Luận án tiến sĩ nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch của cao khô lá đu đủ rừng (trevesia palmata (roxb ex lindl ) vis , họ nhân sâm araliaceae)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ QUỐC PHÒNG

HỌC VIỆN QUÂN Y

LÊ THỊ THANH THẢO

NGHIÊN CỨU B ÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ
TÁC DỤNG TĂNG CƯỜNG MIỄN DỊCH CỦA
CAO KHÔ LÁ ĐU ĐỦ RỪNG
(Trevesia palmata (Roxb. e x Lindl.) Vis.,
họ Nhân sâm Araliaceae)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI – 2020


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ QUỐC PHÒNG

HỌC VIỆN QUÂN Y

LÊ THỊ THANH THẢO

NGHIÊN CỨU B ÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ
TÁC DỤNG TĂNG CƯỜNG MIỄN DỊCH CỦA
CAO KHÔ LÁ ĐU ĐỦ RỪNG
(Trevesia palmata (Roxb. e x Lindl.) Vis.,

họ Nhân sâm Araliaceae)
Chuyên ngành: Công nghệ dược phẩm và Bào chế thuốc
Mã số: 9720202
LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. GS.TS. Võ Xuân Minh
2. PGS.TS. Đỗ Quyên

HÀ NỘI – 2020


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi với sự
hướng dẫn khoa học của tập thể cán bộ hướng dẫn.
Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và được công bố một
phần trong các bài báo khoa học. Luận án chưa từng được cơng bố trong bất
kỳ cơng trình nào khác. Nếu có điều gì sai tơi xin hồn toàn chịu trách nhiệm.

Tác giả

Lê Thị Thanh Thảo


LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình học tập, nghiên cứu và hồn thành luận án, tơi đã nhận
được sự giúp đỡ tận tình của các Thầy cơ, các anh chị, các bạn đồng nghiệp
và những người thân trong gia đình.
Trước hết tơi xin bày tỏ lịng kính trọng đặc biệt và biết ơn sâu sắc tới:
GS.TS. Võ Xuân Minh và PGS.TS. Đỗ Quyên, những người Thầy đã tận tâm
hướng d ẫn khoa học, đã ln động viên, khích lệ, tạo mọi điều kiện thuận lợi

nhất cho tôi, giúp đỡ tôi trong suốt q trình nghiên cứu và hồn thành luận án.
Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc, lời cảm ơn chân thành tới các Thầy
Cô trong: Ban Giám đốc, Viện Đào tạo Dược, Trung tâm Nghiên cứu Ứng
dụng Sản xuất thuốc, Bộ môn Dược lý - Học viện Quân Y, phòng Sau đại học
đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tơi trong q trình học tập và nghiên cứu.
Tôi cũng xin cảm ơn Ban Giám hiệu cùng các Thầy, Cô Bộ môn Thực
vật, Dược liệu - Trường Đại học Dược Hà Nội, Ban Giám hiệu cùng các
Thầy, Cô Bộ môn Dược lý - Trường Đại học Y Hà Nội, Viện Hóa Sinh biển,
Trung tâm các phương pháp phổ ứng dụng, Viện Hóa học - Viện Hàn lâm
Khoa học & Công nghệ Việt Nam, Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc, mỹ phẩm,
thực phẩm Hà Nội đã tạo điều k iện tốt nhất để tơi hồn thành luận án.
Tơi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới Trường Cao đẳng Y tế Hà
Đông, Ủy ban nhân dân Thành phố Hà Nội, các anh/chị đồng nghiệp, người
thân trong gia đình và bạn bè đã luôn động viên giúp đỡ và tạo điều kiện để
tơi hồn thành luận án.
Ngày

tháng

năm 2020

Lê Thị Thanh Thảo


MỤC LỤC
Trang phụ bìa
Lời cam đoan
Lời cảm ơn
Mục lục
Danh mục các chữ, ký hiệu viết tắt trong luận án

Danh mục các hình
Danh mục các bảng
ĐẶT VẤ N ĐỀ

1

CHƯƠN G 1. TỔN G QUAN TÀI LIỆU

3

1.1. TỔN G QUAN VỀ ĐU ĐỦ RỪNG

3

1.1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố

3

1.1.2. Thành phần hóa học

4

1.1.3. Tác dụ ng sinh học và d ược lý

6

1.1.4. Công dụng

7

1. 2. CAO THUỐC
1.2.1. Định nghĩa, phân loạ i
1.2.2. Kỹ thuật điều ch ế cao thuốc
1.3. TỔN G QUAN VỀ TĂN G CƯỜN G MIỄN DỊCH

8
8
10
23

1.3.1. Khái niệm về tăng cường miễn dịch và chất tăng cường miễn
dịch

23

1.3.2. Mơ hình nghiên cứu đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch
của một số chế phẩm thảo mộc
CHƯƠN G 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠN G PHÁP N GHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢN G NGHIÊN CỨ U

24
30
30

2.1.1. Nguyên liệu

30

2.1.2. Động vật thí ngh iệm

30

2.1.3. Thuốc thử, hóa chất và dung mơ i

31


2.1.4. Máy móc, trang thiết b ị nghiên cứu

32

2.1.5. Địa điểm ngh iên cứu

33

2.2. PHƯƠN G PHÁP NGHIÊN CỨU

33

2.2.1. Phương pháp nghiên cứu xây dựng qui trình bào chế cao khơ
lá Đu đủ rừng qu i mơ phịng thí ngh iệm

33

2.2.2. Phương pháp nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở và đánh
giá độ ổn định củ a cao khô lá Đu đủ rừng

46

2.2.3. Phương pháp nghiên cứu tác dụng tăng cường miễn dịch và

độc tính của cao khơ lá Đu đủ rừng trên đ ộng vật th ực ngh iệm
CHƯƠN G 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

48
53

3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUI TRÌNH BÀO CHẾ
CA O KHƠ LÁ ĐU ĐỦ RỪNG QUI MƠ PHỊN G TH Í N GHIỆM

53

3.1.1. Kết quả xác định một số hợp chất chính sử dụng làm chất
đánh dấu

53

3.1.2. Kết quả xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu lá Đu đủ rừng
làm nguyên liệu ch iết xuất

56

3.1.3. Kết quả xây dựng qui tr ình bào chế cao khô lá Đu đủ rừng

72

3.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨ N CHẤT
LƯỢNG VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA CAO KHÔ LÁ ĐU
ĐỦ RỪNG

88

3.2.1. Kết quả xây dựng tiêu chuẩn chất lượng của cao khô lá Đu đủ
rừng

88

3.2.2. Kết quả đ ánh giá độ ổn định của cao khô lá Đu đủ rừng

95

3.3. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ TÁ C DỤNG TĂNG CƯỜNG MIỄN
DỊCH VÀ ĐỘC TÍNH CỦA CAO KHƠ LÁ ĐU ĐỦ RỪNG TRÊN
ĐỘNG VẬ T THỰC NGHIỆM

100

3.3.1. Kết quả đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch của cao khô
lá Đu đủ rừng

100


3.3.2. Đánh giá độc tính của cao khơ lá Đu đủ rừng
CHƯƠN G 4. BÀN LUẬ N

108
119

4.1. VỀ XÂ Y DỰNG QUI TRÌNH BÀO CHẾ CAO KHƠ LÁ ĐU
ĐỦ RỪNG

119

4.1.1. Về xác định nhóm h ợp chất chính sử dụng làm chất đánh dấu
trong xây dựng qui trình bào chế cao khô lá Đu đủ rừng

119

4.1.2. Về lựa chọn 2 ph ương pháp đ ịnh lượng

120

4.1.3. Về tiêu chuẩn cơ sở lá Đu đủ rừng

121

4.1.4. Về qui trình bào chế cao lá Đu đ ủ rừng

122

4.1.5. Về thiết b ị ch iết xuất, cô đặc và kết quả bào chế cao 3:1

128

4.1.6. Bào chế cao khô lá Đu đủ rừng bằng phương pháp phun sấy

129

4.2. VỀ XÂ Y DỰNG TIÊU CHUẨN CHẤ T LƯỢNG VÀ ĐỘ ỔN
ĐỊNH CỦA CA O KHÔ LÁ ĐU ĐỦ RỪNG

135

4.2.1. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở

135

4.2.2. Về đánh giá độ ổn định của cao khô lá Đu đủ rừng

136

4.3. VỀ TÁC DỤNG TĂ NG CƯỜNG MIỄN DỊCH VÀ ĐỘC TÍNH
CỦA CAO KHƠ LÁ ĐU ĐỦ RỪNG

136

4.3.1. Tác dụng tăng cường miễn dịch của cao khô lá Đu đủ rừng

136

4.3.2. Độc tính của cao khơ lá Đu đủ rừng

143

KẾT LUẬN

145

KIẾN NGH Ị

147

DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN
CỨU CỦA ĐỀ TÀ I LUẬ N ÁN
TÀI LIỆU THAM KHẢ O
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT
STT Viết tắt

Phần viết đầy đủ

1.
2.

A
A er

Độ hấp thụ quang
Aerosil

3.

AO

Acid oleanolic

4.

BC

Bạch cầu

5.

C

Nồng độ

6.

13

C-NMR

Carbon-13 nuclear magnetic resonance spectroscopy
(Phổ cộng hưởng từ carbon 13)
Carr's compressibility index (Chỉ số nén Carr)

7.

CI

8.

CR/DP

là tỷ lệ % (khối lượng/khối lượng) của chất rắn trên tổng
khối lượng dịch phun sấy

9.

cs.

Cộng sự

10.

Cyc

Cyclophosphamid

11.

DĐVN

Dược điển Việt Nam

12.

DM/DL

Dung môi/dược liệu (ml/g)

13.
14.

ĐĐR
EtOH

Đu đủ rừng
Ethanol

15.

HMBC

Heteronuclear multiple bond correlation spectroscopy
(Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết)

16.

HPLC

High performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng
hiệu năng cao)

17.
18.

HS chiết
HSPL

Hiệu suất chiết
Hệ số pha loãng

19.

HSPS

Hiệu suất phun sấy

20.

HR-ESI-MS

High resolution - electrospray ionization - mass
spectroscopy (Phổ khối phân giải cao ion hóa phun mù
điện tử)

21.
22.

IL
INF

Interleukin
Interferon

23.

KLCT

Khối lượng cơ thể


24.
25.

KTTP
KLRbk

Kích thước tiểu phân
Khối lượng riêng biểu kiến

26.

LD 50

Lethal Dose 50 (Liều gây chết 50% số con vật thử)

27.

LOD

Limit of detection (Giới hạn phát hiện)

28.

LOQ

Limit of Quantification (Giới hạn định lượng)

29.

M

Khối lượng

30.
31.
32.

Mal
MeOH
m/z

Maltodextrin
Methanol
Mass to charge ratio (tỉ lệ khối lượng/điện tích)

33.

OA

Ovalbumin + Al(OH)3

34.

RSD

Relative standard deviation (Độ lệch chuẩn tương đối)

35.

SPN

Saponin toàn phần

36.

SD

Standard deviation (Độ lệch chuẩn)

37.
38.

SE
STT

Standard error (Sai số chuẩn)
Số thứ tự

39.

TCCS

Tiêu chuẩn cơ sở

40.

TCMD

Tăng cường miễn dịch

41.

TD/CR

Tá dược/Chất rắn

42.

TLC

Thin layer chromatography (Sắc ký lớp mỏng)

43.
44.

KLLTĐ
KLTƯTĐ

Khối lượng lách tương đối
Khối lượng tuyến ức tương đối

45.
46.

TB

TNF

Trung bình
Tumor necrosis factor (Yếu tố hoại tử khối u)

47.

UV – VIS

Ultraviolet-vis ible (Tử ngoại - khả kiến)


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình

Tên hình

Trang

1.1. Cây Đu đủ rừng (Trevesia palmata (Roxb. ex Lind l.) Vis .,)

4

1.2. Cấu trúc saponin phân lập t ừ Đu đủ rừng

5

1.3. Sơ đồ thiết bị b ể ch iết siêu âm và que siêu âm

15

1.4. Cấu tạo hệ thống phun sấy

22

2.1. Sơ đồ nghiên cứu trên mơ hình gây suy giảm miễn dịch bằng
Cy clophosphamid

49

3.1. Cấu trúc hóa học của các hợp ch ất phân lập t ừ lá Đu đủ rừng

53

3.2. Phổ UV-Vis của mẫu t rắng và mẫu chuẩn

56

3.3. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ quang theo thời gian phản ứng
tạo màu

57

3.4. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ quang vào lượng acid
oleanolic chuẩn

58

3.5. Sắc ký đồ củ a mẫu th ử, mẫu chuẩn và mẫu trắng

61

3.6. Đồ th ị mô tả sự phụ thuộ c của diện tích pic vào nồng độ acid oleanolic

62

3.7. Hình ảnh vi phẫ u lá Đu đủ rừng

65

3.8. Hình ảnh soi bộ t lá Đu đủ rừng

66

3.9. Hình ảnh sắc ký đồ TLC dược liệu lá Đu đủ rừng

68

3.10. Ả nh hưởng của tỷ lệ dung môi/dược liệu v à số lần chiết đến chiết xuất
saponin toàn phần

75

3.11. Ả nh hưởng của thời g ian đến chiết xuất saponin tồn ph ần

77

3.12. Sơ đồ tóm tắt các gia i đoạn điều chế cao lá Đu đủ rừng 3:1

87

3.13. Sơ đồ tóm tắt g iai đoạn bào chế cao khô lá Đu đủ rừng

88

3.14. Kết quả chụp bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM) củ a bột cao khơ lá
Đu đ ủ rừng

3.15. H ình ảnh TLC củ a cao khô lá Đu đủ rừng

89
92


Hình

Tên hình

Trang

3.16. Hình ảnh TLC t rong theo dõi độ ổn định của cao khô lá Đu đủ rừng

99

3.17. H ình ảnh vi thể lách chuột ở các lô (HE × 100)

104

3.18. H ình ảnh vi thể tuyến ức chuột ở các lơ (HE × 100)

104

3.19. Tương quan g iữa liều dùng theo t ỷ lệ chuột chết

109

3.20. Ả nh đại thể gan, lách và thận chuột ở các lô khác nhau (HE x 25)

116

3.21. H ình ảnh mơ bệnh học gan chuột sau 90 ngày uống thuốc (HE x 400)

117

3.22. H ình ảnh mơ bệnh học lách chuột sau 90 ngày uống thuốc (HE x 400) 117
3.23. H ình ảnh mô bệnh học thận chuột sau 90 ng ày uống thuốc (HE x 400) 118


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng

Tên bảng

Trang

3.1. Sự phụ thuộc củ a độ hấp thụ quang theo thờ i gian phản ứng tạo màu

57

3.2. Kết quả xác định độ lặp lại và độ đúng của phương pháp UV- Vis

59

3.3. Kết quả xác định t ính tương thích hệ thống HPLC

60

3.4. Diện t ích pic và thờ i gian lưu của các dung d ịch chuẩn ở các nồng độ

61

3.5. Kết quả đánh g iá độ lặp lại và độ đúng t rong ngày và khác ngày

62

3.6. Độ nh iễu nền của sắc ký đồ mẫu chuẩn acid oleano lic

63

3.7. Kết quả xác định tỷ lệ mất khối lượng do làm k hô của bộ t lá Đu đủ rừng 67
3.8. Kết quả xác định hàm lượng tro toàn phần của bột lá Đu đủ rừng

67

3.9. Hàm lượng saponin toàn phần t rong lá Đu đủ rừng

69

3.10. Hàm lượng acid oleanol ic trong lá Đu đủ rừng

70

3.11. Tóm tắt các chỉ tiêu chất lư ợng t rong tiêu chuẩn cơ sở lá Đu đủ rừng

71

3.12. Ả nh hưởng của phương pháp chiết đ ến chiết xuất sapon in toàn phần

72

3.13. Ả nh hưởng của kích th ước tiểu phân dược liệu đến chiết xuất saponin
tồn phần
3.14. Ả nh hưởng của dung mơ i đến chiết xuất saponin toàn phần

73
74

3.15. Ả nh hưởng của tỷ lệ dung môi/dược liệu v à số lần chiết đến chiết xuất
saponin toàn phần

74

3.16. Ả nh hưởng của nhiệt độ đến ch iết xuất saponin toàn phần

76

3.17. Ả nh hưởng của thời g ian đến chiết xuất saponin toàn ph ần

76

3.18. Thơng số qui trình chiết xuất dịch chiết lá Đu đủ rừng bằng phương
pháp ch iết s iêu âm

77

3.19. Kết quả chiết xuất lá Đu đủ rừng qui mô 2 kg/ mẻ bằng phương pháp
chiết siêu âm

78

3.20. Kết quả ch iết xuất, cô đ ặc và loại tạp cao lá Đu đủ rừng 3:1

78

3.21. Công th ức và điều kiện phun sấy khảo sát ảnh hưởng củ a tá dược

79


Bảng

Tên bảng

Trang

3.22. Ả nh hưởng của lo ại tá dược đến h iệu suất phun s ấy

80

3.23. Công thức và điều kiện phun sấy khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ tá
dược/ch ất rắn
3.24. Ả nh hưởng của tỷ lệ tá dược/ch ất rắn đến phun sấy cao Đu đủ rừng

81
82

3.25. Công thức và điều kiện khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ phun sấy và
tốc độ cấp d ịch

83

3.26. Ả nh hưởng của nhiệt độ phun sấy và tốc độ cấp dịch đến phun sấy cao
Đu đ ủ rừng

84

3.27. Công thức và điều kiện khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ chất rắn/dịch
phun
3.28. Ả nh hưởng của tỷ lệ chất rắn/d ịch phun đến phun sấy cao Đu đủ rừng

85
85

3.29. Cơng t hức và thơng số qui trình bào chế cao khô lá Đu đủ rừng bằng
phun sấy

86

3.30. Kết quả xác định mất khối lượng do làm khô của cao khô lá Đu đủ
rừng

90

3.31. Kết quả xác đ ịnh hàm lượng t ro tồn phần của cao khơ lá Đu đủ rừng

90

3.32: Kết quả th ử độ n hiễm khuẩn của cao khô lá đu đủ rừng

91

3.33. Hàm lượng saponin tồn phần trong cao khơ lá Đu đủ rừng

93

3.34. Hàm lượng acid oleanol ic trong cao k hô lá Đu đủ rừng

94

3.35. Tóm tắt các chỉ tiêu chất lượng trong tiêu chuẩn cơ sở cao lá Đu đủ
rừng

95

3.36. Sự thay đổi độ ẩm, độ nhiễm khuẩn, hàm lượng saponin toàn ph ần và
hàm lượng acid o leanolic của 3 lô theo thời gian b ảo quản
3.37. Ả nh hưởng của cao khô lá Đu đủ rừng lên khố i lượng lách tương đối

96
101

3.38. Ả nh hưởng của cao khô lá Đu đủ rừng lên khối lượng tuyến ức tương
đối

101


Bảng

Tên bảng

Trang

3.39. Ả nh hưởng của thuốc th ử lên số lượng bạch cầu

102

3.40. Ả nh hưởng của thuốc lên một số loại bạch cầu ở máu ngoại vi

103

3.41 . Kết quả nhận xét giải phẫu bệnh của lách v à tuyến ức

105

3.42 . Ảnh hưởng củ a thuốc thử lên nồng độ IgG máu ngoạ i vi

106

3.43. Ả nh hưởng của thuốc th ử đến phản ứng bì với kháng nguyên OA

106

3.44. Ả nh hưởng của thuốc th ử đến nồng độ IL– 2

107

3.45. Ả nh hưởng của thuốc th ử đến nồng độ TNF-α

108

3.46. M ối tương quan liều lượng và tỷ lệ phần trăm chuột chết sau uống cao
khô lá Đ u đủ rừng

109

3.47. Ả nh hưởng của cao khô lá Đu đủ rừng đối với khối lượng cơ thể
chuột

110

3.48. Ả nh hưởng của cao khô lá Đu đủ rừng đến số lượng hồng cầu và
lượng huyết sắc tố trong máu chuột

111

3.49. Ả nh hưởng của cao khơ lá Đu đủ rừng lên hematocrit và thể tích trung
bình hồng cầu trong máu chuột

112

3.50. Ả nh hưởng của cao khô lá Đu đủ rừng lên số lượng bạch cầu và tiểu
cầu trong máu chuột
3.51. Ả nh hưởng củ a cao khô lá Đu đủ rừng đ ối với hoạt độ A ST và ALT

113
114

3.52. Ả nh hưởng của cao khô lá Đu đủ rừng lên các chỉ số albumin và
cholesterol toàn phần trong máu

115

3.53. Ả nh hưởng của cao khô lá Đu đủ rừng lên nồng độ creatinin máu
chuột

115


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Các bệnh suy giảm miễn dịch là một nhóm các tình trạng khác nhau
gây nên do một hay nhiều khiếm khuyết của hệ miễn dịch và biểu hiện trên
lâm sàng bởi gia tăng tình trạng dễ mắc nhiều bệnh nhiễm trùng. Ngày nay,
các bệnh suy giảm miễn dịch có xu hướng ngày càng gia tăng với hậu quả cấp
tính, tái diễn hay mạn tính thường là nặng nề [1].
Hiện nay, cơ quan quản lý Thực phẩm và Thuốc Hoa Kỳ (US FDA) đã
cấp phép cho nhiều thuốc có tác dụng điều trị cho bệnh nhân suy giảm miễn
dịch được dùng trên lâm sàng. Các t huốc tăng cường miễn dịch (TCMD) có
nguồn g ốc phong phú, các chất có nguồn gốc từ các chế phẩm sinh học
(Immunoglobulin, Interferon,…) là sản phẩm cơng nghệ cao, giá thành cịn
khá cao. Các thuốc có nguồn gốc tổng hợp hóa dược thường có nhiều tác
dụng khơng mong muốn [2].
Có rất nhiều nghiên cứu về tác d ụng TCMD của các loài thực vật đã
được thực hiện. Đặc biệt, trong số các nhóm hợp chất thiên nhiên, nhóm chất
saponin là nhóm có tác dụng tăng cường miễn dịch nổi bật nhất [3], [4].
Đu đủ rừng (ĐĐR, Trevesia palmata (Roxb. ex Lindl.) Vis. họ Nhân

sâm Araliaceae) là một cây nhỡ, mọc nhiều và dễ mọc ở bìa rừng hay rừng tái
sinh. Với nguyên liệu nghiên cứu là lá, nguồn nguyên liệu dồi dào, sẵn có ở
các khu vực Hà Giang, Ba Vì, Cúc Phương, Phú Thọ…, nên việc thu hái
không làm ảnh hưởng đến môi trường sinh thái hay đa dạng sinh học [5].
Cho đến nay, cây ĐĐR ở Việt Nam mới chỉ được sử dụng theo kinh
nghiệm dân gian lấy lõi thân thay cho vị thuốc thông thảo [5]. Trên thế giới
cũng chỉ có rất ít nghiên cứu về hóa học và tá c dụng dược lý của loài này [6],
[7] và chưa có các chế phẩm nào có tác dụng TCMD từ ĐĐR được nghiên
cứu.


2

Xuất phát từ thực tế trên, cần phải nghiên cứu về tác dụng TCMD của
ĐĐR để định hướng phát triển thành sản phẩm cho đối tượng bệnh nhân suy
giảm miễn dịch đang ngày càng tăng tại Việt Nam và sử dụng được nguồn
nguyên liệu dồi dào trong nước, luận án “Nghiên cứu bào chế và đánh giá
tác dụng tăng cường miễn dịch của cao khô lá Đu đủ rừng (Trevesia
palmata (Roxb. ex Lindl.) Vis., họ Nhân sâm Araliaceae)” được tiến hành
với các mục tiêu sau:
1. Xây dựng được qui trình bào chế cao khô lá Đu đủ rừng ở qui mơ
phịng thí nghiệm.
2. Xây dựng được tiêu chuẩn chất lượng và bước đầu đánh giá được độ
ổn định của cao khô lá Đu đủ rừng.
3. Đánh giá được tác dụng tăng cường miễn dịch và độc tính của cao
khơ lá Đu đủ rừng trên động vật thực nghiệm.


3

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. TỔNG QUAN VỀ ĐU ĐỦ RỪNG
Đu đủ rừng (ĐĐR) có tên khoa học là Trevesia palmata (Roxb. ex
Lindl.) Vis, thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae). ĐĐR cịn được gọi là Thơng
thảo gai, Thầu dầu núi, Nhật phiến, Thôi hoang [8], [9].
1.1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố
1.1.1.1. Đặc điểm thực vật
Cây nhỡ cao 7 - 8 m hoặc hơn, thân ít phân nhánh, cành có gai, ruột
xốp. Lá đơn, phiến lá phân thuỳ chân vịt, xẻ sâu như lá thầu dầu, có 5 - 9 thuỳ
nhọn có răng, gân nổi ở hai mặt, mép lá có răng cưa t hơ; cuống lá dài và có
gai. Lá non phủ lông mềm, màu nâu nhạt, lá già nhẵn [8], [9]. Lá nhiều kiểu
hình, có thể trịn hoặc khơng trịn ở vịng ngồi; bề ngang từ 30 - 90 cm; gốc
lá hình tim rộng; thùy 5 - 10, lá đơn, không bị xẻ ở cây non, xẻ chân vịt ở cây
già. Lá chia thùy, thành các thùy lá có hình mác tới hình elip hoặc bị xẻ với
nhiều hình dạng. Các lõm phân thùy nằm ở khoảng giữa tính từ gốc lá đến
đỉnh lá, có thể xẻ đến tận gân giữa, tạo thành cuống giả. Đỉnh lá nhọn, mép lá
có răng cưa; lơng của cành phân nhánh hình khiên hoặc khơng đồng đều, có
bề ngang khoảng 0,1 - 0,3 mm, mọc rậm rạp ở gân giữa và gân chính. Cuống
lá kích thước từ 20 x 0,3 cm đến 90 x 1 cm; có thể khơng có gai hoặc có gai
chỉ ở gần gốc lá và ở đỉnh. Lưỡi bẹ lá kèm có kích thước tới 2 cm. Hoa to
khoảng 1 cm, màu trắng. Hoa mọc thành tán, ở đỉnh hoặc ở nách, độ dài tổng
thể khoảng 60 cm; cụm hoa thứ cấp thường có một tán ở đỉnh và 2 tán hoa ở
vị trí đối diện qua điểm phân nhánh chính giữa. Lá bắc hình tam giác, nhọn,
dài tới khoảng 3 cm, khơng bị rụng, có lơng tơ dày, thỉnh thoảng xuất hiện các
gai có lơng cứng dài 1 - 2 mm; lơng phủ hình sao khơng đều, bề rộng tới 1
mm, mọc rậm rạp. Mỗi tán từ 25 - 65 hoa; bề rộng 6 - 10 cm, cuống dài từ 2 -

4

4 cm, lá bắc kích thước từ 0,2 - 1 cm, hình tam giác hẹp, có răng cưa, màu
nâu hoặc hơi trắng. Đế hoa hình chng hoặc hình con quay, kích thước từ 6
x 6 - 9 x 9 mm. Đĩa hoa dạng phịng (flat) hoặc hình vịm; gốc trụ hình đầu
kích thước 2 x 1 - 4 x 1 mm. Đài hoa có răng cưa, cánh hoa hình răng, mũi
cánh hoa nhọn dài khoảng 1 mm. Hoa 8 - 10 cánh, kích thước thước 5 x 1,6 8 x 2,5 mm. Hoa hợp một phần, nhị từ 8 - 10, kích thước bao phấn 2 x 1,5 - 3
x 2,5 mm; chỉ nhị kích thước từ 4 - 6 cm. Hạt phấn có kích thước 25,7 - 32,4
µm. Quả dài 13 -18 mm, có khía; hạt dẹt. Có hoa tháng 5 - 6, có quả tháng 7 9 [10].

a. Tồn cây

b. Lá

c. Hoa

Hình 1.1. Cây Đu đủ rừng (Trevesia palmata (Roxb. ex Lindl.) Vis.,)
*Nguồn: Ảnh c hụp Đu đủ rừng tại Vị Xuyên tỉnh Hà Giang tháng 5 năm 2015

1.1.1.2. Phân bố
ĐĐR mọc nhiều và dễ mọc ở những vùng đất ẩm dọc theo các sông,
suối, ở thung lũng các rừng phục hồi [11]. Ở nước ta, loài này phân bố ở các
tỉnh Cao Bằng, Lạng Sơn, Ba Vì, Quảng Trị [8], Sơn La, Lào Cai, Tuyên
Quang, Hà Giang, Hà Nội, Thái Nguyên, Kon Tum, Gia Lai, Đắk Lắk, Lâm
Đồng [12]. Trên thế giới, chúng có ở Trung Quốc, Bangladesh, Nepal, Ấ n Độ,
Thái Lan, Lào, Campuchia [10].
1.1.2. Thành phần hóa học
Cho đến nay, các nghiên cứu về thành phần hóa học của ĐĐR kể cả
trong nước và nước ngồi vẫn cịn rất hạn chế. Một số nghiên cứu chỉ ra,

5

saponin là thành phần chính của lồi này với aglycon là acid oleanolic (AO)
và hederagenin.
Năm 2000, từ cao ethanol (EtOH) lá loài T. palmata Vis. thu hái ở
Italia, De Tommasi N. và cộng sự (cs.) đã phân lập được 6 saponin
bisdesmosidic mới và 2 saponin triterpenoid đã biết, tất cả các hợp chất phân
lập được đều có phần aglycon là AO hoặc dẫn chất của acid này. Theo nghiên
cứu này, saponin phân lập từ cây ĐĐR có cấu trúc tương tự như Quil A (phân
lập từ loài Quillaja saponaria), đều là saponin triterpenoid có 2 mạch đường
(R và R1 ) và chủ yếu là các đường glucose, rhamnose, arabinose; các nhóm
thế cịn lại như R2 là nhóm methyl (-CH3 ) và dẫn chất oxy hóa của nó (CH 2OH); R3 đa số là dẫn chất hydroxyl (-OH) [6].

Hình 1.2. Cấu trúc saponin phân lập từ Đu đủ rừng
*Nguồn: Theo De Tom masi N. và cs. (2000) [6]

Theo kết quả nghiên cứu của Dinda B. và cs. (2010), 6 saponin đã được
phân lập và xác định cấu trúc từ Trevesia palmata Vis. trong đó có 3 saponin
có aglycon là A O và 2 saponin có aglycon là hederagenin [13].
Năm 2010, nhóm nghiên cứu của Panyaphu K. đã sử dụng các phản
ứng hóa học để định tính các nhóm chất đặc trưng, kết quả cho thấy trong lá
cây T. palmata Vis. thu hái ở miền Bắc Thái Lan có mặt của các nhóm hợp
chất phenolic, flavonoid, triterpen và lacton glycosid [14].
Năm 2018, từ lá ĐĐR, Kim B. và cs. đã phân lập được 2 hợp chất
triterpen

glycosid

là

hederagenin-3-O-β-ᴅ-glucopyranosyl-(1 → 3)-α-ʟ-

rhamnopyranosyl-(1→2) -α-ʟ-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-ʟ-arabinopyranosid

và


6

acid 3-O-α-ʟ-rhamnopyranosyl asiatic cùng với 3 hợp chất đã biết là
macranthosid A, α-hederin và ilekudinosid D [15].
Việt Nam hiện chưa có nghiên cứu nào về thành phần hóa học của ĐĐR.
1.1.3. Tác dụng s inh học và dược lý
Hiện nay, cũng chưa có nhiều nghiên cứu về hoạt tính của các hợp chất
và các cao chiết từ ĐĐR.
Năm 2000, De Tommasi N. và cs. đã chứng minh dịch chiết từ lá T.
palmata và một số saponin phân lập được cùng với các sản phẩm
prosapogenin thủy phân đều thể hiện tác dụng chống tăng sinh tế bào trên các
dòng tế bào J774 (dòng tế bào ung thư đại thực bào chuột), HEK-293 (dịng tế
bào phơi thận người 293), WEHI164 (dịng tế bào u sarcoma xơ) so với chất
đối chứng là 6-mercaptopurin [6].
Năm 2012, nghiên cứu của Panyaphu K. và cs. cho thấy, lồi T.
palmata có hoạt tính chống oxy hóa theo phương pháp DPPH (EC50 là 9,3 g
tương ứng 14,76 g/mg dịch chiết); hàm lượng phenolic tổng định lượng theo
phương pháp cân tính theo acid gallic là 10,86 mg/g dịch chiết [14].
Theo nghiên cứu của Rahman K.M.H. và cs. (2014), cắn methanol
(MeOH) từ lá của lồi T. palmata có tác dụng giảm đau và hạ đường huyết
trên chuột nhắt gây tăng đường huyết thực nghiệm thông qua xét nghiệm
dung nạp glucose đường uống. Cắn dịch chiết loài T. palmata làm giảm liều

phụ thuộc vào lượng đường trong máu ở chuột thực nghiệm uống glucose. Ở
liều 100, 200 và 400 mg/kg cân n ặng chuột thực nghiệm, mức đường huyết
giảm tương ứng 17,9, 28,1 và 47,4%, được so sánh với thuốc glibenclamid
liều 10 mg/kg cân nặng làm giảm lượng đường trong máu 47,4%. Trong thử
nghiệm giảm đau trên mơ hình gây đau bằng tiêm acid acetic màng bụng
chuột thực nghiệm, ở các liều 50, 100, 200 và 400 mg//kg cân nặng làm giảm
số lượng các cơn co thắt bụng lần lượt là 33,3, 40,7, 48,1 và 55,6% so với


7

nhóm đối chứng sử dụng aspirin thuốc giảm đau tiêu chuẩn ở liều 200 và 400
mg/kg cân n ặng tương ứng là 48,1 và 63,0% [16].
Sayeed M.A . và cs. (2014) đã chứng minh tác dụng làm tan huyết khối
và kháng viêm in vitro của dịch chiết từ lá loài T. palmata. Kết quả nghiên
cứu cho thấy, cắn MeOH và các cắn phân đoạn (n-hexan, cloroform, ethyl
acetat, nước) đều có tác dụng làm tan huyết khối với kết quả tương ứng là
43,3; 44,2; 43,3; 40,3; 44,3% so với đối chứng dương streptokinase là
71,67%. Tác dụng kháng viêm được đánh giá bằng phương pháp biến tính
albumin trong đó cao MeOH từ lá ở mức liều 1 mg/ml, ức chế 89,24% trong
khi nhóm chứng dương sử dụng natri diclofenac ức chế 96,77% ở mức liều
tương đương [17].
Nghiên cứu của Kim B. và cs. (2018), cho thấy, các hợp chất triterpen
glycosid (TG1-3,5) phân lập từ T. palmata thể hiện các hoạt động chống nấm
mạnh, chống lại mầm bệnh đạo ôn M. oryzae với giá trị nồng độ ức chế 50%
(IC50 ) = 2 - 5 μg/ml. Đặc biệt, khi cây được xử lý bằng hợp chất TPG1 (500
μg/ml), giá trị kiểm soát bệnh chống bệnh đạo ôn, nấm mốc xám cà chua,
bệnh sương mai cà chua và lần lượt là 84, 82 và 88%, so với chứng không
điều trị TG [15].
Một số saponin phân lập từ T. palmata có tác dụng bảo vệ tế bào gan

chuột in vitro khi gây tổn thương bằng carbon tetrachlorid [18]. Các saponin
có aglycon là AO có độc tính rất thấp [19] và thể hiện tác dụng bảo vệ gan,
chống viêm, chống khối u, hạ lipid máu, kháng khuẩn, hạ glucose máu, chống
các tác nhân gây ung thư, chống thụ thai, bảo vệ tế bào tim trước tác hại của
đường máu cao [20] làm tăng tiết insulin của tế bào β tuyến tuỵ [21].
Hederagenin có hoạt tính kháng bổ thể [22] và chống viêm [23].
1.1.4. Công dụng
Ở nước ta, ĐĐR đã được sử dụng từ lâu. Lõi thân dùng chữa phù
thũng, đái dắt, tê thấp và làm thuốc hạ nhiệt, th anh phế nhiệt và được dùng


8

làm thuốc bổ. Lá được dùng nấu nước xông chữa tê liệt, bại người v à giã đắp
chữa gãy xương (ở Trung Quốc người ta dùng lá chữa ngã tổn thương hay dao
chém thương tích) [11]. Ngồi ra, ĐĐR có tác chữa các bệnh khó tiêu, táo
bón, thấp khớp, đau bụng, viêm phổi [24].
Loài T. palmata cũng được sử dụng trong công thức tắm thảo dược sau
sinh của cộng đồng Miên (Yao) của Thái Lan [14]; dân tộc Kry ở Lào sử
dụng nước sắc của thân cây và rễ để phục hồi sau sinh, co tử cung, giảm đau
bụng và tăng tiết sữa [25]. Ở Malaysia dùng để chữa gẫy xương và liền da
[25]. Ở Ấ n Độ, lá ĐĐR được sử dụng làm rau ăn [26]; quả dùng như là 1 chất
làm say cá để dễ đánh bắt [27].
Liều dùng: 20 - 30 g dạng thuốc sắc. Dùng riêng hay phối hợp [11].
1.2. CAO THUỐC
1.2.1. Định ng hĩa, phân loại
* Theo Dược Điển Việt Nam (DĐVN) V [28], cao thuốc là chế phẩm
được điều chế bằng cách cô hoặc sấy đến thể chất qui định các dịch chiết thu
được từ dược liệu thực vật hay động vật với các dung mơi thích hợp. Cao
thuốc được chia làm 3 loại:

- Cao lỏng: Là chất lỏng hơi sánh, có mùi vị đặc trưng của dược liệu sử
dụng, trong đó cồn và nước đóng vai trị dung mơi chính (hay chất bảo quản
hay cả hai). Nếu khơng có chỉ dẫn khác, qui ước 1 ml cao lỏng tương ứng với
1g dược liệu dùng để điều chế cao thuốc.
- Cao đặc: Là khối đặc qnh. Hàm lượng dung mơi sử dụng cịn lại
trong cao không quá 20 %.
- Cao khô: Là khối hoặc bột khô, đồng nhất nhưng rất dễ hút ẩm. Cao
khô khơng được có độ ẩm lớn hơn 5 %.
* Khái niệm cao trong dược điển châu Âu [29] được chia làm 3 loại
tùy thuộc vào các thành phần có hoạt tính đã biết hoặc các thành phần liên
quan khác.


9

- Cao định chuẩn (hoặc cao chuẩn hóa) “standardised extracts”: cao
chiết xuất được điều chỉnh hàm lượng một số thành phần nhất định (đã biết
tác dụng điều trị) trong một giới hạn dung nạp được. Sự tiêu chuẩn hóa phải
đạt được sau khi phối hợp cao chiết xuất với tá dược trơ hoặc bằng cách trộn
các lô chiết xuất với nhau. Khối lượng các thành phần khác của cao có thể
thay đổi. Kết quả là hàm lượng cao sẽ được tính trong một khoảng tương ứng
với một lượng xác định của các hoạt chất có tác dụng điều trị. Ví dụ cao chiết
lá senna chuẩn hóa: 50-65 mg tương ứng với 12,5 mg hydroxy anthracen
glycosid được tính theo sennoside B.
- Cao định lượng “quantified extracts”: là cao chiết xuất có khoảng hàm
lượng xác định của các thành phần (hoạt chất). Sự điều chỉnh chủ yếu được
thực hiện bằng cách trộn các lô mẻ với nhau. Kết quả là hàm lượng cao luôn
phải được nêu tương ứng với hàm lượng của các chất được định lượng trong
một khoảng; ví dụ, chiết xuất từ lá Ginkgo định lượng: 60mg chứa 13,216,16mg flavonoid dưới dạng flavon glycosid; 1,68-2,04mg ginkgolides A, B
và C và 1,56-1.92mg bilobalide.

- Các chế phẩm cao khác: các thành ph ần có hoạt tính (trị liệu) chưa
được xác định, cũng không được điều chỉnh theo một lượng xác định của các
chất đánh d ấu. Chúng chủ yếu được kiểm soát chất lượng bởi qui trình sản
xuất và các thơng số kỹ thuật của qui trình. Trong trường hợp này, hàm lượng
cao sẽ được công bố là một giá trị nhất định. Để đánh giá phân tích hàm
lượng cao với một chất phân tích đánh dấu có thể được lựa chọn bởi nhà sản
xuất, nếu không sẽ được xác định trong chuyên luận Dược điển tương ứng.
Nếu trong quá trình sản xuất cao định lượng hoặc chuẩn hóa, q trình tinh
chế được áp dụng làm tăng tỷ lệ các thành phần đã được mô tả trong các chất
chiết được tới một giá trị kỳ vọng, dược điển châu Âu sẽ coi đó là một cao
được “tinh chế”, ví dụ cao Bạch Quả, định lượng hoặc tinh chế.


10

1.2.2. Kỹ thuật điều chế cao thuốc
Quá trình điều chế cao thuốc thường có 2 giai đoạn chính là chiết xuất
dược liệu và cơ đặc, sấy khơ, hồn thiện chế phẩm.
1.2.2.1. C hiết xuấ t dược liệu
Chiết xuất là phương pháp tách một hoặc nhiều chất ra khỏi nguyên liệu
do sự phân bố các chất giữa hai pha không trộn lẫn vào nhau: một pha lỏng và
một pha rắn tạo cân bằng lỏng – rắn hoặc hai pha lỏng, tạo cân bằng lỏng - lỏng
[30]. Một qui trình chiết xuất điển hình gồm các bước sau:
a, Bước 1. Chuẩn bị dược liệu: Làm khô và chia nhỏ dược liệu phù hợp để
tăng hiệu xuất chiết mà hạn chế các tạp chất này đi vào dịch chiết [34].
b, Bước 2. Lựa chọn dung môi chiết: Cơ sở quan trọng trong lựa chọn dung
mơi là tính phân cực của hợp chất chứa trong dược liệu và của dung môi. Về
nguyên tắc, dung môi phân cực sẽ chiết xuất các chất phân cực và dung môi
không phân cực sẽ chiết xuất các hợp chất khơng phân cực. Khi cần chiết tồn
bộ thành phần trong dược liệu với qui mơ sản xuất th ì dung mơ i thích hợp

nhất là EtOH có nồng độ thích hợp [30], [31].
c, Bước 3. Lựa chọn phương pháp chiết xuất: Có rất nhiều phương pháp
chiết xuất khác nhau, việc lựa chọn biện pháp chiết xuất cần căn cứ vào từng
trường hợp và yêu cầu cụ thể [32], [33].
* Phương pháp ngâm:
Chiết xuất bằng phương pháp ngâm là cho dược liệu đã chia nhỏ tới độ
mịn thích hợp, tiếp xúc với dung môi trong thời gian nhất định, sau đó gạn,
ép, lắng, lọc thu lấy dịch chiết [32]. Tùy theo nhiệt độ chiết xuất, chia thành: - Ngâm lạnh: ngâm ở nhiệt độ phịng, có thể khuấy trộn, thường áp
dụng với những dược liệu chứa hoạt chất dễ bị phân hủy bởi nhiệt.
- Hãm: cho dung môi vào dược liệu đã chia nhỏ trong một thời gian xác
định, có thể khuấy trộn, nhiệt độ thường là ở 40 – 500 C.


11

- Hầm: ngâm dược liệu đã chia nhỏ với dung mơi trong một bình kín, giữ
nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ sôi của dung môi trong một thời gian nhất định.
- Sắc: đun sôi dược liệu với dung môi, áp dụng với dung mơi ít bay hơi.
- Ngâm động: cũng giống ngâm tĩnh, chỉ khác là toàn bộ khối nguyên
liệu chiết được đặt trên một sàn chuyển động, nhằm tăng sự khuếch tán.
Ưu điểm của phương pháp là đơn giản dễ thực hiện, thiết bị có giá thành
thấp, có thể áp dụng cho cả chiết xuất thô và chiết xuất ở qui mô lớn. Nhược
điểm là tốn thời gian, tốn dun g môi, năng suất thấp, thao tác thủ công [34].
* Phương pháp ngấm kiệt:
Chiết xuất bằng phương pháp ngấm kiệt là cho dung môi chảy chậm
qua nguyên liệu chiết đựng trong “bình ngấm kiệt”. Sau một thời gian xác
định, rút nhỏ giọt dịch chiết phía dưới bình ngâm, đồng thời bổ sung thêm
bằng cách thêm dung môi mới với tốc độ chậm và liên tục đi qua lớp dược
liệu không khuấy trộn. Trong thời gian ngâm và dịch chuyển chậm, dung môi
được giữ lại và tiếp xúc với dược liệu, hoạt chất được hịa tan. Sau đó thêm

dung mơi mới, lớp dung môi này ngấm vào trong khối dược liệu và đẩy dịch
chiết (dung mơi cũ đã hịa tan dược chất) ra ngồi. Lớp dung mơi mới tiếp tục
hồ tan hoạt chất còn lại trong dược liệu. Như vậy, dược liệu luôn được tiếp
xúc với dung môi mới nên có thể chiết kiệt hoạt chất trong dược liệu [33].
Phương pháp có ưu điểm tốn ít dung mơi và chiết kiệt được hoạt chất,
thu được dịch chiết đậm đặc, thích hợp cả với lượng nhỏ trong nghiên cứu và
chiết xuất thô và qui mô chiết lớn [31]. Nhược điểm là tốn thời gian, dịch
chiết có thể lẫn nhiều tạp chất.
*Phương pháp chiết hồi lưu và chiết Soxhlet
Trong chiết xuất hồi lưu, dược liệu được ngâm trong bình cầu, phía trên
có lắp với sinh hàn. Dung mơi được làm nóng tới nhiệt độ s ơi, bốc hơi sau đó
gặp sinh hàn ngưng tụ trở lại bình cầu. Nhược điểm của chiết hồi lưu là thành
phần hóa học có thể bị phân hủy bởi nhiệt [31].