điều tra, nghiên cứu tảo độc gây hại ở một số vùng nuôi trồng thuỷ sản tập trung ven biển, đề xuất giải pháp phòng ngừa, giảm thiểu những tác hại do chúng gây ra - một số kết quả nghiên cứu sinh học tảo độc biển trong điều ki

Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Viện Công nghệ môi trờng
______________________________







Báo cáo đề tài nhánh:
Một số kết quả nghiên cứu
sinh học tảo độc biển trong điều kiện
phòng thí nghiệm

Chủ nhiệm: TS. NCVC. Trần Văn Tựa


Thuộc Đề tài cấp nhà nớc:


Điều tra, nghiên cứu tảo độc, tảo gây hại ở một số vùng nuôi trồng thuỷ
sản tập trung ven bờ, đề xuất giải pháp phòng ngừa, giảm thiểu những tác
hại do chúng gây ra.

6132-22
02/10/2006




Phòng Thuỷ sinh học môi trờng, 12/2005

2


Báo cáo đề tài nhánh
Một số kết quả nghiên cứu sinh học tảo độc biển trong điều kiện
phòng thí nghiệm

1. Chủ nhiệm:
TS. NCVC. Trần Văn Tựa
2. Thuộc Đề tài:
Đ
iều tra, nghiên cứu tảo độc, tảo gây hại ở một số vùng nuôi trồng thuỷ sản tập
trung ven bờ, đề xuất giải pháp phòng ngừa, giảm thiểu những tác hại do chún
g
g
ây ra.
3. Đơn vị thực hiện: Phòng Thuỷ sinh học môi trờng, Viện Công nghệ môi trờng
4. Thời gian thực hiện: 2004 - 2005
5. Nội dung nghiên cứu:
- Tìm môi trờng nuôi thích hợp cho một vài loài tảo độc hại trong phòng th
í

nghiệm.
- Đánh giá ảnh hởng của một số yếu tố môi trờng lên sinh trởng và phát
triển của tảo.
- Thử độc tính bằng phép thử sinh học với Artemia và phơng pháp ELISA.
Đây cũng là hợp đồng nghiên cứu số 06/HDH-HĐ giữa Viện Công nghệ môi
trờng và Phân viện Hải dơng học Hải Phòng ( nay là Viện sinh thái và tài nguyên
biển ).
6. Kết quả nghiên cứu:











3



I. Mở đầu


Tảo độc hại đã và đang gây ảnh hởng lớn đến các hệ sinh thái nớc bao
gồm nớc ngọt và nớc mặn, đặc biệt nghiêm trọng khi chúng bùng phát sinh
trởng với mật độ cao. Tảo độc hại đã làm thiệt hại lớn cho nuôi trồng thuỷ sản,
ảnh hởng xấu đến môi trờng cũng nh sức khoẻ con ngời. Đáng chú ý là một số

loài tảo gây hại ngay ở mật độ rất thấp do độc tố của chúng.
Các nớc phát triển nh Nhật Bản, Canađa, Mỹ, Australia, các nớc thuộc
khối EU ( 8,9,11,12, 13 ), vấn đề tảo độc hại đã đợc quan tâm nghiên cứu từ vài
chục năm gần đây trong khi đó ở Việt Nam trong mời năm gần đây mới tiến hành
nghiên cứu vấn đề này. Một số đề tài, dự án trong nớc và hợp tác quốc tế đã đựơc
tiến hành và kết quả đã đa ra danh mục thành phần loài tảo gây hại ven biển Việt
nam và sự biến động của chúng ở một số địa điểm nghiên cứu. Đây là những kết
quả rất quan trọng và có ý nghĩa cả khoa học và thực tiễn (3). Tuy nhiên do nhiều
nguyên nhân, nghiên cứu mới chỉ đi sâu vào phân loại và phân bố của tảo độc,
những nghiên cứu thực nghiệm tìm hiểu về ảnh hởng môi trờng tới sự phát triển
của tảo độc hại cũng nh cơ chế bùng phát của chúng còn rất ít ỏi.
Để góp phần vào những nghiên cứu thực nghiệm về sinh lý sinh thái học của
tảo độc hại, trong khuôn khổ của đề tài KC-09-19 " Điều tra, nghiên cứu tảo độc,
tảo gây hại ở một số vùng nuôi trồng thuỷ sản tập trung ven bờ, đề xuất giải
pháp phòng ngừa, giảm thiểu những tác hại do chúng gây ra" thuộc chơng trình
điều tra cơ bản và nghiên cứu ứng dụng công nghệ biển KC-09, Phòng Thuỷ sinh
học môi trờng, Viện Công nghệ môi trờng đã tiến hành một số nội dung nghiên
cứu sau:
Tìm môi trờng nuôi thích hợp cho một vài loài tảo độc hại trong phòng thí
nghiệm.
Đánh giá ảnh hởng của một số yếu tố môi trờng lên sinh trởng và phát
triển của tảo.
Thử độc tính bằng phép thử sinh học với Artemia và phơng pháp ELISA.
Đây cũng là hợp đồng nghiên cứu số 06/HDH-HĐ giữa Viện Công nghệ môi tr
-
ờng và Phân viện Hải dơng học Hải Phòng ( nay là Viện sinh thái và tài nguyên
biển ).


II. Đối tợng, thiết bị và phơng pháp nghiên cứu

II.1. Đối tợng nghiên cứu

Đối tợng nghiên cứu là 3 loài tảo biển tiềm tàng độc hại trong đó loài
Prorocentrum sp. thuộc họ Prorocentraceae, bộ Prorocentrales, ngành tảo giáp
(Dinophyta) và loài tảo Alexandrium sp. thuộc họ Goniodomaceae, bộ
Gonyaulacales, ngành tảo giáp (Dinophyta). Loài Pseudonitzschia sp. thuộc họ

4
Nitzshiaceae, bộ Pennales ngành tảo silic ( Bacillariophyta ). Các mẫu này chúng
tôi nhận đợc từ Phân Viện Hải dơng học Hải Phòng (thuộc Viện Khoa học và
công nghệ Việt Nam) với các kí mã hiệu Pro. sp3: CB 111104, Alex sp12 : DS
181204 và Pseudo sp18 : CB 211004.

II.2. Thiết bị

Ngoài các dụng cụ thí nghiệm thông
thờng, chúng tôi còn sử dụng một số thiết
bị chuyên dụng sau:
Kính hiển vi OLYMPUS BX51,
OLYMPUS SZX12.
Buồng đếm tế bào Sedgwick-Refter .
Tủ nuôi cấy.
Tủ cấy vô trùng (Biograph II).
Máy siêu âm Branson 1210.
Máy siêu âm B. Braun Labsonic

U.
Giấy lọc GF/C (Glass microfbre
filter) của hãng Whatman.

Máy đo cờng độ ánh sáng
(Luxmeter)
Máy Vortex ( nhãn hiệu OSI ).
Máy ly tâm Centrifuge 5415 C.

II.3. Phơng pháp nghiên cứu

II.3.1. Phơng pháp nuôi giữ giống tảo

Tảo đợc lu giữ trong các bình tam
giác 50 ml chứa 25 ml môi trờng dinh
dỡng . Môi trờng giữ giống cho 2 loài tảo
Prorocentrum sp. và Alexandrium sp. là
môi trờng IMK. Các bình nuôi đợc đậy kín bằng nút bông có phủ giấy bên ngoài
và đợc đặt trong tủ nuôi cấy có nhiệt độ ổn định ở 251
o
C, cờng độ ánh sáng
(CĐAS) là 500 lux, chu kỳ sáng tối là 12h/12h. Sau một thời gian nhất định (tuỳ
loại tảo), chúng tôi sẽ tiến hành cấy lại vào các bình mới . Môi trờng nuôi cấy
đợc khử trùng và chuẩn bị riêng ( xem phần môi trờng )



II.3.2. Quan sát hình thái tế bào tảo.

Hình thái tế bào đợc quan sát dới kính hiển vi OLYMPUS BX51 ở độ
phóng đại 40x và 1000x , có chụp ảnh. Sử dụng trắc vi thị kính và trắc vi vật kính
để đo kích thớc tế bào tảo.

II.3.3. Phơng pháp định lợng tảo.

ảnh 1: Buồng nuôi cấy tảo


5
Đếm số tế bào bằng buồng đếm Sedgwick-Refter . Buồng đếm đợc chia
làm 1000 ô , mỗi ô có chiều dài x chiều rộng x chiều cao là 1mm x1mm x1mm.
Nh vậy cả buồng đếm có thể tích 1ml. Số tế bào trên một ml mẫu đợc xác định
theo công thức:

Trong đó:
C: Số tế bào đếm đợc .
A: Diện tích của một ô đếm (1mm
2
)
D: Chiều cao của một ô đếm.
F: Số ô đếm.
Nếu mẫu đợc pha loãng với n lần thì số tế bào trên
1ml mẫu sẽ là:

Để đảm bảo độ chính xác, số ô cần đếm tối thiểu là 200 ô.

II.3.4. Phơng pháp bố trí thí nghiệm

Buồng nuôi cấy tảo là một tủ gồm ba tầng. Chu kì sáng tối 12h/12h. Nhiệt độ
trong buồng nuôi thí nghiệm đợc giữ ổn định ở 25 1
0
C. Chu kì sáng tối và nhiệt độ
đợc điều khiển bằng rơle thời gian và rơle nhiệt.

Tảo đợc nuôi trong các bình tam giác thuỷ tinh có thể tích 100ml. Bình đợc
rửa sạch và khử trùng ớt ở nhiệt độ 121
0
C trong thời gian 30 phút, sau đó khử
trùng khô ở nhiệt độ 60
0
C và 30 phút. Khi thí nghiệm mỗi bình cho 25-50 ml dịch
tảo có mật độ tế bào khác nhau tuỳ thí nghiệm. Mỗi công thức lặp lại 3 lần. Các thí
nghiệm đều tiến hành ở cùng điều kiện ánh sáng là 3000 lux và 25 1
0
C. Riêng thí
nghiệm về ảnh hởng của cờng độ chiếu sáng khác nhau, các bình nuôi tảo đợc
bố trí ở các khoảng cách khác nhau so với nguồn sáng để tạo sự chênh lệch. Cờng
độ sáng cụ thể đợc xác định bằng máy đo cờng độ ánh sáng ( Luxmeter ).
Tất cả các bình tảo thí nghiệm đều đợc lấy mẫu hàng ngày hoặc 2 ngày
/lần. Mỗi lần lấy 0,5 ml, cho vào lọ nhựa, cố định mẫu bằng vài giọt foocmon và
xác định mật độ tế bào bằng phơng pháp đếm trên kính hiển vi ở độ phóng đại
20x.
Để đánh giá các yếu tố thí nghiệm có ảnh hởng thật sự lên sinh trởng của
các loài tảo thí nghiệm hay không, chúng tôi đã tiến hành kiểm tra theo phơng
pháp phân tích ANOVA.

II.3.5. Môi trờng thí nghiệm

Để chọn môi trờng thích hợp cho nuôi tảo chúng tôi dùng các môi trờng
khác nhau nh : IMK, EM, F2, K, L
1
( 12, 13, 14 ) để tiến hành thí nghiệm.

Pha môi trờng nuôi tảo theo các công thức sau:

6

Thành phần môi trờng EM (Rosowski and Parke. 1971)

Thành phần 1000ml nớc biển lọc
NaNO
3
0,2 g
Na
2
HPO
4.
7H
2
O 0,03 g
Na
2
EDTA 750 mg
Thiamine 1 mg
Dung dịch vi lợng 12 ml
pH 7,5 -7,7

Thành phần dung dịch vi lợng môi trờng EM

Thành phần 1000 ml nớc cất
FeCl
3.
6H
2

O 97 mg
MnCl
2
.4H
2
O 41 mg
ZnCl
2
. H
2
O 5 mg
CoCl
2
.6H
2
O 5 mg
Na
2
MoO
4.
2H
2
O 4 mg

Nớc biển đợc lọc bằng giấy lọc GF/C
Môi trờng và dung dịch vi lợng đợc khử trùng ở 1,02 atm và 120
0
C trong
thời gian 15 phút trớc khi bổ sung vitamin để sử dụng nuôi cấy.

Thành phần môi trờng F2 (Guillard and Ryther, 1962) (13)

Thành phần 1000ml nớc biển lọc
NaNO
3
75 mg
Na
2
HPO
4.
7H
2
O 5 mg
Na
2
SiO
3.
9H
2
O 30 mg
Thiamine HCl
100 àg
Biotine
0,5 àg
Vitamin B12
0,5 àg
Dung dịch vi lợng 1 ml


7

Thành phần dung dịch vi lợng môi trờng F2

Thành phần 1000 ml nớc cất
Na
2
EDTA 4,36 g
FeCl
3
.6H
2
O 3,15 g
MnCl
2
.4H
2
O 180 mg
CuSO
4.
5H
2
O 10 mg
ZnSO
4
.7H
2
O 22 mg
CoCl
2
. 6H

2
O 10 mg
NaMoO
4
.2H
2
O 6 mg
pH 7,5

Nớc biển đợc lọc bằng giấy lọc GF/C
Môi trờng và dung dịch vi lợng đợc khử trùng ở 1,02 atm và 120
0
C trong
thời gian 15 phút trớc khi bổ sung vitamin để sử dụng nuôi cấy.

Thành phần môi trờng K (Keller et al. 1987) (15)

Thành phần
Dung dịch gốc trong
1000ml nớc cất
900ml nớc
biển lọc
TRIS base (pH =7,2) 121,1 g 1,0 mL
NaNO
3
75 g 1,0 mL
Na - glycerophosphate 2,16 g 1,0 mL
NH
4
Cl 2,68 g 1,0 mL

Na
2
SiO
3
. 9H
2
O 30 g 1,0 mL
H
2
SeO
3
1,3 mg 1,0 mL
Dung dịch vi lợng

1,0 mL
Vitamin


0,5 mL

Định mức đủ 1000 mL với nớc biển lọc và khử trùng trớc khi bổ sung
vitamin.
Nớc biển đợc lọc bằng giấy lọc GF/C (Glass microfibre filter) của hãng
Whatman.



Vitamin: Cho vào 1 lít nớc cất các vitamin theo tỷ lệ sau:
Biotin 10,0 mL (0,1 mg/mL)
B

12
1,0 mL ( 1,0 mg/mL)
Thiamine HCl 200,0 mg


8


Thành phần dung dịch vi lợng môi trờng K (Keller et al. 1987)

Thành phần
Dung dịch gốc trong
1000ml nớc cất
Trong 900ml
nớc cất
Na
2
- EDTA.2H
2
O 41,6 g
FeCl
3
.6H
2
O 3,15 g
NaMoO
4
.2H
2
O 6,3 g 1 mL

ZnSO
4
.7H
2
O 22,0 g 1 mL
CoCl
2
. 6H
2
O 10,0 g 1 mL
MnCl
2
.4H
2
O 180,0 g 1 mL
CuSO
4.
5H
2
O 9,8 g 0,5 mL

Định mức đủ 1000 mL với nớc cất hai lần và khử trùng.

Thành phần môi trờng IMK

Thành phần Nồng độ ( mg/l )
NaNO
3
200 mg
Na

2
HPO
4
1,4 mg
K
2
HPO
4
5 mg
NH
4
Cl 2,68 mg
Fe EDTA 5,2 mg
Mn EDTA 0,332 mg
Na
2
EDTA 37,2 mg
ZnSO
4
.7H
2
O 0,023 mg
CoSO
4
. 7H
2
O 0,014 mg
Na
2
MoO

4 .
2H
2
O 0,0073 mg
CuSO
4
. 7H
2
O 0,0025 mg
H
2
SeO
3
0,0017 mg
Thiamin HCl 0,2 mg
Biotin 0,0015 mg
Vitamin B
12
0,0015 mg
MnCl
2.
4H
2
O 0,18 mg

Định mức đủ 1000 mL với nớc biển lọc và khử trùng trớc khi bổ sung
vitamin. Nớc biển đợc lọc bằng giấy lọc GF/C.

II.3.6. Xác định độc tính của tảo bằng phép thử sinh học trên Artemia salina

II.3.6.1. Chiết rút độc tố

Dịch tảo ở giai đoạn phát triển logarit đem ly tâm lấy sinh khối rồi đông khô.

- Chiết độc tố bằng methanol

9
Cân 50 mg mẫu sinh khối đã đông khô cho vào ống eppendorf (2ml). Thêm
1ml metanol 95,5%, trộn đều bằng máy Vortex . Mẫu sau đó đợc phá vỡ tế bào
bằng 2 cách:
+ Siêu âm trên máy siêu âm nhãn hiệu BRANSON 1210 trong 30 phút ở
cờng độ 60 Hz.
+ Siêu âm ở máy siêu âm B. Braun Labsonic trong 1 phút ở cờng độ 570Hz.
Sau siêu âm, ly tâm ở 10.000 vòng /phút trong 10 phút. Dùng pipét hút lấy phần
dịch trong cho vào lọ thuỷ tinh, sau đó bổ sung vào 1ml metanol 95,5%, lặp lại
thao tác nh trên 3 lần. Dịch trong đợc chia đều vào 2 eppendorf rồi tiếp tục ly
tâm ở 14.000 vòng /phút trong 10 phút để loại bỏ hoàn toàn sinh khối. Dịch trong
sau đó đợc sấy khô bằng Specdvac System rồi bảo quản trong lạnh, tối.

- Chiết độc tố bằng acid acetic
Cân vào mỗi ống eppendorf 50 mg mẫu sinh khối đã đông khô. Thêm 5ml
nớc biển lạnh, trộn đều bằng Vortex. Ly tâm ở 10.000 vòng/10 phút. Thu phần
sinh khối sau ly tâm vào các ống eppendorf (2ml). Cho vào mỗi ống 1ml acid
acetic 0.1M. Các bớc tiếp theo tiến hành nh trên.

III.3.6.2. Phơng pháp thử độc tính bằng Artemia ( 4 )

- Chuẩn bị dịch chiết tảo: Hoà tan cặn trong các ống eppendorf bằng 1,25 ml
nớc biển có dịch chiết 1 ( dung dịch mẹ ). Từ dịch chiết mẹ này pha bằng nớc
biển thành các dịch chiết có nồng độ 20;10;5;2,5 và 1,25 mg tảo khô/ml.

- ấp trứng Artemia: Cân 0.1g trứng hoà trong 50 ml nớc biển, ủ ở 25
0
C ( có
sục khí ). Sau 24 giờ trứng nở thành con Artemia. Chuyển dịch ủ trứng sang đĩa
peptri. Dùng đèn chiếu về một phía để tập trung Artemia đã nở rồi dùng pipet
Pasteur hút sang lọ khác. Sục đều để đợc dịch Artemia tơng đối đồng nhất.
Dùng nớc biển để pha loãng sao cho 0,1 ml dịch chứa 10- 20 con . Cho vào mỗi
giếng của microplate 0,1 ml dịch Artemia trong nớc biển (10-20 con) và 0,1 ml
dịch chiết tảo, mỗi nồng độ tiến hành lặp lại 3 lần.
Theo dõi và đếm số Artemia chết sau 24 giờ, sau đó cố định toàn bộ số
Artemia bằng vài giọt foocmon 100% và đếm tổng số Artemia trong mỗi giếng từ
đó sẽ tính đợc tỷ lệ ( %) chết cho mỗi nồng độ dịch chiết.










10

III. Kết quả nghiên cứu và thảo luận
III.1. Một số đặc điểm hình thái tế bào tảo

III.1.1. Hình thái tế bào tảo Prorocentrum sp

Tảo thờng sống ở đáy, dạng đơn bào, quan sát dới kính hiển vi tế bào có

màu nâu vàng, hình trứng, kích thớc: dài 224 àm, rộng 173 àm . Đây là loài có
khả năng chuyển động nhờ roi gắn ở phần đàu tế bào. Tế bào dẹp bên, có vỏ gíáp
gồm hai mảnh vỏ ghép lại với nhau ở phần đai, không có rãnh ngang và rãnh dọc.
Phần đỉnh tế bào lõm xuống (ảnh 2).



ảnh 2. Tế bào tảo Prorocentrum sp. với độ phóng đại 1000X

III.1.2. Hình thái tế bào tảo Pseudonitzschia sp.





ảnh 3. Tế bào tảo Pseudonitzschia sp. với độ phóng đại 1000 X

11
Đây cũng là loài tảo sống bám đáy, tế bào có dạng hình thuyền, màu vàng xanh,
kích thớc: dài 556 àm, rộng 51àm. Các tế bào thờng tạo thành dạng chuỗi 4-8
tế bào hoặc nhiều hơn. Đây cũng là loài có khả năng chuyển động dù không có
roi( ảnh 3) dới đây.

III.1.3.Hình thái tế bào tảo Alexandrium sp.

Kết quả quan sát dới kính hiển vi cho thấy loài Alexandrium sp. này có hình
dạng rất giống loài Alexandrium minutum, đây cũng là loài tảo thờng sống ở đáy,
tế bào có dạng hình trứng, ellips, có chiều dài khoảng từ 20-22,5 àm màu vàng nâu,
rộng 20-25 àm sống đơn độc và di chuyển khá nhanh. Rãnh ngang khá sâu, không
có cánh ở phần vỏ dới của tế bào. Nửa trên dạng gần nh hình nón hơi lệch. Nửa

phần dới dạng ellip.



ảnh 4. Tế bào tảo Alexandrium sp. với độ phóng đại 1000X

III.2. Chọn môi trờng thích hợp cho nuôi tảo
Một trong các yếu tố hết sức quan trọng trong nuôi trồng vi tảo là môi trờng
nuôi. Cùng một loài tảo có thể sinh trởng tốt ở môi trờng này nhng lại kém
trong môi trờng khác. Vì vậy, thí nghiệm tìm hiểu môi trờng thích hợp cho nuôi
tảo là công việc đầu tiên cần tiến hành. Sau một thời gian thực nghiệm nuôi tảo trên
các môi trờng có thành phần khác nhau, chúng tôi đã thu đợc một số kết quả
dới đây:





12
III.2.1. Môi trờng thích hợp với tảo Prorocentrum sp.

Bảng 1. Kết quả đếm tế bào Prorocentrum sp. phát triển trong
các môi trờng khác nhau (Tb/ml)

Môi trờng
Ngày thu mẫu
EM F2 IMK K L1
0 2732 2732 2732 2732 2732
3 9580 5495 10450 9965 7680
5 12970 14590 22740 10690 10750

7 20925 16100 44310 12717 20603
10 26543 16237 55452 12320 24283
12 21782 12939 56130 11875 20416
14 23102 11095 57840 10427 20083


0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
0357101214
Thời gian [Ngày]
Mật độ tảo [Tb/ml]
EM
F2
IMK
K
L1

Hình 1. ảnh hởng của môi trờng nuôi cấy lên
sinh trởng của tảo Prorocentrum sp.

Bảng 2. Kết quả tính ANOVA one way

Source of
Variance

SS dt MS F P-value F crit
Between
group
4.86E+09 5 9.72E+08 8.062455 3.5E+05 2.477165
With group 4.34E+09 36 1.2E+08
Total 9.2E+09 41

13
Nghiên cứu tìm môi trờng thích hợp cho sinh trởng của tảo Prorocentrum
sp. đã đợc thực nghiệm trong thời gian 14 ngày với 5 môi trờng. Kết quả đếm tế
bào ( trình bày ở bảng 1 và minh hoạ trên hình 1) cho thấy môi trờng nuôi đã ảnh
hởng rất rõ đến khả năng sinh trởng của tảo. Tảo phát triển kém nhất trong 2 môi
trờng K và F2, tốc độ tăng trởng chậm, mật độ cao nhất chỉ đạt 16237 tb/ml. ở 2
môi trờng EM và L1 tảo phát triển khá hơn, tuy nhiên mật độ cao nhất cũng chỉ
đạt 26543 tb/ml. Riêng trong môi tròng IMK tảo phát triển rất nhanh, sau 10 ngày
nuôi mật độ tế bào đã đạt 55452 tb/ml và sau 14 ngày nuôi mật độ đạt tới 57840
tb/ml. Nhìn chung đờng cong sinh trởng của tảo ở 5 môi trờng đều đạt giá trị
cực đại sau 10 ngày nuôi, sau đó sinh khối tảo đã không tăng nữa mặc dù kéo dài
thời gian nuôi, ngoại trừ môi trờng IMK.
Để đánh giá tác động của thành phần môi trờng lên sinh trởng của tảo
Prorocentrum sp., chúng tôi đã sử dụng phơng pháp tính Anova một nhân tố, kết
quả ở bảng 2 cho thấy giá trị của F tính toán (8,062455) lớn hơn giá trị của F tra
bảng (2,477165) điều này chứng tỏ các môi trờng nuôi cấy khác nhau có ảnh
hởng thực sự tới sinh trởng của tảo Prorocentrum sp. Nh vậy, môi trờng IMK
thích hợp nhất cho sinh trởng của tảo này.

III.2.2. Môi trờng thích hợp với tảo Pseudonitzschia sp.


Bảng 3. Kết quả đếm số tế bào Pseudonitzschia sp.sinh trởng ở

các môi trờng khác nhau (Tb/ml)

Môi trờng
Ngày lấy mẫu
EM F2 IMK K L1
0 7830 7830 7830 7830 7830
3 18055 9735 26090 25920 10950
5 11911 7780 59366 65805 9567
7 18225 5148 69040 68905 11433
10 8255 4266 71896 58193 11618
12 22845 1882 91897 47513 10687
14 11701 2940 129157 41569 7678

Kết quả nghiên cứu ảnh hởng của 5 môi trờng khác nhau lên sinh trởng của
tảo Pseudonitzschia sp. (đợc thể hiện bằng số liệu đếm tế bào ở bảng 3 và đồ thị
biểu diễn đờng cong sinh trởng của tảo ở hình 2 ) cho thấy ở môi trờng F2 số tế
bào giảm dần theo thời gian, tiếp đến là môi trờng L1 tảo có sinh trởng nhng
mức tăng không đáng kể. Với môi trờng EM tốc độ tăng trởng có khá hơn, sau
14 ngày số lợng tế bào tăng gấp 1,49 lần so với ngày đầu thí nghiệm. ở môi
trờng K tốc độ tăng trởng khá nhanh, trong tuần đầu mật độ tế bào đạt tơng
đơng với môi trờng IMK. Tuy nhiện tốc độ này không duy trì lâu nên sang tuần
thứ 2 số tế bào giảm đi. Sau hai tuần nuôi cấy sinh khối tảo tăng gấp 5,31 lần so

14
0
20000
40000
60000
80000
100000

120000
140000
0246810121416
Thời gian [ngày]
Mật độ tế bào [tb/ml]
EM
F2
IMK
K
L1

Hình 2. ảnh hởng của môi trờng nuôi cấy lên sinh trởng
của tảo Pseudonitzschia sp.

với ngày đầu tiên. Trong môi trờng IMK tảo phát triển nhanh nhất, số lợng tế bào
đạt cực đại sau 2 tuần nuôi ( đạt 129157 tb/ml ), tăng gấp 16,5 lần so với ngày đầu
thí nghiệm.

Bảng 4. Kết quả tính ANOVA one way

Source of
Variance
SS dt MS F P-value F crit
Between
group
2,43E+10 5 4,85E+09 12.28647 5,48E+05 2,477165
With group 1,42E+10 36 3,95E+08
Total 3,85+10 41

Kết quả phân tích ANOVA một nhân tố ( bảng 4 ) cho thấy thành phần của

môi trờng đã tác động rõ rệt lên sinh trởng của tảo, vì thế F tính toán ( 12,28647)
đã cho giá trị lớn hơn nhiều lần so với giá trị của F tra bảng (2,477165). Cũng
giống tảo Prorocentrum sp., môi trờng IMK là môi trờng thích hợp nhất cho tảo
Pseudonitzschia sp. phát triển. Tuy vậy, có thể sử dụng môi trờng K để nuôi tảo
này nhng thời gian nuôi ngắn và mật độ tế bào cực thấp hơn so với môi trờng
IMK.

III.2.3. Môi trờng thích hợp cho nuôi tảo Alexandrium sp.

Kết quả nghiên cứu ảnh hởng của 5 MT khác nhau lên sinh truởng của tảo
Alexandrium sp. đợc thể hiện trong bảng 5 và hình 3. Kết quả cho ta thấy rằng:
đờng cong sinh trởng của tảo Alexandrium sp. trong môi trờng IMK liên tục
tăng lên, sau 16 ngày nuôi cấy sinh khối tảo đã tăng gấp 6,97 lần. Môi trờng EM

15
không thích hợp cho sinh trởng nên tảo đã lụi dần theo thời gian. Kết quả tơng
tự cũng nhận đợc trong môi trờng K. Còn ở môi trờng F2 và môi trờng L1

Bảng 5. Kết quả đếm tế bào Alexandrium sp. nuôi ở
các môi trờng khác nhau (Tb/ml).

Môi trờng
Ngày thu mẫu
EM F2 IMK K L1
0 925 987 1025 987 987
7 962 1137 1325 643 1086
9 525 1018 2287 775 1443
11 750 2240 3960 1700 2460
14 780 1860 4500 880 700
16 680 1500 7140 720 660

0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
0 7 9 11 14 16
Thời gian [Ngày]
Mật độ tảo [Tb/ml]
EM
F2
IMK
K
L1

Hình 3. ảnh hởng của môi trờng nuôi cấy lên sinh trởng của
tảo Alexandrium sp.

Bảng 6. Kết quả tính ANOVA one way

Source of
Variance
SS dt MS F P-value Fcrit
Between
group
38828948 5 7765790 7.274918 0.000145 2.533554

Within group 32024237 30 1067475
Total 70853185 35

trong 7 ngày đầu tảo phát triển rất chậm, đến ngày thứ 9 mật độ tảo đạt giá trị cực
đại (2460 Tb/ml) tăng gấp hai lần so với mật độ ban đầu, nhng sau đó tảo tàn lụi,

16
đờng cong sinh trởng đi xuống. Nh vậy, cũng giống nh tảo Prorocentrum sp.,
IMK cũng là môi trờng thích hợp nhất cho sinh trởng của tảo Alexandrium sp.
Với kết quả phân tích ANOVA một nhân tố đợc trình bày trên bảng 6,
chúng tôi thấy giá trị F tính toán là 7,274918 cao hơn nhiều so với giá trị F tra
bảng là 2,533554. Do đó thành phần của các môi trờng khác nhau đã có ảnh
hởng rõ ( nh đã thấy ở đồ thị của hình 3) lên sinh trởng của tảo Alexandrium sp.
và có thể khẳng định môi trờng IMK là tốt nhất để nuôi tảo này.
Nh vậy kết quả nghiên cứu tìm hiểu ảnh hởng của 5 môi trờng lên sinh
trởng của ba loài tảo Prorocentrum sp., Pseudonitzschia sp. và Alexandrium sp.
cho thấy rằng thành phần môi trờng đã có tác động thực sự lên sinh trởng của
mỗi loài. Trong số 5 môi trờng thử nghiệm thì môi trờng IMK là thích hợp nhất
cho cả 3 loài, 4 môi trờng còn lại (EM,F2,K,L1) các loài tảo thử nghiệm hoặc
không phát triển đợc hoặc có phát triển nhng rất chậm.
Về thành phần môi trờng, IMK không chỉ có vitamin mà còn chứa Fe, Mn
và Na dạng chelat ( liên kết với EDTA) trong khi đó các môi trờng khác chỉ có
Na-EDTA.

III.3. ảnh hởng của CĐAS lên sinh trởng của tảo

III.3.1. Thực nghiệm với tảo prorocentrum sp.

ánh sáng có vai trò rất quan trọng trong quá trình hoạt động quang hợp của
các loài vi tảo. Theo báo cáo của một số tác giả ( 3, 5, 6 ): ở cờng độ ánh sáng

thấp tảo hầu nh không phát triển ( nh ở cờng độ ánh sáng 500 lux với loài
Pseudonitzschia pungens và P. Pseudodelicatissima; ở cờng độ ánh

Bảng 7. Kết quả đếm tế bào Prorocentrum sp. phát triển ở
các cờng độ ánh sáng khác nhau (Tb/ml)

Cờng độ chiếu sáng (Lux)
Ngày thu
1000 2000 3000 4000 5000
0 1124 1139 1216 1094 1014
3 1141 1333 1531 1801 2085
6 1214 2120 2627 2690 3023
8 1984 3757 4362 4322 4374
10 2982 8027 9843 9082 6844
12 3804 10877 12569 12865 11237
14 5010 18401 19877 19308 15367
16 5574 23213 21586 20390 17020
18 7196 33026 36554 29577 27658
20 7192 35443 37241 31885 29717
22 10541 38375 39891 32301 33850
24 13800 35800 34150 32600 32750



17
0
5000
10000
15000
20000

25000
30000
35000
40000
45000
03681012141618202224
Thời gian [ngy]
Mật độ tế bào [Tb/ml]
1000 LUX
2000 LUX
3000 LUX
4000 LUX
5000 LUX

Hình 4. ảnh hởng của cờng độ chiếu sáng lên sinh trởng của
tảo Prorocentrum sp. trong môi trờng IMK,

sáng1000; 2000; 3000 lux thì tảo phát triển tốt và tốt nhất ở cờng độ sáng 3000
lux và thời gian đạt mật độ tối đa ngắn (khoảng 3-4 ngày). Còn với loài
Alexandrium tamarense cũng có những nhận xét tơng tự.

Bảng 8. Kết quả tính ANOVA one way

Source of
Variance
SS dt MS F P-value Fcrit
Between
group
2.91E+09 5 5.82E+08 4.438217 0.001663 2.368267
Within group 7.86E+09 60 1.31E+08

Total 1.08E+10 65

Thí nghiệm của chúng tôi, tảo nuôi trong môi trờng IMK, cờng độ ánh
sáng từ 1000 đến 5000 lux .Từ kết quả đếm tế bào ở bảng 7 và đồ thị biểu diễn tốc
độ sinh trởng của tảo Prorocentrum sp. ở ( hình 4) cho thấy cờng độ chiếu sáng
đã tác động rõ đến sinh trởng của tảo. Pha tiềm sinh đã kéo dài tới 6 ngày ở tất cả
các chế độ chiếu sáng. Sau đó tảo phát triển mạnh từ ngày thứ 7 đến ngày thứ 18.
Những ngày tiếp theo tảo phát triển chậm lại và có chiều hớng suy giảm. Riêng ở
cờng độ chiếu sáng 1000 lux tảo phát triển rất kém, sau 24 ngày nuôi mật độ tảo
chỉ đạt 13800 tb/ml, trong khi ở cờng độ sáng từ 2000 - 5000 lux mật độ tảo đều
đạt > 30.000 tb/ml. Tảo phát triển tốt nhất ở cờng độ chiếu sáng từ 2000 - 3000
lux.
Kết quả phân tích ANOVA một nhân tố ở bảng 8 cho thấy giá trị F tính toán
(4,438217) lớn hơn giá trị của F tra bảng (2,368267), nh vậy cờng độ chiếu sáng
đã có ảnh hởng thực sự tới quá trình sinh trởng của tảo Prorocentrum sp., cờng

18
độ chiếu sáng thích hợp nhất từ 2000 - 3000 lux. Tăng hay giảm cờng độ ánh sáng
đề làm giảm sinh trởng.

III.3.2. Thực nghiệm với tảo Alexandrium sp.


Bảng 9. Kết quả đếm tế bào Alexandrium sp. phát triển ở
cờng độ chiếu sáng khác nhau (Tb/ml).

Cờng độ chiếu sáng (lux)
Ngày thu mẫu
1000 2000 3000 4000 5000
0 1780 1775 1764 1750 1795

2 2894 3349 3262 4116 3162
4 3076 4733 5149 4462 4229
7 4120 5554 6308 6081 6270
9 4317 8716 9500 7487 8600
11 5082 13820 12813 10240 10160
14 5140 15200 13860 12120 11693
16 5125 16900 15680 14360 14000

0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
18000
02479111416
Thời gian [ngày]
Mật độ tế bào [tb/ml]
1000 lux
2000 lux
3000 lux
4000 lux
5000 lux

Hình 5. ảnh hởng của cờng độ chiếu sáng lên sinh trởng của
tảo Alexandrium sp. trong môi trờng IMK

Bảng 10. Kết quả tính ANOVA one way

Source of
Variation
SS df MS F P-value F crit
Between Groups 4.71E+08 5 94216253 5.646834 0.000455 2.437694
Within Groups 7.01E+08 42 16684791
Total 1.17E+09 47


19
Kết quả của bảng 9 và hình 5 cho thấy ảnh hởng của cờng độ chiếu sáng
lên sinh trởng của tảo Alexandrium sp. trong 7 ngày đầu nuôi cấy là không rõ rệt.
Nhng kể từ ngày thứ 9 trở đi tốc độ sinh trởng của tảo đã có sự khác biệt, ở
cờng độ chiếu sáng 1000 lux tảo sinh trởng rất kém , mật độ tảo tối đa chỉ đạt
(5125); ở cờng độ chiếu sáng từ 2000 lux - 3000 lux sinh khối tảo bắt đầu tăng
nhanh và mật độ tảo đạt tối đa là (15680 - 16900 tb/ml) sau 16 ngày nuôi. Trong
khi ở cờng độ chiếu sáng từ 4000 lux - 5000 lux thì tốc độ tăng trởng của tảo có
phần chậm hơn, mật độ tối đa của tảo chỉ đạt từ (14000 - 14360 tb/ml). Nh vậy
cờng độ chiếu sáng trên 3000 lux là không thích hợp cho tảo Alexandrium sp.
Kết quả phân tích ANOVA một nhân tố ở bảng 10 cho thấy giá trị F tính
toán (5.646834) lớn hơn so với giá trị F tra bảng (2,437694), điều đó chứng tỏ
cờng độ chiếu sáng có tác động đến sinh trởng của tảo Alexandrium sp. và đồ thị
biểu diễn đờng cong sinh trởng của tảo thích hợp nhất ở cờng độ chiếu sáng
2000 lux.
Tóm lại với 2 loài tảo thử nghiệm ( Prorocentrum sp. và Alexandrium sp.) thì
tác động của cờng độ chiếu sáng đã ảnh hởng khá rõ rệt lên tốc độ tăng trởng
của hai loài tảo này, cụ thể ở CĐAS thấp (1000 Lux) tảo kém phát triển, tăng dần
CĐAS lên từ 2000 - 3000 lux tảo phát triển rất tốt, nhng tăng tiếp lên 4000 lux
đến 5000 lux sự phát rtriển của tảo lại giảm dần. Kết quả này của chúng tôi cũng

tơng đối phù hợp với kết quả của tác giả ( 5,6 ) khi nghiên cứu về chế độ chiếu
sáng khác nhau với các loài tảo Alexandrium tamarense và các loài tảo
Prorocentrum sp Các tác giả đã có nhận định rằng yếu tố ánh sáng có ảnh h
ởng
đến sinh trởng của các loài tảo thí nghiệm và ở CĐAS thấp 500 lux tảo hầu nh
không phát triển, tăng dần CĐAS lên 1000; 2000; 3000 lux tốc độ phát triển của
tảo tăng lên và tốt nhất ở CĐAS 3000 lux. Tuy nhiên, nghiên cứu trớc mới dừng ở
cờng độ sáng 3000 lux nên không biết nếu tiếp tục tăng cờng độ ánh sáng thì tác
động ra sao đến sinh trởng. Với nghiên cứu này, chúng tôi đã mở rộng biên độ
sáng và chỉ ra ánh sáng cao ( trên 3000 lux ) ức chế sự rõ đến sinh trởng của các
loài nghiên cứu. Nh vậy có thể thấy rằng, nếu so với các tảo lục hay một số loài
tảo lam ( 2, 10 ), Prorocentrum sp. và Alexandrium sp là vi tảo chịu sáng yếu hơn.

III.4. ảnh hởng của độ muối (S
0
/
00
) lên sinh trởng của tảo
III.4.1. Thực nghiệm với tảo Prorocentrum sp.

Khi xem xét tính đa dạng của các loài tảo độc hại một số tác giả nhận thấy
rằng chúng bị chi phối bởi nồng độ muối của từng khu vực. Kết quả phân tích nồng
độ muối và sự đa dạng của các loài tảo độc hại tại những vùng nghiên cứu cho thấy
xu thế chung về phân bố số loài tảo độc hại và nồng độ muối là khu vực nào có
nồng độ muối thấp thì tại đó số loài tảo độc hại có mặt thờng thấp ( 3 ).
Để góp phần tìm hiểu thêm về tác động của nồng độ muối lên quá trình sinh
trởng của 2 loài tảo Prorocentrum sp. và Alexandrium sp., chúng tôi đã tiến hành
thực nghiệm ở các nồng độ muối 20%o; 25%o; 30%o; 35%o, tảo đợc nuôi trong
môi trờng IMK, cờng độ chiếu sáng 3000 lux và ở nhiệt độ 251
0

C, thời gian
chiếu sáng 12 h : 12 h.

20


Bảng 11. Kết quả đếm tế bào Prorocentrum sp. phát triển ở
các nồng độ muối khác nhau (Tb/ml)



0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
02579111316
Thời gian [ngày]
Mật độ tế bào [Tb/ml]
20%o
25%o
30%o
35%o

Hình 6. ảnh hởng của nồng độ muối lên sinh trởng của
tảo Prorocentrum sp. trong môi trờng IMK

Dẫn liệu ở bảng 11 và đồ thị biểu diễn ở hình 6 cho thấy ảnh hởng của nồng

độ muối lên sinh trởng của tảo Prorocentrum sp. trong 7 ngày đầu nuôi cấy là
tơng đối giống nhau, ngoại trừ ở nồng độ 35%o, từ ngày thứ 7 đến ngày thứ 11 tảo
phát triển ở pha logarit, sau đó dừng lại và dần suy giảm. Nhìn vào đờng cong sinh
trởng ta thấy tảo thích nghi trong khoảng nồng độ muối từ 20%o đến 30%o; riêng
đối với nồng độ 35%o tào phát triển kém hẳn. Nếu tính tốc độ tăng sinh khối thì ở
nồng độ 20%o tăng 31,34 lần; ở 25%o là 25,98 lần; ở 30%o là 27,56 lần và ở 35%o
chỉ đạt 18,32 lần so với ban đầu. Nh vậy nếu so sánh giữa các nồng độ thì thấy
rằng tốc độ tăng trởng ở 20%o là nhanh nhất.

Độ mặn (%o)
Ngày thu
mẫu
20 25 30 35
0 1680 1783 1433 1680
2 2483 2407 2467 1966
5 6791 6402 6408 2920
7 11167 11339 10041 4611
9 28598 31588 23566 16713
11 54630 51435 41407 27600
13 53775 50500 41950 31815
16 52650 46325 39500 30775

21
Bảng 12. Kết quả tinh ANOVA one way

Source of
Variance
SS dt MS F P-value Fcrit
Between
group

3.78E+09 4 9.45E+08 2.946628 0.033664 2.641464
Within group 1.12E+10 35 3.21E+08
Total 1.5E+10 39
Việc kiểm tra đánh giá kết quả thí nghiệm theo phơng pháp ANOVA một
yếu tố đợc trình bày trong bảng 12. Qua đó cho thấy F tính toán (2.946628) lớn
hơn so với F tra bảng (2,641464), nên trong phạm vi thí nghiệm này yếu tố độ muối
có ảnh hởng thật sự lên sự phát triển của tảo. Với tảo Prorocentrum sp. nồng độ
muối thích hợp cho sự phát triển là 20%o đến 25%o ( ở cờng độ chiếu sáng 3000
lux và 25
o
C). Tuy nhiên tảo sinh trởng trong khoảng rộng của nồng độ muối

III.4.2. Thực nghiệm với tảo Alexandrium sp.


Bảng 13. Kết quả đếm tế bào Alexandrium sp. phát triển ở
các nồng độ muối khác nhau (Tb/ml).

Độ mặn (%o)
Ngày thu mẫu
20 25 30 35
0 962 1015 1012 862
7 1000 1018 1018 950
9 2031 1462 1037 1028
11 3180 2640 1660 1215
14 4351 4040 2340 1580
16 6280 4860 2660 1260
18 6900 5321 3320 1700
0
2000

4000
6000
8000
0 7 9 11 14 16 18
Thời gian [Ngày]
Số lợng tế bào [Tb/ml]
20%o
25%o
30%o
35%o

Hình 7. ảnh hởng của nồng độ muối lên sinh trởng của tảo Alexandrium sp.
trong môi trờng IMK, cờng độ chiếu sáng 3000 lux và ở 24
o
C

22

Kết quả đếm tế bào ở bảng 13 và đồ thị biểu diễn đờng cong sinh trởng ở
hình 7 cho thấy ảnh hởng của nồng độ muối tới sự phát triển của tảo Alexandrium
sp. cũng cho kết quả tơng tự nh khi thử nghiệm với tảo Prorocentrum sp., thời
gian của pha tiềm sinh đã kéo dài tới 7 ngày ở tất cả các nồng độ thí nghiệm, kể từ
ngày thứ 8 trở đi tảo phát triển nhanh và bắt đầu có sự khác biệt giữa các nồng độ,
sau 18 ngày nuôi sinh khối đạt giá trị cao nhất ở nồng độ 20%o với 6900 tb/ml,
tăng gấp 7,17 lần , tiếp đến ở 25%o đạt 5321tb/ml, tăng gấp 5,24 lần và ở 30%o là
3320 tb/ml, tăng gấp 3,28 lần và sinh khối tảo ở nồng độ 35%o là 1700 tb/ml, tăng
gấp 1,97 lần. Nh vậy nếu so sánh giữa các nồng độ ta thấy tốc độ tăng trởng ở
nồng độ muối 20%o là nhanh nhất, tăng hơn 1,30 lần so với ở 25%o; và 2,08 lần
so với ở 30%o; và 4,06 lần ở 35%o

Bảng 14. Kết quả tính ANOVA one way

Source of
Variance
SS dt MS F P-value Fcrit
Between
group
48842384 4 12210596 6.761858 0.000528 2.689632
Within group 54174145 30 1805805
Total 1.03E+08 34

Kết quả tính ANOVA một nhân tố từ bảng 14 cho thấy giá trị của F tính toán
cao hơn hẳn giá trị của F tra bảng, chứng tỏ yếu tố độ mặn đã có tác động đến quá
trình sinh trởng của tảo Alexandrium sp.,và nh đồ thị sinh trởng ở hình 7 cho
thấy độ mặn càng cao thì ức chế tới sinh trởng của tảo càng mạnh.
Tóm lại tảo Prorocentrum sp. có thể phát triển tốt ở nồng độ muối từ 20%o -
25%o. ở nồng độ 35%o tảo phát triển kém nhất.
Nghiên cứu ảnh hởng của độ mặn lên sinh trởng của tảo Prorocentrum
micans Nguyễn Thuỵ Vỹ Tuyền và Nguyễn Ngọc Lâm (7 ) thấy rằng độ mặn
thích hợp cho tảo từ 20%o - 35%o. Với tảo Alexandrium sp. nồng độ muối thích
hợp nhất cho tảo là 25%o, tăng nồng độ muối thì tốc độ sinh trởng của giảm đi
( 1 ).

III.5. ảnh hởng của nồng độ N-NO
3
lên sinh trởng của tảo Prorocentrum sp.
Nghiên cứu ảnh hởng của các muối dinh dỡng đối với sự phát triển của tảo
là một vấn đề khá phức tạp và thay đổi tuỳ thuộc vào đặc tính sinh thái của từng
loài. Mỗi một loài tảo có một giới hạn nhất định về muối dinh dỡng. Các kết quả
khảo sát ở ngoài tự nhiên không thể phản ánh hết mối quan hệ này. Bởi vì liên quan

tới sự phát triển của tảo là sự tác động tổng hợp của rất nhiều yếu tố. Do đó, để có
những hiểu biết sâu hơn về vấn đề này đòi hỏi phải có những thí nghiệm nuôi mà
thông qua đó chúng ta có thể khống chế đợc tác động của một số yếu tố nhất định.
Để tìm hiểu tác động nồng độ của N-NO
3
trong môi trờng IMK lên sinh trởng

23
của tảo Prorocentrum sp., chúng tôi đã tiến hành bố trí thí nghiệm ở các nồng độ
200 mgN/l; 300 mgN/l; 400 mgN/l; 500 mgN/l. Tảo đợc nuôi ở cờng độ sáng
3000 lux, nhiệt độ 25
o
C và thời gian chiếu sáng là 12h :12h.

Bảng 15. Kết quả đếm tế bào Alexandrium sp. phát triển ở
các nồng độ N-NO
3
khác nhau (Tb/ml).

NaNO
3
(mg/L)
Ngày thu mẫu
200 300 400 500
0 1540 1682 1430 1550
2 3103 3843 3880 3786
4 7365 6570 6295 6765
6 13375 14550 13740 15870
8 15470 16880 17293 17880
10 19000 23660 22880 23040

12 29745 32760 26460 30352
15 32280 33975 30375 31100
17 42533 44016 42100 45325
tế bào(tb/ml
164411 177936 164453 174553

Nhìn vào kết quả đếm tế bào của bảng 15 và đồ thị ( hình 8 ) biểu diễn đờng
cong sinh trởng của tảo Prorocentrum sp. ta thấy khoảng nồng độ N-NO
3
từ 200
mg/l đến 500 mg/l đã tác động không đáng kể tới sự phát triển của tảo. Tảo đã phát
triển nhanh ngay từ những ngày đầu thí nghiệm và trong quá trình nuôi sinh khối
tảo ở các nồng độ đạm mà chúng tôi đếm đợc hầu nh không khác nhau.
0
10000
20000
30000
40000
50000
0 5 10 15 20
Thời gian [ngày]
Mật độ tế bào [tb/ml]
200 mg/l
300 mg/l
400 mg/l
500 mg/l



Hình 8. Sinh trởng của tảo Prorocentrum sp. trong môi trờng IMK với nồng độ

N-NO
3
khác nhau, cờng độ chiếu sáng 3000 lux, ở 25
o
C và
thời gian chiếu sáng 12h :12h.

24
III.6. Kết quả thử độc tính trên Artemia salina
III.6.1. Thử nghiệm cho Artemia ăn tảo trực tiếp

Sinh khối tảo Prorocentrum sp. đợc thu vào giai đoạn cuối của pha lôgarit,
thí nghiệm bố trí làm 6 công thức, tơng ứng với các mật độ tảo 65000 tb/ml;
32500 tb/ml; 16250 tb/ml; 8125 tb/ml; 4062 tb/ml và công thức ĐC không có tảo.
Mỗi công thức lặp lại 3 giếng, mỗi giếng thả 20 con Artemia và theo dõi tỉ lệ chết
của Artemia, cứ sau 2 giờ lấy mẫu để quan sát dới kính hiển vi, thí nghiệm đợc
tiến hành liên tục trong thời gian 24 giờ.



ảnh 5. Hình Artemia salina cha ăn tảo

ảnh 6. Artemia salina với những tế bào tảo Prorocentrum sp. trong ruột (X100).


25
Kết quả theo dõi cho thấy Artemia có ăn tảo, thậm chí ăn rất nhiều, ảnh mà
chúng tôi chụp đợc nhìn thấy trong ruột của Artemia chứa đầy tế bào tảo hầu nh
còn nguyên vẹn và không thấy Artemia bị ngộ độc. Với kết quả này cha thể đánh
giá đợc rằng tảo không chứa độc tố, cần có những thí nghiệm khác để chứng
minh.

3.6.2. Thử nghiệm Artemia với tế bào đợc phá vỡ

3.6.2.1. Xử lí mẫu tảo

Do cấu tạo tế bào loài Prorocentrum sp. có phần vỏ giáp bên ngoài còn loài
Pseudonitzschia sp trong thành phần vỏ có chứa silic khá cứng nên việc phá vỡ tế
bào là không đơn giản. Khi siêu âm trên máy Branson 1210 trong 30 phút ở 60 Hz,
tế bào tảo đã bị phá vỡ hoàn toàn nhng ở điều kiện này tế bào hai loaì tảo biển
vẫn không bị phá vỡ. Để phá vỡ tế bào 2 loài tảo trên, chúng tôi đã dùng máy
B.Braun Labsonic ở cờng độ cao hơn ( 570 Hz ). Kết quả kiểm tra trên kính hiển
vi cho thấy tế bào của hai loài tảo đã bị phá vỡ hoàn toàn ( xem ảnh 6, 7).

III.6.2.2. Tiến trình thử độc tính bằng Artemia salina

Phơng pháp thử sinh học trên Artemia salina là một phơng pháp đơn
giản ,dễ sử dụng và không vi phạm luật cấm sử dụng động vật thí nghiệm tại một số
nớc trên thế giới. Hơn nữâ Artemia salina cũng là thức ăn thờng dùng trong nuôi
tôm nên việc xác định độc tính của tảo trên đối tợng này cũng rất có ý nghĩa với
nuôi trồng thuỷ hải sản.



















ảnh 7. Tế bào Prorocentrum sp. đã đợc phá vỡ