Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (68.86 KB, 2 trang )
PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT RNA TOÀN PHẦN VÀ mRNA.
1. Nguyên tắc tách chiết RNA
− Cần phải được nhiều RNA, sạch, toàn phần không bị gãy mới có ý nghĩa quan
trọng trong quá trình nhân gen và nghiên cứu biểu hiện của gen. Muốn vậy cần
phải làm bất hoạt enzyme endonuclease như RNase và ngăn cản sự xâm nhập
của enzyme RNase từ bên ngoài vào.
− Điều khó khăn là phần lớn các RNA đều không bền, dễ bị phân hủy bởi các
enzyme ribonuclease, vì thế bước đầu tiên của quy trình tách chiết là phân rã tế
bào trong môi trường hóa học có khả năng làm biến tính RNase.
− Các enzyme này lại rất bền vững và hoạt động mạnh không cần có sự tham gia
của yếu tố cộng nhân tố, thậm chí nhiều khi xử lý ở nhiệt độ 90
o
C trong một
giờ vẫn không làm bất hoạt được men này. Chúng tồn tại ở khắp nơi, ở rất
nhiều trên đầu ngón tay, chính vì thế mọi dụng cụ đều phải dùng mới hoặc sử
dụng một lần.
− Khi thao tác phải đeo găng tay, khẩu trang, các dung dịch, nước hoặc muối khi
sử dụng để chiết xuất RNA đều phải xử lý bằng hóa chất
Diethylpysocarbbonate (DEPC), hóa chất này làm bất hoạt men RNase bằng
cách làm biến đổi liên kết cộng hóa trị phosphodiester.
− Tất cả các dung dịch dùng để chiết xuất RNA tuyệt đối không được lẫn tạp
RNase, muốn thế thì tất cả các dung dịch trừ dung dịch TES vì chứa Tris-Cl
chất này làm bất hoạt DEPC, sau khi thêm dung dịch Guanidium đều phải
được xử lý DEPC.
2. Các bước chiết xuất cơ bản.
− Tế bào, mô (nơi có gen mục tiêu hoạt động) được lấy mẫu và nghiền trong
dung dịch có chứa các chất tẩy mạnh như SDS và Sarkosyl ở nồng độ cao kết
hợp với 2 tác nhân gây biến tính protein mạnh và hiệu quả là: Guanidinium
thiocyanate và 2 mercaptoethanol, 2 chất này có tác dụng ức chết hoạt động
của các RNase nội bào và tách các protein liên kết ra khỏi RNA.
− Loại bỏ các protein ra khỏi mẫu bằng cách xử lý Phenol:Choloroform rồi quay