Tổng quan về fish Vi sinh vật môi trường

I. Tổng quan về FISH
FISH (fluorescence in situ hydridization) – kĩ thuật lai huỳnh quang tại chỗ.
Là sự kết hợp chính xác của phép lai 1 đoạn oligonucleotit ( đầu dị) có gắn
tín hiệu huỳnh quang với 1 trình tự ADN đích đặc trưng
Bằng quan sát trực quan từ kính hiển vi huỳnh quang, các phân tử huỳnh
quang phát sáng với những màu sinh động cho phép hiển thị các đoạn ADN ,
nhiễm sắc thể hay tế bào đích
Có thể nhận dạng, liệt kê và định vị các tế bào sinh vật trong mẫu môi
trường tự nhiên hay trong các mô bệnh phẩm


II. Quy trình thực hiện
FISH dị tìm và phát hiện ra các trình tự acid nucleic của các lồi vi
sinh vật mong muốn bằng cách dùng đầu dò được đánh dấu huỳnh
quang lai đặc hiệu với các trình tự đích đặc hiệu bổ sung với nó bên
trong tế bào nguyên vẹn (không cần phá vỡ tế bào).
1. Chuẩn bị đầu dị:
• lựa chọn đầu dị và lựa chọn thuốc nhuộm huỳnh quang
2. Chuẩn bị mẫu.


 Lựa chọn đầu dị
• Đầu dị: là những
oligonucleotide dài từ
15-30 bp được tạo từ
một thiết bị tổng hợp
tự động, có trình tự bổ
sung với các rRNA 16s
của tế bào sinh vật.
• Xem xét đến tính đặc
hiệu, độ nhạy & khả

năng xâm nhập vào tế
bào


 Lựa chọn đầu dị
• rARN 16S: ổn định về mặt di truyền, số lượng bản sao nhiều và cấu
trúc được bán bảo tồn -> nhận biết và định danh các loài vi sinh vật
trở nên dễ dàng hơn .


 Đánh dấu huỳnh quang


(a) Đánh dấu đầu 5’
(b) gắn các nucleotide đầu 3’
(c) Dùng chất chỉ thị

DIG
TSA

(d) đánh dấu bằng enzym

(e) đầu dò
polyribonucleotide

HRP


Bảng 1: Một số thuốc nhuộm được sử dụng để dị tìm vi sinh vật bằng phương pháp
FISH

Chuẩn bị mẫu
Mẫu chứa vsv &
đầu dò
Chất tạo tủa:
ethanol
(methanol)