Xây dựng quy trình định lượng ezetimib và chất chuyển hóa ezetimib glucuronid trong huyết tương người bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ (lc ms

.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN THỊ HỒNG TRANG

XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG EZETIMIB
VÀ CHẤT CHUYỂN HĨA EZETIMIB GLUCURONID
TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT
SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ (LC-MS/MS)

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021

.


.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN THỊ HỒNG TRANG

XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG EZETIMIB
VÀ CHẤT CHUYỂN HĨA EZETIMIB GLUCURONID
TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT
SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ (LC-MS/MS)

NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC & ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ: 8720210

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. TS. CHƯƠNG NGỌC NÃI

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021

.

i


.

LỜI CAM ĐOAN
Tơi cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tôi.
Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố
trong bất kỳ cơng trình nào khác.

Nguyễn Thị Hồng Trang

.

ii


.

MỤC LỤC
Trang
Trang phụ bìa

i

Lời cam đoan

ii

Mục lục

iii

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt

v

Danh mục các bảng

vii

Danh mục các hình, sơ đồ, đồ thị

ix

ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ EZETIMIB .............................................................................3
1.2. TỔNG QUAN VỀ EZETIMIB PHENOXY Β-D-GLUCURONID ......................8
1.3. MỘT SỐ CHUẨN NỘI SỬ DỤNG ......................................................................9
1.4. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG - KHỐI PHỔ (LC-MS/MS) .......................12
1.5. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ MẪU HUYẾT TƯƠNG .............17
1.6. THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG THUỐC TRONG DỊCH SINH
HỌC THEO HƯỚNG DẪN US-FDA VÀ EMA ......................................................20
1.7. TỔNG QUAN CÁC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG
EZETIMIB TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI ......................................................22
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 26
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU - ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .....................................26
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................................28
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .............................................................. 37
3.1. KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN KHỐI PHỔ ................................................................37
3.2. KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ ....................................................................40

.

iii


.

3.3. KHẢO SÁT QUY TRÌNH XỬ LÝ MẪU ..........................................................43
3.4. KHẢO SÁT CHẤT CHUẨN NỘI .....................................................................47

3.5. XÁC ĐỊNH KHOẢNG NỒNG ĐỘ ĐỊNH LƯỢNG ..........................................49
3.6. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH LƯỢNG EZM,...............49
EZM-G TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG LC-MS/MS ............................49
3.7. DỰ THẢO QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI EZETIMIB VÀ CHẤT
CHUYỂN HÓA EZETIMIB GLUCURONID TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI
BẰNG KỸ THUẬT LC-MS/MS...............................................................................58
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ....................................................................................... 62
4.1. KỸ THUẬT PHÂN TÍCH ÁP DỤNG CHO QUY TRÌNH ................................62
4.2. QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG EZM, EZM-G TRONG HUYẾT TƯƠNG
NGƯỜI ......................................................................................................................62
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 69
4.3. KẾT LUẬN ........................................................................................................69
4.4. KIẾN NGHỊ ........................................................................................................69
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

.

iv


.

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt
Từ nguyên
aP2
Fatty acid-binding protein 4
APCI
Atmospheric pressure chemical

ionization
ApoB
Apolipoprotein B

Ý nghĩa
Protein vận chuyển axit béo 4
Ion hóa hóa học tại áp suất khí quyển

Protein vận chuyển cholesterol từ máu
đến các mơ
Area under the concentration –
Diện tích dưới đường cong nồng độtime curve
thời gian
Area under the concentration- Diện tích dưới đường cong nồng độ time curve from time 0 to thời gian từ thời điểm 0 đến vô cùng
infinite time
Area under the concentration - Diện tích dưới đường cong nồng độ time curve from time 0 to the last thời gian từ thời điểm 0 đến thời điểm t
measurable concentration
Blank
Mẫu trắng
Bộ Y Tế
Maximum concentration observed Nồng độ đỉnh trong huyết tương
Calibration curve
Đường chuẩn
Coefficient of variation
Hệ số phân tán
Ethyl acetate
Ethyl acetat
European Medicines Agency
Cơ quan Dược phẩm châu Âu
Electrospray ionization

Ion hóa phun điện
Ezetimibe
Ezetimib
Ezetimibe glucuronide
Ezetimib glucuronid
Gas chromatography
Sắc ký khí
High density lipoprotein
Lipoprotein tỷ trọng cao
High performance liquid
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
chromatography
High quality control
Mẫu kiểm chứng ở nồng độ cao
Internal standard
Chuẩn nội
Khối lượng phân tử
Liquid chromatography
Sắc ký lỏng
Liquid Chromatography Sắc ký lỏng ghép nối khối phổ hai lần
Tandem Mass Spectrometry
Low density lipoprotein
Lipoprotein tỷ trọng thấp
Liquid-liquid extraction
Chiết lỏng-lỏng

AUC
AUC0-∞

AUC0-t

BLK
BYT
Cmax
CC
CV
EA
EMA
ESI
EZM
EZM-G
GC
HDL
HPLC
HQC
IS
KLPT
LC
LC-MS/MS
LDL
LLE

.

v


.

LLOQ

LogP

Lower limit of quantitation
(=lgKow) - Octanol/water
partition coefficient
Low quality control
The matrix factor
Medium quality control
Multiple Reaction Monitoring
Tert-butyl methyl ether
(= -lgKa)- acid dissociation
constant
Protein precipitation
Reversed-phase
Relative standard deviation

LQC
MF
MQC
MRM
MTBE
pKa
PPE
RP
RSD
S
SALLE

Salting-out assisted liquid liquid
extraction

Solid phase extraction

SPE
TB
Tmax

Giới hạn định lượng dưới
Hệ số phân tán octanol/nước
Mẫu kiểm chứng ở nồng độ thấp
Hệ số ảnh hưởng nền mẫu
Mẫu kiểm chứng nồng độ trung bình
Kiểu đo mảnh phổ khối hai lần
Tert-butyl methyl ether
Hằng số phân ly axít
Tủa protein
Pha đảo
Độ lệch chuẩn tương đối
Diện tích pic
Chiết lỏng - lỏng hỗ trợ tách bằng muối

Chiết pha rắn
Trung bình
Time at which the maximum Thời gian đạt nồng độ đỉnh
concentration (Cmax) is observed
Retention time
Thời gian lưu
Upper Limit of Quantitation
Giới hạn định lượng trên
United States – The Food and Cơ quan Quản lý Thuốc và Thực phẩm
Hoa Kỳ

Drug Administration

tR
ULOQ
US-FDA

.

vi


.

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Thông số dược động học tham khảo ...........................................................6
Bảng 1.2. So sánh hướng dẫn của US-FDA và EMA ...............................................20
Bảng 1.3. Tóm tắt các quy trình định lượng EZM và EZM-G trong huyết tương
người .........................................................................................................................22
Bảng 1.4. Nồng độ tối đa (Cmax) của EZM, EZM-G trong huyết tương người theo tài
liệu tham khảo ...........................................................................................................23
Bảng 2.1. Chất đối chiếu và chuẩn nội dự kiến sử dụng trong nghiên cứu ..............26
Bảng 2.2. Dung mơi và hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu ............................26
Bảng 2.3. Các lô huyết tương trắng đã sử dụng trong nghiên cứu............................27
Bảng 2.4. Thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu...................................................27
Bảng 2.5. Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc .................................................................28
Bảng 2.6. Cách pha hỗn hợp chuẩn...........................................................................28
Bảng 2.7. Nồng độ lý thuyết của các thuốc trong huyết tương người ......................33
Bảng 3.1 Phổ khối của EZM, EZM-G và chuẩn nội .................................................37
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát cột sắc ký ......................................................................41

Bảng 3.3. Kết quả khảo sát tỷ lệ pha động ................................................................42
Bảng 3.4. Hiệu suất chiết với dung môi tủa protein (n=5)........................................43
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát các dung môi chiết (n=5) ..............................................44
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát loại acid thêm vào (n=5) ...............................................45
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát thể tích acid ...................................................................45
Bảng 3.8. Kết quả khảo sát thể tích acetonitril (n=5) ...............................................46
Bảng 3.9. Kết quả khảo sát chuẩn nội (n=6) .............................................................48
Bảng 3.10. Nồng độ lý thuyết của các thuốc trong huyết tương ...............................49
Bảng 3.11. Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống (n = 6)............................................50
Bảng 3.12. Identification point của chất phân tích ...................................................50
Bảng 3.13. Kết quả xác định tính đặc hiệu ...............................................................51
Bảng 3.14. Mối tương quan giữa giá trị nồng độ và tỷ số diện tích pic (S/S IS) ........52
Bảng 3.15. Kết quả khảo sát tính tương thích của phương trình hồi quy và ý nghĩa
thống kê .....................................................................................................................53
Bảng 3.16. Kết quả khảo sát độ đúng và độ chính xác trong ngày và giữa các ngày
(n=6) ..........................................................................................................................54
Bảng 3.17. Tỷ lệ phục hồi của các chất phân tích trong huyết tương người (n = 6).54
Bảng 3.18. Kết quả khảo sát độ ổn định của các chất phân tích trong huyết tương
người (n = 6)..............................................................................................................55
Bảng 3.19. Kết quả khảo sát độ ổn định của dung dịch gốc các chất phân tích .......56
Bảng 3.20. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nền mẫu ..............................................56
Bảng 3.21. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của lượng mẫu tồn dư (n=6) .....................57
Bảng 3.22. Hệ số pha loãng (n=6) ............................................................................57
Bảng 3.23. Chất chuẩn đối chiếu và nội chuẩn được sử dụng trong quy trình .........58
Bảng 3.24. Dung mơi hóa chất được sử dụng trong quy trình ..................................58
Bảng 3.25.Trang thiết bị được sử dụng trong quy trình ............................................58

.

vii

.

Bảng 3.26. Cách pha dung dịch chuẩn gốc ...............................................................59
Bảng 3.27. Nồng độ giai mẫu chuẩn .........................................................................59
Bảng 3.28. Nồng độ lý thuyết của giai mẫu chuẩn và mẫu kiểm chứng...................60
Bảng 3.29. Bảng khối phổ của EZM, EZM-G và chuẩn nội ....................................61

.

viii


.

DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Cơng thức cấu tạo ezetimib .........................................................................3
Hình 1.2. Cơ chế tác dụng của ezetimib (Nguồn: NCBI [28]) ......................................5
Hình 1.3. Cơng thức cấu tạo ezetimib phenoxy β-D-glucuronid ................................8
Hình 1.4. Cơng thức cấu tạo methyl paraben ..............................................................9
Hình 1.5. Cơng thức cấu tạo propyl paraben ..............................................................9
Hình 1.6. Cơng thức cấu tạo butyl paraben ...............................................................10
Hình 1.7. Cơng thức cấu tạo benzyl paraben ............................................................ 11
Hình 1.8. Cơng thức cấu tạo của phenyl paraben ..................................................... 11
Hình 1.9. Độ nhạy và khoảng khối lượng giới hạn cho các kiểu ion hóa trong LCMS/MS [13] ..............................................................................................................13
Hình 1.10. Cấu tạo của một bộ phân tích khối hai tứ cực [17] .................................15
Hình 3.1. Phổ khối của mảnh mẹ (A), mảnh con (B) của EZM nồng độ 5 ng/mL và
mảnh mẹ (C), mảnh con (D) của EZM-G nồng độ 50 ng/mL (B) ............................38

Hình 3.2. Phổ khối của mảnh mẹ và mảnh con methyl paraben (A), propyl paraben
(B), butyl paraben (C), benzyl paraben (D), phenyl paraben (E) ở nồng độ 2 µg/mL
...................................................................................................................................39
Hình 3.3. Sắc ký đồ khảo sát với hệ pha động acetonitril - acid acetic 0,5% sử dụng
các cột khác nhau: .....................................................................................................40
Hình 3.4. Sắc ký đồ khảo sát với hệ pha động acetonitril - acid acetic 0,5% với các
tỷ lệ 55:45 (A), 45:55 (B), 50:50 (C) trên cột sắc ký Nucleodur 100-5 C8ec
(1504,6 mm; 5µm) ..................................................................................................42
Hình 3.5. Sắc ký đồ khảo sát tủa bằng acetonitril (A) ..............................................43
Hình 3.6. Sắc ký đồ khảo sát thể tích acetonitril chiết mẫu ......................................46
Hình 3.7. Sắc ký đồ khảo sát chất chuẩn nội: methyl paraben (A), propyl paraben
(B), butyl paraben (C), benzyl paraben (D), phenyl paraben (E) .............................47
Hình 3.8. Sắc ký đồ huyết tương trắng (A), nồng độ MQC các chất phân tích (B)
theo quy trình chiết đề xuất .......................................................................................49
Hình 3.9. Sắc ký đồ của mẫu huyết tương trắng (A), mẫu chuẩn ở mức nồng độ
LLOQ (B) ..................................................................................................................51
Hình 3.10. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ các chất phân tích trong
huyết tương và tỷ số diện tích pic của EZM(A), EZM-G(B)....................................52

.

ix


.

ĐẶT VẤN ĐỀ
Rối loạn lipid huyết là một căn bệnh phổ biến hiện nay. Nếu trước đây, độ tuổi bị rối
loạn lipid huyết thường trên 55 tuổi, thì hiện nay, bệnh rối loạn lipid huyết đang có
xu hướng trẻ hóa với tỷ lệ những người mắc bệnh ở độ tuổi từ 25 - 44 tăng cao bất

thường và có xu hướng tăng dần hàng năm. Bệnh rối loạn lipid huyết có liên quan
đến nhiều chứng bệnh khác như béo phì, đái tháo đường, … và có thể dẫn đến
những biến chứng nguy hiểm như đột quỵ, xơ vữa động mạch, nhồi máu cơ tim,
tăng huyết áp, bệnh mạch máu ngoại biên, suy thận và các bệnh tim mạch khác, ….
Ezetimib đã được Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ phê duyệt
vào năm 2002 cho việc điều trị rối loạn lipid huyết độc lập hoặc phối hợp với statin.
Kể từ đó, việc sử dụng các chế phẩm có hoạt chất ezetimib đã tăng lên. Thị trường
Việt Nam hiện nay đang lưu hành nhiều dạng bào chế có thành phần ezetimib được
sản xuất bởi các công ty dược phẩm trong nước và ngoài nước như: “Ridolip 10”,
“Sezstad 10”, “Ezetimib tablets 10 mg”, … nhưng đa số các chế phẩm này chưa
được đánh giá tương đương sinh học so với thuốc gốc là “Zetia®” sản xuất.
Ezetimib là một thuốc dùng đường uống có tác dụng ức chế hấp thu cholesterol
bằng cách ức chế chọn lọc sự hấp thu cholesterol từ lòng ruột. Ezetimib làm giảm
mức LDL - cholesterol trong khoảng từ 17-20% và có ảnh hưởng nhỏ đến mức
triglycerid và HDL-cholesterol. Sau khi uống, ezetimib được chuyển hóa nhanh
chóng tại gan bằng cách glucuronid hóa nhóm 4-hydoxylphenyl, tạo thành chất
chuyển hóa glucuronid và trải qua chu trình gan ruột nhiều lần. Chất chuyển hóa
này là chất chuyển hóa chiếm ưu thế trong huyết tương và nước tiểu, đóng vai trị là
chất có hoạt tính chính, ức chế hấp thu cholesterol mạnh. Do đó, theo hướng dẫn
của US-FDA và EMA, thử nghiệm đánh giá tương đương sinh học của các thuốc có
chứa ezetimib phải đánh giá trên ezetimib và chất chuyển hóa của nó là ezetimib
glucuronid.
Trên thế giới hiện nay đã có rất nhiều cơng trình nghiên cứu định lượng ezetimib
trong dịch sinh học bằng các kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao với phương pháp
xử lý mẫu chiết lỏng - lỏng, chiết pha rắn [10] và phát hiện bằng đầu dò UV – Vis

.

1

.

[16] hay đầu dị khối phổ được cơng bố [6], [4], [10], [12], [5]; nhưng ở Việt Nam
cho đến nay vẫn chưa có cơng trình nghiên cứu nào được cơng bố.
Nồng độ đỉnh đạt được trong huyết tương của ezetimib và chất chuyển hóa ezetimib
glucuronid có hàm lượng tương đối thấp (ng/mL [11]), rất khó khăn trong việc lựa
chọn các loại đầu dò phổ biến để phát hiện trong quá trình định lượng ezetimib và
chất chuyển hóa ezetimib glucuronid trong dịch sinh học.
Xuất phát từ những lý do trên, đề tài: “Xây dựng qui trình định lượng ezetimib và
chất chuyển hóa ezetimib glucuronid trong huyết tương người bằng kỹ thuật
sắc ký lỏng ghép nối khối phổ (LC-MS/MS)” được thực hiện.
Mục tiêu cụ thể của đề tài là:
- Xác định điều kiện sắc ký và điều kiện khối phổ thích hợp.
- Xây dựng quy trình chiết ezetimib và chất chuyển hóa ezetimib glucuronid trong
huyết tương người.
- Thẩm định quy trình định lượng ezetimib và chất chuyển hóa ezetimib glucuronid
trong huyết tương người bằng kỹ thuật LC-MS/MS theo tài liệu hướng dẫn của USFDA và EMA.
- Ứng dụng nghiên cứu đánh giá tương đương sinh học các chế phẩm generic có
chứa hoạt chất ezetimibe.

.

2


.

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ EZETIMIB

1.1.1. Cấu trúc
Cơng thức cấu tạo:

Hình 1.1. Cơng thức cấu tạo ezetimib
Công thức phân tử: C24H21F2NO3 [29].
Danh pháp: (3R,4S)-1-(4-fluorophenyl)-3-[(S)-3-(4-fluorophenyl)-3hydroxypropyl]-4-(4-hydroxyphenyl) azetidin-2-on
Khối lượng phân tử: 409,43 g/mol [29], [31].
1.1.2. Tính chất lý hóa
Mơ tả: Bột kết tinh màu trắng [29].
Tính tan: Dễ tan trong ethanol, methanol và aceton, hầu như không tan trong nước
[26] (0,00846 ng/mL [29]).
Điểm chảy: 163 oC [26], [29].
Giá trị pKa: 9,73 [26].
logP: 4,14 [26]
1.1.3. Cơ chế tác dụng và dược động học
Cơ chế tác dụng
Ezetimib là thuốc chống lipid huyết thuộc nhóm 2-azetidinon. Cơ chế của ezetimib
là ức chế sự hấp thụ cholesterol ở bờ bàn chải của ruột non thông qua kênh vận
chuyển sterol: Niemann-Pick C1-Like1 (NPC1L1). Điều này dẫn đến việc giảm
lượng cholesterol cung cấp cho gan, giảm lượng cholesterol dự trữ trong gan và
tăng độ thanh thải cholesterol trong máu; giảm cholesterol toàn phần, LDLcholesterol, ApoB và triglycerid trong khi tăng HDL-cholesterol. [3]

.

3


.

Cơ chế hoạt động

Ezetimib có tác dụng hạ cholesterol trong máu thông qua việc ức chế chọn lọc sự
hấp thu cholesterol và phytosterol bởi ruột non mà không làm ảnh hưởng đến sự hấp
thu các vitamin và dưỡng chất tan trong dầu. Đích chính của ezetimib là protein vận
chuyển cholesterol Niemann - Pick C1 - Like 1 (NPC1L1). Protein NPC1L1 nằm
trên màng tế bào hấp thu ở bờ bàn chải lòng ruột non cũng như là tế bào vi quản gan
và đóng vai trị hỗ trợ q trình hấp thu cholesterol tự do vào tế bào ruột non liên
quan đến phức hợp protein vận chuyển axít béo aP2 và vỏ clathrin. Một khi
cholesterol trong lòng ruột và mật đến tiếp xúc với thành tế bào ruột non, nó sẽ gắn
với vùng cảm ứng sterol của NPC1L1 và tạo thành phức hợp NPC1L1/cholesterol.
Phức hợp này được hấp thu bằng cách gắn với protein aP2 ở túi clathrin tạo thành
một phức hợp túi được dịch thể lưu trữ trong khoang tái chế nội tiết [26].
Ezetimib khơng có tác động dược lý đến chức năng ngoại tiết tuyến tụy, đúng hơn
nó khu trú và thể hiện tác động ở bờ bàn chải của ruột non. Ezetimib chặn chọn lọc
protein NPC1L1 ở viền bàn chải jejunal, làm giảm sự hấp thu micell trong lòng ruột
vào tế bào ruột non. Nhìn chung, ezetimib làm giảm việc cung cấp cholesterol
đường ruột đến gan, làm giảm lượng cholesterol dự trữ trong gan và giảm
cholesterol vào gan từ máu. Trong khi cơ chế hoạt động đầy đủ của ezetimib trong
việc giảm cung cấp cholesterol vào cả tế bào ruột và tế bào gan vẫn chưa được hiểu
đầy đủ; một nghiên cứu đã chỉ ra rằng ezetimib ngăn chặn phức hợp NPC1L1/sterol
tương tác với aP2 ở túi clathrin, khiến nó khơng có khả năng liên kết với sterol. Một
nghiên cứu khác cho thấy ezetimib phá vỡ chức năng của các phức hợp protein khác
liên quan đến việc điều chỉnh sự hấp thu cholesterol, bao gồm cả phức hợp dị vòng
CAV1 - ANX2 (caveolin 1 và annexin 2) [26].

.

4


.

Hình 1.2. Cơ chế tác dụng của ezetimib (Nguồn: NCBI [28])
Dược động học
Hấp thu
Khoảng 93% liều được hấp thu sau khi uống. Sinh khả dụng tuyệt đối không thể
được xác định vì ezetimib hầu như khơng hịa tan trong mơi trường nước thích hợp
để tiêm. Dạng phối hợp cố định ezetimib và simvastatin tương đương sinh học với
liều tương ứng khi dùng từng thành phần riêng lẻ. Nồng độ đỉnh trong huyết tương
đạt được trong vòng 4 - 12 giờ sau khi uống [3].
Phân bố
Trên 90% thuốc gắn với protein huyết [3].
Chuyển hóa
Thuốc chuyển hóa nhanh chủ yếu ở ruột non và gan thành ezetimib glucuronid (có
hoạt tính). Ezetimib và ezetimib glucuronid chiếm tỷ lệ tương ứng 10-20% và 8090%, trong tổng số thuốc trong huyết tương. Thuốc có chu trình gan-ruột [3].
Thải trừ
Bài tiết qua phân (78%) và nước tiểu (11%) trong vòng 10 ngày sau khi dùng thuốc.
Thành phần chính trong phân là ezetimib (69% liều dùng), trong nước tiểu là
ezetimib glucuronid (9% liều dùng).
Thời gian đạt nồng độ đỉnh (Tmax) của ezetimib và chất chuyển hóa có hoạt tính
tương ứng là 4 - 12 giờ và 1 - 2 giờ. Hiệu quả trong khoảng 2 tuần [3].

.

5


.

Bảng 1.1. Thông số dược động học tham khảo
Liều

20 mg
5 mg
10 mg
20 mg

Ezetimib toàn phần
Cmax
AUC
Tmax
(ng/mL) (ng.h/mL)
(h)
64,2 (51)
726 (30) 2,3 (66)
50,1 (38)
240 (41) 0,9 (55)
73,6 (43)
440 (35) 1,3 (76)
119,0 (40)
819 (39) 1,2 (52)

Cmax
(ng/mL)
5,2 (52)
2,1 (64)
3,4 (51)
6,1 (66)

Ezetimib
AUC

(ng.h/mL)
86 (56)
22 (53)
41 (43)
76 (46)

Tmax (h) TLTK
9,9 (114)
3,8 (94)
8,2 (86)
7,3 (73)

[11]
[11]
[11]
[11]

Số liệu được biểu diễn dưới dạng: trung bình (CV%)
Chỉ định [3]
Tăng cholesterol máu nguyên phát: Ezetimib kết hợp với một thuốc ức chế men khử
HMG-CoA (statin) hoặc dùng một mình, được chỉ định như điều trị hỗ trợ chế độ ăn
kiêng để giảm lượng cholesterol toàn phần, cholesterol lipoprotein tỷ trọng thấp
(LDL-C), apolipoprotein B (Apo B), triglycerid (TG), cholesterol lipoprotein tỷ
trọng cao (non-HDL-C) và để tăng cholesterol lipoprotein tỷ trọng cao (HDL-C) ở
những bệnh nhân tăng cholesterol ngun phát (dị hợp tử có tính chất gia đình và
khơng có tính chất gia đình) là người lớn hoặc thanh thiếu niên (10 đến 17 tuổi).
Ezetimib kết hợp với fenofibrat được chỉ định điều trị hỗ trợ chế độ ăn kiêng để
giảm lượng cholesterol toàn phần, LDL-C, Apo B và non-HDL-C ở những bệnh
nhân người lớn tăng lipid máu kết hợp.
Tăng cholesterol máu đồng hợp tử có tính gia đình (HoFH): Ezetimib kết hợp với

một statin được chỉ định để giảm lượng cholesterol toàn phần và LDL-C ở những
bệnh nhân HoFH là người lớn hoặc thanh thiếu niên (10 đến 17 tuổi). Bệnh nhân
cũng có thể kết hợp thêm các phương pháp hỗ trợ khác (như lọc bỏ LDL).
Tăng sitosterol máu đồng hợp tử (Phytosterol máu): Ezetimib được chỉ định để
giảm lượng sitosterol và campesterol ở những bệnh nhân tăng sitosterol máu đồng
hợp tử có tính gia đình.
Phịng ngừa các biến cố tim mạch nguy hiểm trong bệnh thận mạn tính (CKD):
Ezetimib kết hợp với simvastatin được chỉ định để làm giảm nguy cơ các biến cố
tim mạch nguy hiểm ở những bệnh nhân mắc bệnh thận mạn tính.

.

6


.

Liều dùng - Cách dùng [3]
Bệnh nhân nên có chế độ ăn kiêng lipid hợp lý và nên duy trì chế độ ăn kiêng trong
thời gian điều trị với ezetimib.
Liều đề nghị ezetimib là 10 mg mỗi ngày, uống một mình, hoặc cùng với statin,
hoặc cùng với fenofibrat. Có thể uống ezetimib vào bất kỳ thời gian nào trong ngày,
cùng hoặc không cùng thức ăn.
Bệnh nhân suy thận/bệnh thận mạn tính
Đơn trị liệu: Khơng cần điều chỉnh liều ezetimib ở bệnh nhân suy thận. Kết hợp với
simvastatin: Không cần chỉnh liều ezetimib hoặc simvastatin ở những bệnh nhân
suy thận nhẹ (GFR (glomerular filtration rate - độ lọc cầu thận) ước tính ≥
60mL/phút/1,73 m2). Ở những bệnh nhân mắc bệnh thận mạn tính và GFR ước tính
< 60mL/phút/1,73m2, liều ezetimib là 10 mg và simvastatin là 20 mg x 1 lần/ngày,
uống vào buổi tối. Nên theo dõi chặt chẽ những bệnh nhân này nếu dùng liều

simvastatin cao hơn.
Người cao tuổi
Không cần điều chỉnh liều cho bệnh nhân cao tuổi.
Trẻ em
Trẻ em và thanh thiếu niên ≥ 6 tuổi: Không cần điều chỉnh liều.
Trẻ em < 6 tuổi
Không nên dùng Ezetimib.
Suy gan
Không cần điều chỉnh liều ở bệnh nhân suy gan nhẹ (điểm Child-Pugh 5 đến 6).
Không nên dùng ezetimib cho bệnh nhân suy gan trung bình (điểm Child-Pugh 7
đến 9) hoặc suy gan nặng (điểm Child-Pugh > 9).
Kết hợp với thuốc hấp phụ acid mật: Nên uống ezetimib hoặc trước ≥ 2 giờ hoặc
sau ≥ 4 giờ khi dùng thuốc hấp phụ acid mật.
Chống chỉ định [3]
- Phối hợp chất ức chế HMG - CoA reductase trên bệnh nhân bị bệnh gan hoạt động
hay tăng nồng độ transaminase huyết thanh kéo dài không rõ nguyên nhân.

.

7


.

- Bệnh nhân quá mẫn cảm với bất cứ thành phần nào của thuốc.
- Phụ nữ có thai, phụ nữ cho con bú.
1.2. TỔNG QUAN VỀ EZETIMIB PHENOXY β-D-GLUCURONID
1.2.1. Cấu trúc
Cơng thức cấu tạo:

Hình 1.3. Cơng thức cấu tạo ezetimib phenoxy β-D-glucuronid
Công thức phân tử: C30H29F2NO9 [30], [32].
Danh pháp: (2S,3S,4S,5R,6S)-6-[4-[(2S,3R)-1-(4-fluorophenyl)-3-[(3S)-3-(4fluorophenyl)-3-hydroxypropyl]-4-oxoazetidin-2-yl] phenoxy]-3,4,5trihydroxyoxan-2-carboxylic acid [30], [32].
Khối lượng phân tử: 585,55 g/mol [32].
Tính chất lý hóa
Mơ tả: dạng bột trắng ngà [30].
Tính tan: tan trong methanol, dimethyl sulfoxid [32], khó tan trong nước (0,0847
mg/mL [28]).
Điểm chảy: 137-140 oC [31].
Giá trị pKa: 3,23 [28].
logP: 2,48 [28].

.

8


.

1.3. MỘT SỐ CHUẨN NỘI SỬ DỤNG
1.3.1. Methyl paraben
Công thức cấu tạo:

Hình 1.4. Cơng thức cấu tạo methyl paraben
Cơng thức phân tử: C8H8O3 [33]
Danh pháp: methyl 4-hydroxybenzoat [33]
Khối lượng phân tử: 151,15 [33]
Tính chất lý hóa
Mơ tả: Hầu như khơng mùi, tinh thể nhỏ không màu hoặc bột kết tinh màu trắng
[33]

Tính tan: Ít tan trong nước, dễ tan trong ethanol, ether, tan trong acid trifluoroacetic
[33]
Điểm chảy: 131 oC [33]
Giá trị pKa: 8,57 [33]
logP: 1,96 [33]
1.3.2. Propyl paraben
Công thức cấu tạo

Hình 1.5. Cơng thức cấu tạo propyl paraben
Cơng thức phân tử: C10H12O3 [34]
Danh pháp: propyl 4-hydroxybenzoat [34]
Khối lượng phân tử: 180,20 [34]

.

9


.

Tính chất lý hóa
Mơ tả: dạng tinh thể khơng màu hoặc bột màu trắng hoặc chất rắn màu trắng đục
[34].
Tính tan: tan tốt trong ethanol, ethyl ether, ít tan trong cloroform, độ tan trong nước
là 463 mg/L ở 20 oC [34].
Điểm chảy: 96-97 oC [34]
Giá trị pKa: 8,5 [34]
logP: 3,04 [34]
1.3.3. Butyl paraben
Cơng thức cấu tạo

Hình 1.6. Cơng thức cấu tạo butyl paraben
Công thức phân tử: C11H14O3 [35]
Danh pháp: Butyl 4-hydroxybenzoat [35]
Khối lượng phân tử: 194,23 [35]
Tính chất lý hóa
Mơ tả: dạng tinh thể hoặc bột kết tinh màu trắng [35]
Tính tan: khơng tan trong nước, tan trong ether, aceton và propylen glycol, ít
tan trong dầu [35].
Điểm chảy: 68-69 oC [35]
Giá trị pKa: 8,47 [35]
logP: 3,57 [35]

.

10


.

1.3.4. Benzyl paraben
Cơng thức cấu tạo

Hình 1.7. Cơng thức cấu tạo benzyl paraben
Công thức phân tử: C14H12O3 [36], [37]
Danh pháp: benzyl 4-hydroxy benzoat [36]
Khối lượng phân tử: 228,24 [36]
Tính chất lý hóa
Mơ tả: bột màu trắng [37]
Tính tan: độ tan trong nước là 0,135 mg/mL [38]

Giá trị pKa: 8,5 [38]
logP: 3,66 [38]
1.3.5. Phenyl paraben
Cơng thức cấu tạo

Hình 1.8. Cơng thức cấu tạo của phenyl paraben
Công thức phân tử: C13H10O3 [40]
Danh pháp: phenyl 4-hydroxybenzoat [41]
Khối lượng phân tử: 214,22 [41]
Tính chất lý hóa
Mơ tả: Bột màu trắng [40]
Tính tan: tan trong methanol [39]
Điểm chảy: 182 oC [39]
Giá trị pKa: 11,41 [39]
logP: 3,22 [41]

.

11


.

1.4. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG - KHỐI PHỔ (LC-MS/MS)
1.4.1. Đại cương
Đây là kỹ thuật phân tích dựa trên sự kết hợp giữa sắc ký lỏng hiệu năng cao
(HPLC) và phân tích khối phổ (MS).
Sắc ký lỏng cao áp (high pressure liquid chromatography) hay sắc ký lỏng hiệu
năng cao (high performance liquid chromatography) là kỹ thuật sắc ký (được viết
tắt là SK) tách hỗn hợp trên cột được nhồi đầy bằng các hạt có kích thước ≤ 10 µm.

Do vậy, phải dùng một bơm có áp suất cao gần 300 atm để đẩy pha động qua cột (chứa
pha tĩnh) với tốc độ dòng vài ml/phút và cho phép phân giải nhanh một lượng mẫu cỡ
20 µg. Sắc ký lỏng hiệu năng cao ra đời từ 1960 đến nay, đã được sử dụng rộng rãi
trong các phịng thí nghiệm, áp dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau, do có độ nhạy
cao, giới hạn phát hiện thấp và dễ dàng áp dụng với độ đúng và độ chính xác đáp
ứng các yêu cầu về định lượng. Thích hợp với các chất khó bay hơi và chịu nhiệt
[2].
Máy phân tích phổ khối lượng (thường được gọi là máy đo phổ khối – Mass
Spectrometer – MS) dựa trên sự đo lường trực tiếp tỷ lệ khối lượng theo thế điện
tích ký hiệu là m/z) của những ion trong pha khí của chất phân tích [2].
Những ion của chất phân tích được sinh ta từ nguồn ion của máy được gia tốc và
được tách ra khỏi bộ phận phân tích trước khi được đưa đến bộ phận phát hiện. Tất
cả các quá trình này xảy ra trong một buồng có hệ thống bơm chân không sâu, đạt
từ 10-3 đến 10-6 Pa. Phổ khối được chỉ ra là sự tương quan giữa số lượng các ion có
giá trị m/z (đến bộ phân phát hiện) theo giá trị m/z. Đa số các ion đều mang điện
tích dương +1 nên tỷ lệ m/z tường đương với m (do đó thường gọi là phổ khối).
Thơng tin từ khối phổ đồ cho phép định tỉnh (dựa vào khối lượng phân tử, cấu trúc
phân mảnh) và định lượng (dùng chất chuẩn nội hay chuẩn ngoại) với giới hạn phát
hiện từ piconol (10-12 M) đến femtomole (10-15 M). Máy đo phổ khối được phân loại
dựa vào bộ phận tách các ion mang điện tích theo phương pháp nào: máy dùng từ
trường, máy dùng tứ cực bẫy ion hay máy sử dụng kỹ thuật thời gian bay [13].

.

12


.

Việc ghép máy sắc ký lỏng với phổ khối gặp nhiều khó khăn vì nhiều yếu tố khơng

tương thích về kỹ thuật giữa hai máy cần phải giải quyết [2]:
- Máy sắc ký lỏng: hoạt động ở áp suất cao, nhiệt độ thấp, mẫu phân tích ở thể lỏng
trong pha động (đơi khi khó bay hơi như dung dịch đệm), lưu lượng lớn (vài
ml/phút).
- Máy phổ khối: hoạt động ở áp suất chân không sâu, nhiệt độ cao, mẫu phân tích
phải ở thể khí, lưu lượng nhỏ (vài µl/phút).
Do đó, cần có những giao diện trung gian (interface) thích hợp như: giao diện đưa
mẫu lỏng trực tiếp, giao diện chùm tia hạt (Partical beam), giao diện FAB, giao diện
tia nhiệt (Themospray), giao diện ESI, giao diện APCI.
1.4.2. Kỹ thuật ion hóa

Hình 1.9. Độ nhạy và khoảng khối lượng giới hạn cho các kiểu ion hóa trong LCMS/MS [13]
Giao diện thơng dụng cho hệ thống LC-MS/MS là ESI và APCI. Trong đề tài này,
kỹ thuật ion hóa ESI sẽ được áp dụng.
Kỹ thuật ion hóa phun điện ESI
Mẫu phân tích được hịa tan trong dung mơi (thường là hỗn hợp đồng lượng
methanol – acetonitril 1-5%) để tạo thành dung dịch điện ly. Dung dịch chất điện ly
này cùng với khí mang được phun sương ra khỏi ống mao quản bằng thép khơng gỉ
có ϕ = 0,1 mm - 0,5 mm với vận tốc 1 - 10 µl/phút đi vào vùng điện trường có thể

.

13


.

áp đặt từ 3-6 kV trong áp suất khí quyển ở nhiệt độ phòng. Ra khỏi đầu mao quản,
các giọt sương mang điện tích dương hoặc âm (tùy thuộc vào điện thế dương hay
âm của điện trường) bị bay hơi dung môi nên càng ở xa đầu phun, giọt sương càng

có kích thước nhỏ và bị hút vào bộ phân tích khối lượng. Trong cách ion hóa này
mẫu thử phải được chuyển thành chất điện ly mà điều này phụ thuộc vào dung môi,
pKa của mẫu thử trong dung môi và pH của dung dịch điện ly. Các dung môi
thường sử dụng là: ethanol, methanol, acetonitril, aceton, tetrahydrofuran,
cloroform, dicloromethan…. Cách ion hóa này thường được dùng để phân tích các
peptid, protein bằng cách hòa tan trong hỗn hợp đồng lượng methanol - acetonitril
1-5%, để phân tích các polyethylen glycol (PEG) bằng cách tạo muối với natri hoặc
kali [2].
Ưu điểm [2]:
Ít cho phân mảnh ion nên dễ xác định được ion phân tử.
Thích hợp cho phân tích các hợp chất khơng bền nhiệt, các hợp chất có phân tử
lượng lớn tới 100.000 Da như protein, các hợp chất có tính phân cực.
Thường được dùng để phân tích các chất rửa giải từ hệ thống GC-MS, LC-MS.
Nhược điểm [2]:
Hiện diện các pic của những ion (M+Na)+ hay (M+23)+ và ion (M+K)+ hay
(M+39)+ làm phức tạp cho việc giải đoán cấu trúc.
Kỹ thuật ion hóa hóa học tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Chemical
Ionization – APCI)
Mẫu được hòa tan vào pha động từ máy sắc ký lỏng cho đi ngang qua một ống mao
quản đốt nóng và được phun sương ra khỏi ống mao quản nhờ dịng khí mang
nitrogen với lưu lượng dịng có thể đến 1mL/phút. Các giọt sương này đi vào vùng
điện trường có điện cực corona ở điện thế vài kV. Sự ion hóa có được do hiệu ứng
nhiệt ở áp suất khí quyển để tạo thành ion tựa phân tử (M+H)+ nếu trao đổi proton,
hoặc tạo thành ion tựa phân tử (M+H)- nếu trao đổi electron. Các ion này bị hút vào
bộ phân tích khối lượng do áp suất chân khơng ở đây. Kiểu ion hóa này có thể tạo ra
một số phân mảnh ion và thích hợp cho những phân tích những hợp chất có phân tử
lượng nhỏ, độ phân cực trung bình rửa giải từ máy HPLC [2].

.

14


.

1.4.3. Bộ phận tách ion
Sau khi bị ion hóa, các ion có tỷ số khối lượng trên điện tích (m/z) khác nhau di
chuyển đến bộ phận phân tách các ion mang điện tích. Có các loại tiêu biểu là: máy
dùng từ trường, máy dùng tứ cực - bẫy ion hay máy sử dụng kỹ thuật thời gian bay
[2].
Trong đề tài này sử dụng máy tứ cực - quadrupole.
Sự khác biệt là ở bộ phân tích khối lượng gồm hai cặp cực hình trụ được đặt song
song một cách chính xác. Một hiệu điện thế gồm vừa điện một chiều (U), vừa điện
xoay chiều có tần số rất cao 108 Hz (V.cos.ωt) được áp đặt vào hai thanh kề nhau
nên chúng chịu một hiệu điện thế chung (U + V.cos.ωt). Với một giá trị cố định (U +
V.cos.ωt) chỉ những ion với động năng đặc trưng nào đó mới có thể đi vượt qua các
thanh tứ cực để đến được bộ phận thu nhận tín hiệu [2].
Bộ phận phân tích khối hai tứ cực (Triple quadrupole)
Một cấu hình thiết bị khối phổ đặc biệt hữu ích thu được khi đặt một buồng va chạm
ở giữa hai tứ cực. Sự kết hợp này được gọi là khối phổ ba tứ cực và là một ví dụ của
MS liên tục trong đó hai hoặc nhiều giai đoạn phân tích khối lượng được thực hiện
độc lập. Ưu điểm của MS liên tục là độ đặc hiệu của phương pháp phân tích tăng
lên đáng kể so với phân tích khối lượng một tứ cực [17].
Tứ cực thứ nhất và tứ cực thứ ba có thể đồng thời phân đoạn các giá trị m/z khác
nhau, và một bảng các cặp ion mảnh mẹ/ mảnh con có thể được tạo ra để đặc biệt
phát hiện một lượng lớn các chất phân tích mong muốn [17].

Hình 1.10. Cấu tạo của một bộ phân tích khối hai tứ cực [17]

.

15