5 xét nghiệm vi sinh chẩn đoán lao

13-Sep-18

XÉT NGHIỆM VI SINH
CHẨN ĐOÁN LAO VÀ LAO
KHÁNG THUỐC

1

LOẠI BỆNH PHẨM – THỂ TÍCH
BẢO QUẢN VÀ VẬN CHUYỂN MẪU
2

1


13-Sep-18

 Bệnh

phẩm phải được đảm bảo về chất lượng và
số lượng; được thu thập, vận chuyển và xử lý
đúng cách.
 Tùy theo thể loại bệnh lao mà các loại bệnh
phẩm được thu thập khác nhau:

Loại bệnh phẩm
Đàm

Thể tích
5-10ml (VN: 3-5ml)

Dịch não tủy
Dịch abces
Dịch màng phổi, dịch màng
tim, dịch màng bụng
Dịch dạ dày
Hạch lympho
Dịch rửa phế quản

10ml, càng nhiều càng tốt
10ml, càng nhiều càng tốt
10ml, càng nhiều càng tốt

Nước tiểu
Sinh thiết mô
Phân
Máu
Xương, tủy xương

50ml, càng nhiều càng tốt
1g
≥1g
10ml
100mg, càng nhiều càng tốt
1-3ml bệnh phẩm chọc hút

5-10ml
1 phần hay toàn bộ hạch
≥ 5ml

Infectious diseases- Donald Armstrong, Jonathan

Cohen, 1999

3

4

2


13-Sep-18

% BỆNH PHẨM PHÂN LẬP ĐƯỢC M.tb

THỂ TÍCH DỊCH NÃO TỦY - TỈ LỆ CẤY DƯƠNG

118 BN LMN/HIV âm
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0

57

80

78

6.0-7.9

>8

62

40

0-1.9

2.0-3.9

4.0-5.9

THỂ TÍCH DỊCH NÃO TỦY (ml)

5

Thwaites, G. E., T. T. Chau, and J. J. Farrar. 2004. Improving the bacteriological
diagnosis of tuberculous meningitis. J Clin Microbiol 42:378-9.



Các bệnh phẩm phải được chuyển đến phịng xét nghiệm
ngay lập tức.



Nếu khơng có điều kiện chuyển mẫu ngay (đàm), có thể
giữ mẫu ở 40C trong vịng 3-4 ngày

6

3


13-Sep-18

SỰ PHÁT TRIỂN CÁC TEST
CHẨN ĐOÁN
7

Advances in Diagnostic Assays for Tuberculosis. Cold Spring Harb Perspect Med 2015;5:a017806

4


13-Sep-18

CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN MỚI …


Cần:
 Cho kết quả nhanh
 Cho kết quả chính xác: độ nhạy, đặc hiệu cao
 Test có thể được lưu trữ và thực hiện ở nhiệt độ phịng
 Dễ thực hiện, đơn giản

 Khơng cần trang thiết bị hiện đại, phức tạp
 Rẽ tiền
 Có thể áp dụng rộng rãi ở những nước có mật đô lao cao

10

5


13-Sep-18

11

XÉT NGHIỆM VI SINH
CHẨN ĐỐN LAO

PHƯƠNG PHÁP SOI TÌM AFB
 Được áp

dụng để chẩn đoán và phát hiện lao ở các
nước có gánh nặng về lao với nguồn lực hạn chế
 Dễ thực hiện, chi phí thấp
 Cho kết quả chính xác và nhanh, trong vịng vài giờ.
 Khơng phân biệt vi khuẩn sống hay chết, vi khuẩn
nhạy hay kháng thuốc, MTB hay NTM
 Các phương pháp soi:
 Soi trực tiếp (áp dụng rộng rãi)
 Soi thuần nhất (áp dụng hạn chế)
12

6


13-Sep-18

PHƯƠNG PHÁP SOI TRỰC TIẾP (1)




10.000 vi khuẩn/ml đàm
Độ nhạy: 50 – 80%, Độ đặc hiệu: 98 – 99%
Thu thập 2 mẫu đàm trong 1 ngày, cách nhau 2
giờ

13

Fuchsin 0.3% - 05 phút

Rửa nhẹ dưới vòi nước

NHUỘM
Rửa nhẹ dưới vòi nước

Acid cồn 3% - 03 phút

ZIEHL
NEELSEN

Methylen 0.3% - 1 phút

Rửa nhẹ dưới vịi nước –
Để khơ tự nhiên
14

7


13-Sep-18

PHƯƠNG PHÁP SOI TRỰC TIẾP NHUỘM ZN (2)

Cách đọc và ghi kết quả
0 AFB/100 qt
Âm tính
1 – 9 AFB/100pt
Ghi số cụ thể
10 – 99 AFB/100qt
1+
1 – 10 AFB/qt
2+
>10 AFB/qt
3+


Tỉ lệ phát hiện:
 Đàm 1: 80 – 83%
 Đàm 2: Thêm khoảng 10%
 Đàm 3: Thêm khoảng 5%

Auramine 0.1% - 20 phút

2011
15

Rửa nhẹ dưới vòi nước

NHUỘM
Rửa nhẹ dưới vòi nước

HUỲNH

KMnO4 0.5% - 1 phút

QUANG

Acid cồn 0.3% - 3 phút

Rửa nhẹ dưới vịi nước –
Để khơ tự nhiên
16

8


13-Sep-18

SOI TÌM AFB BẰNG KHV HUỲNH QUANG (3)

NC phân tích tổng hợp

Bệnh phẩm
không xử lý
Bệnh phẩm
đã xử lý

Độ đặc hiệu
(%)

KHV thường

Độ nhạy
(%)
32 - 94

KHV HQ

52 - 97

94 - 100

KHV thường

52 - 94

94 - 100

KHV HQ

63 - 97

94 - 100

94 - 100

17

Lancet Infect Dis, 2006.6(9):p.570-81

SOI TÌM AFB BẰNG KHV HUỲNH QUANG (4)

KHV HUỲNH QUANG LED









Sử dụng đèn LED cực sáng như 1 nguồn sáng phản chiếu, chuyển
ánh sáng thường thành ánh sáng huỳnh quang
Khơng thay bóng đèn
Khơng tạo nhiệt trong q trình sử dụng
Giảm năng lượng tiêu thu
Có thể sử dụng pin
Giảm giá thành
10.000 giờ
Có thể sử dụng nhiều loại thuốc nhuộm (Au/KMnO4; AuRhod/KMnO4; Au/MethBlue)

18

9


13-Sep-18

KHV HQ LED đã được TCYTTG khuyến
cáo sử dụng vào năm 2009 để phát hiện
lao ở các nước có dịch tể lao cao

Chuẩn vàng

Độ nhạy LED-FM

Độ đặc hiệu LED-FM

Cấy

93% (85% - 97%)

99% (98% - 99%)

Soi trực tiếp (ZN)

Tăng 6% (0.1% - 13%) Không thay đổi

Soi huỳnh quang cổ
điển

Tăng 5% (0 – 11%)

Tăng 1% (-0.7% - 3%)

Giảm thời gian đọc tiêu bản còn 50% so với ZN

19

PHƯƠNG PHÁP CẤY






>100 - 1000 vi khuẩn/ml đàm
Vi khuẩn lao tăng sinh tốt trên môi trường trứng chứa
glycerol và asparagine hoặc môi trường lỏng chứa serum
hoặc albumin bò
Tăng tỉ lệ phát hiện khoảng 30 – 50% so với phương
pháp soi
Cho kết quả chậm vì thời gian nhân đôi dài (18-24 giờ):





Phương pháp cấy đặc: 3 tuần – 1 tháng
Phương pháp cấy lỏng: 2 – 3 tuần

Các chủng cấy dương có thể dùng để thực hiện :




Các xét nghiệm định danh
Kháng sinh đồ
Xét nghiệm sinh học phân tử…

20

10


13-Sep-18

PHƯƠNG PHÁP CẤY TRÊN MƠI TRƯỜNG ĐẶC (1)


Được TCYTTG cơng nhận là chuẩn vàng trong chẩn đốn lao



Các loại mơi trường:
 Lưwenstein-Jensen (LJ): mơi trường trứng chứa Glycerol và
Asparagine
 Mơi trường OGAWA : môi trường trứng chứa Glycerol và
sodium glutamate
 Middlebrook 7H10 agar



Qui trình cấy:
 Bệnh phẩm được xử lý với NALC-NaOH hoặc NaOH 2-4%
(ngoại trừ dịch cơ thể vô trùng như dịch não tủy…)
 Cặn lắng của bệnh phẩm đã xử lý được cấy trên môi trường
LJ, ủ ở 35-370C cho đến khi thấy khóm trùng mọc

21

PHƯƠNG PHÁP CẤY TRÊN MƠI TRƯỜNG ĐẶC (2)




Đọc và phân tích kết quả:
 Đọc kết quả hàng tuần
 Thường có kết quả cấy dương sau 3-4 tuần :
 Khóm trùng có màu kem, sần sùi như bơng cải súp lơ
 Khi hịa tan khóm trùng trong nước muối sinh lý sẽ thấy sự
hiện diện của các hạt rất nhỏ
 Quan sát dưới KHV: hình ảnh dây thừng với chiều dài khác
nhau
 Nếu có kết quả cấy dương trong vịng 1 tuần:
 Nhóm vi khuẩn mọc nhanh (Mycobacterium Other Than
Tuberculosis – MOTT hay Nontuberculosis mycobacteriaNTM)
22
 Trả kết quả âm tính sau 8 tuần
Tỉ lệ ngoại nhiễm chấp nhận: 2-3%

11


13-Sep-18

Đọc kết quả

Giải thích

Khơng mọc

Âm tính

1-19 khóm trùng

Dương tính: số cụ
thể

20-100 khóm trùng

Dương tính: 1+

Khóm trùng vi khuẩn lao
trên mẫu cấy dương

100-200 khóm trùng Dương tính: 2+
200-500 khóm trùng Dương tính: 3+
>500 khóm trùng

Dương tính: 4+

Ngoại nhiễm

Ngoại nhiễm

23

Mẫu cấy LJ dương

PHƯƠNG PHÁP CẤY TRÊN MƠI TRƯỜNG ĐẶC (4)


Ưu điểm
 Mơi trường dễ pha chế
 Rẽ tiền
 Vi khuẩn lao mọc tốt trên mơi trường này
 Sau khi pha chế, có thể sử dụng trong vài tuần (giữ
4-80C)
 Mơi trường có chứa malachite green dùng để ức
chế sự phát triển của các tạp khuẩn.



Khuyết điểm
 Thời gian cho kết quả lâu (4-8 tuần)

24

12

13-Sep-18

PHƯƠNG PHÁP CẤY LỎNG TỰ ĐỘNG (1)






Hệ thống BACTECTM MGITTM 960 (Becton Dickinson, Sparks,
MD)
Ưu điểm:
 Vi khuẩn lao mọc và phát triển trên môi trường lỏng nhanh
hơn môi trường đặc
 Độ nhạy cao hơn phương pháp cấy đặc khoảng 10%
 Đọc kết quả bằng máy
 Thời gian cho kết quả nhanh (10-14 ngày)
Khuyết điểm
 Đắt tiền
 Tỉ lệ ngoại nhiễm cao hơn (5-10%)
Năm 2007, TCYTTG khuyến cáo sử dụng phương pháp
cấy lỏng để tăng tỉ lệ phát hiện

25

PHƯƠNG PHÁP CẤY LỎNG TỰ ĐỘNG (2)










MGIT: Mycobacteria Growth Indicator Tube
Tube MGIT chứa Middlebrook 7H9, OADC và PANTA
Đáy tube được phủ 1 lớp silicon chứa muối ruthenium
(ruthenium salt) đóng vai trị như 1 chất phát huỳnh quang.
Bình thường, oxy hiện diện trong mơi trường cấy sẽ che lấp
sự phát quang của muối ruthenium.
Khi vi khuẩn sử dụng oxy để chuyển hóa và tăng sinh trong
môi trường nuôi cấy, lượng oxy trong môi trường sẽ giảm, sự
phát quang ở đáy tube sẽ được nhìn thấy khi xem dưới đèn
UV
26
Cần xác định sự hiện diện của AFB trong mẫu cấy

13


13-Sep-18

ĐỊNH DANH VI KHUẨN LAO (1)
Định danh vi khuẩn lao chủ yếu dựa vào các tính chất sau:
 Vi khuẩn sinh trưởng chậm
 Nhiệt độ sinh trưởng 35 – 370C
 Khơng sinh sắc tố
 Phản ứng Niacin dương tính

 Phản ứng Nitrate dương tính
 Phản ứng catalase dương tính ở 680C, pH 7.0
 Khơng mọc trên mơi trường LJ có chứa 500mg/L pnitrobenzoic acid
 Mọc trên mơi trường có chứa thiophen-2-carboxylic
27
acid hydrazide (2µg/ml TCH)

TEST ĐỊNH DANH MTB

COMPLEX

Phát hiện protein MPT 64 (kháng nguyên) do M.tb complex tiết ra trong
môi trường cấy lỏng

28

JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Dec. 2011, p. 4343–4346

14


13-Sep-18

29

XÉT NGHIỆM VI SINH
CHẨN ĐOÁN LAO KHÁNG THUỐC

PHƯƠNG PHÁP KHÁNG SINH ĐỒ TRÊN MÔI TRƯỜNG ĐẶC (1)


Phương pháp kháng sinh đồ cổ điển: phương pháp tỉ lệ kháng
(proportional DST method)
 Là phương pháp kháng sinh đồ gián tiếp
 Được công nhận là chuẩn vàng trong chẩn đốn lao kháng
thuốc
 Tính chất kháng thuốc được xác định dựa trên tỉ lệ % của
số khóm trùng đếm được ở ống mơi trường có thuốc trên
ống mơi trường khơng thuốc.
 Được khuyến cáo thực hiện ở những bệnh nhân lao/nghi lao
kháng thuốc: BN bỏ trị, thất bại điều trị, tái trị, HIV…
 Rẽ tiền
30
 Thời gian có kết quả từ 28 – 42 ngày kể từ khi có kết quả
cấy dương tính

15


13-Sep-18

PHƯƠNG PHÁP KHÁNG SINH ĐỒ TRÊN MÔI TRƯỜNG ĐẶC (1)
Thuốc kháng lao hàng 1

Thuốc kháng lao hàng 2

INH
Streptomycin
Rifampicin
Ethambutol

Ofloxacin
Amikacin
Ethionamide
Kanamycin
PAS
Capreomycin

PZA: Phương pháp Wayne: positive: nhạy (có pyrazinamidase)
pyrazinamidase/MTB (pncA gene)
PZA (prodrug)

Pyrazinoic acid (POA)
dạng hoạt động của PZA, diệt MTB 31
Jonmalung et al. BMC Microbiology 2010, 10:223

PHƯƠNG PHÁP KHÁNG SINH ĐỒ TRÊN MÔI TRƯỜNG ĐẶC (3)



Giải thích kết quả: vd: với tỉ lệ kháng 1%



Nếu tỉ lệ này <1%: chủng nhạy
Nếu tỉ lệ này≥1%: chủng kháng



32

16


13-Sep-18

BACTECTM MGITTM 960 SIRE/PZA
 Kháng

sinh đồ gián tiếp
 Cơ chế hoạt động của máy tương tự MGIT 960
 Một bệnh phẩm: Ống control
Ống INH 0.1g/ml
Ống RIF 1g/ml
Ống STR 1g/ml
Ống EMB 1g/ml
 Máy tự so sánh độ phát quang đo được ở ống thuốc so
với ống không thuốc để xác định sự nhạy/kháng thuốc
33
 Máy tự động phân tích và báo kết quả

LINE PROBE SSAY – LPA
GENOTYPE MTBDR-PLUS (1)
 Xét

nghiệm sinh học phân tử
 Phát hiện M.tb complex trực tiếp từ mẫu đàm hoặc từ
mẫu cấy dương
 Phát hiện chủng kháng INH (đột biến gen katG và
inhA)

 Phát hiện chủng kháng RIF (đột biến trên gen ropB)
trực tiếp từ mẫu đàm
 Thời gian cho kết quả trong vòng 24 giờ
34

17


13-Sep-18

Genotype®MTBDRplus – Version 1 (2)
Mẫu đàm soi dương:
Nhạy – RIF : 98.9%
Đặc hiệu – 99.4%
Nhạy– INH: 94.2%
Đặc hiệu – INH: 99.7%
Mẫu đàm soi âm
Khơng giải thích được
kết quả:
RIF: 20% (n=4/20)
INH: 26% (n=5/19)

35

Barnard, Am J Respir Crit Care
Med, 2008

GENOTYPE®MTBDRPLUS (3)

Năm 2008, TCYTTG khuyến cáo:

Áp dụng test SHPT này trong chẩn đoán sớm lao đa
kháng
 Chỉ áp dụng cho mẫu đàm soi dương hoặc mẫu cấy
dương
 Khơng thể thay thế hồn tồn các phương pháp cấy
và kháng sinh đồ cổ điển


36

18


13-Sep-18

XPERT MTB/RIF (1)

 Hệ

thống khép kính
 Xét nghiệm trực tiếp từ mẫu đàm
 Phát hiện vi khuẩn lao và vi khuẩn lao kháng RIF
 Có kết quả trong 90 phút
 Tăng tỉ lệ phát hiện khoảng 30% so với phương pháp soi
37
 Sử dụng tại tuyến cơ sở

XPERT MTB/RIF (2)
Độ nhạy
Cấy (+)

3 mẫu đàm
n=x/y
723/741
(%)
(97.6)
2 mẫu đàm
n=x/y
1423/1482
(%)
(96.0)
1 mẫu đàm
n=x/y
675/732
(%)
(92.2)

Đặc hiệu

Soi (+) /cấy (+) Soi (-)/cấy(+) Không lao
566/567
(99.8)

157/174
(90.2)

604/616
(98.1)

1127/1134
(99.4)

296/348
(85.1)

1215/1232
(98.6)

551/561
(98.2)

124/171
(72.5)

604/609
(99.2
38

Catharina C Boehme et al. NEJM,
2010

19


13-Sep-18

Năm 2010 - 2011, TCYTTG khuyến cáo:
 Ưu tiên áp dụng Xpert MTB/RIF trong chẩn đoán sớm
lao và lao đa kháng, ở các đối tượng:
 Có nguy cơ mắc lao đa kháng
 Bệnh nhân HIV(+) có triệu chứng nghi ngờ mắc lao

hoặc lao đa kháng
 Có thể áp dụng để chẩn đốn lao ở những bệnh nhân có39
triệu chứng nghi lao nhưng khơng thuộc nhóm ưu tiên

40

20


13-Sep-18

TRIỂN KHAI ÁP DỤNG KỸ THUẬT …


KHV huỳnh quang LED: Thay thế KHV đèn
sáng và KHV huỳnh quang cổ điển



Kỹ thuật SHPT (LPA): Chuẩn vàng, không thể
loại bỏ pp cấy và kháng sinh đồ cổ điển



Xpert MTB/RIF: Thay thế cho phương pháp soi.

Xpert MTB/RIF khơng thể loại bỏ hồn tồn sự cần thiết
của các pp soi, cấy và LPA trong tương lai gần 41

21

13-Sep-18



Xét nghiệm dựa trên sự phát hiện kháng nguyên mycobacterial
lipoarabinomannan (LAM) antigen trong nước tiểu



Xét nghiệm thực hiện trên mẫu nước tiểu nên có ưu điểm hơn
so với xét nghiệm thực hiện trên mẫu đàm vì mẫu nước tiểu dễ
thu thập và lưu trữ, và khơng có các nguy cơ kiểm soát nhiễm
khuẩn liên quan đến thu thập mẫu đàm.



Kháng nguyên LAM là một lipopolysaccharide hiện diện
trong thành phần màng tế bào của mycobacterial, được giải
phóng trong q trình chuyển hóa hoặc phân hủy tế bào vi
khuẩn.



LAM được tìm thấy nổi bật ở những người đang mắc lao; và
có phản ứng chéo thấp với nhiễm mycobacteria không lao.



Sự hiện diện của LAM trong nước tiểu có liên quan gián
tiếp đến đáp ứng miễn dịch của người; và quá trình phát
hiện nó có đóng góp vào việc phá triển các test POC có
chi phí khơng đắt.



Có độ nhạy chưa đạt u cầu, test LAM nước tiểu hiện
tại khơng thích hợp để sàng lọc lao. Tuy nhiên, không
giống các phương pháp chẩn đốn lao khác, nó có độ
nhạy được cải thiện ở nhóm HIV/Lao và cải thiện hơn
nữa nếu CD4 thấp.
44

22


13-Sep-18

1.

Ngoại trừ những trường hợp đặc biệt được nêu dưới đây đối
với người nhiễm HIV có CD4 thấp hoặc những người bệnh
rất nặng, LF-LAM khơng được dùng để chẩn đốn lao
(khuyến cáo mạnh, bằng chứng có chất lượng thấp).

2.

LF-LAM có thể được dùng để hỗ trợ chẩn đoán lao ở bệnh
nhân người lớn ngoại trú nhiễm HIV có các triệu chứng của

lao (lao phổi/lao ngồi phổi) và có CD4 ≤ 100 cells/μL, hoặc
người nhiễm HIV có bệnh rất nặng bất kể CD4 là bao
nhiêu/không biết số lượng CD4 (khuyến cáo có điều kiện,
bằng chứng có chất lượng thấp).

Lưu ý:
 Khuyến cáo này cũng áp dụng đối với BN HIV ngoại
trú có triệu chứng mắc lao (LP/LNP) có CD4 ≤100
cells/μL, hoặc người nhiễm HIV có bệnh rất nặng bất kể
CD4 là bao nhiêu/khơng biết tình trạng CD4, dựa trên
khái qt kết quả của BN nội trú.
 Khuyến cáo này cũng áp dụng đối với BN HIV trẻ em
có triệu chứng mắc lao (LP/LNP) , dựa trên khái quát kết
quả của BN người lớn.
3.

LF-LAM không được dùng làm test sàng lọc lao
(khuyến cáo mạnh, bằng chứng có chất lượng thấp )

46

23


13-Sep-18

WHO 2015, FL-LAM. Policy Guidance

24

13-Sep-18

(02 mẫu cấy âm trên 2 mẫu đàm khác nhau)

(02 mẫu cấy âm trên cùng mẫu đàm hoặc khác mẫu đàm)

Có ít nhất 01 mẫu cấy âm

25