rễ, không cộng sinh với rễ.
Nghiên cứu của Fedorov cho biết số lượng vi khuẩn Azotobacter ở vùng rễ cây là rất
nhỏ, nguyên nhân là do hệ vi sinh vật hội sinh ở vùng rễ đã cạnh tranh đẩy vi khuẩn
Azotobacter ra khỏi bề mặt rễ cây, có thể vi khuẩn Pseudomonas đã cạnh tranh với
nhóm vi khuẩn này.
Trong đất Azotobacter chủ yếu tập trung ở lớp đất bề mặt từ 0 – 25cm. Sự phân
bố của chúng giảm dần theo độ sâu của tầng đất. Đất ở độ sâu 75 – 100cm gần như
không có Azotobacter.
Vi khuẩn cố định đạm sống tự do Azotobacter chủ yếu tập trung ở vùng đất có
thực vật phát triển. Nhiều dẫn liệu cho thấy hoạt động cố định đạm của vi khuẩn vùng
quanh rễ mạnh hơn vùng ngoài rễ 3 – 4 lần. Hiện tượng này khiến cho những sản
phẩm cố định nitơ của vi khuẩn Azotobacter trở nên có lợi cho cây trồng.
Những kết luận liên quan đến điều kiện cho vi khuẩn Azotobacter phát triển là
hết sức quan trọng, vì vậy mật độ tế bào có ý nghĩa quyết định đến lượng nitơ do
chúng cố định được. Kết quả nghiên cứu của Jensen và Kraxinhikov cho biết khi đất
chứa 1.000 tế bào Azotobacter/1g đất thì số lượng nitơ cố định được không quá 2 – 5
kg/ha. Sự có mặt của vi khuẩn Azotobacter trong đất trồng không chỉ làm tăng hàm
lượng nitơ trong đất mà còn có tác dụng thúc đẩy sự sinh trưởng và phát triển của cây
trồng nhờ những chất có hoạt tính sinh học do chúng tiết ra. Bằng thực nghiệm
Misuxtin đã chứng minh được rằng vi khuẩn Azotobacter chroococum có khả năng tiết
ra những chất kích thích thuộc nhóm auxin và những chất tương tự giberellin. Ngoài ra
ông còn phát hiện thấy chúng cũng sinh ra một số loại vitamin cần thiết cho sự trao đổi
chất của thực vật như vitamin B6, vitamin PP,…[2]
1.6. Ứng dụng vi khuẩn Azotobacter trong nông nghiệp
Đối với sản xuất nông nghiệp, vi sinh vật có vai trò rất to lớn tham gia tích cực
vào sự phân giải các hợp chất hữu cơ, chuyển hóa các chất khoáng, cố định nitơ phân
tử để làm giàu nitơ cho đất.
Trong hoạt động sống vi sinh vật còn sản sinh ra rất nhiều chất hoạt động sinh
học có tác dụng trực tiếp đối với quá trình sinh trưởng và phát triển của cây trồng. Các

chất hoạt động sinh học này (acid amin, vitamin, enzyme, chất kháng sinh,…) tích lũy
trong vùng rễ cây trồng, làm tăng cường sự phát triển của loài cây phù hợp với khu hệ
vi sinh vật này và làm hạn chế sự phát triển của các loài cây khác. Người ta còn nhận
thấy nếu không có vi sinh vật giúp cây trồng tiêu thụ các sản phẩm trao đổi chất do cây
trồng tiết ra quanh bộ rễ thì một số các sản phẩm này sẽ đầu độc cây trồng.
10
Vai trò của vi sinh vật đối với sản xuất nông nghiệp nói riêng và đối với nhiều
lĩnh vực khác là rất to lớn, là vô cùng vô tận. Trong số đó phải kể đến vai trò của vi
sinh vật trong việc cố định đạm cho cây trồng.
Ngày nay người ta đang nghiên cứu và sản xuất nhiều chế phẩm vi sinh vật với
mục đích bón cho đất, nhiều loài vi sinh vật có khả năng sống, phát triển mạnh trong
môi trường đất và chuyển hóa các hợp chất khó tiêu thành dễ tiêu [1, 2].
Azotobacterin là chế phẩm cố định nitơ tự do Azotobacter. Ở Việt Nam, viện
Công nghệ sau thu hoạch đã nghiên cứu sản xuất, tiến hành khảo nghiệm và bón thử
tại nhiều địa phương như Bắc Ninh, Thái Bình, Ninh Bình, Nghệ An,… Tại huyện
Quế Võ (Bắc Ninh) sử dụng chế phẩm phân vi sinh Azotobacterin bón cho 2 ha khoai
tây. Sau một thời gian, thân khoai tây to và nhẵn hơn so với dùng phân N-P-K, năng
suất củ tăng từ 10 – 15%.
Nhiều nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn Azospirillum cho các cây lương thực
thuộc họ hòa thảo trong các điều kiện khác nhau đã khẳng định ý nghĩa nông nghiệp
của nó. Ở Việt Nam đã có nhiều cơ sở nghiên cứu và ứng dụng vào sản xuất chế phẩm
làm tăng năng suất lúa, như bộ môn vi sinh vật học, viện Khoa học kỹ thuật Nông
nghiệp Việt Nam đã nghiên cứu thành công ảnh hưởng chế phẩm hai chủng Mat2-1b
và DA9-3a lên năng suất lúa của phòng vi sinh vật đất, Viện Nghiên cứu Sinh học,
viện Công nghệ Sinh học, trung tâm Khoa học Tự Nhiên và công nghệ Quốc gia ở một
số địa điểm thuộc châu thổ sông Hồng. Ngoài ảnh hưởng lên năng suất hạt, việc sử lý
mầm mạvới chế phẩm Azospirillum cho thấy cây mạ cứng chắc và lớn hơn, chống
chịu rét tốt, lúa chín sớm hơn từ 3 – 5 ngày so với cây lúa không được sử lý với chế
phẩm Azospirillum [7].
1.7. Alginate và ứng dụng

Alginate có trong tất cả các loại tảo nâu (Phaeophyceae) là thành phần của vách
tế bào. Nguồn thu nhận chính alginate trong công nghiệp là tảo bẹ lớn. Alginate
thường được chiết trong kiềm, sau đó được kết tủa bằng acid hay muối canxi [8].
Alginate là muối của acid Alginic một polymer của β-1,4-D-Mannuroic acid
(M) và α-1,4-L-Guluronic acid (G). Acid Alginic là một polymer ái nước và có tính
keo, được tinh chế từ nhiều loại rong nâu khác nhau. Công thức cấu tạo của acid
Alginic: (C
6
H
6
O
6
)n.
Alginate là một acid hữu cơ có trong tảo nâu, có trọng lượng phân tử từ 32.000-
200.000 do D-Mannuroic acid và L-Guluronic acid liên kết với nhau bởi liên kết
glucozit. Nó tồn tại dưới dạng sợi, hạt hay bột màu trắng đế vàng nâu. Được dùng làm
chất tạo đông, chất ổn định, chất tạo gel, chất nhũ hóa, không tan trong nước và dung
môi hữu cơ, tan chậm trongdung dịch Carbonate natri, Hydroxide natri.
Các dạng thương phẩm của Alginate: Natri Alginate, Kali Alginate, Amon
Alginate, Mg Alginate, Canxi Alginate, Propylen glycol Alginate.
Các dạng này được chiết xuất từ quá trình trích ly từ nhiều loại rong nâu khác
nhau bao gồm Macrocytis Pyrifera, Laminaria, Digitata và Ascophylum nodosum
Sodium Alginate là muối của acid Alginic có liên kết (1-4) guluronic acid. Alginate
polymer ưa nước và có thể tạo thành thể gel không thuận nghịch với sự hiện diện của
Ca
2+
. Bằng cách này Alginate được đánh giá có khả năng tạo màng tốt. Khi hòa tan các
Alginate vào nước và sẽ ngậm nước và tạo dung dịch nhớt, độ nhớt tỉ lệ thuận với
chiều daì của phân tử Alginate. Alginate cũng có khả năng tạo màng rất tốt. Các màng
rất đàn hồi, bền, chịu dầu và không dính bệt. Màng thuộc nhóm polysacharide có khả

11
năng ngăn cản oxy và Lipid thấm qua. Bên cạnh đó màng còn có khả năng làm giảm
thất thoát ẩm từ đó màng bao sẽ hơi khô và co lại làm cho lượng ẩm bên trong không
thoát ra được.
Sự hóa dẻo của màng có thể nâng cao bằng cách thêm vào các tác nhân làm dẻo
cách này gọi là sự hóa dẻo. Kết quả làm cho độ bền của màng càng tăng lên, chính
điều này giúp màng ít bị rách, đó là kết quả của quá trình co lại của các phân tử bên
trong giữa các chuỗi polymer trong cấu trúc màng. Chất dẻo phải phù hợp với polymer
sử dụng làm màng và cũng phải cùng hoạt tính tan với polymer. Các yếu tố khác là
chất dẻo phải được giữ lại trong hỗn hợp lâu, ổn định cao, không bay hơi và màu, và
quan trọng là mùi của các chất này không làm ảnh hưởng tiêu cực đến tính tính chất
của màng.
Alginate có thể kết hợp với các thành phần khác để tạo thành màng hợp phần,
nhờ sự kết hợp này mà cải tiến được đặc tính của màng. Màng hợp phần Alginate và
tinh bột được đánh giá là có độ bền cơ học cao. Lipid, sáp, các loại acid béo, các loại
dầu, chất béo nó có thể được kết hợp với Alginate trong màng hợp phần Alginate -
Lipid. Dựa trên tính kị nước sự kết hợp màng làm tăng cường rào cản sự bốc hơi
nước.
Alginate được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp do chúng tạo ra được vật
liệu may mặc có giá trị cao. Alginate – Ca không tan trong nước được sử dụng trong
sản xuất các loại băng gạt trong y học. Alginate được sử dụng trong công nghiệp sản
xuất enzyme không tan nhằm mục đích tăng khả năng sử dụng, kéo dài thời gian, số
lần sử dụng nhằm giảm giá thành enzyme. Alginate cũng được sử dụng như những keo
giữ màu trong công nghiệp in vải. Ngoài ra alginate còn ứng dụng trong công nghiệp
giấy, mực in đặc biệt, mỹ phẩm, thuốc trừ sâu, một số tá dược trong dược phẩm, thực
phẩm (sản xuất nước hoa quả, nấu đông, kem sữa sôcôla, mứt ướt, tương cà chua, bơ
nhân tạo, nước sốt, gia vị,…). Mặt khác alginate còn được dùng làm mĩ phẩm trong
sản xuất đồ hóa trang, xà phòng, sáp chải tóc, nước thơm, kem bôi, thuốc đánh răng.
Trong y tế, alginate được dùng làm men, chất phụ trợ cho thuốc viên, thuốc đắp
và còn vật liệu cho răng giả. Trong lĩnh vực hóa học, chất nhũ hóa, sơn chịu nước và

chịu nhiệt. Tại Hoa Kì người ta đã sử dụng alginate như các chất ổn định trong công
nghệ lạnh, tạo cho vải bóng mịn, là tác nhân đồng hóa sữa. Alginate có khả năng hấp
thụ được các kim loại nặng được ứng dụng trong công nghệ làm sạch nước [9].
Trong những năm gần đây, việc cố định tế bào sống trong alginate canxi bằng
phương pháp bẫy đã trở thành một kĩ thuật ứng dụng rộng rãi. Phạm vi sử dụng của nó
ngày càng rộng, từ các vi khuẩn cho tới tế bào của động vật có vú. Việc ứng dụng của
nó rất đa dạng, kỹ thuật chuẩn bị lại khá đơn giản. Quy trình chung là trộn lẫn dung
dịch alginate canxi và dịch huyền phù tế bào. Dịch huyền phù thu được sẽ được cho
nhỏ giọt vào dung dịch tạo gel như CaCl
2
. Các hạt gel alginate canxi hình thành có
dạng hình cầu.Trong mỗi hạt gel tạo thành một mạng lưới (matrix) bao quanh các tế
bào. Cấu trúc hạt gel như vậy sẽ tạo thành các lỗ xốp, thuận tiện cho việc khuếch tán
cơ chất vào và khuếch tán sản phẩm ra khỏi hạt gel [11].
1.8. Vị trí địa lý và thổ nhưỡng của Đơn Dương
1.8.1. Vị trí địa lý
Đơn Dương là huyện nằm ở phía Đông Nam Đà Lạt, phía Nam cao nguyên
Lâm viên. Phía Đông giáp tỉnh Ninh Thuận, phía Tây và phía Nam giáp huyện Đức
Trọng, phía Bắc giáp thành phố Đà Lạt và huyện Lạc Dương [13].
12
1.8.2. Địa hình
Đơn Dương có độ cao trên 1000 m. Với diện tích đất tự nhiên trên 61.000 ha ;
trong đó đất sản xuất nông nghiệp gần 17.000 ha, đất lâm nghiệp 38.000 ha.
Địa hình huyện Đơn Dương có thể chia thành 3 dạng chính:
- Địa hình núi cao bao gồm khối núi chạy dài theo hướng Đông Bắc - Tây Nam
có độ cao phổ biến 1.000-1.500m , độ dốc trên 15
0
, đại bộ phận diện tích còn rừng
thông che phủ.Đơn Dương có các đỉnh núi cao như: Yang Kuet (1.431m) ở phía Đông
Bắc Đơn Dương; Kanan (1.485m), Ya Bonnonh (1.650m), Srêla (1.486m), Parglo

(1.395,5m)
- Dạng địa hình đồi thoải lượn sóng có xen kẽ núi thấp là dạng chuyển tiếp giữa
địa hình núi cao với địa hình thung lũng, độ dốc phổ biến 3
0
– 15
0
, phân bố ở phía
Nam sông Đa Nhim. Một số diện tích là đất Bazan (Ka Đô, Châu Sơn).
- Dạng địa hình thung lũng sông suối miền núi, độ dốc 0
0
– 15
0
. Ở đây là loại đất
phù sa, dốc tụ, phân bố dọc theo sông Đa Nhim và các dòng suối, là vùng sản xuất
nông nghiệp chủ yếu của huyện [10, 13].
1.8.3. Khí hậu
Khí hậu mát mẻ, nhiệt độ trung bình hàng năm là 24
0
C, ít bị ảnh hưởng bởi gió
bão. Một năm có 2 mùa: mùa mưa từ tháng 4 đến tháng 10 và mùa khô từ tháng 11 đến
tháng 3 năm sau. Thời tiết tương đối ôn hòa thích hợp cho việc trồng cây lương thực,
cây ăn trái, cây công nghiệp [13].
1.8.4. Phân loại đất đai
Gồm có các loại đất chính sau:
- Đất phù sa dốc tụ
- Đất phù sa sông suối
- Đất phù sa không được bồi hàng năm
- Đất nâu đỏ trên Bazan
- Đất đỏ vàng trên đá phiến
- Đất mùn vàng đỏ Gzanit và Daxit.

Tổng diện tích đất tự nhiên: 61.032 ha [10].
13
2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Vi khuẩn Azotobacter
Các chủng vi khuẩn Azotobacter sử dụng trong các thí nghiệm được phân lập từ
đất trồng rau tại khu vực Thôn Sao Mai – Ka Đơn - Đơn Dương – Lâm Đồng.
2.1.2. Cây đậu đen
Tên khoa học: Vigna cylindrica
Họ đậu: Fabaceae
Tên tiếng việt: đậu đen, hắc đại đậu, hương xị.
Đậu đen là loài cây thuộc họ Đậu mọc quanh năm, toàn thân không lông. Lá
kép gồm 3 lá chét mọc so le, lá chét giữa to và dài hơn lá chét hai bên. Hoa màu tím
nhạt. Quả giáp dài, tròn, bên trong chứa 7 đến 10 hạt màu đen.
2.1.3. Cây rau xà lách
Tên khoa học: Lactuca sativa
Họ cúc: Asteraceae
Tên tiếng việt: Xà lách, rau sống
Tên tiếng anh: Salad
Xà lách là loại rau rất giàu Vitamin A và các loại khoáng chất như Ca,Fe. Ở
Việt Nam, xà lách được dùng để ăn sống. Tính chất của xà lách là giải nhiệt, lọc máu,
khai vị, cung cấp khoáng chất, giảm đau, gây ngủ, trị ho, trị tiểu đường.
Ở nước ta sử dụng hai nhóm xà lách chủ yếu sau:
- Xà lách trứng: Lá trắng, chịu được mưa nắng, cuộn chắc
- Xà lách li ti: á xanh nhạt, tán lớn, ít cuộn, xốp, chịu úng.
2.2. Vật liệu và môi trường nuôi cấy
2.2.1. Môi trường thạch Ashby
KH
2
PO
4

0.2 g
K
2
SO
4
0.1 g
CaCO
3
5.0 g
MgSO
4
.7H
2
O 0.2 g
NaCl 0.2 g
Glucose 20 g
Agar 20 g
H
2
O 1000 ml
pH 7.0
Môi trường được khử trùng ở 121
0
C/30 phút.
2.2.2. Môi trường lỏng Ashby
Thành phần môi trường tương tự môi trường thạch Ashby không bổ sung agar
14
2.2.3. Môi trường thạch nước chiết giá đỗ
KH
2

PO
4
0.2 g
K
2
SO
4
0.1 g
CaCO
3
5.0 g
MgSO
4
.7H
2
O 0.2 g
NaCl 0.2 g
Glucose 20 g
Agar 20 g
H
2
O 1000 ml
Nước chiết giá đỗ 200g
pH 7.0
Môi trường được khử trùng ở 121
0
C/30 phút.
2.2.4. Môi trường lỏng nước chiết giá đỗ
Thành phần tương tự môi trường thạch nước chiết giá đỗ không bổ sung agar
2.2.5. Thuốc nhuộm Gram

Crystal Violet 2g
Cồn ethanol 95% 20ml
Ammonium oxalate 0.8g
Nước cất 80ml
2.2.5.2. Lugol
Iốt 1g
KI 2g
Nước cất 300ml
2.2.5.3. Fuchsin
Fuchsin 2.5g
Cồn ethanol 95% 20ml
Nước cất 80ml
15
2.2.6. Hóa chất
- Alginate 2%
- CaCl
2
1,5%
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn cố định đạm trong đất trồng rau
- Thu mẫu đất tại vùng đất trồng: cà chua, đậu leo, hành lá, cà tím, xà lách tại khu
vực Sao Mai – Ka Đơn – Đơn Dương – Lâm Đồng.
- Cách lấy mẫu: lấy đất ở tầng đất canh tác vùng gần rễ, độ sâu khoảng từ 10-
20cm, trên mỗi vùng đất lấy ở 5 điểm đại diện rồi trộn đều lại. Lấy lượng vừa đủ cho
vào bịch nilon. Mẫu được bảo quản và chuyển về phòng thí nghiệm để phân tích.
- Cân 10g mẫu đất tiến hành nghiền nhỏ trong điều kiện vô trùng. Sau đó lấy 1g
mẫu cho vào bình tam giác chứa 99ml nước muối sinh lí. Lắc đều 5 phút, để lắng 30
giây rồi đem pha loãng theo thang bậc 10 để đạt nồng độ 10
-5
. Lấy 0,1ml dịch pha

loãng ở các nồng độ 10
-2
, 10
-3
, 10
-4
, 10
-5
cấy vào đĩa Petri chứa sẵn môi trường thạch
ashby, mỗi nồng độ lặp lại trên 2 đĩa.
- Nuôi cấy trong tủ ấm ở nhiệt độ 30
0
C, 72 giờ.
2.3.2. Phương pháp cấy chuyền
- Lựa chọn khuẩn lạc đặc trưng, thuần khiết, mọc riêng biệt, dùng que cấy đã vô
trùng cấy ria qua môi trường thạch đĩa.
- Đem ủ ở nhiệt độ 30
0
C. Khi vi khuẩn mọc đều ta tiến hành cấy chuyền sang
môi trường mới 1 hoặc 2 lần để thu nhận giống thuần chủng.
- Cấy chuyền qua các ống thạch nghiêng. Ủ ở nhiệt độ 30
0
C. Sau 3 ngày khi vi
khuẩn phát triển mạnh đem bảo quản trong tủ lạnh, nhiệt độ 4 – 6
0
C. Sau 2 - 3 tháng
tiến hành cấy chuyền lại một lần.
2.3.3. Phương pháp nhân giống
Dùng que cấy vô trùng cấy giống từ các đĩa giống thuần chủng vào 100ml môi
trường dịch thể. Tiến hành nuôi cấy trên máy lắc ổn nhiệt: 120 vòng/phút, nhiệt độ

30
0
C, 7 ngày.
2.3.4. Phương pháp nhân sinh khối vi khuẩn Azotobacter
Vi khuẩn Azotobacter từ ống thạch nghiêng được cấy vào môi trường lỏng
Ashby và môi trường lỏng nước chiết giá đỗ, nuôi cấy trên máy lắc ổn nhiệt (30
0
C,
120 vòng/ phút). Dùng pipet vô trùng hút dịch sinh khối từ giống cấp 1 cho vào môi
trường lỏng dùng để nhân sinh khối, lắc đều và cho vào tủ ấm giữ ở nhiệt độ 30
0
C.
Qua các mốc thời gian thì lấy mẫu để xác định số lượng tế bào vi khuẩn. Sau đó đánh
giá mức độ tăng số lượng tế bào của Azotobacter trong môi trường nhân sinh khối
bằng phương pháp đếm khuẩn lạc.
2.3.5. Phương pháp xác định số lượng tế bào vi khuẩn cố định đạm
- Chuẩn bị dịch sinh khối vi khuẩn Azotobacter cần xác định số lượng tế bào.
- Lấy 1ml pha loãng theo thang bậc 10. Sử dụng 0,1ml dịch pha loãng ở nồng độ
thích hợp cấy trải trên bề mặt thạch đĩa chứa môi trường Ashby, dùng que gạt vô trùng
gạt đều dịch sinh khối lên khắp bề mặt thạch. Để yên 15 phút để dịch ngấm đều trên bề
mặt thạch. Lật úp các đĩa petri lại và nuôi cấy trong tủ ấm ở 30
0
C.
16