XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTID VÙNG SIÊU BIẾN I Ở NGƯỜI VIỆT NAM

XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTID VÙNG SIÊU BIẾN I Ở NGƯỜI VIỆT NAM
Trần Mỹ Linh, Vũ Thị Thư, Phan Minh Tuấn, Lê Quang Huấn, Lê Trần Bình
Viện Công nghệ sinh học
GIỚI THIỆU
ADN của hệ gen ty thể ở người có 16 569 cặp bazơ với 2 vùng chính: vùng mã hoá và vùng điều
khiển (Anderson, 1981). Vùng mã hoá mang thông tin di truyền cho các phân tử sinh học khác
nhau tham gia vào quá trình tạo năng lượng của tế bào (13 gen mã hoá cho các phân tử protein, 22
gen mã hoá cho tRNAs và 2 gen mã hoá cho rRNA), vùng điều khiển chịu trách nhiệm điều khiển
phân tử mtADN (Parsons et al, 1997; Hagelberg et al. 1987; Lee et al. 1999). Trong vùng điều
khiển lại chứa 2 vùng biến đổi có sự khác nhau rất lớn trong quần thể (Greenberg et al. 1983),
chúng được gọi là vùng siêu biến I (342 cặp bazơ) và vùng siêu biến II (268 cặp bazơ). ADN có
tính bảo thủ cao trong các thế hệ do chúng được cấu tạo dạng mạch vòng nên ít chịu sự tác động
của các tác nhân gây đột biến, hơn nữa không có hiện tượng tái tổ hợp như ADN nhân vì chúng
chỉ có một bản sao từ mẹ (Case and Wallace 1981; Giles et al. 1980). Mặt khác, ADN ty thể lại có
sự đa hình cao nhờ sự có mặt của 2 vùng siêu biến (Budowle et al. 1999, Kalmar at al. 2000).
Các công trình nghiên cứu gần đây cho thấy thông tin của hệ gen ty thể không chỉ giúp ta xác định
mối quan hệ huyết thống mà còn giúp ta xác định đặc trưng di truyền ngoài nhân của mỗi dân tộc,
mỗi bộ tộc ở các vùng địa lý khác nhau. Đặc trưng di truyền này có sự liên quan như thế nào tới
tần suất xuất hiện các bệnh hiểm nghèo (như các bệnh ung thư , các bệnh về gen ...) của các dân
tộc đã và đang được các nhà nghiên cứu quan tâm nhằm xác định mối liên quan trực tiếp của
chúng, giúp cho việc phòng ngừa và điều trị có hiệu quả các căn bệnh nan y.
Hiện nay, chúng ta chưa có nghiên cứu nào về hệ gen ty thể của các dân tộc sinh sống trên lãnh thổ
Việt Nam. Chính vì vậy, để góp phần xây dựng hướng nghiên cứu mới, trong bài này chúng tôi
trình bày những kết quả đầu tiên trong việc xây dựng phương pháp nghiên cứu vùng siêu biến I
trong ADN ty thể của người Việt Nam.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Vật liệu
ADN ty thể được tách chiết từ các mẫu tóc, máu của người khoẻ mạnh. Cặp mồi nhân đoạn gen
vùng siêu biến I trong D-loop: LOOP460F: 5’- CTCCACCATTAGCACCCAAAGC-3’,
LOOP460R: 5’-CAC GGAGGATGGTGGTCAAG-3’ đặt của hãng Pharmacia Biotech. Vector
pCR


2.1, của hãng Invitrogen. Các enzim hạn chế EcoR I, enzim T4 ligaza của hãng New England
Biolabs, các hoá chất khác sử dụng trong thí nghiệm đều là những hoá chất tinh khiết của các hãng
Sigma và Merck.
Phương pháp tách chiết ADN từ các mẫu máu
ADN thu được từ các mẫu máu đã chống đông bằng EDTA theo quy trình dưới đây có độ tinh
sạch cao và có thể sử dụng cho các thí nghiệm về sinh học phân tử như PCR, cắt enzym hạn chế...
1. Mẫu máu (1ml) máu trộn đều với đệm SSC (0,8 ml), ly tâm 12 000 vòng/phút thời gian 1
phút. Loại bỏ dịch ly tâm.
2. Thêm 1ml đệm SSC, vortex, sau đó ly tâm như trên và loại bỏ hoàn toàn dịch ly tâm.
3. Thêm 375 µl 0,2M NaOAc, vortex, sau đó thêm 25µl SDS 10% và 5 µl proteinase K
(20mg/ml H
2
O), vortex, ủ 1 giờ ở 55
0
C.
4. Thêm 120 µl phenol:chloroform:isoamylalcohol (25:24:1), vortex, ly tâm 2 phút, tốc độ 12
000 vòng/phút. Hút lớp nước phía trên vào ống mới, thêm 1ml cồn 100% lạnh, ủ ở –20
0
C, 15 phút.
5. Ly tâm 2 phút, tốc độ 12 000 vòng/phút, làm khô mẫu 5 phút.
6. Thêm 180 µl TE, vortex và ủ 55
0
C trong 10 phút. Sau đó thêm 20 µl 2M Sodium acetate, trộn
đều, thêm 500 µl ethanol 100% lạnh, ly tâm 12000 vòng/phút thời gian10 phút.
7. Loại bỏ dịch ly tâm, rửa chất tủa với 1ml cồn 80%, ly tâm 1 phút với tốc độ 12 000
vòng/phút.
8. Hoà mẫu ADN thu được trong 200 µl TE, ủ qua đêm ở 55
0
C. Sau đó bảo quản ở –20

0
C.
Phương pháp tách chiết ADN từ các mẫu tóc
1. Các sợi tóc được rửa sạch bằng cồn sau đó bằng nước cất.
2. Cắt ngắn các sợi tóc, ủ với đệm chiết qua đêm ở 56
0
C (Đệm chiết gồm 10 mM Tris, 100 mM
NaCl, 39 mM DTT, 10 mM EDTA and 2% SDS, proteinase K, 10µg/ml).
3. Chiết 1 lần với phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25:24:1), 2 lần với chloroform.
4. Dịch chiết chứa ADN được cô đặc trong ống Microcon-100 (Amicon).
Nhân đoạn gen vùng siêu biến và xác định trình tự
Nhân đoạn gen vùng siêu biến được tiến hành với cặp mồi LOOP460F/ LOOP460R và chu trình
nhiệt như sau: 94
0
C-3 phút và 35 chu kỳ ( 94
0
C-30 giây, 56
0
C-1 phút, 68
0
C-1 phút 30 giây), ổn
định 8 phút ở 72
0
C và kết thúc ở 4
0
C. Sản phẩm PCR được gắn trực tiếp vào vector pCR

2.1, sau
đó plasmid tái tổ hợp được biến nạp vào vi khuẩn E.coli chủng DH5α. Các kỹ thuật tách chiết
ADN plasmid và ADN tái tổ hợp được tiến hành theo Sambrook và cộng sự [10]. Trình tự đoạn

gen vùng siêu biến I được Công ty “BIOSERVICE UNIT”, Bangkok, Thailand xác định theo
phương pháp của Sanger.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Tách chiết ADN tổng số từ các mẫu tóc và máu
ADN tổng số từ các mẫu máu và mẫu tóc của người được tách theo phương pháp như đã trình bầy
ở phần phương pháp có độ tinh sạch cao khi kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% (Hình 1).
Hình 1: Điện di đồ các mẫu ADN trên gel agarose 0,8%
Kênh 1: Mẫu ADN tách từ tóc.
Kênh 2: Mẫu ADN tách từ máu
Để phân lập và tách dòng đoạn gen vùng siêu biến I chúng tôi đã thiết kết cặp mồi dựa trên trình tự
gen ty thể đã được công bố trong Ngân hàng gen quốc tế. Thành phần phản ứng PCR ngoài các
thành phần cơ bản như ADN khuôn, cặp mồi LOOP460F/ LOOP460R, Taq ADN-polymeraza,
dNTP còn có muối MgCl2 và chu trình nhiệt như sau: 94
0
C-3 phút và 35 chu kỳ ( 94
0
C-30 giây,
56
0
C-1 phút, 68
0
C-1 phút 30 giây), ổn định 8 phút ở 72
0
C và kết thúc ở 4
0
C.
Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agaroza 1 %. Kết quả được trình bầy trên hình
2.
Hình 2: Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 1%
Kênh 1: Chỉ thị phân tử ADN

Kênh2: Sản phẩm PCR từ mẫu tóc
Kênh3: Sản phẩm PCR từ mẫu máu
Tách dòng đoạn gen vùng siêu biến I
Sản phẩm PCR không cần phải qua một bước tinh chế nào mà được sử dụng trực tiếp cho phản
ứng gắn với vector tách dòng: trộn sản phẩm PCR (1µl) với vectơ pCR

2.1 (1µl), ủ qua đêm ở
14
0
C để sản phẩm PCR gắn vào vector. Sau đó được biến nạp vào tế bào vi khuẩn E. coli chủng
DH5α. Nhờ bộ máy tổng hợp của tế bào vi khuẩn, plasmit được tạo ra với một số lượng lớn các
bản sao.
Sau khi biến nạp, các tế bào vi khuẩn E. coli chứa vectơ tái tổ hợp được cấy trải trên môi trường
thạch LB có bổ sung ampicillin, IPTG, X-gal. Trong môi trường chọn lọc này, theo lý thuyết thì
các khuẩn lạc E. coli mang vector tái tổ hợp sẽ có màu trắng trong khi đó các khuẩn lạc mang
vector pCR

2.1 gốc (không đính thêm đoạn ADN ngoại lai) sẽ có màu xanh. Các khuẩn lạc biến
nạp đã chọn được nuôi qua đêm để tách ADN plasmit, kết quả tách chiết ADN plasmit được trình
bầy trên hình 3.
Hình 3: Kết quả tách ADN plasmit các khuẩn lạc biến nạp
Kênh 1: Mẫu ADN plasmit đã được xử lý RNase
Kênh 2-5: : Mẫu ADN plasmit chưa xử lý RNase
Để khẳng định kết quả gắn sản phẩm PCR vào vector chúng tôi đã cắt kiểm tra ADN plasmit với
enzym cắt hạn chế EcoR I. Kết quả phản ứng cắt với enzym hạn chế được kiểm tra bằng điện di
trên gel agarose 0,8% (hình 4).
Hình 4: Kết quả kiểm tra phản ứng cắt ADN plasmit với enzym hạn chế EcoR I
trên gel agarose 0,8%
Kênh 1: ADN plasmit chưa cắt với enzym hạn chế EcoR I
Kênh 2, 3: ADN plasmit của các khuẩn lạc khác nhau cắt với enzym hạn chế EcoR I

Kênh 4: Sản phẩm PCR trước khi gắn vào vector
Kênh 5: Chỉ thị phân tử ADN
Xác định trình tự đoạn gen vùng siêu biến I
ADN plasmit sau khi được kiểm tra và khẳng định đã được gắn sản phẩm PCR được gửi cho
“BIOSERVICE UNIT”, Bangkok, Thailand để xác định trình tự. Kết quả xác định trình tự
nucleotid sản phẩm PCR từ mẫu máu người Việt nam (sản phẩm PCR từ mẫu tóc chưa gửi xác
định trình tự) như sau:
So sánh trình tự nucleotid của sản phẩm PCR mà chúng tôi thu được với trình tự vùng siêu biến
trong mtADN đã được Anderson, 1981 công bố chúng tôi thu được kết quả như sau: