THỰC HÀNH VI SINH ĐẠI CƯƠNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA CƠNG NGHỆ HÓA HỌC VÀ THỰC PHẨM

THỰC TẬP
VI SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG

Biên soạn: Th.S Nguyễn Minh Hiền


NỘI DUNG THỰC HÀNH VI SINH ĐẠI CƯƠNG
GIỚI THIỆU CHUNG

1. Giáo trình phục vụ mơn học
SV có thể sử dụng bất kỳ giáo trình nào về Thực hành Vi sinh đại cương
2. Nội dung học
Các thiết bị trong PTN Vi sinh, chuẩn bị môi trường dinh dưỡng, phương pháp khử
trùng Phân lập, cấy chuyền VSV
Làm tiêu bản, quan sát tế bào VSV
Đếm tế bào men bằng buồng đếm hồng cầu
Khảo sát 1 số phản ứng sinh hoá của vi khuẩn
3. Yêu cầu của GV với SV
Yêu cầu kiến thức: Chuẩn bị bài trước khi đến phịng thí nghiệm. GV sẽ kiểm tra bài, nếu
bất kỳ SV nào trong nhóm khơng chuẩn bị bài, cả nhóm sẽ bị nghỉ buổi học đó và khơng
được dạy và học lại.
Sau khi kết thúc mơn học, SV có 5 -10 ngày để viết báo cáo. Nộp bài cho 1 bạn (có chỉ
định) trong nhóm. Bài báo cáo ghi rõ họ tên, nhóm, tổ. Bài báo cáo SV có thể đánh máy
hoặc viết tay.
Yêu cầu kỹ năng: quan sát GV thực hiện thao tác và làm đúng các yêu cầu khi thực hiện
thao tác nuôi cấy VSV, làm tiêu bản, quan sát kính hiển vi (KHV)
Yêu cầu thái độ: nghiêm túc, nhanh nhẹn, thực hiện đúng quy định trong PTN và các yêu
cầu của GV. Tham gia tích cực trả lời câu hỏi của GV cũng như đặt câu hỏi trong buổi học

BÀI 1:
MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG, PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG
1.1. Các thiết bị trong PTN Vi sinh
Sinh viên quan sát và tìm hiểu. Sau đó, liệt kê đầy đủ thơng tin vào Bảng 1.
Bảng 1. Một số thiết bị trong PTN vi sinh

STT

Tên thiết bị

Mục đích

Tủ sấy

Sấy khơ, diệt khuẩn và tiệt trùng các dụng cụ dùng
trong các thí nghiệm

Tủ ủ

Tạo ra và duy trì mức nhiệt độ và độ ẩm thích hợp
cho mơi trường theo u cầu của người nghiên cứu

1
2
Máy đồng nhất mẫu

Đồng hóa các loại mẫu

3
Máy ly tâm

Tách những hỗn hợp các chất có tỉ trọng khác nhau

4
Bếp khuấy từ

Làm nóng và khuấy đều mơi trường bằng lực từ
trường

Máy đếm khuẩn lạc

Xác định và đếm sinh vật sống trong mẫu nghiên
cứu

5
6
7

Nồi hấp tiệt trùng
(Autoclave)

Khử trùng những vật dụng trong phịng thí nghiệm

Tủ lạnh

Đảm bảo điều kiện lưu trữ, bảo quản tối ưu các vật
phẩm nghiên cứu trong thời gian dài ở nhiệt độ ổn
định

Làm lỏng, nóng mơi trường

8
Lị vi sóng
9
Kính hiển vi
10

Dùng để phóng đại các mẫu sinh học mà mắt
thường khơng thể nhìn thấy được, tế bào động vật,
thực vật, vi khuẩn có kích thước cực kỳ nhỏ


1.2. Môi trường nuôi cấy VSV
1.2.1. Khái niệm:
- Môi trường ni cấy vi sinh vật là mơi trường có điều kiện thích hợp cho vi sinh vật
phát triển, chứa nhiều chất dinh dưỡng cần thiết và nồng độ pH phù hợp
1.2.2. Yêu cầu của môi trường dinh dưỡng nuôi cấy VSV
- Đủ chất dinh dưỡng cần thiết
- Độ pH thích hợp
- Độ nhớt nhất định
- Không chứa các yếu tố độc hại
- Hồn tồn vơ trùng
1.2.3. Phân loại
1.2.3.1. Phân loại môi trường theo thành phần
- Môi trường nuôi cấy tự nhiên: khơng xác định về mặt hóa học
- Mơi trường ni cấy tổng hợp: xác định về thành phần hóa học
- Môi trường bán tổng hợp: Môi trường tự nhiên nhưng một số thành phần hóa học đã được
xác định rõ
1.2.3.2. Phân loại môi trường theo trạng thái vật lý

- Môi trường rắn: chứa thạch với nồng độ 1,5-2% hoặc một số khác
=> Công dụng: phân lập và nhân giống
- Môi trường bán rắn: chứa thạch với nồng độ 0.5% hoặc ít hơn
=> Cơng dụng: kiểm tra khả năng di động của vi sinh vật, phù hợp cho việc nuôi cấy vi
khuẩn Microaerophilic
- Môi trường lỏng: khong chứa gelatin hoặc agar
=> Công dụng: nhân giống, nghiên cứu lên men và các thử nghiệm khác
1.2.3.3. Phân loại môi trường theo công dụng
Môi trường cơ bản (General purpose media)
- Phù hợp với hầu hết vi sinh vật. Chúng thường chứa nguồn carbon, năng lượng
(thường là glucose), muối, axit amin và vitamin. Các nguyên liệu thô phức tạp khác
nhau (chẳng hạn như peptone, chiết xuất thịt, và chiết xuất nấm men- Yeast) được sử
dụng trong việc chuẩn bị các môi trường này.
Môi trường tăng sinh (Enrich media)
- Dành cho vi sinh vật khó mọc.Mơi trường tăng sinh cung cấp cả tác nhân hóa học và
vật lý để tăng số lượng vi sinh vật. Khơng có tác nhân ức chế nào được sử dụng để
ngăn chặn sự phát triển của các vi sinh vật không mong muốn.
Môi trường phân biệt (Differential media)
- Chúng chứa các chất làm cho màu sắc của các cụm khuẩn lạc. Nhờ mơi trường này
mà ta có thể phân biệt được chủng này và chủng kia trên cùng một đĩa nuôi cấy.
Môi trường chọn lọc (Selective media)
- Chúng cho phép một số loại vi sinh vật phát triển do không có một số chất dinh dưỡng
quan trọng trong mơi trường khiến nó khơng thuận lợi cho hầu hết các vi sinh vật, các


chất ức chế trong môi trường ngăn chặn sự phát triển của các vi sinh vật không mong
muốn và cung cấp các chất hỗ trợ phân lập và nhận dạng nhanh chóng cho vi sinh vật
bằng cách ức chế sự phát triển của các vi sinh vật không mong muốn.
1.2.4. Cơng thức mơi trường
Ví dụ: Mơi trường P.D.A (Potato Dextrose Agar): dùng để nuôi cấy men, mốc

Khoai tây: 200 g

H2O: 1 L

Dextrose: 40 g

pH: 4.5-5

Agar: 20 g

121

C /15’/ 0.1 Mpa

Các thơng tin có trong cơng thức mơi trường (GV chỉ định loại môi trường)
Môi trường PCA (Plate Count Agar): xác định tổng số lượng vi khuẩn hiếu khí sống trong mẫu
Casein peptone: 5 gms/l

Agar: 9-18 gms/l

Yeast Extract: 2.5 gms/l

pH cuối cùng là 7.0 ± 0.2 ở 25°C

Glucose: 1 gms/l
Môi trường SCA (Starch Casein Agar): xác định vi khuẩn biến phân giải đường để tạo năng
lượng (saccharolytic) và chủ yếu là xạ khuẩn Actinomycetes
Soloble Starch: 10 gms/l

CaCO3: 0.02 gms/l

Casein (Vitamin free): 0.3 gms/l

FeSO4.7H2O: 0.01 gms/l

KNO3: 2 gms/l

Agar: 18 gms/l

MgSO4.7H2O: 0.05 gms/l

Nước biển/Nước cất = 1000 ml

K2HPO4: 2gms/l

pH (ở 25°C) 7.0 ± 0.1

NaCl: 2gms/l
Môi trường KIA (Kligler Iron Agar): giúp phân biệt các loài bacillus đường ruột
Peptone: 15 gms/l

Sodium Thiosulfate: 0.3 gms/l

Lactose: 10 gms/l

Ferrous Sulfate: 0.2 gms/l

Proteose Peptone: 5 gms/l

Phenol Red: 0.024 gms/l

Sodium Chloride: 5 gms/l

Agar: 12 gms/l

Chiết thịt bò: 3 gms/l
Chiết nấm: 3 gms/l
Dextrose: 1 gms/l

pH 7.4 +/- 0.2 ở 25ºC


1.2.5. Các bước để nấu môi trường (GV hướng dẫn cách làm)

Chuẩn bị môi trường
Bước 1: Cân, đong ( bằng ống đong ) môi trường theo công thức.
Bước 2: Đun ( nếu cần ), kiểm tra pH.
Bước 3: Phân phối môi trường vào dụng cụ vô trùng.
Bước 4: Khử trùng theo yêu cầu.
1.3 Phương pháp khử trùng
1.3.1. Khử trùng môi trường

Bảng 2 Khử trùng môi trường bằng phương pháp…………………………………………….
Phương pháp

Nhiệt độ/ thời gian

Nguyên lý tiêu diệt VSV

Nhiệt ẩm

Nhiệt độ: 121
Thời gian: khoảng
10-15 phút

Dựa vào hơi nước bão hòa ở nhiệt độ cao, áp
suất cao.

Pasteur

Nhiệt độ: 60-75
Thời gian: giữ trong
15-30 phút

Dựa vào nhiệt độ để bất hoạt các vi sinh vật

Nhiệt độ: 180
Thời gian: 30 phút

Dựa vào nhiệt độ để bất hoạt các vi sinh vật

Nhiệt khô


1.3.2. Khử trùng dụng cụ
Dụng cụ thuỷ tinh: sử dụng nhiệt ẩm ( nồi hấp tiệt trùng ), nhiệt khô ( tủ sấy )
Dụng cụ nhựa: sử dụng nhiệt ẩm ( nồi hấp tiệt trùng ).
1.3.3. Khử trùng PTN: phun hơi độc, đèn UV

2.1. Kết quả thực hành

(hình ảnh minh chứng)

(hình ảnh minh chứng)

(hình ảnh minh chứng)

Mơi trường…………………. Mơi trường…………………. Mơi trường…………………

* Hình ảnh em xin để ở cuối *


BÀI 2:
PHÂN LẬP VÀ CẤY CHUYỀN VI SINH VẬT

2.1 Phân lập
2.1.1. Khái niệm
- Là q trình tách riêng các lồi vi sinh vật từ quần thể ban đầu và đưa về dạng thuần khiế t
…………………………………………………………………………………………………………

2.1.2. Mục đích phân lập
- Tạo dòng thuần
…………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………

2.1.3. Phương pháp phân lập (GV hướng dẫn thao tác)
VSV

Dụng cụ

Môi trường

Phương pháp

Vi khuẩn Đĩa peptri, PCA + agar
nồi hấp tiệt
+
Nấm men trùng, lọ tam
giác, cân
điện tử, lị vi
sóng, que
cấy vòng

…………………………
…………………………
…………………………

…………………………
…………………………
…………………………


VSV

Dụng cụ

Môi trường

Nấm mốc mẫu được Czapek – pectin
chuẩn bị

(g/L)
sẵn,đèn cồn
,dao hoặc
lưỡi lam
,nhíp gắp,lọ
nước
cồn,đĩa
petri, lọ tam
giác, que
cấy móc

2.2. Cấy chuyền
2.2.1. Khái niệm
- Truyền vi sinh vật từ môi trường này sang mơi trường khác
2.2.2. Mục đích
- Giúp bảo quản, nhân giống và khảo sát sinh hóa

Phương pháp
…………………………
…………………………
…………………………

…………………………
…………………………
…………………………


2.2.3 Phương pháp cấy chuyền (GV hướng dẫn thao tác)
VSV

Dụng cụ

Phương pháp

Nấm men Que cấy vòng, que B1: Hơ que cấy kỹ trên ngọn lửa đèn cồn, hơ miệng ống
cấy thẳng
nghiệm qua ngọn lửa đèn cồn
B2: Chạm nhẹ que cấy quanh thành ống nghiệm để làm
nguội. Nhúng thẳng que cấy vào môi trường lỏng. Rút ra và
hơ lại miệng ống nghiệm rồi đóng nắp
- Lưu ý: ln giữ que cấy và miệng ống nghiệm trong mơi
Nấm mốc Que cấy móc
trường vô trùng (cách ngọn lửa tầm 5cm)
Thạch đứng: dùng que cấy thẳng, đưa que cấy vng góc
cách đáy 1cm
Thạch nghiêng sâu: dùng que cấy thẳng, đưa que cấy xuống
cách đáy 1cm, cấy ziczac trên phần nghiêng
Vi khuẩn Que cấy vòng, que Thạch nghiêng: dùng que cấy vòng, cấy ziczac trên phần
nghiêng
cấy thẳng
Đĩa: dùng que cấy vòng, chia đáy thành 4 phần
B1: Hơ que cấy, cấy ziczac ở phần 1
B2: Hơ que cấy, gióng từ phần 1 cấy các đường song song
qua phần 2
B3: Hơ que cấy, gióng và cấy các đường song song từ phần 2
qua phần 3
B4: Hơ que cấy, gióng từ phần 3 cấy các đường ziczac
- Lưu ý: Làm đến đâu mở nắp đến đó và đường cấy các phần
khơng chạm nhau
2.3. Kết quả thực hành

(hình ảnh minh chứng)

(hình ảnh minh chứng)

(hình ảnh minh chứng)

Cấy phân lập……………….. Cấy chuyền………………… Cấy chuyền…………………
……………………………... ……………………………... ……………………………...
* Hình ảnh em xin để ở cuối *


BÀI 3:
KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH SINH HỐ CỦA VSV
3.1. Mục đích
- Định danh, xác định vi khuẩn

3.2. Yêu cầu khi thực hiện phản ứng sinh hố
u cầu về VSV: Dịng thuần, không lẫn tạp nhiễm,...
Yêu cầu thời gian đọc kết quả: 24g sau nuôi cấy
3.3. Một số phản ứng sinh hóa cơ bản
Mục đích

Mơi trường PCA
(Plate Count
Agar): xác định
tổng số lượng vi
khuẩn hiếu khí
sống trong mẫu

Thành phần mơi trường
Casein peptone: 5 gms/l
Yeast Extract: 2.5 gms/l
Glucose: 1 gms/l
Agar: 9-18 gms/l
pH cuối cùng là 7.0 ± 0.2 ở
25°C

Môi trường SCA
(Starch Casein Soloble Starch: 10 gms/l
Agar): xác định Casein (Vitamin free): 0.3
vi khuẩn biến
gms/l
phân giải đường KNO : 2 gms/l
3
để tạo năng
MgSO4.7H2O: 0.05 gms/l
lượng
(saccharolytic) và K2HPO4: 2gms/l
chủ yếu là xạ
NaCl: 2gms/l
khuẩn
Actinomycetes CaCO3: 0.02 gms/l
FeSO4.7H2O: 0.01 gms/l

Kết quả - giải thích – hình minh chứng

- Vi sinh vật phát triển nhưng có sự khác
nhau ở từng phần (phần 1 thường dày đặc
hơn, phần 4 ít nhất)

- Vì trong q trình ni cấy, lượng vi sinh
vật trên que cấy ở phần 1 thường nhiều hơn
và giảm dần qua phần 2 và 3. Cuối cùng
phần 4 là phần ít nhất
-Vi khuẩn đường ruột Lactobacillus:
Thường khơng dẫn đến bất kỳ thay đổi
màu sắc nào trên môi trường SCA.

Agar: 18 gms/l
Nước biển/Nước cất = 1000
ml
pH (ở 25°C) 7.0 ± 0.1

Mục đích

Thành phần mơi trường

Kết quả - giải thích – hình minh chứng


Mơi trường KIA
(Kligler Iron
Agar): giúp phân
biệt các lồi
bacillus đường
ruột

Mơi trường KIA gồm glucose và lactose
(có thể lên men carbohydrat), đỏ phenol
Lactose: 10 gms/l

(chỉ thị pH), pepton (nguồn
carbon/nitrogen) và muối sắt cộng với
Proteose Peptone: 5 gms/l
thiosulfate natri. Có 3 hình thái lên men
Sodium Chloride: 5 gms/l
carbohydrat có thể xảy ra là:
Chiết thịt bò: 3 gms/l
- Acid (màu vàng) phần gốc và kiềm (màu
đỏ) phần nghiêng của mơi trường, khi đó
Chiết nấm: 3 gms/l
cho thấy vi sinh vật lên men đường glucose
Dextrose: 1 gms/l
nhưng không lên men đường lactose.
Sodium Thiosulfate: 0.3 gms/l - Acid (màu vàng) phần gốc và acid (màu
vàng) phần nghiêng của mơi trường, khi đó
Ferrous Sulfate: 0.2 gms/l
cho thấy vi sinh vật lên men cả đường
Phenol Red: 0.024 gms/l
glucose và đường lactose.
Agar: 12 gms/l
- Kiềm (màu đỏ) phần gốc và kiềm (màu
pH 7.4 +/- 0.2 ở 25ºC
đỏ) phần nghiêng mơi trường, khi đó cho
thấy vi sinh vật khơng thể lên men đường
glucose và đường lactose. Các sản phẩm
sinh ra không phải là sản phẩm acid.
Peptone: 15 gms/l


BÀI 4:

LÀM TIÊU BẢN VÀ QUAN SÁT TẾ BÀO VI SINH VẬT
4.1. Quan sát đại thể
Quan sát khuẩn lạc bằng mắt để thấy được đặc điểm của khuẩn lạc như màu sắc, hình
dạng, đường kính, độ vun, bóng, nhăn, có sợi......
Việc quan sát đại thể các khuẩn lạc điển hình trên mơi trường phân lập chọn lọc giúp dự
đốn được đó là VSV nào (phụ thuộc rất nhiều vào kinh nghiệm người quan sát)
Mô tả khuẩn lạc VSV đã phân lập ở Bài 2:

(hình ảnh minh chứng)
* Hình ảnh em xin để ở cuối *

Khuẩn lạc của nấm men
Trên môi trường PCA
Hình dạng trịn
Bờ, mép khuẩn lạc trịn đều

Đường kính 2mm
Màu sắc trắng đục
4.2. Quan sát vi thể
Làm tiêu bản và quan sát tiêu bản đó dưới kính hiển vi (KHV) để thấy được: hình dạng, cách
sắp xếp, kích thước của tế bào


4.2.1. Làm tiêu bản bằng phương pháp nhuộm
đơn Mục đích:
- Thường áp dụng với nấm men
- Quan sát và đo kích thước tế bào
- Cho phép quan sát rõ hình dạng, cấu tạo của tế bào cũng như đếm số lượng tế bào
Cách tiến hành:
B1: Ghi tên VSV. Tạo vết bôi

- Hơ kỹ que cấy trên ngọn lửa đèn cồn, mở nắp ống nghiệm và hơ qua ngọn lửa đèn cồn
- Chạm nhẹ que cấy vào thành ống nghiệm để làm nguội que cấy. Nhúng que cấy vào môi
trường lỏng khuấy nhẹ để lấy mẫu.
- Khi lấy que cấy ra, tránh chạm vào miệng ống nghiệm. Hơ lại miệng ống nghiệm rồi đậy
nắp lại
Lưu ý: Giữ que cấy và miệng ống nghiệm trong môi trường vô trùng (cách ngọn lửa đèn cồn
5cm)
B2: Cố định vết bôi bằng cách hơ trên ngọn lửa đèn cồn cho đến khi vết bôi khô
B3: Nhuộm màu (Sử dụng Gentian Violet, Fuchsin kiềm, Xanh metylen)
- Đặt tiêu bản cố định trên giá rồi nhỏ vài giot thuốc nhuộm phủ kín vết bơi
- Sau 1-2 phút, đổ thuốc nhuộm đi và rửa nhẹ bằng nước sạch đến khi nước chảy qua vết bơi
khơng cịn màu
- Thấm khô tiêu bản bằng giấy thấm
B4: Quan sát tiêu bản dưới Kính hiển vi


4.2.2. Làm tiêu bản bằng phương pháp nhuộm kép (GV hướng dẫn thao tác)

Mục đích:
- Quan sát được hình dạng, kích thước và cách sắp xếp tế bào
- Phân biệt vi khuẩn gram âm và gram dương
Cách tiến hành:
B1: Ghi tên VSV. Tạo vết bôi
B2: Cố định vết bôi
B3: Nhuộm màu ( VIAS)
- Nhỏ thuốc nhuộm Crystal Violet vào tiêu bản để 1 phút. Rửa sạch bằng nước sạch và thấm
khô bằng giấy sao cho vẫn giữ được vết bôi
- Nhỏ Lugol để 1 phút. Rửa nước => Tẩy cồn => Rửa nước
- Nhỏ thuốc nhuộm Saffranin, để 30s. Rửa nước
B4: Quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 100X (nhỏ giọt dầu)

4.2.3. Làm tiêu bản bằng phương pháp giọt ép
Mục đích:
- Đặc điểm của sợi nấm
- Đặc điểm của cơ quan sinh sản
- Hình dạng, cấu tạo, cách sắp xếp của bào tử
Cách tiến hành:
B1: Dùng 1 phiến kính khơ, nhỏ lên đó 1 giọt nước cất
B2: Dùng que cấy hay pipet lấy lên phiến kính một giọt huyền phù VSV
B3: Đặt lá kính mỏng lên giọt huyền phù VSV sao cho khơng tạo ra bọt khí
B4: Thấm nhẹ lớp dịch trào ra ngồi lá kính
B5: Tiến hành quan sát trên kính hiển vi


4.3. Kết quả thực hành
Mỗi tiêu bản quan sát được phải có đầy đủ các thơng tin sau:
+ Tên VSV
+ Vật kính quan sát
+ Hình dạng tế bào
+ Cách sắp xếp tế bào
+ Màu sắc tế bào (nếu là vi khuẩn phải ghi rõ đó là vi khuẩn Gram (+) hay Gram (-)

(hình ảnh minh chứng)

(hình ảnh minh chứng)

(hình ảnh minh chứng)

……………………………... ……………………………... ……………………………...

……………………………... ……………………………... ……………………………...
……………………………... ……………………………... ……………………………...
……………………………... ……………………………... ……………………………...
……………………………... ……………………………... ……………………………...
……………………………... ……………………………... ……………………………...
……………………………... ……………………………... ……………………………...
……………………………... ……………………………... ……………………………...
* Hình ảnh em xin để ở cuối *
4.4. Bài tập về nhà
4.4.1. Tại sao phải nhỏ dầu xem kính lên tiêu bản khi quan sát kính hiển vi ở vật kính 100?

Dầu soi rất cần thiết khi soi với vật kính 100. Nó làm tăng độ chiết quang cảu mơi trường. Nếu
khơng có dầu soi bạn khơng thể soi được. Bởi vì khả năng phân giải của vật kính phụ thuộc
vào khẩu độ của nó, điều này phụ thuộc vào chỉ số khúc xạ của mơi trường giữa mẫu thử và
vật kính.


4.4.2. Giải thích cơ chế bắt của vi khuẩn Gram (+) và Gram (-)

- Vì cấu tạo vách tế bào khác nhau nên nên khi tiến hành nhuộm vi khuẩn gram âm và gram
dương sẽ có cơ chế bắt màu khác nhau
+ Vi khuẩn Gram (+): màu tím. Chúng có lớp vách tế bào peptidoglycan dày, dạng lưới có
khả năng bắt màu tím của thuốc nhuộm tím gentian tinh thể. Cũng vì lớp vách dày nên việc
tẩy cồn sẽ khó khăn hơn do đó vi khuẩn giữ được màu tím của thuốc nhuộm tím Gentian
+ Vi khuẩn Gram (-): màu xanh. Lớp vách peptidoglycan mỏng hơn và nó có thêm lớp màng
lipopolysaccharide phía ngồi, khi tẩy cồn cồn hịa tan lớp màng và do lớp vách mỏng bị cồn
tẩy dễ dàng nên nó khơng giữ được màu tím của thuốc nhuộm mà sẽ bắt màu thuốc nhuộm
sau là dung dịch Fushin kiềm
4.4.3. So sánh phương pháp nhuộm đơn và nhuộm kép

Nhuộm đơn

Nhuộm kép

- Đều cố định vết bôi và nhuộm trước khi thực hiện quan sát dưới kính hiển
vi
Giống nhau

- Thực hiện nhuộm màu 1 lần
Chọn 1 trong số những loại thuốc
nhuộm để thực hiện

Khác nhau
về quy trình

- Thực hiện nhuộm màu 2 lần
Chọn 2 loại thuốc nhuộm để thực
hiện. Có thể căn cứ theo phương
pháp V.I.A.S
Với thứ tự như sau
+ Crystal Violet: 1 phút
+ Lugol: 1 phút
+ Alcohol (cồn): nhúng nhanh qua
+ Saffarnin: 30 giây

Quan sát hình dạng, kích thước, cách Phân biệt 2 loại vi khuẩn Gram ( + )
sắp xếp của tế bào
và Gram ( - )
Khác nhau
về mục đích

BÀI 5:
ĐẾM SỐ LƯỢNG TẾ BÀO BẰNG BUỒNG ĐẾM HỒNG CẦU

5.1. Giới thiệu buồng đếm hồng cầu
Mục đích:
- Xác định nồng độ tế bào trong mẫu chất lỏng
BĐHC là phiến kính thuỷ tinh hình chữ nhật, trên đó có khắc lưới đếm.

Hình 5.1. Buồng đếm hồng cầu

Hình 5.2. Lưới đếm
Lưới đếm là 1 hình vng, có độ dài cạnh là 1mm gồm 25 ơ vng lớn.
1 ơ vng lớn có 16 ô vuông nhỏ.
Các ô vuông lớn chia cắt nhau bởi 3 đường kẻ song song
Chiều cao/độ sâu đường khắc trên lưới đếm là 0,1mm
S lưới đếm= 1 mm2

S ô vuông nhỏ= 2,5x10-3mm2

S ô vuông lớn = 0,04 mm2

V ô vuông nhỏ = 2,5x10-4mm2

Khi đếm, ta thực hiện trên 5 ơ đếm lớn tại các vị trí 4 góc và ô chính giữa
Và tại mỗi ô đếm lớn, ta cần chọn đồng bộ 2 cạnh kề của ô đếm để lấy tế bào nằm trên
cạnh đó.

Cơng thức tính số lượng nấm men trên mẫu bằng BĐHC:
(tế bào/ml)
Trong đó:
A: Tổng số lượng tế bào trong 1 ô đếm nhỏ
V: Thể tích ô vuông nhỏ
Tổng thể tích 5 ô vuông nhỏ: 16 5= 80 ô => V= mm3
10n: nồng độ pha loãng được đếm
1000: Hệ số chuyển từ mm³ thành ml
5.2. Quy trình đếm nấm men (GV hướng dẫn quy trình)
B1: Pha lỗng mẫu cần đếm sao cho trong mỗi ơ nhỏ của buồng đếm có khoảng 5-

10 tế

bào (không lớn hơn 10 tế bào và nhỏ hơn 2,5 tế bào). Ô lớn từ 10-50 tế bào.
B2: Lắc đều ống nghiệm pha loãng mẫu. Dùng Pipet nhỏ một giọt dung dịch mẫu vào giữa
buồng đếm, tráng đều sao cho đầy khoang đếm
B3: Dùng phiến kính đậy lại, tránh tạo bọt khí
B4: Thực hiện soi dưới kính hiển vi và điều chỉnh sao cho phù hợp để đếm số lượng tế bào.
Tùy vào số lượng tế bào mà người dùng có thể đếm tất cả tế bào có trong ơ hay chỉ
đếm tế các tế bào có trong một số ô vuông lớn đại diện.
B5: Bắt đầu đếm tế bào sau khi nhỏ giọt dung dịch từ 3 - 5 phút.

5.3. Tính kết quả
A: Số lượng tế bào đếm được ở 5 ơ vng lớn
- Ơ1: 24 tế bào
- Ô2: 34 tế bào
- Ô3: 30 tế bào
=> A= 24+34+30+20+21= 129 tế bào
- Ô4: 20 tế bào
- Ô5: 21 tế bào

( tế bào/ ml)
5.4. Bài tập về nhà
5.4.1. Ưu điểm của phương pháp đếm trực tiếp tế bào bằng buồng đếm hồng cầu
- Đếm dễ dàng, nhanh, tiết kiệm thời gian
- Quan sát nhanh chóng mật độ vi sinh vật có trong mẫu
5.4.2. Nhược điểm của phương pháp đếm trực tiếp tế bào bằng buồng đếm hồng cầu


- Không phân biệt được tế bào sống và tế bào chết
- Khó đạt được đơ chính xác cao
- Dễ nhầm lẫn tế bào vi sinh vật với các vật thể khác
- Khơng thích hợp với huyền phù sinh vật có mật độ thấp
5.4.3. Ứng dụng của phương pháp đếm trực tiếp tế bào bằng buồng đếm hồng cầu
- Cho phép ta đếm số lượng vi sinh vật có kích thước lớn như nấm men, tảo, bào tử vi nấm
- Vẽ đường cong sinh trưởng