4 định trình tự chuỗi

ĐỊNH TRÌNH TỰ CHUỖI
(DNA SEQUENCING)
ThS. Nguyễn Kim Thạch
BM. Hóa Sinh – Sinh Học Phân Tử
Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch

E-mail:
1


Định trình tự chuỗi DNA là quá trình (kỹ thuật) xác định cụ thể trình
tự các nucleotide của đoạn DNA đang quan tâm.


SEQ CĨ VAI TRỊ QUAN TRỌNG

Nghiên cứu gen
& bộ gen

GENOMICS

HUMAN GENOME PROJECT
2003
> 30.000 GENES

GENETICS


SEQ CĨ VAI TRỊ QUAN TRỌNG

Hỗ trợ các kỹ

thuật liên quan
đến gen &
protein

RECOMBINANT DNA

THUỐC
VACCINE

MONOCLONAL
ANTIBODY


SEQ CĨ VAI TRỊ QUAN TRỌNG

Tham gia chẩn
đốn các biến
đổi trên gen

SNP

ĐỘT BIẾN LIÊN QUAN ĐẾN
MỘT / VÀI NUCLEOTIDE
POLYMORPHISM

INDIVIDUAL
MEDICINE


Các dạng đa hình trong gen

Genome trong khảo cổ học
• Sự phân hủy của mẫu thu thập  mitDNA sequencing
• Bộ genome nhân của mẫu cổ vật: cave bear, mammoth, Neanderthal (106 bp )


XÁC ĐỊNH KIỂU GEN CỦA HPV

HPV

HPV

TYPE 6, 11,…

TYPE 16, 18,…

CTC bình thường

Ung thư CTC


XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN TRÊN BCR-ABL/CML


XÁC ĐỊNH ĐỘT
BIẾN TRÊN
BCR-ABL/CML

KỸ THUẬT SEQ
SANGER METHOD


KỸ THUẬT SEQ
NEXT GENERATION


FREDERICK SANGER

Nobel 1958
Định trình tự protein (INSULIN)

Nobel 1980
Định trình tự chuỗi acid nucleic (X176)


PHƯƠNG PHÁP SANGER

PCR
VỚI 1 ĐOẠN MỒI

DIDEOXYNUCLEOTIDE CÓ GẮN
HUỲNH QUANG

Phương pháp Sanger


NHĨM –OH Ở VỊ
TRÍ 3’ CẦN THIẾT

CHO SỰ KÉO DÀI
CHUỖI CỦA DNA
POLYMERASE


5’

Gắn kết thông thường

P
1
R
5’
P
1
2
ddNTP R
3’
P
OH
R
5’
2P
PO4
A
R
P
Liên kết Phosphodiester
2
R

P
3’ H H
R
dideoxynuceotide

Không gắn tiếp

A
Terminated

3

4

5

6

3’


DIDEOXYNUCLEOTIDE NGĂN CẢN
VIỆC KÉO DÀI CHUỖI TRONG PCR


QUY TRÌNH KỸ THUẬT SEQ
1. Thực hiện PCR (1 đoạn mồi + dideoxynucleotides)
2. Tinh lọc sp PCR
3. Thực hiện điện di và đọc kết quả

SP PCR TRONG SEQ

dNTPs
C G
T A

DNA ĐÍCH

ddNTPs
C

TCAGGTGACCTAGCGTGACCGTGACGTGTG

A
T

ĐOẠN MỒI

AGTCCACTGG

Polymerase

TCAGGTGACCTAGCGTGACCGTGACGTGTG
AGTCCACTGGAT
TCAGGTGACCTAGCGTGACCGTGACGTGTG
AGTCCACTGGATCG

TCAGGTGACCTAGCGTGACCGTGACGTGTG
AGTCCACTGGA

TCAGGTGACCTAGCGTGACCGTGACGTGTG
AGTCCACTGGATC

G



Các mãnh DNA sai khác nhau
1 nucleotide được phân tách
trên gel đện di
32P
32P
32P
32P

32P
32P
32P
32P

ATCGATCGAT
ATCGATCGA
ATCGATCG
ATCGATC
ATCGAT
ATCGA
ATCG
ATC

32P

AT

32P

A

Điện di gel Polyacrylamide
T

A

G

C

G
C
T
A


SẢN PHẨM PCR TRONG SEQ

Sp PCR là tập hợp các đoạn
khác nhau 1 nucleotide.


ĐIỆN DI SP PCR TRONG SEQ

ĐOẠN MỒI

5’

3’


Genotyping of HCV
Why do we need?


5-10%

Vietnam is in the high
prevalence of HCV infection
Source: HepNet-Hepatitis Information Network Author: Schering-Plough