Đề tài : Nghiên cứu ứng dụng pullulan trong sản xuất bánh kẹo và bảo quản thịt

1
BỘ CÔNG THƯƠNG
VIỆN CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM
–––––––––––––––––––––––––––––––





BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI R-D CẤP BỘ



Tên đề tài:
“NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PULLULAN TRONG
SẢN XUẤT BÁNH KẸO VÀ BẢO QUẢN THỊT”




Chủ nhiệm Đề tài: NGÔ THỊ VÂN

7314
23/4/2009

Hà Nội, 12-2008

2
I. Tổng quan
1.1 Cơ sở pháp lý /xuất xứ của đề tài

Căn cứ vào Quyết định số 1999/QĐ-BCT ngày 03 tháng 12 năm 2007 của
Bộ trởng Bộ Công nghiệp về việc giao kế hoạch KHCN năm 2008;
Căn cứ vào Hợp đồng nghiên cứu Khoa học và Phát triển Công nghệ số
85.08RD/HĐ- KHCN giữa Bộ Công thơng và Viện Công nghiệp Thực
phẩm ký ngày 28 tháng 01 năm 2008
( Chi tiết xem trong phần phụ lục)

3
1.2 Tính cấp thiết và mục tiêu của đề tài
1.2.1. Tính cấp thiết của đề tài
Mt sn phm mi có nguồn gốc sinh học đang đợc chú ý, quan tâm
nhiều trên th gii hiện nay là pullulan. Pullulan cú nhng tớnh cht nh l tan
hon ton trong nc lạnh tạo dung dịch có độ nhớt, dính cao, dung dịch
trong và ổn định, không hoà tan trong dung môi hữu cơ, chu c khong pH
rng 2- 12, không tạo gel, có sức căng bề mặt lớn hơn nớc, nhiệt độ cháy 250-
280
0
C. Dung dịch pullulan dễ dàng hình thành màng film mỏng trong suốt, cú
th tụ mu, trang trớ lờn v đặc biệt hơn l màng pullulan ngn khụng cho

khụng khớ thm qua, có thể so sánh với polypropulen, polyeste, polyvinyl
[4,17,18]
Chớnh vỡ các đặc tính trên nên pullulan c ng dng rng rói trong cỏc
ngnh cụng nghip nh: cụng nghip thc phm, cụng nghip dc, mỹ phẩm
v cỏc ngnh cụng nghip khỏc( Desh et al., 1992). Trong cụng nghip thc
phm, pullulan c s dng để tăng độ bóng, giữ màu sắc, nâng cao chất
lợng của sản phẩm kẹo, lm tng nht, độ dính cho ung, kem, xỳc
xớch Mng pullulan cú kh nng ngn khụng cho khụng khớ thm qua nờn
c s dng bao gúi, phủ bên ngoài cho cỏc s
n phm thc phm chống
oxy hoá nhất là các sản phẩm có dầu và tăng cờng khả năng chống mất màu
của sản phẩm. Ngoi ra, pullulan c s dng l thc phm chc nng (thc
phm ớt calo). Trong cụng ngh dc phm, y hc, pullulan c s dng
lm v nang thuc tân dợc, lm cht gi cõn bng ỏp sut trong mỏu Trong
cụng ngh m phm, với khả năng kết dính cao pullulan đợc ứng dụng trong
sản xuất dầu gội đầu, làm chất tạo sợi, tạo bọt và độ nhớt thấp giúp cho dịch dễ
thấm sâu vào da, tóc. Trong cỏc ngnh cụng nghip khỏc nh cụng nghip dt
thỡ nú l tỏc nhõn h vi.
Với khả năng tạo màng mỏng trong suốt, ngăn oxy pullulan đang đựơc
chú ý nh một nguồn nguyên liệu mới thay thế một phần bao bì polyethylen
nhằm giải quyết vấn đề ô nhiễm môi tr
ờng bức bách hiện nay.

4
Hiện nay pullulan c nghiên cứu và sn xut trờn quy mụ cụng nghip
rt nhiu nc trờn th gii nh Nht Bn, Trung Quc, Th Nh K Các
Công ty lớn sản xuất pullulan là Công ty Hayashibare Biochemical Osaka
Nhật bản với sản phẩm pullulan PI20 ứng dụng nhiều trong ngành thực phẩm,
dợc phẩm. Các công ty Ayurvedic Remedie Holistic, công ty Feinkost
ingredient, công ty Dow Chemical, Sumitomo Chemical sản xuất ra pullulan

dạng bột dùng cho công nghiệp giấy, phân bón, và phụ gia thực phẩm
ở nớc ta, pullulan hầu nh cha đợc chú ý đến. Để có thể ứng dụng
đợc pullulan, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài Nghiên cứu ứng dụng
pullulan trong sản xuất bánh kẹo và bảo quản thịt nhằm bớc đầu tạo ra
các sản phẩm có chất lợng cao góp phần đảm bảo đợc vệ sinh an toàn thực
phẩm, tạo tiền đề cho nghiên cứu sản xuất pullulan ở nớc ta.
1.2.2. Mục tiêu của đề tài
ứng dụng pullulan trong chế biến và bảo quản thực phẩm
1.3. Nội dung nghiên cứu
1.3.1.
Nghiên cứu các điều kiện công nghệ ứng dụng pullulan trong sản
xuất bánh kẹo
1.3.2. Nghiên cứu các điều kiện công nghệ sử dụng pullulan trong bảo quản
thịt
1.3.3. ứng dụng sản xuất sản phẩm kẹo quy mô thử nghiệm

5
1.4. Tổng quan tài liệu
1.4.1. Giới thiệu về pullulan
Pullulan đợc sinh tổng hợp từ chủng Aureobasidium pullulans, đợc
hình thành khi tế bào đang trong trạng thái pha log muộn (Catley,1971) và sự
hình thành phụ thuộc đối với nhiều nhân tố bao gồm pH, nhiệt độ, cơ chất và
chủng giống (Catley,1971; Yuen, 1974; Madi et al, 1997; Gibb,1996). Hiệu
suất và khối lợng phân tử phụ thuộc nhiều vào điều kiện lên men.
Bender ngời đầu tiên miêu tả sự hình thành polysacarit ngoại bào từ
chủng Aureobasidium pullulan ( Bender etal., 1959). Năm 1938 nhà khoa học
Bayer đã quan sát sự hình thành polymer ngoại bào từ chủng Aureobasidium
pullulan và mãi đến năm 1958 tác giả Bayer mới phân lập đợc và bắt đầu
nghiên cứu các đặc tính của polysacarit này. Năm 1959 polysacarit ngoại bào từ
chủng Aureobasidium pullulan đợc đặt tên là pullulan. Trong suốt những năm

1961 pullulan đợc nghiên cứu và xem xét cấu trúc phân tử. Sau khi phát hiện
một enzim pullulanase có thể thuỷ phân liên kết alpha 1,6 glucozit để chuyển
pullulan thành maltotrioza thì cấu trúc pullulan càng đợc làm sáng tỏ [4,5,6,9]
Hiện nay theo hệ thống số quốc tế (INS), mã số pullulan là E 1204 .
Trong sản phẩm thơng mại PI 20 một sản phẩm pullulan đã deion tồn tại 1250
đơn vị glucoza. Trên thế giới, Cụng ty Hayshibara Co.ltd, Nhật bản sn xut
pullulan trờn quy mụ cụng nghip t nm 1972 vi sn lng 1000 tn/ nm và
Công ty Shanghai Puao BioTech Co.Ltd -Trung quốc đang sản xuất pullulan
trên quy mô công nghiệp [17]
1.4.2. Cấu tạo và cấu trúc của pullulan

Pullulan l mt polysaccharit c to b
i ch yu cỏc n v
maltotrioza v mt phn nh cỏc n v maltotetraoza theo liờn kt - 1,6
glucozit. Cỏc n v ny c cu to t cỏc glucoza theo liờn kt - 1,4
glucozit. Pullulan có công thức hoá học (C
6
H
10
O
5
)
n
. Pullulan c sn xut t
tinh bt thụng qua quỏ trỡnh lờn men từ chng Aureobasidium pullulans.

6

Hình 1.1. Cấu trúc của pullulan [5]
Polysacarit ngo¹i bµo của chủng Aureobasidium pullulans có hai d¹ng
sản phẩm: polysaccarit dị hình và glucan trung hoà. Glucan trung hoà được gọi
là pullulan , chứa hai liên kết α- 1,4 và α- 1,6 glucozit. Pullulan được xác định
dựa trên cơ sở sự quay cực, thuỷ phân axit fomic, phổ hồng ngoại, phương pháp
phân tích methyl hoá. Người ta đã đưa ra tỉ lệ liên kết α- 1,4 : α- 1,6 glucozit
trong ph©n tö pullulan là 3:2 dựa trên phương pháp methyhoá và oxyhoá. Cấu
trúc của pullulan được mô tả nh
ư là một chuỗi mạch thẳng bao gồm các đơn vị
maltotrioza liên kết với nhau theo liên kết α - 1,6 glucozit và đơn vị này lại
được tạo thành từ ba đơn vị glucoza liên kết với nhau theo liên kết α - 1,4
glucozit [5, 6,12]
Khảo sát pullulan từ một chủng khác của Aureobasidium pullulans,
Bouveng và các cộng sự [10] cũng đưa ra kết quả tương tự với tỉ lệ liên kết α -
1,4: α - 1,6 glucozit là 2:1, đây cũng là giá trị lí thuyết v
ề chuỗi
polymaltotrioza. Sự thay đổi liên kết α - 1,4 và α - 1,6 glucozit cho pullulan từ
các chủng khác nhau đã được công bố rộng rãi.





7

Hỡnh 1.2. Cu trỳc n gin ca pullulan [5]
Bng phơng pháp thu phõn hon ton ca enzim pullulanaza enzim
c hiu tỏc ng lờn liờn kt - 1,6 glucozit cho thấy cu trỳc polymaltotrioza
trờn (hỡnh 1.2) có chút thay i sau khi tỡm thy maltotetraoza, nhng n v
tetrasaccharit ny xut hin ở cui phõn t pullulan. Sau ny ngi ta xỏc nh
c nhng n v ny l maltotetraoza v nú khụng ch xut hin cui chui
m nú c phõn b mt cỏch ngu nhiờn trờn phõn t polymaltotrioza. T
l
ny cú th lờn ti 7%.[10,9,15]
Cu trỳc pullulan ó c ch ra hỡnh 1.1 cho đến nay vẫn c chp
nhn mt cỏch rng rói. Tuy nhiên trong cu trỳc phân tử của pullulan vn cú
nhiu s thay i, đú l kh nng phõn nhỏnh (nhng khụng ỏng k).
Bouveng v cỏc cng s [10] cho rằng không loi kh nng cú liờn kt - 1,3
glucozit trong phõn t (1%- 2%). Bi vỡ, ụng ó tỡm thy glucoza khụng b
oxyhoỏ cũn li sau s ụxyhoỏ tun hon. Tác giả Elinov v Mateeva [15] c
ng
cho thy cú liờn kt - 1,3 glucozit nhng mc cao hn 7%. Do vy ó cú
nhiu ý kin khỏc nhau v cu trỳc mch thng trong ú cú liờn kt - 1,3
glucozit vi - 1,4 glucozit vi di khỏc nhau ó nh hng trc tip lờn
liờn kt - 1,6 glucozit.
Bng cỏch kt ta vi cetyl trimetylamoni hydroxit, Bouveng v cỏc
cng s [10,15] ó tỏch c c -glucan v cỏc axit polysaccharit d hỡnh cha

glucoza, manoza, galactoza v axit uronic cú trong pullulan. Bng phng phỏp

8
metyl hoỏ, oxihoỏ hon ton, thu phõn axit v enzim, ngi ta tỡm thy trong
-glucan cú cha liờn kt - 1,3 glucozit liờn kt vi liờn kt - 1,6 glucozit.
Mt -glucan cha 68% liờn kt 1,3 glucozit v 32% liờn kt 1,6 glucozit v
axit malic cng c tỏch ra sau khi kt ta phõn on vi cetyl trimethylamoni
bromua[15]
1.4.3. Khối luợng phân tử của pullulan
Khối lợng phân từ pullulan phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy (thời gian,
pH, phosphat, ), tuy nhiên nó khoảng 10- 3000 kDa (Sugimoto, 1978; Wiley
et al., 1993).
ó cú nhiu nghiờn cu v phõn t lng ca pullulan v cho thy cú s
bin thiờn ỏng k. S phõn ct bi enzim amylaza và s phõn ct ca enzim
pullulanase lờn pullulan phõn t l
ng thp ó to ra cỏc tetrasaccharit phõn
nhỏnh thay vỡ cỏc n v maltotetraoza.V cỏc n v maltotetraoza trong
pullulan cng b phõn ct bi enzim - amylaza tuyn nc bt. Tác giả
Yeun [17] cho rng cú th iu chnh c phõn t lng bng cỏch la chn
chng v thay i cỏc iu kin nuụi cy. Tác giả Sugimoto [12] thỡ li cho
rng pH v nng photphat l hai yu t quan trng quyết nh phõn t lng
ca pullulan. Phõn t lng gim khi tng pH v tăng nng photphat trong
canh trng. Pullulan có khối lợng phân tử 500,000- 600,000 dalton khi đợc
sản xuất ở pH ban đầu là 3, trong khi pullulan có khối lợng phân tử 200,000-
300,000 dalton khi pH ban đầu là 4,5. Để có pullulan phân tử luợng cao cần
điều chỉnh pH canh trờng t 3,0 6,0 sau hai ngy nuôi cấy v tng nng
ngun cỏcbon. Phõn t lng của pullulan cng tng khi t l t bo tng, tng
tc khuy. Ngoài ra pullulan có khối lợng phân tử trên 1000000 danton nếu
sử dụng glucoza kết hợp với glucozamin trong môi trờng nuôi cấy. Pullulan có
khối lợng phân tử lớn đợc sử dụng nhiều trong các ngành công nghiệp

hơn.[17,12]



9
1.4.4. TNH chất của PULLULAN
Pullulan có những tính chất rất u việt nh : bột màu trắng, không mùi,
không vị , không hút ẩm, chứa 6% ẩm, không có tính khử. Pullulan bị phá huỷ ở
nhiệt độ cao 250 280
0
C. Pullulan hoà tan trong nớc lạnh và nớc nóng,
không hoà tan trong dung môi hữu cơ trừ dimethylformaldehide và
dimethylsulfoxide( Sugimoot, 1978; Tsujiaka và Misuhashi, 1993).Dung dịch
pullulan nhớt nhng không tạo gel và ổn định. Độ nhớt của pullulan phụ thuộc
vào khối lợng phân tử của pullulan. Độ nhớt dung dịch nồng độ 10% ở 30
0
C
là 132-179mm
2
/s, độ nhớt của pullulan tơng tự với dung dịch gum arabis.
Pullulan luôn có khả năng hình thành một màng film trong suốt.
Dung dch pullulan cú sc cng b mt cao và độ n nh tốt, chịu pH
rộng t 2-12, nht ca nú khụng thay i khi cú mt ca cỏc ion kim loi
khỏc nhau cú trong dung dch. Với khả năng dính kết cao nên có thể nén trực
tiếp dới nhiệt có ẩm.
Pullulan cú th to thnh nhng loi vt liu cú hỡnh dng khỏc nhau.
Pullulan c to thnh mng cú tớnh cht ngn nga, khụng cho khụng khớ
thm qua.
Sản phẩm thơng mại của hãng Hayshibara Co.ltd có thành phần nh
sau:

Trng thỏi Dng bt mu trng hoc h
i vng
trng
S ho tan trong nc (25
0
C) D tan
m <6%
Cht tro <3%
Protein <0,5%
Arsenic <2 ppm
Kim loi nng <5 ppm


10
1.4.5. Những NG DNG CA PULLULAN
Pullulan đợc US Food and Drug Administration (FDA) và Substances
General Recognized as Safe (GRAS) cho phép sử dụng trong lĩnh vực thực
phẩm, dợc phẩm và mỹ phẩm
1.4.5.1 Trong công nghiệp thực phẩm:
Với tính chất tạo đợc màng mỏng, trong, ngăn cản đợc sự tiếp xúc của
oxy với sản phẩm, pullulan đợc coi là chất lý tởng để bao gói bảo quản, phủ
bên ngoài hoàn hảo cho các sản phẩm thực phẩm chống oxy hoá nhất là các sản
phẩm có dầu, làm nổi trội màu và tăng cờng khả năng chống mất màu của sản
phẩm. Do có khả năng ngăn cản khí nên màng pullulan còn đợc dùng nhiều
trong việc giữ hơng trong quá trình bảo quản, lm gim mt mựi v ca sn
phm v ng thi trỏnh c s oxy hoỏ cht bộo v cỏc thnh phn cha du
cú trong thc phm lm tng thi hn s dng. Một ứng dụng rất có giá trị của
màng pullulan là dùng để trang trí, vẽ tranh lên sản phẩm nhất là trong công
nghiệp sản xuất bánh kẹo.

Dung dịch pullulan không màu, không mùi có thể tạo lớp áo bóng, đẹp,
bền màu cho sản phẩm. Cấu trúc phân tử của pullulan là maltotrioza liên kết với
nhau nên pullulan rất khó bị phân huỷ bởi enzim vì thế nó cung cấp calo một
cách từ từ khi vào cơ thể ngời. Pullulan
c s dng l thc phm chc nng
(thc phm ít calo).
Năm 2003 tác giả Bryan W. Wolf , Keith A. Garlel, Young
S. Choe đã có bài báo trên tạp chí dinh dỡng của Mỹ về pullulan tiêu hoá chậm
trong cơ thể ngời. Thí nghiệm đợc đánh giá qua một đêm của ngời sử dụng
đồ uống chứa 50 g cacbonhyđrat là maltodextrin và 50 gam pullulan, tiêu chí
phân tích là nồng độ hyđrogen trong hơi thở và nồng độ glucoza trong máu. So
với mẫu đối chứng peak glucoza trong máu là giảm đi rõ rệt của ngời sử dụng
pullulan là 1,97+- 0,1mmol/lít, còn ngời sử dụng maltodextrin là 4.24mmol/lít.
Điều đó cho thấy pullulan tiêu hoá chậm không làm tăng glucoza trong máu khi
ăn, calo ít. [8,15,16]
Khả năng kết dính của pullulan cao nên nó đợc dùng nhiều để giữ hình
dạng khác nhau của các viên thịt, cá trong chế biến đồ hộp, thức ăn nhanh.

11
Pullulan còn đợc sử dụng trong sản xuất đồ uống, cream, nớc sốt để làm tăng
độ nhớt của sản phẩm. Pullulan còn ức chế sự phát triển của nấm. Vì vậy nó là
nguyên liệu tuyệt vời cho bảo quản thực phẩm. Nhật bản đã có lịch sử hơn 20
năm sử dụng pullulan nh một thành phần thực phẩm và tác nhân kết dính của
thuốc [17]

Một sản phẩm kẹo của Nhật bản có ứng dụng pullulan [17]
Trong công nghiệp thực phẩm pullulan c sử dụng rất rộng rãi nh :
- Pullulan đợc cán mng có thể dựng lm cỏc tỳi ng chố gi mựi
hng cho chố, dùng bo qun qu trng sch v cỏc sn phm ca
trng.
- Pullulan c s dng lm tng nht cho ung, kem v xỳc
xớch.
-
Pullulan dựng ci tin cht lng v hỡnh dng ca sn phm. Thờm
0,1% pullulan vo cỏc sn phm tht nng, tht mui, xỳc xớch
gi hỡnh dng bờn ngoi cho chỳng.
- Pullulan cũn c s dng ni cỏc mnh, on ca cỏc sn phm
tht, cỏ, bũ v gia cm ó c nu to hỡnh dỏng cho chỳng trong
cỏc ba n nhanh hoc cỏc thc n nhanh.
- to thc phm ớt calo, ng
i ta phi trn bt mỡ, tinh bt amyloza
v pullulan ging nh l bỏnh quy, bỏnh xp m trong ú pullulan
thay th cỏc thnh phn amyloza.

12
- Màng pullulan đợc sản xuất từ dung dịch pullulan nồng độ 5- 20 %
không chứa các thành phần plastic, khuấy ở 100- 1000 v/p trong 30- 60
phút, sau khi phủ trên Mylar và sấy khô trong điều kiện 70
0
F và 50%
ẩm trong thời gian 1- 5 ngày tới độ ẩm 10% hoặc hơn, kết quả màng
film trong có thể bóc ra khỏi Mylar ( freepatentsonline. com)

Một sn phm tht, xỳc xớch có ứng dụng pullulan[17]
1.4.5.2.Trong công nghiệp dợc phẩm:
Pullulan đợc sử dụng bao viên giảm sự va đập làm vỡ viên, bột pullulan
đợc sử dụng làm chất kết dính, làm sệt, bóng. Với tớnh cht chng oxy tuyt
vi nú lm tng thi hn s dng cho sn phm.
Pullulan đợc sử dụng để tạo capsule vỏ nang dùng để đóng viên các
loại thuốc tân dợc trong sản xuất thuốc, đặc biệt trong sản xuất các vitamin C,
E, D Vỏ nang từ pullulan có u điểm hơn so với loại truyền thống nh tăng
cờng tính năng chống ẩm, hoà tan dễ dàng, gia tăng tính độ ổn định chất
lợng trong thời gian lu hành, ngăn chăn oxy. Thuốc tân dợc truyền thống
thờng đợc đóng trong viên nang gelatin có nguồn gốc động vật, có thể gây
khó khăn tiên hoá đối với một số ngời ăn kiêng. Ngoài ra đối với những ngời
tu hành điều đó đồng nghĩa với việc vi phạm giáo lý nhà phật. Chính vì vậy
ngời ta sử dụng pullulan trong sản xuất vỏ nang có thể đáp ứng cho tất cả mọi
đối tợng. Gần đây khách hàng quan tâm đến sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên
không chỉ ở Mỹ, Nhật mà ở các vùng miền trên thế giới, đặc biệt những nơi có
văn hoá tín ngỡng sử dụng nguyên liệu từ thực vật. [12,15,17,18]

13
Pullulan c dựng duy trỡ cõn bng ỏp sut thm thu trong mỏu v
mụ t bo v cú th lm tng cung cp huyt tng. Pullulan c s dng nh
l huyt tng m rng (plasma extender), to ra nhng tác dụng mong mun.
Pullulan cú phõn t lng 3000 9000 hoà tan trong dung dch mui sinh lớ
to ra dung dch pullulan 4-10% wt/vol, sau ú em tit trựng, dung dch ny

c tiờm vo tnh mch đảm bảo s an ton tuyt i. Pullulan cú th c
chuyn hoỏ v bi ti
t hon ton.
Pullulan phõn t lng cao ứng dụng trong sản xuất thuốc cho phộp kộo
di s ho tan của một số hoạt chất bằng cách làm chậm sự bay hơi của chúng
(sulphamethizole, ibuprofenvis).
Dch lờn men ca chng A. pullulans R106 chứa nhng cht khỏng sinh
t nhiờn aureobasidins cú hot tớnh chng mc cao chng li bnh nm
Candida albicans.
Pullulan cú th to thnh v bc thuc c s dng trong cỏc sn phm
dc phm. Vi ngun gc khụng phi ng vt nú ỏng tin cy i vi khỏch
hng v nú phự hp cho tt c
nhúm khỏch hng. Vi tớnh cht chng oxy tuyt
vi nú lm tng thi hn s dng cho sn phm. Pullulan có thể đợc biến đổi
để sản xuất các dẫn xuất có độ hoàn tan thấp hoặc polyme biến đổi mà hoàn
toàn không tan trong nớc. Những dẫn xuất của pullulan đợc ứng dụng nhiều
trong phát triển các sản phẩm thuốc sinh học vì nó không độc, không thoái hoá
nh tinh bột. Tốc độ tan rã của pullulan so với dextran trong huyết thanh là
nhanh hơn , chỉ số tan rã là 0.7 sau 48 giờ ủ so với 0.05 của dextran[17,18,23]
Pullulan đợc sử dụng nh một chất mang phân tán thuốc, phân tử
pullulan đợc hydro hoá có thể hình thành hạt nano ổn định






14

ng dng pullulan trong cụng nghip dc phm [17]

Hiện cũng có rất nhiều nghiên cứu sử dụng pullulan trong sản xuất sản
phẩm vệ sinh răng miệng,thấu kính, màng plasma Nh Công ty Pfizer
NewYork Mỹ nổi tiếng với trong các sản phẩm vệ sinh răng miệng đang sử
dụng pullulan bột. Sản phẩm bảo vệ răng miệng của Pfizer ở Canada nh
Listerine, sản phẩm này phát triển rộng khắp thế giới. Trong thành phần nớc
xúc miệng Listerine có: Pullulan, Methol, Flavors, Sucralose, Potassium
acesulfate, Carragenan, Glyceryl Oleate, Eucalyptol, Xanthan Gum( Listerrine
professional)
1.4.5.3. Trong công nghiệp mỹ phẩm
Với khả năng kết dính cao pullulan đợc ứng dụng trong sản xuất dầu gội
đầu. Pullulan có tác dụng tạo sợi, tạo bọt và độ nhớt thấp giúp cho dịch dễ thấm
sâu vào da, tóc. Ngoài ra pullulan đợc ứng dụng vào các sn phm son mụi,
kem dng da, kem chống nhăn dng lng nhằm giỳp n nh, gi m, tng
gel .
Trong các sản phẩm dỡng da, phấn trang điểm, mỹ phẩm mắt, dầu gội
đầu, ngời ta sử dụng pullulan có khối lợng phân tử 5000- 500.000 daton và tỉ
lệ pullulan bổ sung từ 0,1- 99 %, tuỳ theo từng sản phẩm. Khi sử dụng pullulan
trong các sản phẩm mỹ phẩm có u điểm nh dễ tan trong nớc, ổn định trong
thời gian dài[12,17]

15
Pullulan có trong thành phần mỹ phẩm Keshin gaku: ethylalcoho 10

phần, pullulan khối lợng phân tử 400.000 daton 0,05 phần, propyleneglycol 5
phần, oley alcohol 0,1 phần, polyoxyethylen sorbitar 1,2phần, nớc hoa 0,2
phần, nớc tinh khiết 83,45 phần. Trong dầu gội, pullulan khối lợng phân tử
800.000 daton 2 phần, ethyalcohol 13 phần, glycerin 2 phần, nớc tinh khiết 80
phần, nớc hoa 0,3 phần [17]
1.4.5.4. Trong các ngành công nghiệp khác
Pullulan đợc sử dụng làm chất kết dính trong công nghiệp sản xuất phân
bón, công nghiệp giấy sử dụng pullulan tạo ra giấy có độ dày và thấm mực một
cách lý tởng. Trong cụng nghip dt thỡ pullulan l tỏc nhõn h vi. Cỏc dn
xut ca pullulan c este hoỏ v ete hoỏ cú th c s dng trong cụng
nghip sn xut h dỏn .

16
II. Thực nghiệm
2.1 PHNG PHP tiến hành nghiên cứu
2.1.1. Phơng pháp công nghệ
2.1.1.2. Nghiên cứu công nghệ tạo màng film từ pullulan
Cân 5 gam pullulan hoà tan trong 100 ml nớc, khuấy cho tan hết tạo
dung dịch có độ nhớt. Dung dịch pullulan phủ đầy trên khay có kích thớc 30
x40cm và sấy khô. Màng film mỏng dùng để bao gói, bảo quản sản phẩm thực
phẩm
2.1.1.3 Nghiên cứu ứng dụng pullulan trong sản xuất kẹo
Chuẩn bị dịch pullulan: Định lợng pullulan ( 0,3 gam/ 100 gam kẹo) hoà
tan trong nớc nóng.
Nấu kẹo: Cân 100 gam đờng kính, bổ sung 100 ml nớc cho vào chảo
đun trên bếp cho tan hoàn toàn, cho tiếp 100 gam siro glucoza và dịch pullulan
vào nấu kẹo, khi độ ẩm khối kẹo đạt <3% đa ra làm nguội. Đánh giá chất
lợng kẹo so với mẫu đối chứng từ đó rút ra nhận xét và theo dõi bảo quản kẹo.
2.1.1.4. Nghiên cứu sử dụng màng pullulan trong bảo quản thịt chín
Thịt là loại thực phẩm có giá trị dinh dỡng nên rất dễ hỏng khi bảo quản.

Màng pullulan đợc ví nh cái hàng rào ngăn oxy có thể kéo dài thời gian bảo
quản thịt chín hoặc túi đựng thực phẩm chín khô tránh oxy hoá tăng thời gian
bảo quản phần nào hạn chế sử dụng hoá chất bảo quản.
Tiến hành chuẩn bị thịt lợn chín trong các dụng cụ đựng thuỷ tinh hoặc
nhựa, sau đó dùng màng pullulan phủ kín , theo dõi bảo quản
Tiến hành chuẩn bị ruốc thịt đóng gói trong màng pullulan trên máy dán
kín , theo dõi bảo quản.
2.1.2. Phơng pháp phân tích
2.1.2.1.Xác định nồng độ chất khô bằng chiết quang kế
Chiết quang kế là một dụng cụ quang học dựa trên sự khúc xạ khác nhau
trong môi trờng có nồng độ chất tan khác nhau. Dịch đem đo cần trong suốt, ở
20
o
C để đảm bảo chính xác.

17
Tiến hành đo: dung dịch cần đo làm nguội tới 20
o
C rồi lấy một giọt cho
lên bề mặt của chiết quang kế. Đậy nắp kính lại, điều chỉnh sao cho đọc rõ kết
quả trên chiết quang kế, ta ghi lại kết quả đó chính là nồng độ phần trăm chất
khô.
2.1.2.2. Phơng pháp xác định độ nhớt của dịch pullulan
Chuẩn bị dung dịch pullulan làm nguội đến 30
o
C rồi đem đo độ nhớt bằng
dụng cụ đo độ nhớt.
Phơng pháp đo: hút 2ml dịch cho vào dụng cụ đo độ nhớt. Dùng quả bóp
đẩy dịch lên trên vạch đo thứ nhất đợi dịch chảy đến vạch đo ta bắt đầu bấm giờ
tính thời gian cho đến khi dịch chảy đến vạch đo thứ hai. Ghi lại thời gian này,

làm ba lần rồi lấy kết quả trung bình.
Tính toán kết quả:
+ Đo tỷ trọng của dịch: lấy 5ml dịch đem cân khối lợng bằng cân tiểu ly, sau
đó tính ra tỷ trọng của dịch thủy phân theo công thức d=m/V
+ Đo tỷ trọng của nớc: tơng tự nh đo với dịch
Độ nhớt của dịch tính theo công thức:
à = à
o
ì
00
11
td
td
ì
ì

Trong đó:
à
o
: độ nhớt của nớc
d
1
: tỷ trọng của dịch pullulan
d
o
: tỷ trọng của nớc (d
o
= 0.997)
t
1

: thời gian chảy của 2ml dịch (giây)
t
o
: thời gian chảy của 2ml nớc (giây)
2.1.2.3. Xỏc nh pH bng mỏy o pH meter
2.1.2.4. Phơng pháp xác định đờng khử bằng Lane - Eynon
Cơ sơ phơng pháp.
Dùng hai dung dịch chính là Sunfat đồng (CuS0
4
) và Tatrat kép
(KNaC
4
H
4
O
6
) trong môi trờng kiềm, tác dụng với dung dịch đờng khử (có
gốc CHO) tạo ra Cu
2
O.

18
CuSO
4
+ 2NaOH = Cu(OH)
2
+ Na
2
SO
4

OH-CH-COONa O-CH-COONa
Cu(OH)
2
+ Cu + 2H
2
O
OH-CH-COOK O-CH-COOK
O-CH-COONa
Cu + CH
2
OH(CHOH)
4
CHO + 2H
2
O
O-CH-COOK
OH-CH-COONa
+ CH
2
OH(CHOH)
4
COOH + Cu
2
O
OH-CH-COOK
Để nhận biết điểm khử Cu dùng chỉ thị Xanhmethylen khi tồn tại ở dạng tự
do, xanh methylen có màu xanh. Khi hết Cu, d đờng khử, Xanhmethylen tác
dụng với đờng khử tạo phức không màu. Căn cứ vào sự đổi màu ta kết thúc
phản ứng.

Tiến hành.
- Kẹo đợc hoà tan trong nớc và pha loãng dịch đờng đến nồng độ xấp xỉ
1%.
- Chuẩn bị các bình tam giác 250ml. Hút vào mỗi bình 5ml dung dịch Fehling
A và 5ml dung dịch Fehling B.
- Dung dịch đã chuẩn bị ở trên cho vào buret 50ml. Cho trớc vào mỗi bình
tam giác khoảng 13-15ml dịch đờng.
- Cho bình tam giác lên bếp điện. Bắt đầu sôi để 2 phút, sau đó nhỏ 2-3 giọt
Xanhmethylen 1%.Tiếp tục chuẩn độ đến hết màu xanh của xanhmethylen
(chuyển sang màu đỏ gạch) thì dừng lại. Thời gian chuẩn không quá 1 phút.
Tổng số thời gian từ lúc bắt đầu sôi đến kết thúc quá trình chuẩn độ không
quá 3 phút. Ghi số ml dịch đờng đã chuẩn.



19
Tính toán.
( a ì b )
DE= ì 100%
C
a: Lợng đờng khử tra trong bảng Eynon-lane(g).
b: Tỉ lệ pha lãng.
C: Nồng độ phần trăm chất khô (
0
Bx).
2.1.2.5.Phơng pháp xác định độ ẩm bằng máy Precisa HA60 của Thuỵ Sỹ
2.1.2.6.Phơng pháp đánh giá bằng cảm quan TCVN 3215-79.
2.1.2.7. Phơng pháp xác định các chỉ tiêu vi sinh vật
Cân 10 gam thịt đã chế biến cho vào 10 ml dung dịch đệm phosphat pH
7, khuấy đều , ly tâm ở 2500 v/p trong 15 phút , sau đó lấy dịch tiến hành kiểm

tra vi sinh vật.
a.Xác định E.coli (TCVN5155-90)
Pha loãng mẫu 10
-1
,10
-2
, 10
-3
và lấy 1ml dịch phân tích cấy vào đĩa Petri
có môi trờng thạch Endo (nên làm đồng thời 2-3 hộp cùng một lúc) và chan
đều trên mặt thạch. Nuôi cấy trong tủ ấm ở nhiệt độ 37C 1C trong 48 giờ.
Nhận biết: Trên mỗi hộp Petri đã nuôi nếu mọc các khuẩn lạc có màu
hồng đến màu đỏ cánh sen, tròn, bờ đều, có ánh kim có thể khẳng định đó là
E.coli.
b.Xác định Coliforms.(TCVN 6262-1:1997, ISO5541:1986)
Pha loãng mẫu ở các mức 10
-1
,10
-2
, 10
-3
Hút lấy 1ml dịch pha loãng mẫu
cấy cho lên môi trờng, dùng que chan đều dịch trên môi trờng. Lật ngợc đĩa
peptri, đặt vào tủ ấm ở nhiệt độ 37C 2C, nuôi trong 24 giờ 2 giờ.
Nhận biết: những khuẩn lạc điển hình cho nhóm Coliforms là những
khuẩn lạc có màu đỏ thẫm, có đờng kính ít nhất 0,5mm.
Khẳng định trên môi trờng TSI, nếu khuẩn lạc có màu vàng hoặc màu
xanh thì có thể kết luận chúng là Coliforms.
c. Xác định vi sinh vật tổng số( TCVN 5165-90)

20
Môi trờng nuôi cấy.
Thành phần môi trờng: Pepton: 10g;thạch : 20g; cao thịt bò:1,4g; NaCl :
5g; nớc cất :1000ml.
Sau khi pha môi trờng từ các thành phần chất khô, khuấy đều cho đến
khi thạch tan hoàn toàn trong nớc hoặc đun nóng trong nồi hơi nớc cho tan.
Phân phối môi trờng vào bình lợng từ 100ml- 150ml và thanh trùng bằng nồi
hấp ở nhiệt độ 121C trong 15 phút. Sau đó làm nguội đến 45C trong nồi cách
thủy rồi rót vào các đĩa peptri.
Cấy và nuôi ấm

Dịch phân tích đợc cho môi trờng làm giầu và nuôi cấy 2 ngày ở 30
0
C,
sau đó tiến hành xác định vi sinh vật tổng bằng cách pha loãng mẫu phân tích
tới nồng độ 10
-1
,10
-2
, 10
-3
. Lấy 1 giọt mẫu pha loãng cho vào đĩa peptri chứa
môi trờng thạch dinh dỡng, chan đều trên mặt thạch. Mỗi độ pha loãng nên
làm đồng thời 2-3 hộp.Lật ngợc đĩa, đặt vào tủ ấm để nhiệt độ 30C 1C
trong thời gian 48giờ .
Kết quả

Đếm số khuẩn lạc xuất hiện trên các đĩa sau khi ủ có số lợng khuẩn lạc
nằm trong khoảng 30 đến 300. Số lợng vi sinh vật trung bình có trong 1ml mẫu
đợc tính theo công thức:

C
N(khuẩn lạc/ml) =
(n
1
+ 0,1n
2
).f
1
.v
Trong đó :
C : Tổng số khuẩn lạc đếm đợc trên tất cả các đĩa
n
1
: Số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ nhất( độ pha loãng thấp nhất )
n
2
: Số đĩa đếm ở nồng đọ pha loãng thứ hai( độ pha loãng tiếp theo)
f
1
: Hệ số pha loãng của đĩa đếm thứ nhất

v : Thể tích mẫu cấy vào mỗi đĩa Petri
d. Xác định Staphilococcus aureus (TCVN5156-90)
Môi trờng nuôi cấy


21
Thành phần môi trờng Chapman: Pepton: 10g/l; cao thịt: 5g/l ; NaCl: 75g/l;
thạch 20g/l; nớc cất: 1000ml; pH: 6,8. Hoà tan các chất và môi trờng hấp khử
trùng ở nhiệt độ 121C trong 15 phút.

Cấy và nuôi ấm

Nhỏ 1 giọt mẫu cấy lên bề mặt hộp Petri chứa sẵn môi trờng thạch
Chapman và ria cấy đều trên mặt thạch. Nuôi trong tủ ấm ở 37C trong 24 giờ.
Quan sát khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch. Đếm các khuẩn lạc màu vàng nhỏ (1- 2
mm ).
Phép thử khẳng định

Chọn khuẩn lạc nghi ngờ, dùng que cấy vòng cấy chuyển sang các ống
nghiệm có chứa 0,5ml dịch huyết tơng thỏ. Lắc nhẹ để trộn đều môi trờng.
Để các ống đã cấy trong tủ ấm ở nhiệt độ 37C 1C trong 2 giờ. Theo dõi
phản ứng huyết tơng sau mỗi 2 giờ. Tiếp tục nuôi cấy đến 24 giờ thì ngừng nếu
không thấy xuất hiện khối kết tụ.
Kết quả
Dựa vào số khuẩn lạc đếm đợc trên các đĩa Petri và dựa vào tỷ lệ số ống
thử phản ứng coagulase dơng tính trên tổng số ống thử phản ứng, áp dụng công
thức dới đây để tính lợng St.aureus trung bình trong 1g mẫu:
C
N(khuẩn lạc/ml) = x R
n . f
1
. v
Trong đó :
C : Tổng số khuẩn lạc đếm đợc trên tất cả các đĩa
n : Số đĩa Petri đã nuôi cấy
f

: Hệ số pha loãng của đĩa đếm thứ nhất

v : Thể tích mẫu cấy vào mỗi đĩa Petri

R : Số ống thử phản ứng coagulase dơng tính /tổng số ống thử.
e. Xác định Salmonella (TCVN 6402: 1998 ISO 6785:1985)
Môi trờng cơ bản

22
Thành phần môi trờng: Cao thị: 5g/l; pepton: 10g/l; thạch: 20g/l; NaCl:
3g/l; CaCO
3
: 45g/l; nớc cất: 1000ml ; pH : 7
Hoà tan các chất và môi trờng hấp khử trùng ở nhiệt độ 121C trong 15
phút.
Môi trờng cơ bản 900ml: Dung dịch Na
2
S
2
O
3
.5H
2
O:100ml; dung dịch
Iôdua : 20ml; dung dịch xanh brilliant : 2ml; dung dịch mật bò: 50ml. Phân
phối vào các ống nghiệm từ 10-15ml, trong điều kiện vô trùng.
Môi trờng đặc chọn lọc: Pepton:10g; cao thịt bò:5g; glucoza:5g;
Na
2
HPO
4
.12H
2
O: 4g; FeSO

4
0,3g; Amoni xitrat bismut: 1,85g; Na
2
SO
3
) 6,15g;
thạch:15g; xanh brilliant : 0,025g; nớc cất :1000ml. Hòa tan các thành phần
trong nớc sôi, không hấp áp lực. Chỉnh pH =7,7. Phân phối vào các đĩa petri
Cấy và nuôi ấm
Pha loãng mẫu 10
-1
,10
-2
, 10
-3
Hút lấy 1ml cho vào ống nghiệm có chứa
môi trờng tăng sinh chọn lọc, nuôi ở 37C trong thời gian từ 18-24 giờ.
Dùng que cấy vòng lấy từ mỗi ống nghiệm đã nuôi ấm cấy ria lên bề mặt
môi trờng chọn lọc nuôi ở 37C trong thời gian từ 24 giờ.
Sau khi nuôi ấm, kiểm tra sự có mặt của các khuẩn lạc Salmonella. Nếu
khuẩn lạc mọc yếu và không điển hình thì nuôi tiếp 24 giờ nữa.
Những khuẩn lạc điển hình trên môi trờng đặc chọn lọc là những khuẩn
lạc có màu nâu hoặc màu đen có ánh kim, một số chủng cho ra các khuẩn lạc có
màu xanh lá cây.
Khẳng định trên môi trờng TSI : lấy những khuẩn lạc điển hình đã chọn
trên môi trờng đặc, cấy lên bề mặt thạch TSI, nuôi ấm ở nhiệt độ 37C trong
24 giờ.
Sau thời gian nuôi ấm nếu khuẩn lạc có

Màu sắc Kết quả

Màu vàng Dơng tính
Màu đỏ hoặc không đổi màu Âm tính

23
Màu đen Có tạo thành sunfua hidro
Có bọt khí hoặc vết nứt Sinh khí từ glucoza
2.1.2.8. Phơng pháp xác định chỉ số peroxyt
Xử lý mẫu: Cân 100 gam ruốc, xay nhỏ cho vào phễu chiết để trích ly
chất béo bằng dung môi diethyl ether, ete petro. Sau đó đuổi dung môi bằng cô
chân không đến khối lợng không đổi, ta thu đợc chất béo sử dụng xác định
chỉ số peroxyl.
Cơ sở phơng pháp: Chỉ số peroxyt là chỉ số biểu hiện sự ôi két của dầu
trong sản phẩm ruốc. Hợp chất peroxyt của dầu tác dụng với kali iodua sẽ sinh
ra iot. Chuẩn độ lợng iot thoát ra bằng natri thiosunphat.
Tiến hành:. Lấy 2 gam chất béo trích ly ở trên thêm 20 ml hỗn hợp gồm 2
phần axit acetic và 1 phần cloroform ( theo thể tích). Sau đó thêm 5 ml dung
dịch kali iodua bão hoà, rồi để yên 30 phút trong bóng tối. Cuối cùng thêm 30
ml nớc cất và chuẩn độ iot thoát ra bằng natrithiosunphat dung dịch 0,002N
cho đến khi xuất hiện màu vàng nhạt thì thêm 0,5 ml dung dịch tinh bột 1%, và
chuẩn tiếp đến hết màu xanh. làm một mẫu trắng, thay dầu bằng nớc.
Tính toán: Chỉ số peroxyt, biểu thị bằng gam iot thoát ra từ 100 gam sản
phẩm, tính theo công thức
(V1- V2) .N.0,1269 x 100
X=
G
Trong đó :
V2: Thể tích natrithiosunphat 0,002N dùng chuẩn mẫu trắng, ml
V1: Thể tích natrithiosunphat 0,002N dùng chuẩn mẫu sản phẩm, ml
N: Nồng độ đơng lợng natri thiosunphat.
0,1269: mg đơng lợng của iot

G: Trọng lợng mẫu,g

24
2.1.2.9. Phơng pháp xác định độ dày của màng pullulan: Theo TCVN
3652: 2000
2.1.2.10. Phơng pháp xác định độ chịu nén: bằng máy Hoursfield Siber
Hegner
2.2. Thiết bị, dụng cụ, nguyên vật liệu và hóa chất
2.2.1. Nguyên liệu
- Pullulan của hãng Hayashibara- Nhật bản : Dạng bột màu trắng, không mùi,
vị, có độ ẩm 6%, pH dung dịch 10%: 7, độ nhớt dung dịch 10% ở 30
0
C:
1700cp, kích thớc hạt 1,7mm, khối lợng phân tử 200 kD
- Siro glucoza: chất khô 80%, đờng khử: 38- 40, tro : 0,6%, Nhiệt độ cháy
140- 150
0
C
- Đờng kính: hàm lợng sacaroza 99,7%, tro : 0,15%, nhiệt độ nóng chảy:
186- 188
0
C
- Mật ong tự nhiên
- Thịt lợn mua ngoài thị trờng
- Các hóa chất cần thiết
2.2.2. Thiết bị sử dụng
- Bể ổn nhiệt: GELmbH.D3006 - Đức sản xuất
- Chiết quang kế - Trung quốc sản xuất
- Máy so màu: UV 1601 Nhật Bản.
- Máy đo độ ẩm: Precisa HA60- Switzerland.

- Nhớt kế brookerfild - Mỹ sản xuất
- Máy đo pH: Thermor Orion, Model 410.
- Tủ sấy
- Máy đo độ chịu nén Hoursfield Siber Hegner
- Máy đo độ dày Milistar
- Máy khuấy
- Bếp điện
- Thiết bị cô chân không

25
- M¸y dËp viªn
- M¸y ®ãng gãi