ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG VƯỜN GIỐNG VÔ TÍNH BẠCH ĐÀN VÀ QUY TRÌNH NHÂN NHANH INVITRO MỘT SỐ DÒNG BẠCH ĐÀN ƯU TRỘI CỦA VƯỜN GIỐNG FORTIP VẠN XUÂN PHỤC VỤ SẢN XUẤT

BỘ CÔNG THƯƠNG
TỔNG CÔNG TY GIẤY VIỆT NAM
VIỆN NGHIÊN CỨU CÂY NGUYÊN LIỆU GIẤY
……………………*……………………




BÁO CÁO KẾT QUẢ ĐỀ TÀI
CẤP BỘ NĂM 2008

TÊN ĐỀ TÀI:

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG VƯỜN GIỐNG VÔ TÍNH BẠCH
ĐÀN VÀ QUY TRÌNH NHÂN NHANH INVITRO MỘT SỐ
DÒNG BẠCH ĐÀN ƯU TRỘI CỦA VƯỜN GIỐNG FORTIP
VẠN XUÂN PHỤC VỤ SẢN XUẤT




CƠ QUAN CHỦ QUẢN: BỘ CÔNG THƯƠNG
CƠ QUAN CHỦ TRÌ: VIỆN NGHIÊN CỨU CÂY NGUYÊN LIỆU GIẤY
CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: ThS. PHẠM ĐỨC HUY




7116
17/02/2009

PHÚ THỌ, THÁNG 12/2008

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
HSNC: Hệ số nhân chồi
TLCHH: Tỷ lệ chồi hữu hiệu
BAP: 6-Benzylaminopurine
NAA: 1-Naphtalene acetic acid
IBA: 3-Indolbutiric acid
Hvn (m): Chiều cao vút ngọn
Dg (cm): Đường kính phía trên vị trí ghép
Dt (m): Đường kính tán lá
S (%): Tỷ lệ sống
N: Số mẫu kiểm tra

MỤC LỤC

Trang
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

TÓM TẮT
1
I. TỔNG QUAN
2
1.1. Cơ sở pháp lý của đề tài
2
1.2. Tính cấp thiết và mục tiêu nghiên cứu của đề tài
2

1.2.1. Tính cấp thiết của đề tài
2
1.2.2. Mục tiêu của đề tài
3
1.3. Địa điểm, đối tượng và nội dung nghiên cứu
4
1.3.1. Địa điểm nghiên cứu
4
1.3.2. Đối tượng nghiên cứu
4
1.3.3. Nội dung nghiên cứu
4
1.4. Tổng quan tình hình nghiên cứu
5
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trong nước
5
1.4.2. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài
7
II. THỰC NGHIỆM
9
2.1. Phương pháp nghiên cứu
9
2.1.1. Trồng vườn giống
9
2.1.2. Trồng và chăm sóc vườn vật liệu
10
2.1.3. Thử nghiệm nhân giống invitro
10
2.1.3.1. Phương pháp cắt, rửa và khử trùng mẫu 11
2.1.3.2. Thử nghiệm và chọn môi trường cơ bản 11

2.1.3.3. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến HSNC và
TLCHH
11
2.1.3.4. Điều kiện thí nghiệm 13
2.1.3.5. Thu thập và xử lý số liệu 13
2.2. Thiết bị, dụng cụ và nguyên vật liệu
15
2.3. Kết quả thực nghiệm và thảo luận
16
2.3.1. Trồng vườn giống
16
2.3.1.1.
Điều tra chọn địa điểm và thu thập điều kiện tự nhiên của địa
đ
iểm thiết lập vườn giống
16
2.3.1.2. Thiết kế và trồng vườn giống 16
2.3.1.3. Sinh trưởng của các dòng ở 6 tháng tuổi 16
2.3.2. Trồng vườn vật liệu
21
2.3.3. Thử nghiệm nhân giống invitro
21
2.3.3.1. Nghiên cứu môi trường cơ bản thích hợp cho nhân nhanh chồi. 21
2.3.3.2.
Ảnh hưởng của BAP đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu
hiệu
23
2.3.3.3.
Ảnh hưởng của BAP và NAA đến hệ s
ố nhân chồi và tỷ lệ

chồi hữu hiệu
26
2.3.3.4.
Ảnh hưởng của BAP và IBA đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi
hữu hiệu
30
2.3.2.5. So sánh HSNC và TLCHH giữa 5 dòng 31
III KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
33
3.1. Kết luận
33
3.2. Kiến nghị
33
IV. TÀI LIỆU THAM KHẢO
35
PHẦN PHỤ BIỂU




1
TÓM TẮT
Đề tài: “Nghiên cứu xây dựng vườn giống vô tính Bạch đàn và quy trình
nhân nhan in vitro một số dòng Bạch đàn ưu trội của vườn giống FORTIP Vạn
Xuân phục vụ sản xuất” được thực hiện trong 2 năm (2007 và 2008). Năm 2007,
đề tài đã chọn lọc được 20 cây trội của vườn giống FORTIP Vạn Xuân, thử
nghiệm các phương pháp ghép và tạo được 400 cây ghép với cành ghép được lấy
từ 20 cây trội
đã chọn lọc
Năm 2008, đề tài đã thực hiện 2 mục tiêu chính là xây dựng vườn giống

từ cây ghép của 20 dòng đã được chọn lọc và tiến hành nghiên cứu nuôi cấy in
vitro cho 5 dòng ưu trội nhất từ 20 dòng đã chọn lọc.
Vườn giống được trồng tháng 6 năm 2008, diện tích 1,0 ha tại Đội Ngọc
Mỹ - Công ty lâm nghiệp Lập Thạch – Vĩnh Phúc. Các dòng cây ghép cho tỷ lệ
sống cao, biến động từ
82-100%. Đến nay sinh trưởng của các dòng cây ghép
tương đối tốt và không bị sâu bệnh.
Đề tài thực hiện các thử nghiệm nhân giống in vitro giai đoạn nhân chồi
bao gồm: thử nghiệm môi trường cơ bản, nồng độ BAP, ảnh hưởng phối hợp của
BAP + NAA và BAP + IBA. Đề tài chọn được môi trường MS + 30g/l sucrose +
4.5g/l agar + 2.0mg/l vitaminB2 + 1.5mg/l BAP + 1.5 mg/l NAA, pH =6 là thích
hợp nhất trong các môi trường đã thử nghiệm và cũng là môi trường phù hợp
cho cả 5 dòng tiến hành nghiên cứu.

2
I. TỔNG QUAN
1.1. Cơ sở pháp lý của đề tài.
- Căn cứ quyết định số 1999/QĐ-BCT, ngày 03/12/2007 của Bộ trưởng Bộ
Công nghiệp về việc giao kế hoạch khoa học và công nghệ năm 2008 cho Viện
nghiên cứu cây nguyên liệu giấy.
- Căn cứ hợp đồng nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ số 45.08
RD/HĐ-KHCN, ngày 23/01/2008.
- Căn cứ quyết định số 12/QĐ-KHTH, ngày 28/01/2007 của Viện trưở
ng
Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy về việc giao nhiệm vụ nghiên cứu khoa
học và phát triển công nghệ.
- Căn cứ quy phạm kỹ thuật xây dựng rừng giống và vườn giống (QPN 15
– 93) của Bộ Lâm nghiệp ngày 02/11/1993 (chi tiết xem phụ biểu 5).
1.2. Tính cấp thiết và mục tiêu nghiên cứu của đề tài.
1.2.1. Tính cấp thiết của đề tài.

Ở nước ta hiện nay, cây Bạch đàn (Eucalyptus) là một trong những loài cây
trồ
ng rừng chủ lực trên hầu hết các vùng sinh thái nhằm đáp ứng các nhu cầu
nguyên liệu giấy, gỗ trụ mỏ, gỗ xây dựng, gỗ xẻ và củi. Trong khoảng 10 năm
trở lại đây, năng suất rừng trồng bạch đàn đã được cải thiện rõ rệt nhờ kết quả
của các chương trình cải thiện giống.
Giai đoạn từ năm 1996-1999, dự án FORTIP (Regional Project on Forest
Tree Improvement) về cải thiện giống cây rừng đã xây dựng 46 ha rừng giống và
vườn giống cho các loài cây Bạch đàn, Keo lá tràm và Keo tai tượng với nguồn
hạt được lấy từ các giống, xuất xứ triển vọng trong và ngoài nước. Dự án cũng
đã xây dựng được nhiều vườn giống, rừng giống thế hệ 1 và thế hệ 1.5 đáp ứng
nhu cầu giống cho nghiên cứu và sản xuất [3].
Vườ
n giống Bạch đàn tại Vạn Xuân, Phú Thọ gồm 144 gia đình được thiết
lập năm 1996 là một trong những vườn giống có nhiều gia đình và cá thể có
năng suất rất cao trong dự án FORTIP nói trên. Đây là nguồn vật liệu quý cần để
chọn lọc những dòng có năng suất cao từ đó nhân giống phục vụ trồng rừng và

3
xây dựng vườn giống cho phục phụ các chương trình nghiên cứu cải tạo giống
tiếp theo.
Đồng thời, để đạt được kết quả tốt thì một chương trình cải thiện giống
không chỉ dừng lại ở chỗ có được những giống được cải thiện mà giống đó phải
được nhân rộng phục vụ sản xuất và cung cấp vật liệu cho các chương trình c
ải
thiện giống khác. Do đó, yêu cầu cần thiết là xây dựng vườn giống từ các dòng
đã chọn lọc và tiến hành nhân giống vô tính phục vụ cho trồng rừng thử nghiệm
từ đó từng bước đưa cây giống chất lượng cao vào trồng rừng sản xuất.
Trong xây dựng rừng giống, vườn giống, để tăng phẩm chất di truyền của
hạt giống, người ta thiế

t lập vườn giống bằng cây ghép với cành ghép lấy từ cây
tuyển chọn và gốc ghép là cây có sức chống chịu tốt với điều kiện bất lợi của
ngoại cảnh như khí hậu, đất đai, sâu bệnh vv. Vườn giống trồng từ cây ghép có
nhiều ưu điểm rõ rệt so với vườn giống trồng từ hạt như nhanh ra quả, duy trì các
đặc tính di truyền của cây mẹ
[12].
Về nhân giống vô tính, hiện nay ở nước ta thì nhân giống bằng phương
pháp nuôi cấy in vitro là phương pháp ưu thế nhất. Đặc biệt trong nhân giống
cây bạch đàn nói riêng và cây lâm nghiệp nói chung thì đây là phương pháp cho
hiệu quả rõ rệt nhất.
Từ những đặc điểm trên, xây dựng vườn giống bằng cây ghép với cành
ghép từ những cây ưu trội của vườn giống FORTIP Vạn Xuân và thử nghiệm
nhân giố
ng in vitro là cần thiết. Xây dựng vườn giống cung cấp nguồn hạt giống
cho khảo nghiệm chọn lọc giống mới và phục vụ lai tạo giống. Thử nghiệm nhân
giống in vitro nhằm tạo cây con phục vụ khảo nghiệm dòng vô tính, công nhận
giống mới và phát triển vào sản xuất.
1.2.2. Mục tiêu của đề tài.
1) Xây dựng vườn giống từ cây ghép của các dòng bạch đàn nă
ng suất cao tại
vườn giống FORTIP Vạn Xuân.
2) Xác định điều kiện nuôi cấy in vitro (môi trường hóa học) thích hợp để nhân
nhanh các dòng đã được chọn lọc tại vườn giống FORTIP Vạn Xuân phục
vụ sản xuất.


4
1.3. Địa điểm, đối tượng và nội dung nghiên cứu.
1.3.1. Địa điểm:
Vườn giống được thiết lập tại Đội Ngọc Mỹ - Công ty Lâm nghiệp Lập

Thạch với diện tích 1,0 ha. Vườn vật liệu và thử nghiệm nhân giống in vitro tại
Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy.
1.3.2. Đối tượng nghiên cứu
• Cây trồng vườn giống:
Vườn giống đượ
c trồng từ cây ghép với cành ghép lấy từ 20 cây trội được
chọn lọc của vườn giống Vạn Xuân (20 cây trội đã được chọn năm 2007 của đề
tài này chi tiết xem phụ biểu 1).
Cây ghép đem trồng là cây có vết ghép đã ổn định. Sinh trưởng phát triển
tốt, không sâu bệnh, tán lá phát triển cân đối, chiều cao > 50cm.
• Cây thử nghiệm nuôi cấy in vitro:
Từ 20 cây trội đã chọn lọc, đề
tài lựa chọn 5 cây có thể tích thân cây cao
nhất làm đối tượng để tiến hành nghiên cứu nhân giống in vitro, cụ thể là các cây
trội sau: Cây trội số 154, 141, 122, 136 và 126 (đặc điểm cụ thể của 5 cây trội
thử nghiệm nhân giống in vitro xem phụ biểu 1).
1.3.3. Nội dung nghiên cứu.
Để đạt được mục tiêu đề ra, đề tài thực hiện các nội dung nghiên cứu sau:
1. Điều tra chọn địa đi
ểm thiết lập vườn giống.
2. Thu thập điều kiện tự nhiên, đất đai của địa điểm thiết lập vườn giống.
3. Thiết kế và trồng vườn giống.
4. Trồng và chăm sóc vườn vật liệu phục vụ cho nuôi cấy in vitro.
5. Nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy in vitro.
6. Thu thập các chỉ tiêu nghiên cứu, xử lý s
ố liệu và viết báo cáo khoa học.

5
1.4. Tổng quan tình hình nghiên cứu.
1.4.1. Trong nước.

Ở Việt Nam, từ năm 1996-1999, dự án FORTIP (Regional Project on
Forest Tree Improvement) về cải thiện giống cây rừng đã xây dựng 46 ha rừng
giống và vườn giống cho các loài cây Keo lá tràm, Keo tai tượng và Bạch đàn
với nguồn hạt được lấy từ các xuất xứ tốt trong và ngoài nước. Các gia đình
trồng trong vườn giống theo khối, lặp lại 8 lần. Sau đó đánh giá sinh trưởng và
giữ lại những gia
đình tốt nhất có triển vọng [3].
Ngoài diện tích rừng giống trên, hiện nay nước ta chiếm đa số là các rừng
giống được chuyển hoá từ rừng tự nhiên hoặc rừng trồng, nên phẩm chất di
truyền của hạt giống còn thấp. Chúng ta có khoảng 2.000 ha rừng giống và vườn
giống các loại như Thông 3 lá ở Lâm Đồng, Thông Nhựa ở Quảng Bình, Tếch ở
Định Quán, Keo và Bạch đàn ở Vùng Trung tâm Bắ
c bộ.
Vấn đề xây dựng rừng giống đã được Viện nghiên cứu cây nguyên liệu
giấy quan tâm từ lâu, năm 1996 Viện đã chuyển hoá được 10,3 ha rừng giống từ
rừng trồng với nguồn hạt nhập nội. Hiện nay, rừng giống chuyển hoá này đã cho
hiệu quả kinh tế rõ rệt, rừng trồng từ nguồn hạt này cho năng suất và chất lượng
rừ
ng tăng lên rõ rệt.
Trong những năm gần đây, Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng – Viện
Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam đã xây dựng vườn giống Bạch đàn ghép tại Ba
Vì phục vụ cho công tác lai tạo. Đây cũng là một trong số rất ít vườn giống cây
lâm nghiệp được trồng bằng cây nghép ở nước ta [3].
Đối với lĩnh vực nhân giống in vitro, mặc dù còn nhiều khó khăn cần giải
quy
ết, song trong những năm gần đây, việc áp dụng các biện pháp nhân giống in
vitro vào nghiên cứu và thực tiễn sản xuất trong lâm nghiệp đã thu được kết qủa
đáng khích lệ. Một số cơ sở đã tiến hành nhân giống in vitro ở quy mô công
nghiệp như Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy – Phù Ninh – Phú Thọ, Lâm
trường thực nghiệm Yên Lập – Quảng Ninh, Công ty Giống cây Lâm nghiệp

Trung ương, …vv. Đồng thời, mộ
t số tỉnh và địa phương đã thành lập phòng
nuôi cấy in vitro để phục vụ cho công tác giống cây trồng và đã có những thành
công bước đầu.

6
Một số loài cây trồng rừng quan trọng, một số loài cây quý hiếm đã được
nghiên cứu và sản xuất. Cây Bạch đàn (Eucalyptus), cây Tếch (Techtona
grandis), cây Hông (Paulownia fortunei) đã được Viện nghiên cứu cây nguyên
liệu giấy Phù Ninh sản xuất ở quy mô công nghiệp; cây Keo lai (A. mangium x
A. auriculiformis) cây Trầm gió (Aquilaria crassna Pierri), cây tre Tàu
(sinocalamus latiflus), tre Mạnh tông (Dendrocalamus asper) và nhiều loài cây
khác đã nghiên cứu thành công. Các kết quả này cho thấy bước đầu có nhiều
triển vọ
ng cho sản xuất cây con giống chất lượng cao.
Mai Đình Hồng, 1995 đã đưa ra môi trường nuôi cấy in vitro cây bạch đàn
urô dòng U6 như sau: môi trường nhân chồi là MS + 3% đường + 4.5 g/l agar +
0.5 mg/l BAP + 0.25 mg/l NAA. Môi trường tạo rễ và cây con hoàn chỉnh là MS
1/4 nồng độ + 1.5 % đường + 5 g/l agar + 1 mg/l IBA [2].
Nhóm tác giả của Viện Sinh học nhiệt đới, Sở NN&PTNT Kiên Giang và
Trường Đại học Nông lâm Tp.HCM đã nghiên cứu và đưa ra môi trường nuôi
cấy cây Trầm hương (Aquilaria crassna) là WPM + 0.1 mg/l BA + CW (10%)
cho phát sinh chồi. Môi trường thuận l
ợi cho tạo chồi và nhân nhanh chồi là
WPM + BA (0.1 mg/l) + NAA (0.1 mg/l) [7].
Cũng với cây trầm, Đoàn Thị Mai và cộng sự đã đưa ra môi trường nhân
chồi thích hợp là MS cải tiến bổ sung 1.0 mg/l BAP + 0.5 mg/l kinetin. Môi
trường ra rễ thích hợp nhất là 1/2 MS cải tiến bổ sung 2.0 mg/l IBA [5].
Nhân giống in vitro cây Tre tàu (Sinocalamus latiflorus) và tre Mạnh tông
(Dendrocalamus asper) với mẫu vật được lấy từ hạt và được khử trùng bằng

hypoclorit canxi trong 15 phút, HgCr
2
trong 5 phút. Qua nhiều công thức thí
nghiệm, nghiên cứu thu được kết quả sau: Tạo chồi từ hạt tốt trên môi trường
MS có BA 3 mg/l và Kinetin 1 mg/l; nhân chồi tốt trên môi trường MS có BA
2mg/l và kinetin 1 mg/l; chồi, cây con ra rễ và sinh trưởng thành cây hoàn chỉnh
tốt trên môi trường có nồng độ khoáng MS giảm 1/2 và IBA 10 mg/l [10].
Nhân giống vô tính cây Hông (Paulownia fortunei) bằng phương pháp
nuôi cấy mô. Mẫu nuôi cấy tạo vật liệu ban đầu từ chồi đỉnh và chồi bên. Mẫu
vật được khử trùng bằng hypoclorit canxi trong 20 phút sau đó cấ
y vào các loại
môi trường khác nhau. Kết quả thu được như sau: môi trường thích hợp nhất cho
tạo chồi và nhân nhanh chồi là MS cải tiến có bổ sung 30 g/l đường, 8 g/l agar, 5

7
mg/l BA và 0.1 mg/l NAA. Môi trường tạo rễ và cây con hoàn chỉnh tối ưu là 1/2
dinh dưỡng khoáng MS + 20g/l đường + 0.1 mg/l NAA + 1.0 g/l than hoạt tính
[13].
1.4.2. Ngoài nước.
Ở các nước có nền lâm nghiệp phát triển, mạng lưới cung ứng giống được
xây dựng khá hoàn chỉnh. Mỗi địa phương đều có rừng giống và vườn giống
cung cấp nguồn hạt giống, vật liệu nhân giống cho địa phương đó. Do vậy chủ
động nguồn giống cho các chương trình tr
ồng rừng của khu vực.
Ngoài vườn giống lấy hạt, một số nước còn thiết lập vườn giống nghiên
cứu hay còn gọi là ngân hàng dòng (clone banks) với mục đích là lưu giữ và bảo
tồn các giống đã tuyển chọn phục vụ cho các chương trình cải thiện giống dài
hạn nhằm sản xuất một lượng lớn hạt giống từ những dòng ưu tú đã chọn lọ
c.
Trong lĩnh vực nhân giống in vitro, môi trường hóa học dùng cho các loài

cây thân gỗ rất đa dạng, tuy nhiên người ta thường sử dụng 5 loại môi trường
sau[14]:
 Môi trường khoáng MS (Murashige & Skoog, 1962) là môi trường cơ bản,
giàu dinh dưỡng thích hợp cho các loài thực vật nói chung. Môi trường
này không chỉ đơn thuần sử dụng trong nuôi cấy mô mà nó còn được sử
dụng trong nuôi cấy tế bào, nuôi cấy phôi vô tính, nuôi cấy hạt phấn, bao
phấn…vv.
 Môi trường MS cải tiế
n (Murashige & Skoog medium including Nitsch
vitamins, 1969). Đây là môi trường MS (1962) được bổ sung thêm một số
loại vitamin. Thành phần môi trường được nghiên cứu và công bố bởi
Nitsch năm 1969, môi trường này được sử dụng để nuôi cấy nhiều loài cây
khác nhau trong đó có cây mận (Prunus spp), cây ôliu (Olea
europaea)…vv.
 Môi trường WPM (Woody Plant Medium) được Mccown đưa ra vào năm
1980 là môi trường thường được dùng để nuôi cấy các loài cây gỗ. Đã có
nhiều công trình nuôi cấy in vitro sử dụng môi trường này như nhân giống
thông (Loblolly pine, Pinus taeda
) ở Mỹ.

8
 Môi trường Litvay là môi trường mà tên môi trường được lấy từ tên tác
giả nghiên cứu ra (Litvay J.D, 1985). Đây cũng là môi trường được tác giả
sử dụng để nuôi cấy cây thông nói chung (Pinus).
 Môi trường WV3 (Westvaco3 Medium, 1997) là môi trường đã được sử
dụng để nuôi cấy cây thông, cây dương.
lai (P. caribaea x P. elliottii) ở Ôxtrâylia,…vv.
Công trình của M.E.cortezzi Graca và S.Mendes thuộc Trung tâm nghiên
cứu lâm nghiệp Curitiba, Brazil đã nuôi cấy in vitro cây Bạch đàn (Eucalyptus
dunnii Maid) tốt nhất trên môi trường MS có bổ sung 0,1 mg/l BAP + 0,01 mg/l

IBA[16].
I. Joihs và cộng sự của Viện nghiên cứu lâm nghiệp Ấn Độ đã nuôi cấy
thành công cây Bạch đàn lai (E.terecornis x E.gandis) trên môi trường MS +
BAB 1,0mg/l và NAA 1,0 mg/l[15].

9
II. THỰC NGHIỆM.
2.1. Phương pháp nghiên cứu.
2.1.1. Trồng vườn giống.
Vườn giống được trồng theo quy phạm kỹ thuật xây dựng rừng giống,
vườn giống hiện hành của Bộ NN&PTNT (Quy phạm ngành 15-93) và các tiêu
chuẩn kỹ thuật trong trồng rừng Bạch đàn.
a) Xử lý thực bì.
Thực bì được phát trắng toàn diện theo lô, sau đó xếp thực bì theo băng
rộng 2m và đốt hoàn toàn. Thực bì được xử lý trước khi cuốc hố 20 ngày.
b) Làm đất.
Hố trồng được cuốc với kích thước 60x60x60cm. Trước khi trồng 10 ngày
bón lót 500g/hố phân NPK 10-5-5 và 10kg/hố phân chuồng hoai sau đó trộn
phân và lấp đất đầy hố cao hơn mặt đất tự nhiên 5cm .
c) Trồng và chăm sóc vườn giống
Cự ly trồng là 6m x 6m (hàng cách hàng 6m và cây cách cây 6m), mật độ
277 cây/ha. Thời vụ trồng vào vụ xuân từ 15/02 đến 15/05. Hàng nằm trên
đường từ chân lên đỉnh theo hướng Đông – Tây.
Các dòng được trồng theo hàng có chuyển dịch sao (phụ lục 4) cho các cây
cùng một dòng cách xa nhau nhằm hạn chế tối đa sự giao phấn trong cùng một
dòng
Thường xuyên kiểm tra, theo dõi và cắt tỉa các chồi phát sinh ở phần gốc
ghép. Chăm sóc năm 1 (nă
m 2008) 3 lần, cụ thể như sau:
Lần 1: Phát thực bì cạnh tranh, cắt dây leo trên toàn diện tích, rẫy cỏ và xới vun

đất màu xung quanh gốc với đường kính từ 0,5 – 0,6m. Tiếp tục trồng dặm cây
chết, thời gian chăm sóc từ 1-1,5 tháng, thời gian chăm sóc vào tháng 5-6.
Lần 2: Phát thực bì cạnh tranh, cắt dây leo trên toàn diện tích, rẫy cỏ và xới vun
đất màu xung quanh gốc với đường kính từ 0,6 – 0,8m. Thời gian chăm sóc vào
tháng 8-10. Bón thúc 500gam phân NPK
Lần 3: Phát thực bì cạnh tranh, cắt dây leo trên toàn di
ện tích.

10
 Theo dõi, thu thập số liệu của vườn giống.
Theo dõi thu thập các chỉ tiêu Hvn; Hg; Dt; sâu bệnh và phẩm chất cây: tốt,
xấu, trung bình.
- Cây tốt: là cây sinh trưởng tốt, tán lá xanh đẹp, phát triển cân đối, không sâu
bệnh.
- Cây trung bình: là cây sinh trưởng phát triển ở mức độ trung bình, không sâu
bệnh.
- Cây xấu: là cây sinh trưởng kém, còi cọc, sâu bệnh.
2.1.2. Trồng và chăm sóc vườn vật liệu
Vườn vật liệu được trồng từ cây ghép của 5 cây trội chọn lọc. Cây được
trồng ra đất theo luống, giữa các luống cách nhau 0,5m. Cây được trồng theo
hàng trên luống với cự ly 25 x 25cm, mỗi giống trồng 20 cây.
Trước khi trồng làm đất toàn diện và nhặt sạch cỏ, khi trồng bón lót 100g
phân NPK cho mỗi hố. Vườn vật liệu
được tưới chăm sóc và rẫy nhổ cỏ và cắt
tỉa tạo chồi thường xuyên nhằm cung cấp nguồn vật liệu tốt nhất cho nhân giống
in vitro.
2.1.3. Thử nghiệm nhân giống in vitro.
Sơ đồ chung của phương pháp nhân giống in vitro
Cây trội (đối tượng cần nhân giống).
Xử lý cho nảy chồi và cắt mẫu.

Khử trùng mẫu nuôi cấy
Cấy mẫu vào
Môi trường tái sinh chồi (giai đ
oạn tạo vật liệu khởi đầu).
5 loại môi trường khác nhau để tìm ra môi trường thích hợp nhất.
Nuôi mẫu trong tủ lạnh.
Tăng tỷ lệ sống của mẫu nuôi cấy.
Môi trường nhân nhanh chồi.
Môi trường được bổ sung auxin, cytokinin, các chất đa lượng, vi
lượng và vitamin với tỷ lệ khác nhau nhằm tìm ra môi trường thích
hợp cho nhân nhanh chồi.


11
Nội dung cụ thể của phương pháp như sau:
2.1.3.1. Phương pháp cắt, rửa và khử trùng mẫu cấy
• Cắt mẫu.
Mẫu nuôi cấy (explant) lấy từ chồi bên của cây cấp dòng. Mẫu được lấy ở
chồi từ 30-40 ngày tuổi, sinh trưởng tốt, không sâu bệnh, cắt bỏ phần ngọn non,
toàn bộ phiến lá và gần hết phần cuống lá (cuống lá được cắt sát với chồi) . Mẫu
cấy có chiều dài từ 1.5-3.0 cm, đường kính mẫu cấy từ 1-2 mm, mang từ 2-3
nách lá trong đoạn từ lá thứ 3 đế
n lá thứ 6.
• Khử trùng mẫu
Mẫu sau khi cắt được ngâm ngay vào nước. Sau đó rửa mẫu bằng nước 3
lần, tiếp tục rửa bằng xà phòng (xà phòng bột) và rửa lại 4 lần bằng nước cất.
Đưa mẫu vào phòng cấy vô trùng, rửa lại 2 lần bằng nước cất vô trùng.
Khử trùng bằng cồn 75
0
khoảng 2 giây, sau đó rửa lại 4 lần bằng nước cất vô

trùng. Cuối cùng, khử trùng mẫu bằng HgCl
2
0,1% trong thời gian 11 phút.
2.1.3.2. Thử nghiệm và chọn môi trường cơ bản.
Đề tài tiến hành cấy mẫu đã được khử trùng vào ống nghiệm chứa 5 loại
môi trường sau có bổ sung sucrose 30g/l; 4.5g/l agar, 2.0mg/l vitamin B2, pH=6
và không bổ sung chất điều hoà sinh trưởng (thành phần 5 loại môi trường xem
phụ biểu 2)[14].
1. Công thức 1: Môi trường Litvay.
2. Công thức 2: Môi trường MS.
3. Công thức 3: Môi trường MS cải tiến.
4. Công thức 4: Môi trường WPM.
5.
Công thức 5: Môi trường WV3.
6. Công thức 6: Đối chứng (môi trường nuôi cấy dòng PN14 không bổ
sung chất điều hòa sinh trưởng)[8].
2.1.3.3. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến HSNC và TLCHH.
Các chất điều hoà sinh trưởng tuy chiếm hàm lượng rất nhỏ trong môi
trường nuôi cấy nhưng có vai trò quan trọng quyết định sự thành công của quá
trình nhân giống. Trong môi trường nhân giống in vitro người ta thường sử dụng

12
các chất kích thích sinh trưởng trong nhóm auxin như NAA và IBA. Các chất
trongvà cytokinin . Auxin được sử dụng để điều chỉnh sự phát sinh rễ. Cytokinin
sử dụng để điều chỉnh sự phát sinh chồi. Tỷ lệ cân đối giữa auxin/cytokinin tạo
cây hoàn chỉnh [1]. Trong nhân giống in vitro, người ta thường sử dụng auxin là
IAA, NAA và IBA, cytokinin là BAP, BA và kinetin.
• Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến HSNC và TLCHH của 5 dòng
nghiên cứu.
Từ môi trường cho HSNC tốt nhất ở các thí nghiệm về ảnh hưởng của môi

trường cơ bản đến HSNC (MS + 30 g/l sucrose + 4.5g/l agar + 2.0 mg/l vitamin
B2, pH=6) chúng tôi tiến hành bổ sung BAP ở mức các nồng độ thay đổi như
sau:
Công thức 7: Nồng độ 0,5 mg BAP/l.
Công thức 8: Nồng độ 1,0 mg BAP/l.
Công thức 9: Nồng độ 1,5 mg BAP/l.
Công thức 10: Nồng độ 2,0 mg BAP/l.
Công thức 11: Nồng độ 2,5 mg BAP/l.
Công th
ức 12: Đối chứng (môi trường sản xuất dòng PN14).
• Ảnh hưởng phôi hợp của BAP và NAA đến HSNC và TLCHH.
Để tìm hiểu ảnh hưởng của auxin đến quá trình phát sinh chồi trong sự
tương tác với BAP và cũng là để tìm ra môi trường thích hợp cho nhân chồi 5
dòng nghiên cứu, đề tài tiến hành bổ sung NAA với các nồng độ khác nhau vào
môi trường MS + 30 g/l sucrose + 4.5g/l agar + 2.0 mg/l vitamin B2 + 2.0 mg/l
BAP, pH=6 (môi trường cho HSNC và TLCHH cao nhất ở thí nghiệm trên).
Nồng độ NAA trong môi trường thay đổi như sau:
Công thức 13: Nồng độ 0,5 mg/l NAA
Công th
ức 14: Nồng độ 1,0 mg/l NAA
Công thức 15: Nồng độ 1,5 mg/l NAA
Công thức 16: Nồng độ 2,0 mg/l NAA
Công thức 17: Nồng độ 2,5 mg/l NAA
Công thức 18: Đối chứng (môi trường sản xuất dòng PN14).



13
• Ảnh hưởng phôi hợp của BAP và IBA đến HSNC và TLCHH.
Song song với việc nghiên cứu ảnh hưởng phối hợp của BAP và NAA,

đến HSNC và TLCHH của 5 dòng nghiên cứu. Đề tài tiến hành nghiên cứu ảnh
hưởng của BAB và IBA đến hiệu quả của quá trình nhân nhanh chồi. Môi trường
WPM + 30 g/l sucrose + 4.5g/l agar + 2.0 mg/l vitamin B2 + 2.0 mg/l BAP,
pH=6 được bổ sung IBA ở mức các nồng độ (mg/l) thay đổi như sau:
Công thức 19: Nồng độ 0,05 mg/l IBA
Công thức 20: Nồng độ 0,10mg/l IBA
Công thức 21: Nồng
độ 0,15 mg/l IBA
Công thức 22: Nồng độ 0,20 mg/l IBA
Công thức 23: Nồng độ 0,25 mg/l IBA
Công thức 24: Đối chứng (môi trường sản xuất dòng PN14).
2.1.3.4. Điều kiện thí nghiệm
 Sau khi cấy mẫu được duy trì trong tủ lạnh (ngăn mát 12
0
C±1) 48 giờ.
 Quá trình nuôi cấy (nhân chồi và tạo rễ) được tiến hành trong điều kiện ánh
sáng, nhiệt độ và độ ẩm được duy trì như sau:
- Ánh sáng: mẫu được nuôi cấy dưới ánh đèn nêon với cường độ ánh từ
1000 – 3000 lux, thời gian chiếu sáng 10 giờ/ngày.
- Nhiệt độ: duy trì nhiệt độ trong phòng từ 23 – 27
0
C.
- Độ ẩm: thường xuyên xấp xỉ 60%.
 Các thí nghiệm chọn loại môi trường cơ bản, mỗi công thức theo dõi 60
mẫu sống (ống nghiệm). Vì giai đoạn này tỷ lệ chồi hữu hiệu chưa thể hiện
rõ nên đề tài chỉ đánh giá kết quả qua HSNC sau 4 tuần nuôi cấy.
 Các thí nghiệm nghiên cứu môi trường nhân chồi, mỗi công thức theo dõi
10 bình, mỗi bình 6 chồi nuôi cấy. Môi trường chứa trong bình tam giác.
Đánh giá k
ết quả qua HSNC và TLCHH sau 4 tuần nuôi cấy.

 Mỗi công thức thí nghiệm được thực hiện 3 lần lặp lại, mỗi lần 60 mẫu.
2.1.3.5. Thu thập và xử lý số liệu.
 Thu thập các chỉ tiêu
- Số chồi mới tạo thành.

14
- Số chồi hữu hiệu: Những chồi có chiều cao từ 1,0 cm trở lên, thân, lá
và ngọn rõ ràng, có nhiều hơn 2 cặp lá, không bị callus. Ghi tình trạng
phát triển của chồi ở cả hai giai đoạn nhân chồi và ra rễ bao gồm: hình
thái của chồi, những chồi chết, chồi bị đen.
∑ Chồi tạo thành
HSNC (lần) =
∑ Chồi ban đầu

∑ Chồi hữu hiệu
TLCHH (%) = x 100
∑
Chồi tạo thành
 Xử lý số liệu.
- Vẽ biểu đồ và tính các giá trị trung bình được thực hiện trên phần
mềm Excel.
- Để kiểm tra ảnh hưởng của các nhân tố thí nghiệm, chúng tôi sử dụng
phương pháp phân tích phương sai một nhân tố bằng phần mềm SPSS
16.0. Sử dụng tiêu chuẩn Duncan để phân nhóm và tìm ra công thức
thí nghiệm tốt nhất, cụ thể như sau:
Kết quả thực nghiệm cho thấy, các dòng có sinh trưởng và phát triển
(HSNC và TLCHH) đồng gần như nhau ở cùng một môi trường cơ bản hoặc
nồng độ chất điề
u hòa sinh trưởng nên đề tài phân tích ảnh hưởng của môi
trường hoặc nồng độ chất điều hòa sinh trưởng đến 5 dòng.

Để tiến hành phân tích phương sai, trước hết cần kiểm tra các mẫu có nằm
trong một tổng thể hay không nói cách khác phương sai tổng thể bằng nhau là
điều kiện cần và đủ để tiến hành phân tích phương sai một nhân tố. Khi giá trị
Sig trong bảng Test of Homogeneity of Variances >0,05 điều này có nghĩa
phương sai tổng thể
bằng nhau và ngược lại.
Nếu phương sai tổng thể không bằng nhau, chúng tôi sẽ tiến hành kiểm tra
sự sai khác về tỷ lệ sống của cành ghép qua tiêu chuẩn LSD. Các công thức có
sự sai khác được đánh dấu (*), còn lại là không sai khác.

15
- Phân tích phương sai một nhân tố (Anova)
Giả thuyết Ho: Không có sự sai khác giữa các chỉ tiêu so sánh (chỉ tiêu so sánh
đồng đều ở các nhân tố kiểm tra)
Giả thuyết H
1
: Có sự sai khác giữa các chỉ tiêu so sánh (chỉ tiêu so sánh có sự
khác nhau rõ rệt về mặt thống kê)
+ Trong bảng ANOVA, Nếu giá trị Sig của F thu được >0,05 thì chấp nhận
H
0
(Không có sự sai khác)
+ Trong bảng ANOVA, nếu giá trị Sig của F <0,05 thì chấp nhận H
1
(Sai
khác rõ rệt về mặt thống kê)
.
- Phân nhóm bằng tiêu chuẩn Duncan
Sử dụng tiêu chuẩn Duncan để phân nhóm ảnh hưởng của các nhân tố đến
kết quả nghiên cứu. Trong bảng phân nhóm Duncan, chỉ tiêu so sánh được chia

thành các nhóm khác nhau. Giữa các nhóm có sự sai khác nhau rõ rệt, trong cùng
một nhóm không có sự sai khác.
Khi sử dụng phương pháp phân nhóm bằng tiêu chuẩn Duncan có thể có
nhiều đối tượng so sánh ở cùng một cấp, điều này có nghĩa chỉ tiêu so sánh nằm
ở giữa 2 cấp. Nếu có nhiều đối tượng có giá trị so sánh cùng
ở 2 cấp chứng tỏ chỉ
tiêu so sánh phân cấp không nhiều (nói các khác là ảnh hưởng của các nhân tố
kiểm tra không lớn).
2.2. Thiết bị, dụng cụ và nguyên vật liệu.
- Panh, kéo nuôi cấy mô.
- Thước đo chiều cao, thước đo đường kính, địa bàn.
- Hóa chất sử dụng trong nuôi cấy mô và các trang thiết bị phụ trợ khác.

16
2.3. Kết quả thực nghiệm và thảo luận.
2.3.1. Trồng vườn giống.
2.3.1.1. Điều tra chọn địa điểm thiết lập vườn giống và thu thập điều kiện
tự nhiên của địa điểm thiết lập vườn giống.
Thuộc xã Hợp Lý, huyện Lập Thạch, tỉnh Vĩnh Phúc. Ở độ cao 100m so
với mực nước biể
n, độ dốc bình quân 12
0
, hướng phơi Tây Bắc. Đất Feralit vàng
đỏ phát triển trên đá mẹ phiến sạn kết. Độ sâu tầng đất từ 30-80cm, thành phần
cơ giới thịt trung bình, hơi chặt, tỷ lệ đá lẫn từ 10-15%. Thực bì chủ yếu là sim,
mua, chiều cao bình quân <1,0cm, độ che phủ bình quân <30%. Lượng mưa bình
quân năm từ 1600-1700mm, nhiệt độ bình quân năm 23
0
C. Hàng năm xuất hiện
sương hại từ tháng 11 năm trước đến tháng 3 năm sau. Trồng rừng trên đất sau

khai thác bạch đàn.
Đề tài đã tiến hành đào và mô tả phẫu diện đất, kết quả mô tả phẫu diện
đất được thể hiện ở phụ biểu 4.
Ở khu vực này cây Bạch đàn nói chung cũng như Bạch đàn urophylla sinh
trưởng phát triển tốt. Địa điể
m trồng vườn giống có độ dốc nhỏ, và có cách ly
với rừng trồng Bạch đàn. Ở đây cũng chưa từng xảy ra sâu bệnh hại rừng trồng
Bạch đàn ở mức độ nguy hiểm. Đồng thời đất rừng thuộc sự quản lý của Công ty
lâm nghiệp Lập Thạch thuộc quy hoạch vùng nguyên liệu của Công ty giấy Bãi
Bằng nên thuận lợi cho việc quản lý, b
ảo vệ và duy trì vườn giống lâu dài. Do
vậy, đây là địa điểm tốt để thực hiện xây dựng vườn giống của đề tài.
2.3.1.2. Thiết kế và trồng vườn giống.
Kết hợp với Công ty thiết kế lâm nghiệp, đề tài đã xây dựng hồ sơ thiết kế
và trồng vườn giống theo đúng quy phạm kỹ thuật xây dựng rừng giống, vườn
giố
ng của Bộ NN&PTNT. Sơ đồ bố trí các dòng trồng tại vườn giống thể hiện tại
phụ biểu 3.
2.3.1.3. Sinh trưởng của các dòng.
Vườn giống được trồng giữa tháng 6/2008, đến đầu tháng 12/2008 đề tài
tiến hành đo đếm các chỉ tiêu sinh trưởng và phát triển. Kết quả sinh trưởng và
phát triển của các dòng cây ghép ở 6 tháng tuổi như sau:

17
a) Tỷ lệ sống.
Tỷ lệ sống phản ánh sự thích ứng của điều kiện lập địa và khí hậu đối với
cây trồng [9]. Lập Thạch là nơi thích hợp cho trồng rừng Bạch đàn đồng thời cây
ghép được trồng có bầu to (Φ14cm). Cây đem trồng đủ tiêu chuẩn, sinh trưởng và
phát triển tốt nên ở tất cả các dòng , khi đem trồng cây sinh trưởng, phát triển tốt
nên hầu hết cây trồng đều sống 100%. Tuy nhiên do vết ghép yếu nên một số cây

bị gãy ở phần ghép do gió bão hoặc sự va quyệt của gia súc nên tỷ lệ sống biến
đổi từ 82-100%. Kết quả tỷ lệ sống của các dòng được thể hiện ở bảng 02.
Tỷ lệ sống có sự khác nhau giữa các dòng nhưng không phải do bản chất
di truyền của cây mà do các tác động cơ học nên sự khác nhau về
tỷ lệ sống
không có ý nghĩa nhiều về sự thích ứng của cây trồng đối với điều kiện lập địa.
b) Sinh trưởng chiều cao vút ngọn
Hvn là yếu tố quan trọng để đánh giá năng suất sinh khối của cây trồng.
Đối với cây lấy gỗ thì Hvn không những thể hiện năng suất mà còn thể hiện chất
lượng gỗ. Bảng 02 cho thấy chiều cao vút ngọn của các dòng cây ghép có sự
khác nhau không nhiều. Hvn trung bình cao nhất là dòng số 14 với 1.93m, sau đó
đến dòng số 5 với 1.87m và thấp nhất là dòng số 6 với 1.5m.
Để kiểm tra sự sai khác về
mặt thống kê, đề tài phân tích phương sai một
nhân tố. Bảng 01 cho thấy sinh trưởng hvn giữa các dòng không có khác nhau rõ
rệt vì giá trị Sig >0.05.
c) Sinh trưởng đường kính phía trên vị trí ghép.
Cùng với sinh trưởng chiều cao, đường kính ở thân cây có yếu tố quyết
định đến năng suất và chất lượng gỗ Bạch đàn. Trong trường hợp này thì đường
kính phía trên vị trí ngoài việc cho thấy sinh trưởng đường kính của cây mẹ, còn
cho thấy khả năng tương thích giữa cành ghép và gốc ghép.
Bảng 02 cho thấy Dg bình quân của các dòng là 1.9cm, giữa các dòng có
sự khác nhau không nhiều, chỉ tiêu này biến động từ 1.5 - 2.4cm. Trong đó, cao
nh
ất là dòng số 4 với Dg=2.4cm và thấp nhất là dòng số 1 với Dg = 1.53 cm. Chỉ
tiêu này không có sự sai khác về mặt thống kê.


18
d) Sinh trưởng đường kính tán

Sinh trưởng Dt thể hiện khả năng sử dụng không gian dinh dưỡng của cây
trồng (gồm cả phía trên mặt đất và hệ rễ dưới mặt đất). Đối với rừng giống và
vườn giống từ cây ghép thì đường kính tán ảnh hưởng rõ rệt đến sản lượng và
chất lượng hạt giống.
Dt của các dòng nói chung khá cao (1.1m) và giữa các dòng có sự biến
động mạnh. Cao nhất là dòng 13 và dòng 7 với Dt là 1.34m; thấ
p nhất là dòng 19
với Dt là 0.87m. Tuy nhiên sự khác nhau này cũng không có ý nghĩa về mặt
thống kê toán học.
Tóm lại: Sinh trưởng của các dòng cây ghép không có sự sai khác rõ rệt
về cả Hvn, Dg và Dt. Có thể tại thời điểm đo đếm vườn giống mới ở 6 tháng tuổi
nên các chỉ tiêu này chưa được thể hiện một các rõ ràng. Tại thời điểm này, vườn
giống chưa có hiện tượng sâu bệnh hại.

Bảng 02: So sánh phương sai của các chỉ tiêu sinh trưởng.
ANOVA

Sum of
Squares df Mean Square F Sig.
Between Groups 3.438 19 .181 1.007 .455
Within Groups 33.603 187 .180

Hvn (m)
Total 37.041 206

Between Groups 9.589 19 .505 .830 .670
Within Groups 113.739 187 .608

Dg (cm)
Total 123.329 206

Between Groups 2.791 19 .147 1.356 .154
Within Groups 20.258 187 .108

Dt (m)
Total 23.049 206


19
Bảng 01. Sinh trưởng và tỷ lệ sống của các dòng ở 6 tháng tuồi.

Dòng Hvn (m) Dg (cm) Dt (m) S (%)
Mean
1.64 1.53 1.17 90.0
1
N
10 10 10 10
Mean
1.77 1.6 0.93 90.0
2
N
10 10 10 10
Mean
1.75 2.0125 1.0875 100.0
3
N
8 8 8 8
Mean
1.8714 2.4 1.3429 100.0
4

N
7 7 7 7
Mean
1.8917 2.1083 1.15 100.0
5
N
12 12 12 12
Mean
1.5 1.9308 1.1692 92.3
6
N
13 13 13 13
Mean
1.6231 1.8077 1.3462 92.3
7
N
13 13 13 13
Mean
1.7615 2.1846 1.2615 100.0
8
N
13 13 13 13
Mean
1.88 2 1.18 90.0
9
N
10 10 10 10
Mean
1.525 1.725 0.975 87.5
10

N
16 16 16 16
Mean
1.8 1.9188 1.1063 87.5
11
N
16 16 16 16
Mean
1.7357 1.8929 1.0357 100.0
12
N
14 14 14 14
Mean
1.5769 1.7462 1.2615 92.3
13
N
13 13 13 13
Mean
1.9308
2.2077 1.1538 100.0
14
N
13 13 13 13
Mean
1.7778 2.2778 1.2222 100.0
15
N
9 9 9 9
Mean
1.725 2.025 1.1 100.0

16
N
8 8 8 8
Mean
1.7375 2 1.05 87.5
17
N
8 8 8 8
Mean
1.65 1.8333 1.1833 100.0
18
N
6 6 6 6
Mean
1.525 1.75 0.875 100.0
19
N
4 4 4 4
Mean
1.8 2.225 1.225 100.0
20
N
4 4 4 4
Mean
1.7208 1.9435 1.1435 95.5
Total
N
207 207 207 207

20

Cây sau khi ghép Cây ghép 6 tháng tuổi tại vườn giống
Ảnh 1: Cây sau khi ghép và cây ghép trồng tại vườn giống


Cây ghép 6 tháng tuổi tại vườn giống Vị trí ghép

Ảnh 2: Cây ghép trồng tại vườn giống và vị trí ghép