nghiên cứu khả năng sinh sản và mối tương quan với các đa hình gen thụ thể prolactin và properdine của lợn nái lai f1 (đực rừng thái lan x nái địa phương pác nặm)

1
MỤC LỤC
Trang phụ bìa
1
2
CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu, chữ Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt
bp Base paire Cặp Bazơ
DNA Deoxyribonucleic acid Axit Deoxyribonucleic
dNTP Deoxynucleoside triphosphate Deoxynucleosit triphosphát
EDTA Ethylene diamine tetracetic acid Axít êthylen điamin têtraceetic
EtBt Ethidium bromid Ethidium brômit
PRLR Prolactin receptor Thụ thể Prolactin
kb Kilobase Kilô bazơ
µg Microgram Micrô gram
µl Microlitre Micrô lít
TBE Tris boric acid - EDTA Đệm TBE
TE Tris - EDTA Đệm TE
RNase Ribonuclease Ribônucleaza
RFLP
Restriction Fragment Length
Polymorphism
Đa hình độ dài các đoạn cắt
giới hạn
RADP
Random Amplified polymorphic
DNA
Đa hình DNA được khuếch đại
ngẫu nhiên
QTL Quantitative trait loci Vị trí tính trạng số lượng
PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi Polymerase

MS Microsatellite DNA vệ tinh
OD Optical density Mật độ quang học
AFLP
Amplified Fragment length
Polymorphism
Đa hình chiều dài các đoạn
DNA được khuếch đại
2
3
DANH MỤC CÁC BẢNG
3
4

4
5
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Ở Việt Nam cũng như nhiều nước trên thế giới, lợn là giống vật nuôi lâu
đời và có ý nghĩa rất quan trọng trong sản xuất nông nghiệp. Từ nhiều năm qua,
sự phát triển của ngành chăn nuôi lợn đã góp phần đáng kể trong việc nâng cao
chất lượng cuộc sống, nó đã cung cấp khoảng 75% tổng lượng thịt cho xã hội.
Theo thông báo của FAO, 55% số lượng lợn trên thế giới thuộc về vùng châu Á
- Thái Bình Dương, trong đó Việt Nam là nước có số đầu lợn tương đối lớn. Tổng
đàn lợn ở Việt Nam tính đến tháng 6/2005 là 28 triệu con [30]. Theo số liệu thống
kê tại thời điểm 01/04/2010, cả nước có 27,3 triệu con, trong đó số đầu lợn nái là
4,18 triệu con) [9]. Bên cạnh việc nhập khẩu và chăn nuôi các giống lợn hướng nạc,
lợn lai giữa lợn nội và lợn ngoại, thì các giống lợn địa phương vẫn được sử dụng
rất phổ biến đặc biệt khu vực miền núi trung du bởi khả năng thích nghi cao với
điều kiện khí hậu cũng như điều kiện chăn nuôi của vùng nông thôn nghèo Việt
Nam. Mặc dù các giống lợn nội có nhược điểm là số con/lứa đẻ thấp, tăng trưởng

chậm, tỷ lệ mỡ và tiêu tốn thức ăn cao, nhưng thịt mỡ thơm ngon rất được người
dân ưa chuộng.
Lợn địa phương Pác Nặm được nuôi phổ biến ở trong các nông hộ theo hình
thức bán hoang dã quanh nhà và vườn rừng, nguồn thức ăn chủ yếu là ngô, sắn, cám
gạo và rau cỏ tự nhiên. Cũng như các giống lợn địa phương khác, lợn địa phương
Pác Nặm có đặc điểm nổi trội như khả năng thích nghi cao, thịt thơm và ngon. Đặc
biệt nhóm lợn đen tuyền, thường được coi là đặc sản bởi nuôi tự nhiên, không có
tồn dư thuốc tăng trọng cũng như kháng sinh và bị săn mua ráo riết dẫn đến nguy cơ
tuyệt chủng cao. Trong những năm qua, các nhà khoa học trường Đại học Nông
Lâm Thái Nguyên đã phối hợp với Phòng Nông nghiệp và PTNT huyện Pác Nặm
tiến hành chọn lọc, lai tạo giống lợn địa phương Pác Nặm với lợn rừng Thái Lan tạo
ra nhóm lợn lai mang các đặc điểm có giá trị của cả hai giống lợn bố và mẹ. Tuy
nhiên, một hạn chế đặt ra là khả năng sinh sản của cả hai nhóm lợn rừng và lợn địa
5
6
phương Pác Nặm đều không cao, làm ảnh hưởng đến tốc độ tăng đàn. Số lợn con
đẻ/lứa là một chỉ tiêu kinh tế kỹ thuật rất quan trọng, những nghiên cứu cải tiến vấn
đề này luôn là mối quan tâm của các nhà khoa học. Ngoài việc chọn lọc theo kỹ thuật
truyền thống, việc áp dụng các kỹ thuật di truyền học phân tử để xác định các locus
gen và các vùng nhiễm sắc thể chứa các locus gen có ảnh hưởng đến các tính trạng
này đang mở ra một hướng nghiên cứu đầy triển vọng. Trong đó, một số chỉ thị di
truyền liên quan đến tính trạng này như ESR (Oestrogen receptor gene) [52], PRLR
(Prolactin recptor gene) [57], FSH (Follicle Stimulating Hormone β suybinit Gene)
[47], Properdine đã được nghiên cứu ở một số giống lợn.
Với mục đích ứng dụng các kỹ thuật di truyền phân tử để xác định sự tương
quan giữa đa hình gen và số con/lứa đẻ ở lợn lai và khảo sát khả năng sinh sản của
chúng nhằm phục vụ công tác chọn lọc và lai tạo đàn lợn giống phù hợp với điều
kiện tự nhiên và chăn nuôi của người dân, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:
“Nghiên cứu khả năng sinh sản và mối tương quan với các đa hình gen
thụ thể prolactin và properdine của lợn nái lai F1 (đực rừng Thái Lan x nái địa

phương Pác Nặm)”.
2. Mục tiêu của đề tài
Nghiên cứu sức sản xuất của lợn nái lai F1 (Đực Rừng Thái Lan x nái địa
phương Pác Nặm) và xác định ảnh hưởng của đa hình gene Prolactin, Properdine
đến khả năng sinh sản của lợn nái lai F1 phục vụ cho công tác chọn tạo dòng lợn
Rừng lai cung cấp cho nhu cầu sản xuất.
3. Ý nghĩa của đề tài
3.1. Ý nghĩa khoa học
- Đánh giá được khả năng sinh sản của lợn nái lai F1 (đực rừng Thái Lan x nái
địa phương Pác Nặm).
- Xác định được đa hình gen Prolactin và gen Properdine là cơ sở khoa học
cho việc nghiên cứu mối tương quan giữa kiểu gen Prolactin và gen Properdine với
chỉ tiêu số lợn con đẻ/lứa của lợn nái lai F1 (đực rừng Thái Lan x nái địa phương
Pác Nặm).
6
7
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả nghiên cứu về khả năng sinh sản và số con đẻ ra/lứa ở lợn lai F1 (đực
rừng Thái Lan x nái địa phương Pác Nặm) là cơ sở để phát triển loại lợn này phục
vụ nhu cầu của thị trường và phát triển kinh tế xã hội của các địa phương.
7
8
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Cơ sở khoa học về di truyền trong chăn nuôi lợn
1.1.1. Cơ sở khoa học của việc cho lai tạo giữa lợn đực rừng và lợn nái lai
(♂ Thái Lan x nái địa phương Pác Nặm)
Lai giống là phương pháp nhân giống bằng cách cho con đực giống và cái giống
thuộc hai quần thể khác nhau phối giống với nhau. Hai quần thể này có thể là hai dòng,
hai giống hoặc hai loài khác nhau, do vậy đời con không còn là dòng, giống thuần mà

là con lai giữa hai dòng, giống khởi đầu là bố mẹ của chúng. Ví dụ: cho lợn đực
Yorkshire phối giống với lợn cái Móng Cái, đời con là Yorkshire x Móng Cái.
- Vai trò tác dụng của lai giống:
Lai giống có hai tác dụng chủ yếu. Một là tạo được ưu thế lai ở đời con về một
số tính trạng nhất định. Các tác động cộng gộp là nguyên nhân của hiện tượng sinh
học này. Hai là làm phong phú thêm bản chất di truyền ở thế hệ lai bởi vì con lai có
được những đặc điểm di truyền của giống khởi đầu, người ta gọi đó là tác dụng phối
hợp. Điều này có nghĩa là lai giống sử dụng được tác động cộng gộp các nguồn gen
ở thế hệ bố mẹ.
+ Ưu thế lai
Khái niệm ưu thế lai được đề xuất bởi Shull (1914). [40]
Ưu thế lai là hiện tượng con lai có sức sống, sức chống đỡ bệnh tật và năng
suất cao hơn mức trung bình của thế hệ bố mẹ.
Mức độ ưu thế lai của một tính trạng được tính bằng công thức sau:
H (%)=
)(2/1
)(2/1)(2/1
BA
BABAAB
+
+−+
x 100
Trong đó:
H: ưu thế lai
AB : giá trị kiểu hình trung bình của con lai bố A, mẹ B
BA: giá trị kiêu hình trung bình của con lai bố B, mẹ A
A: giá trị trung bình của dòng (giống) A
B: giá trị trung bình của dòng (giống) B
8
9

Cần phân biệt 3 kiểu ưu thế lai sau:
Ưu thế lai cá thể: là ưu thế lai do kiểu gen của chính con vật gây nên.
Ưu thế lai của mẹ: là ưu thế lai do kiểu gen mà mẹ con vật gây ra thông qua
điều kiện ngoại cảnh cung cấp cho nó. Chẳng hạn, nếu bản thân mẹ là con lai, thông
qua sản lượng sữa, khả năng nuôi con khéo mà con lai có được ưu thế này.
Ưu thế lai của bố: ưu thế lai của bố không bằng ưu thế lai của mẹ. Có rất ít
tính trạng có được ưu thế lai của bố, song cũng có thể thấy rằng, khả năng thụ thai,
tình trạng sức khỏe của con đực lai tạo nên ưu thế lai cho đời con của nó.
Các tính trạng liên quan đến khả năng nuôi sống và khả năng sinh sản có ưu
thế lai cao nhất. Các tính trạng có hệ số di truyền thấp thường có ưu thế lai cao, vì
vậy để cải tiến các tính trạng này, so với chọn lọc, lai giống là giải pháp nhanh hơn,
hiệu quả hơn.
Hai quần thể vật nuôi càng khác biệt với nhau về di truyền bao nhiêu thì ưu thế
lai thu được khi lai giữa chúng càng lớn bấy nhiêu. Ưu thế lai cao nhất ở F1, ưu thế
lai ở thế hệ F2 ( giao phối giữa F1 x F1, hoặc F1 với dòng bố, mẹ khởi đầu chỉ bằng
1/2 ưu thế lai của F1.
1.1.2. Đặc điểm sinh lý sinh dục của lợn nái
1.1.2.1. Đặc điểm sinh lý của lợn nái hậu bị
Lợn nái khi thành thục về tính sẽ xuất hiện các triệu chứng động dục và kèm theo
quá trình rụng trứng. Đồng thời lợn nái hậu bị vẫn tiếp tục sinh trưởng đề thành thục về
thể vóc. Chu kỳ động dục của lợn nái trung bình là 21 ngày (biến động từ 18-25 ngày).
Chu kỳ của lợn nái phụ thuộc vào các yếu tố khác nhau:
- Ảnh hưởng của giống: Giống khác nhau có chu kỳ động dục khác nhau: Lợn
Ỉ, từ 19 - 21 ngày lợn Móng Cái từ 18 - 25 ngày.
- Ảnh hưởng của tuổi: Nái tơ thì có chu kỳ tính thường ngắn hơn lợn nái
trưởng thành. Theo Kralling, lợn nái ở lứa đẻ thứ 2, thứ 3 thì chu kỳ tính trung bình
là 20,8 ngày, lứa 6 -7 là 21,5 ngày; lứa 8- 9 là 22,4 ngày. Khi theo dõi sinh sản trên
lợn Ỉ thấy ở lứa thứ nhất chu kỳ tính 19 ngày, lứa thứ 2 là 20 ngày (Lưu Kỷ, 1976).
9
10

Theo Xignort thời gian động dục lần đầu thường ngắn hơn những lần sau, đồng thời
thường không có trứng rụng hoặc trứng rụng rất ít, kích thước tế bào trứng nhỏ hơn
những lần sau.
- Ảnh hưởng của dinh dưỡng: Nếu dinh dưỡng tốt thì chu kỳ tính ổn định và
ngược lại.
- Trong thời gian động dục lợn nái có sự rụng trứng, từ đó liên quan đến sự thụ
thai, chửa và đẻ.
Trong quá trình động dục, hàm lượng hormone có sự thay đổi qua các ngày
trong chu kì động dục của lợn nái. Oestrogen tăng mạnh từ ngày thứ 10 và cao nhất
ở ngày 20-21 (29 - 30pg/ml trong huyết thanh), sau đó giảm dần xuống 7-8 ở ngày
thứ 8 sau động dục. Hàm lượng prostaglandin trong tĩnh mạch tử cung thay đổi và
đột nhiên tăng cao ở ngày 15 (6ng/ml), trong khi bình thường tỷ lệ này 0,3-0,5
ng/ml. Hormone progesterone tăng tiết từ ngày 1 đến 13 (32 ng/ml) trong huyết
thanh và giảm dần và xuống tỷ lệ thấp nhất ở ngày thứ 20, chỉ còn 0,8-1ng/ml. Hàm
lượng prolactin huyết thanh thay đổi liên tục từ ngày 13 đến ngày thứ 5 sau chu kì
động dục biến động lên đến 15 ng/ml và sau 1 ngày xuống lại 1,5-1,8ng/ml, cứ thay
đổi lên xuống theo chu kì 2-3 ngày nhưng ở ngày đầu chu kì từ 2-13 có hàm lượng
thấp 1,8ng/ml. FSH và LH thay đổi và khi động dục tỷ lệ FSH/LH = 1/3.
Số lượng tế bào trứng rụng trong 1 chu kỳ động dục phụ thuộc vào giống, tuổi,
và chế độ nuôi dưỡng, chăm sóc. Qua một số nghiên cứu cho biết, lợn nái Móng Cái
15 - 30 tế bào. Số lượng tế bào trứng rụng phụ thuộc vào chế độ nuôi dưỡng. Vì vậy
người ta thường tăng cường nuôi dưỡng lợn nái trước khi phối giống để tăng số tế
bào trứng rụng nhưng đến lúc gần động dục cho giảm tiêu chuẩn ăn, (Kiều Minh Lực
và CTV, 2002) [16]
1.1.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát dục của lợn cái
Sự thành thục về tính của lợn phụ thuộc nhiều yếu tố.
- Giống: Theo Trần Thế Thông lợn nái Móng Cái thành thục về tính lúc 4
tháng 12 ngày, trọng lượng đạt 12 kg. Trong cùng một giống nhưng khi phối đồng
huyết thì thành thục về tính muộn hơn.
10

11
- Chế độ dinh dưỡng: Dinh dưỡng là yếu tố rất quan trọng. Trong cùng một
giống, nếu dinh dưỡng tốt thì tuổi thành thục về tính sớm và ngược lại.
- Mùa vụ: Theo Smith, lợn con đẻ vào mùa đông thì thành thục sớm hơn về
mùa hè.
- Sự có mặt của lợn đực: Sự có mặt của lợn đực đã thúc đẩy nhanh sự xuất
hiện chu kỳ động dục có trứng rụng, Cole (1970) đã chứng minh rằng nếu hàng
ngày chúng ta cho con đực tiếp xúc với lợn nái ở tuổi 165 - 190 ngày đã làm tăng
nhanh hoạt động sinh dục của con cái.[16]
1.1.3. Khả năng sinh sản của lợn nái và các yếu tố ảnh hưởng
- Tuổi động dục lần đầu
Là tuổi khi lợn cái có biểu hiện động dục lần đầu tiên. Tuổi động dục lần đầu
khác nhau về giống lợn, ví dụ: lợn nội có tuổi động dục lần đầu sớm hơn nái ngoại.
Lợn ỉ động dục ở 3 - 4 tháng tuổi (Trần Văn Phùng, và cs, 2006) [22]
- Tuổi phối giống lần đầu
Là tuổi tại thời điểm phối giống lần đầu, thông thường người ta chưa tiến hành
phối giống cho lợn động dục lần đầu tiên tại thời điểm này lợn chưa thành thục về
thể vóc, số lượng trứng rụng còn ít, người ta thường phối giống cho lợn nái kỳ thứ 2
hoặc kỳ thứ 3. vì vậy chúng ta cần theo dõi tránh phối giông sớm hoặc muộn gây
tổn thất về kinh tế.
- Tuổi đẻ lứa đầu
Là tuổi lợn mẹ đẻ lứa đầu tiên. Tuổi đẻ lúa đầu phụ thuộc vào giống và chế độ
nuôi dưỡng, ví dụ lợn Mẹo tuổi động hớn đầu tiên lúc 8 tháng tuổi. (Phạm Hữu Doanh,
và cs, 1996) [16]
- Số con sơ sinh còn sống đến 24h/lứa đẻ: là chỉ tiêu kinh tế rất quan trọng. Nó
phụ thuộc vào khả năng đẻ nhiều hay ít con của giống, trình độ phối giống của người
nuôi dưỡng chăm sóc, và điều kiện chăm sóc nuôi dưỡng lợn nái chửa. Trong 24 giờ
sau khi sinh nhưng con không đạt khối lượng sơ sinh trung bình của giống, dị dạng,
thì sẽ bị loại thải. Ngoài ra do lợn con chưa nhanh nhẹn bị lợn mẹ đè chết.
11

12
- Bình quân số lợn con đẻ ra còn sống/lứa: là tỷ lệ giữa tổng số lợn con đẻ ra
còn sống trong 24 giờ kể từ khi lợn nái đẻ xong của tất cả các lứa đẻ trên tổng số
lứa đẻ. Số con đẻ ra để lại nuôi: số lợn con đẻ ra còn sống để lại nuôi, đối với lợn
ngoại khối lượng lớn hơn 0,8 kg, đối với lợn nội khối lượng lớn hơn 0,3 kg.
- Tỷ lệ sống: tỷ lệ sống của lợn con sau 24 giờ là tỷ lệ số lợn con còn sống đến
24 giờ so với số con đẻ ra còn sống.
- Số con cai sữa/ lứa: đây là chỉ tiêu kinh tế kỹ thuật rất quan trọng, quyết định
năng suất trong chăn nuôi lợn nái, nó phụ thuộc vào kỹ thuật chăn nuôi lợn con bú
sữa, khả năng tiết sữa khả năng nuôi con của lợn mẹ và khả năng hạn chế các yếu tố
gây bệnh cho lợn con. Đó là số lợn con còn sống cho đến khi cai sữa, thời gian cai
sữa dài hay ngắn phụ thuộc vào trình độ chế biến thức ăn và kỹ thuật nuôi. Trong
chăn nuôi đại trà thường cai sữa vào 35 hoặc 42 ngày tuổi.
- Số con cai sữa /nái/năm: là chỉ tiêu tổng quát nhất để đánh giá năng suất
chăn nuôi lợn nái. Chỉ tiêu này phụ thuộc vào thời gian cai sữa lợn con và số lợn
con cai sữa trong mỗi lứa đe. Nếu cai sữa sớm sẽ tăng số lứa đẻ/nái/năm, và tăng số
lượng lợn con cai sữa trong mỗi lứa thì số lượng lợn con cai sữa/nái/năm cao và
ngược lại. Số lượng lợn con cai sữa/nái/năm là tỷ lệ giữa tổng số lợn con cai sữa
trong năm so với tổng số lợn nái sinh sản trong năm.
- Khối lượng sơ sinh:
Là khối lượng lợn con được cân ngay sau khi đẻ, đã được cắt rốn, lau khô và
bấm số tai và trước khi cho bú ngày đầu tiên.
Khối lượng sơ sinh toàn ổ là chỉ tiêu nói lên khả năng nuôi dưỡng thai của lợn
mẹ, đặc điểm giống, kỹ thuật quản lý chăm sóc và phòng bệnh cho lợn nái chửa. Do đó
thành tích này phụ thuộc cả vào phần của lợn nái và phần nuôi dưỡng của con người.
Khối lượng sơ sinh toàn ổ là khối lượng của tất cả lợn con sinh ra còn sống và
được phát dục hoàn toàn. Nếu những lợn sinh ra khỏe mạnh mà bị lợn mẹ đè chết thì
đó thuộc về trách nhiệm của con người chứ không phụ thuộc vào năng suất của lợn nái.
Khối lợn sơ sinh phụ thuộc vào giống, khối lượng sơ sinh của lợn nội (Ỉ, Móng Cái)
thường từ 0,4 - 0,6 kg/con, khối lượng sơ sinh của lợn ngoại trung bình 1,1 - 1,2 kg/con.

12
13
Lợn con có khối lượng sơ sinh càng cao thì khả năng sinh trưởng càng nhanh,
khối lượng cai sữa sẽ cao.
- Độ đồng đều:
Là chỉ tiêu đánh giá sự chênh lệch về khối lượng giữa các cá thể trong đàn. Có
2 phương pháp tính:
Lấy khối lượng sơ sinh từng con so sánh với khối lượng sơ sinh bình quân của
toàn ổ. Sự chênh lệch càng nhỏ chứng tỏ sự đồng đều là rất cao.
Xác định độ đồng đều phát dục: là tỷ lệ giữa khối lượng sơ sinh nhỏ nhất so
với khối lượng sơ sinh lớn nhất.
Đồng đều là chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất lượng của nái về khả năng
sinh sản. Bởi vì khi so sánh giữa 2 đàn lợn có thể khối lượng sơ sinh kém nhau
không nhiều nhưng độ đồng đều của lợn con giữa các đàn là chênh lệch rất lớn.
- Khối lượng cai sữa toàn ổ:
Ngoài chỉ tiêu số con cai sữa trên lứa, khối lượng toàn ổ lúc cai sữa cũng là chỉ
tiêu quan trọng để đánh giá năng suất của lợn nái.
Hiện nay các cơ sở chăn nuôi thường áp dụng thời gian cai sữa khác nhau tùy
thuộc vào khả năng chế biến thức ăn và trình độ kỹ thuật nuôi dưỡng, cho nên để đánh
giá thành tích của lợn nái chúng ta thường xác định khối lượng lợn con lúc 56 hoặc 60
ngày tuổi, có như vậy chúng ta mới so sánh và đánh giá thành tích của lợn nái với nhau
được. Còn việc xác định khối lượng của lợn con lúc cai sữa ở thời điểm sớm hơn chỉ
nhằm mục đích xác định mức dinh dưỡng cho lợn con một cách chính xác đảm bảo
cung cấp đầy đủ nhu cầu dinh dưỡng cho lợn con ở giai đoạn sau cai sữa.
Khối lượng lợn con cai sữa phụ thuộc rất lớn vào khối lượng sơ sinh và là cơ
sở cho việc nâng cao khối lượng xuất chuồng sau này.
Khối lượng bình quân của lợn con khi cai sữa (kg) bằng tổng số khối lượng
lợn con cai sữa (kg) so với tổng số lợn con cai sữa.
1.1.4. Đặc điểm và khả năng sản xuất của lợn địa phương Pác Nặm
Ở nước ta hiện nay các giống lợn địa phương rất phong phú. Miền núi phía Bắc

Việt Nam nuôi phổ biến là các giống lợn Mẹo, lợn Mường Khương, lợn Táp Ná, lợn
địa phương Pác Nặm, Trải qua quá trình chọn lọc, các giống lợn ở nước ta đã thích
13
14
nghi với điều kiện tự nhiên và kinh tế xã hội của địa phương. Chúng có đặc điểm di
truyền quý giá đó là khả năng sử dụng các loại thức ăn thô xanh, nghèo dinh dưỡng và
tính chống chịu các bệnh tật nhiệt đới rất tốt, nhất là bệnh ký sinh trùng. Các giống lợn
này thường đẻ nhiều con và có phẩm chất thịt thơm ngon, một số giống có khả năng
thích nghi với vùng núi cao, nhiệt độ thấp và một số lại quen với môi trường ẩm ướt
(Lê Viết Ly, 1994) [20].
Giống lợn địa phương có tầm quan trọng đặc biệt trong đời sống các dân tộc
thiểu số vùng núi phía Bắc. Là con vật thân thuộc được nuôi nhiều nhằm cung cấp
thịt mỡ cho nhu cầu của con người. Giống lợn địa phương có những ưu điểm nổi bật
như rất phù hợp với điều kiện tự nhiên miền núi phía Bắc, điều kiện canh tác của
nhân dân miền núi, khả năng chịu đựng kham khổ cao, thích hợp với phương thức
chăn nuôi chăn thả. Thịt và mỡ lợn thơm ngon, được người dân ưa chuộng (Đặc biệt
nhóm lợn đen tuyền đang được coi là hàng đặc sản). Tuy nhiên, lợn cũng có nhiều
nhược điểm như kết cấu ngoại hình xấu, lưng võng, bụng xệ, tầm vóc nhỏ, đẻ ít con,
sinh trưởng chậm. Mặc dù có một số nhược điểm như vậy, nhưng đây vẫn là con vật
được người dân địa phương ưa chuộng và nuôi nhiều. Do một số quan niệm chưa
khoa học của người dân trong công tác chọn giống và chăm sóc nuôi dưỡng, cùng
với xu thế phát triển hiện nay, với trào lưu phát triển của các giống lợn nhập nội có
năng xuất cao đã tạo ra các giống lợn lai với ưu thế hơn hẳn thì các giống lợn bản
địa có xu hướng bị thu hẹp dần . Đặc biệt với nhóm lợn đen tuyền của giống lợn bản
địa nuôi tại Pác Nặm, do những đặc điểm ưu việt về chất lượng thịt được người tiêu
dùng ưa chuộng cho nên có nguy cơ tuyệt chủng đang dần hiện hữu. Vì vậy chúng
ta cần tìm ra các biện pháp bảo tồn và phát triển các giống lợn địa phương.
Đặc điểm của giống lợn địa phương Pác Nặm: Dựa vào màu sắc lông, da có thể
chia làm 3 nhóm như sau: [21]
* Nhóm đen tuyền:

Toàn thân đen tuyền. Nhóm này có đặc điểm là tương đối nhỏ, có đặc điểm hoang
sơ hơn. Nhóm lợn này được nuôi nhiều ở bà con dân tộc H'mông và dân tộc Dao. Hiện
14
15
nay số lượng còn không nhiều chỉ chiếm từ 6,10% - 8,33% đàn lợn nái điều tra, 2,42 -
3,92% đàn lợn thịt. Nguyên nhân là do mặc dù có khối lượng nhỏ, lớn chậm nhưng thịt
ngon, là đối tượng cung cấp thực phẩm có chất lượng cao do đó làm suy giảm đáng kể
số lượng đàn lợn. Cần có biện pháp bảo tồn tránh nguy cơ tuyệt chủng.
* Nhóm lợn đen có một số điểm trắng
Toàn thân lợn có màu đen và có điểm trắng ở một số vị trí như gương mũi, 4 ngón
chân, giữa trán và đuôi có một nhúm lông màu trắng.
Nhóm lợn này được nuôi nhiều ở bà con dân tộc H'mông và dân tộc Dao. Về số
lượng đàn lợn này chiếm tỷ lệ tương đối cao trong đàn lợn địa phương. Trong đàn lợn
nái, nhóm lợn đen có một số điểm trắng chiếm từ 40,24% - 58,33%; đối với đàn lợn thịt
chiếm từ 30,99% - 43,79%. Nhóm lợn này được nuôi nhiều ở khu vực các thôn vùng
cao của các xã, khối lượng cũng lớn hơn nhóm đen tuyền.
* Nhóm lợn lang trắng đen
Nhóm lợn này có màu lông trắng và đen xen kẽ. Các vết lang trắng không cố định
và mức độ lang không giống nhau, con nhiều, con ít. Các vết lang này thường phân bố ở
bụng, ngang sườn, cổ, vai, lưng, gương mũi, 4 ngón chân, giữa trán và đuôi. Phần còn
lại có da và lông màu đen. Nhóm lợn này chiếm từ 33,34% - 53,66% tổng đàn lợn nái;
từ 52,29 - 66,59% tổng đàn lợn thịt. Nhìn chung nhóm lợn lang trắng đen này có tầm
vóc to hơn và lớn nhanh hơn được nuôi nhiều ở vùng thấp hơn nơi có người dân tộc Tày
sinh sống.
1.2. Cơ sở khoa học và lý luận về di truyền
1.2.1. Cấu trúc của nucleic acid - DNA (Desoxyribonucleic acid)
Phân tử DNA là một chuỗi xoắn kép gồm hai chuỗi đơn. Mỗi chuỗi đơn là một chuỗi
nucleotide. Mỗi nucleotide gồm ba thành phần: nhóm phosphate, đường desoxyribose
và một trong bốn base và thường được ký hiệu bằng chữ cái đầu tiên của các base đó
(A-adenine, C-cytosine, G-guanine và T-thymine). Hai chuỗi đơn kết hợp với nhau nhờ

các liên kết hydrogen hình thành giữa các base bổ sung nằm trên hai chuỗi: A bổ sung
cho T và C bổ sung cho G. Mỗi chuỗi đơn có một trình tự định hướng với một đầu
15
16
5’phosphate tự do, đầu kia là 3’ hydroxyl tự do (quy ước là 5’ → 3’. Hướng của hai chuỗi
đơn trong chuỗi xoắn kép ngược nhau, nên được gọi là hai chuỗi đối song [10].
Một đặc điểm của phân tử DNA có ý nghĩa rất quan trọng được sử dụng vào
phương pháp lai phân tử. Đó là khả năng biến tính và hồi tính. Biến tính là hiện
tượng hai sợi đơn của phân tử DNA tách rời nhau khi các liên kết hydrogen giữa các
base bổ sung nằm trên hai sợi bị đứt do các tác nhân hóa học (dung dịch kiềm,
formamide, urea) hay do tác nhân vật lý (nhiệt). Sau đó, nếu điều chỉnh nhiệt độ và
nồng độ muối thích hợp, các sợi đơn có thể bắt cặp trở lại theo nguyên tắc bổ sung,
để hình thành phân tử DNA ban đầu, đó là sự hồi tính [3].
1.2.2. Tổng hợp DNA in vitro
Phần lớn những hiểu biết về các quá trình hóa sinh tham gia vào việc tổng hợp
DNA là bắt nguồn từ công trình của A. Kornberg và đồng nghiệp năm 1950. Theo
Kornberg những chất cần thiết cho quá trình tổng hợp DNA trong ống nghiệm
(invitro) là:
1. Hỗn hợp của tất cả bốn deoxyribonucleotit 5' - triphosphat
2. Các ion Mg
2+
3. Enzym DNA - polymerase tinh sạch chiết xuất từ E.coli
4. DNA có trọng lượng phân tử cao
Trong những thí nghiệm đầu tiên Kornberg đã nhận ra được số lượng DNA
lớn gấp khoảng 20 lần số lượng DNA đưa vào. Phản ứng tiếp diễn cho đến khi
hết một trong các tiền chất 5' - triphosphat, mặc dù chất quan trọng đối với
phản ứng là Enzym DNA - polymerase có tác dụng hình thành mối liên kết
phosphodiester. Lúc đầu người cho rằng DNA phân tử lượng cao có thể thực
hiện 2 chức năng trong phản ứng: một là làm chất mồi (primer) nghĩa là đóng
vai trò như đỉnh sinh trưởng để bổ sung các nucleotit mới, hai là đóng vai trò

khuôn để tổng hợp sợi DNA mới có trình tự bổ trợ (bổ sung) cho các
bazơnitơ.Tất cả các số liệu hiện có chứng tỏ rằng DNA này chỉ thực hiện chức
năng thứ hai [3].
1.2.3. Gen và những quan niệm về gen
16
17
Khái niệm về gen như một quan niệm di truyền tách biệt, phát hiện được
nhờ phép phân tích lai của Mendel, đã được W.Johannson đưa vào năm 1909.
Theo Johannson thì "nhiều tính trạng của cơ thể được xác định bởi những cái
mà chúng ta gọi là gen" [10]. Quan niệm đó về gen tồn tại suốt cả giai đoạn phát
triển của di truyền học kinh điển. Từ đó đến nay bản chất của gen là vấn đề trung
tâm của di truyền học Người đầu tiên thành công trong việc cụ thể hóa các khái
niệm về gen là T.Morgan (1926) Có thể tóm tắt quan điểm về gen của trường
phái Morgan như sau:
- Gen là đơn vị đột biến, nghĩa là gen bị biến đổi như một tổng thể hoàn chỉnh.
- Gen là đơn vị tái tổ hợp, nghĩa là trao đổi chéo không bao giờ diễn ra ở bên
trong gen mà chỉ có thể diễn ra ở giữa các gen.
- Gen là đơn vị chức năng, nghĩa là gen hoạt động như một đơn vị thống nhất
quy định một tính trạng của cơ thể.
Vào những năm 50, DNA được chứng minh là vật chất di truyền, mô hình cấu
trúc DNA của Waston - Crick được nêu ra và học thuyết trung tâm ra đời. Gen được
hiểu là một đoạn DNA trên nhiễm sắc thể mã hóa cho một polypeptide hay RNA
(một đại phân tử sinh học).
Cuối những năm 70, việc phát hiện ra gen gián đoạn ở Eucaryote cho thấy
có những đoạn DNA không mã hóa cho các aminoacid trên phân tử protein.
Khái niệm gen được chỉnh lý một lần nữa: "gen là một đoạn DNA đảm bảo cho
việc tạo ra một polypeptide, nó bao gồm cả vùng trước và sau vùng mã hóa cho
protein và cả những đoạn không mã hóa (intron) xen giữa các đoạn mã hóa
(exon)" . Hiện nay có thể định nghĩa gen một cách tổng quát như sau: "gen là
đơn vị chức năng cơ sở của bộ máy di truyền, chiếm một locus nhất định trên

nhiễm sắc thể và xác định một tính trạng nhất định. Các gen là những đoạn vật
chất di truyền mã hóa cho những sản phẩm riêng lẻ như các RNA được sử dụng
trực tiếp hoặc cho tổng hợp các enzym, các protein cấu trúc hay các mạch
polypeptide để gắn lại tạo ra các protein có hoạt tính sinh học" [31].
1.2.4. Các chỉ thị di truyền (genetic marker)
17
18
Trong nhiều thập kỷ qua, ứng dụng các phương pháp chọn lọc dựa trên khoa học
về di truyền quần thể và khoa học thống kê đã cho phép tạo ra vật nuôi có hiệu suất tăng
trưởng cao. Các kết quả dựa trên chọn lọc kiều hình với một tính trạng kinh tế quan trọng
ở gia súc, gia cầm đã đạt được nhiều thành tựu đáng kể. Tuy nhiên, theo thời gian những
hạn chế của phương pháp này trong việc cải thiện tính di truyền vật nuôi đã trở nên rõ
ràng. Hiệu quả của chúng giảm khi các tính trạng mong muốn khó định lượng, khả năng
di truyền thấp (ví dụ như tính kháng bệnh). Thêm vào đó, việc chọn lọc nói chung chỉ
hạn chế các đặc tính có thể đo lường một cách phù hợp ở một số lượng lớn các mẫu. Một
vài đặc tính như: tỷ lệ sống sót, năng suất trứng… lại biểu hiện rất muộn trong quá trình
sống nên khó có thể dùng làm tiêu chí có ích trong chọn lọc. Ngoài ra hiệu quả chọn lọc
dựa trên kiểu hình thường không cao khi mục tiêu chọn lọc có tương quan di truyền
không phù hợp (ví dụ như năng suất sữa và hàm lượng protein của sữa), sự tương tác át
chế của gen) và giữa các gen với môi trường cũng rất phức tạp, do đó khó có thể xác
định một cách chính xác nếu chỉ dựa trên kiểu hình và phả hệ [41].
Sự phát triển của kỹ thuật sinh học phân tử đã mở ra khả năng xác định và sử
dụng các biến dị hệ gen cho việc nâng cao tính di truyền của giống vật nuôi. Đặc
biệt sự ra đời của các chỉ thị di truyền (các trình tự đánh dấu trên bộ gen liên kết với
các tính trạng cần quan tâm) có thể giúp giải quyết những hạn chế của các phương
pháp trên.
Hệ thống các chỉ thị phân tử chính đang được sử dụng để nghiên cứu di truyền
ở động vật có thể kể đến: RELP, RAPD, AFLP, Microsatellites… Trong nghiên cứu,
các chỉ thị này được sử dụng vào nhiều mục đích:
* Dùng để đánh giá mức độ biến động di truyền trong một quần thể vật nuôi.

Nếu mức độ biến động di truyền này còn cao thì cần tiếp tục quá trình chọn lọc
nhằm ổn định dòng.
* Cho phép đánh giá sự khác biệt di truyền giữa hai cá thể bố mẹ. Sự khác biệt
này càng lớn thì tính dị hợp tử ở thế hệ con càng cao.
18
19
* Theo dõi hiệu quả của một chương trình chọn giống định hướng đối với một
allele đặc biệt.
* Xác định các chỉ thị ở các locus có liên kết chặt chẽ với các tính trạng
mong muốn.
Dựa trên chức năng, người ta chia các chỉ thị di truyền thành hai loại cơ bản
như sau:
A. Chỉ thị loại I (known function)
Còn gọi là các ứng cử gen (cendidate gene) - là những chỉ thị đối với những
gen đã biết chính xác sản phẩm biểu hiện, do vậy được voi là quyết định tới các tính
trạng mong muốn [51]. Những chỉ thị loại này chủ yếu là các gen nằm trong vùng
mã hoá (coding gene), gồm RELP, SNP.
B. Chỉ thị loại II (unknown functions)
Là những chỉ thị đối với những gen nằm ngoài vùng mã hoá, có thể nằm gần
hoặc cách xa đoạn gen đã biết sản phẩm biểu hiện. Chỉ thị loại này chưa được biết
về sản phẩm của nó, song cũng được xác định là có tác động hoặc ảnh hưởng đến
tính trạng [51]. Chỉ thị DNA này thường được phát hiện nhờ kỹ thuật RAPD, AFLP,
Microsatellites, Minisatellites…
Trong nghiên cứu và phân tích di truyền các giống vật nuôi, mỗi loại chỉ thị
phân tử có một thế mạnh riêng và đem lại hiệu quả nhất định. Do đó, việc lựa chọn
và sử dụng chỉ thị phân tử nào trong nghiên cứu là phù hợp còn tuỳ thuộc vào mục
đích cũng như điều kiện cơ sở vật chất cũng như các trang thiết bị thí nghiệm.
1.2.5. Một số phương pháp sử dụng trong nghiên cứu gen lợn và ứng dụng
Trong chọn giống ở lợn và nhiều gia súc khác, thường thì các chỉ thị di truyền
được sử dụng có liên quan đến các tính trạng năng suất, chất lượng thịt, sinh sản,

khả năng kháng bệnh…
Nghiên cứu đa hình gen (DNA) vật nuôi và xác định sự liên quan của nó với
các tính trạng có ý nghĩa kinh tế nhằm tìm các chỉ thị di truyền hỗ trợ cho công tác
chọn giống rất có ý cả trong khoa học lẫn thực tiễn.
19
20
Sử dụng các phương pháp phân tích đa hình có thể xác định các chỉ thị di
truyền ở mức độ sinh hoá (như: Sự đa hình nhóm máu, đa hình protein/enzyme
hoặc hệ thống kháng nguyên) hoặc ở mức độ DNA (lai ghép DNA-DNA, phân
tích đa hình bằng enzyme giới hạn (RFLP) với DNA nhân hoặc DNA ty thể,
khuếch đại ngẫu nhiên đa hình DNA (RAPD), khuếch đại đa hình chiều dài các
đoạn gen nhân có chọn lọc (AFLP), đa hình các trình tự lặp lại đơn giản:
minisatellites, microsatellie (MS), SNP - đa hình nucleotide đơn…).
Mỗi phương pháp đều có những ưu nhược điểm nhất định. Nhìn chung, chúng
đều dựa vào sự khác biệt về chiều dài các đoạn giới hạn (do đột biến làm mất hay
thêm một vị trí nhận biết của enzyme giới hạn) hoặc số lượng các trình tự lặp lại tại
một vùng trên bộ gen giữa các cá thể khác nhau.
* Phương pháp phân tích đa hình các đoạn cắt bằng enzyme giới hạn (Polymerase
Chain Reaction - Restriction Fragment Lenghth Polymorphism = PCR-RFLP).
- Nguyên lý của phương pháp này là nhờ PCR (Polymerase Chain Reaction) để
khuếch đại đoạn gen cần nghiên cứu bằng các đoạn mồi chuyên biệt, sau đó dùng
enzyme giới hạn để cắt đoạn gen đó tại các điểm đột biến nhất định để từ đó xác định
sự có mặt hay không của điểm đột biến đó tương ứng với sự có mặt hay không của các
allele tương ứng với các đột biến đó trong đoạn gen mà ta quan tâm nghiên cứu. Từ đó
xác định tần số tương đối của các allele cũng như gen đó có đa hình hay không…
* Phương pháp phân tích đa hình chiều dài các đoạn DNA được khuếch đại
(Amplified Fragment Lenghth Polymorphisms = AFLP).
AFLP cũng là một trong những kỹ thuật phân tích đa hình được sử dụng khá phổ
biến. Kỹ thuật này dựa trên nguyên tắc của PCR nhưng đoạn mồi được thiết kế theo trình
tự của những đoạn DNA đã biết, do đó sản phẩm nhân có độ đặc hiệu cao. Winimers và

cs (2002) đã sử dụng 48 cặp mồi AFLP xác định vị trí gen quy định tính trạng tỷ lệ thịt
xẻ và độ dày mỡ lưng ở các thế hệ lợn F
2
Duroc và Berlin của Đức. [58]
* Phương pháp phân tích đa hình Microsatellile (MS)
MS là phương tiện rất hiệu quả để đánh giá mức độ đa hình và quan hệ di
truyền quần thể động vật. Mới đây, tổ chức Nông lương thế giới (FAO) đã đưa ra
20
21
danh sách 27 chỉ thị cho lợn. Thời gian qua, nhiều nghiên cứu về đa dạng di truyền
đã được tiến hành trên các giống lợn châu Âu, Trung Quốc và Hàn Quốc. Một dự án
nghiên cứu lớn nhằm đánh giá mức độ đa dạng di truyền của 50 giống lợn Trung
Quốc và so sánh với 59 giống lợn châu Âu đang được tiến hành bởi Blott và cs
(2003) [25]. Ở Việt Nam, các nghiên cứu về đa dạng sinh học trên các giống lợn sử
dụng các MS nhìn chung còn hạn chế.
* Phương pháp phân tích đa hình bằng trình tự DNA
Việc xác định đa hình không chỉ dựa trên kích thước allele mà còn dựa trên những
thông tin về trình tự nucleotide của nó. Người ta có thể phân tích trình tự cac nucleotide
trực tiếp trên sản phẩm PCR hay gắn sản phẩm PCR hay gắn sản phẩm PCR vào một
vector và biến nạp vào tế bào E.coli. Ngày nay nhờ có kỹ thuật PCR nên các phương
pháp phân tích trình tự đã cải tiến, cùng với sự trợ giúp của máy xác định trình tự tự
động, các phần mềm thu thập và xử lý số liệu thích hợp… đã giúp cho việc xác định
trình tự được nhanh, chính xác và dễ dàng hơn.
1.2.6. Ứng dụng của các chỉ thị di truyền đến tính trạng số lượng ở lợn
Trong chọn giống ở lợn và nhiều gia súc khác, thường các chỉ thị di truyền được sử
dụng có liên quan đến các tính trạng năng suất, chất lượng thịt, sức sinh sản và khả năng
kháng bệnh… Đó là những tính trạng số lượng (Quantitative trait) hay còn gọi là
các tính trạng liên tục (vì trong quần thể, giá trị của các tính trạng này biến thiên
liên tục) và các locus di truyền tương ứng của chúng được coi là các locus tính trạng
số lượng (QTL- Quantitative trait loci).

Hiện nay, việc sử dụng các chỉ thị di truyền để phát hiện những vùng trong bộ
gen liên quan đến tính trạng số lượng được ứng dụng rộng rãi, đặc biệt chúng còn được
sử dụng vào việc xác định dấu vết di truyền, hình thành các bản đồ liên kết (linkage
map) hay bản đồ các locus tính trạng số lượng (QTL mapping) với vị trí các gen mã
hoá cho các tính trạng mong muốn, nhằm đáp ứng nhanh và hiệu quả việc chọn lọc
phục vụ cho các chiến lược lai tạo và chọn giống theo phương pháp cổ điển.
Việc phát triển các chỉ thị di truyền phân tử nói chung đều đòi hỏi trình độ kỹ
thuật cao song có nhiều những ưu điểm: Nó cho phép sử dụng nguồn gèn mà không
21
22
làm ảnh hưởng đến sự điều hoà và biểu hiện tự nhiên của gen; chỉ cần một lượng rất
nhỏ chứa rất ít vật liệu di truyền vẫn có thể cho kết quả nhanh và chính xác. Do vậy,
thời gian vừa qua số lượng gen và chỉ thị di truyền trên bản độ di truyền của lợn đã
không ngừng được gia tăng.
1.3. Cơ sở lý luận về phương pháp nghiên cứu
1.3.1. Phương pháp tách DNA
DNA là phân tử có kích thước lớn, do đó trong thao tác cần tránh mọi tác nhân
cơ học hay hóa học quá mạnh có thể làm đứt gãy phân tử này. Có nhiều phương
pháp tách chiết DNA tế bào [3]. Nói chung các phương pháp tách chiết cơ bản đó
đều được tiến hành theo ba bước:
Bước 1: Phá vỡ màng tế bào và màng nhân (tế bào Eukaryote).
Bước 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu là các
protein.
Bước 3: Kết tủa DNA, mục đích của việc kết tủa là nhằm thu nhận DNA dưới
dạng cô đặc, một phần nhằm bảo vệ chúng ra khỏi sự phân hủy các enzym, mặt
khác có thể hòa tan chúng lại trong dung dịch theo nồng độ mong muốn.
1.3.2. Phương pháp nhân đoạn DNA đặc hiệu (phản ứng PCR)
1.3.2.1. Phản ứng PCR cho phép nhân các đoạn DNA định trước
Kỹ thuật nhân đoạn DNA đặc hiệu, hay còn gọi là kỹ thuật PCR (Polymerase
Chain Reaction) được Kary Mullis hoàn thiện vào giữa những năm 80 và được xem là

một cuộc cách mạng trong di truyền học phân tử. Kỹ thuật này là một phương pháp hoàn
toàn mới trong việc nghiên cứu và phân tích gen [19].
Kỹ thuật PCR sử dụng các đặc điểm của quá trình sao chép DNA. DNA
polymerase dùng các đoạn DNA mạch đơn làm khuôn để tổng hợp nên sợi mới bổ
trợ với nó. Các sợi DNA mạch đơn này có thể được tạo ra theo cách đơn giản là đun
nóng dung dịch DNA mạch kép tới gần nhiệt độ sôi (94
o
C-97
o
C). DNA polymerase
cũng đòi hỏi phải có một đoạn ngắn DNA mạch kép (đoạn mồi - primer) để khởi
đầu quá trình tổng hợp. Vì vậy để khởi đầu quá trình tổng hợp DNA cần cung cấp
đoạn mồi oligonucleotit (có độ dài từ 6 đến 30 nucleotit), đoạn này gắn với khuôn
22
23
tại điểm khởi đầu sao chép. Đó là đặc điểm quan trọng đầu tiên của kỹ thuật PCR vì
DNA polymerase được điều khiển để tổng hợp một đoạn DNA đặc thù. Cả hai sợi
ADN đều được dùng để làm khuôn cho quá trình tổng hợp nên các đoạn mồi
oligonucleotit được cung cấp cho cả hai sợi. Trong kỹ thuật PCR, các đoạn mồi
được chọn để chặn hai đầu của đoạn DNA cần nhân lên, sao cho các sợi DNA tổng
hợp mới được bắt đầu tại mỗi đoạn mồi và kéo dài về phía đoạn mồi nằm trên sợi
kia [3]. Như vậy sau mỗi chu kỳ các điểm bám cho các đoạn mồi lại xuất hiện trên
mỗi sợi DNA mới được tổng hợp. Hỗn hợp phản ứng lại được đun nóng lên để tách
sợi ban đầu khỏi sợi mới tổng hợp, các sợi này sau đó lại dùng làm khuôn cho chu
kỳ tiếp theo bao gồm các bước: gắn đoạn mồi, tổng hợp DNA và tách rời các đoạn.
1.3.2.2. Cách tiến hành phản ứng PCR chuỗi trùng hợp
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm
ba bước:
- Bước 1 (tách hai mạch) : trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành
phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ 94-97

o
C
trong vòng 30 giây - 1 phút để hai mạch ADN sợi kép tách nhau ra thành hai mạch
đơn, làm khuôn cho quá trình tổng hợp.
- Bước 2 (bắt cặp mồi) : nhiệt độ được hạ thấp cho phép các mồi bắt cặp với
khuôn; trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 40-70
o
C và kéo dài
30 giây - 1 phút.
- Bước 3 (sinh tổng hợp) : nhiệt độ được nâng lên 72
o
C đây là nhiệt độ thích
hợp cho enzym DNA polymerase hoạt động tiếp tục lắp ghép các nucleotit bổ sung
với mạch khuôn kéo dài sợi DNA mới.
Một chu kỳ bao gồm ba bước trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần, mỗi lần
lại làm tăng gấp đôi lượng mẫu của lần trước. Đây là sự khuyếch đại theo cấp số
nhân, theo tính toán sau 30 chu kỳ sự khuyếch đại sẽ là 10
6
so với số lượng bản
mẫu ban đầu [19].
23
24
1.3.3. Enzym giới hạn
Hiện tượng giới hạn và enzyme giới hạn do Hamilton Smith và cộng sự phát
hiện đầu tiên (1970) ở vi khuẩn Hemophilus influezae. Bình thường tế bào vi khuẩn
bị nhiễm phage thường bị phage phá hủy. Một số vi khuẩn khi bị nhiễm phage,
không bị phage phá hủy mà có khả năng phân hủy DNA phage, nhờ một số loại
enzym đặc hiệu có trong tế bào vi khuẩn. Các loại enzym trong tế bào vi khuẩn có
thể cắt DNA phage ở những vị trí nhất định thành những đoạn ngắn, những enzym
này được gọi là enzym giới hạn [42].

Enzym giới hạn (Restriction Enzym - RE) là các enzym thuộc nhóm enzym
endonuclease, có khả năng nhận biết các trình tự nucleotid đặc hiệu trên phân tử
DNA (khoảng 4 - 8 nucleotid), cắt đặc hiệu phân tử DNA ở những vị trí nhất định
thành những đoạn ngắn.
1.3.4. Phương pháp RFLP
- RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism DNA): đa hình chiều dài
các đoạn DNA cắt bởi enzyme giới hạn. Kỹ thuật này dựa trên đặc điểm của các loại
enzyme giới hạn khác nhau, tạo nên các đoạn cắt DNA khác nhau phân biệt bằng điện di
đồ. Các đoạn cắt còn được gọi là các "dấu vân tay- Fingerprinting" đặc trưng cho từng
phân tử DNA. Phương pháp này được sử dụng để xác định sự khác biệt trong cấu trúc bộ
gen của các cá thể, các loài sinh vật, nhằm so sánh sự khác biệt về cấu trúc gen quan tâm
giữa các mẫu nghiên cứu [19].
- Nguyên lý: các mẫu nghiên cứu được tách chiết, tinh sạch DNA rồi xử lý
bằng cùng môt loại enzyme giới hạn. Mỗi enzyme giới hạn sẽ nhận biết và cắt
đặc hiệu DNA ở những vị trí xác định. Do đó, các bộ gen có cấu trúc khác nhau
tạo nên số lượng đoạn cắt DNA khác nhau, và có thể có kích thước khác nhau.
Ngược lại, những bộ gen hoàn toàn giống nhau tạo nên số lượng và kích thước
các đoạn cắt DNA giống nhau, có thể phát hiện nhờ điện di đồ.
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng enzyme cắt giới hạn cho gen PRLR là
ALu I và gen Properdine là SmaI. Vị trí cắt của enzyme giới hạn ALuI và SmaI được
mô tả như bảng sau:
24
25
Bảng 1.1. Vị trí cắt của enzyme giới hạn ALuI và SmaI
Cặp mồi Nguồn gốc Trình tự Vị trí cắt
PRLR/ALuI
vi khuẩn
Arthrobacter
luteus
5’ AGCT 3’

3’ TCGA 5’
5’ AG CT 3’
3 TC GA 5’
Properdine/SmaI
Vi khuẩn
Serratia
marcescens
5’ CCCGGG 3’
3’ GGGCCC 5’
5’ CCC GGG 3’
3’ GGG CCC 5’
1.3.5. Điện di trên gel agarose
Điện di là một phương pháp được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu cấu trúc và
đặc điểm sinh học của phân tử mang điện tích (DNA, Protein v.v ). Nguyên lý chung
của phương pháp điện di là dựa vào điện tích âm của DNA trong môi trường có điện
trường. Sở dĩ DNA mang điện tích âm là nhờ các nhóm photphat nằm trên khung
phosphodiester của chúng. Các phân tử DNA có kích thước khác nhau sẽ di chuyển từ
cực âm sang cực dương với tốc độ khác nhau [19].
Kiểu gel dùng trong điện di có tác dụng rất quan trọng đối với mức độ phân
tách các phân tử. Có hai loại gel được dùng phổ biến là Agarose và Polyacrylamid
và trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng gel Agarose.
Agarose là phân tử polymer được tách chiết từ rong biển, cấu tạo bởi 2 monome là
D-galactoza và 3,6 - anhydroL-galacoza nên sau khi đun sôi sẽ tạo thành mạng lưới cho
phép các phân tử khác nhau đi qua tùy theo kích thước và trọng lượng của phân tử.
Agarose nóng chảy ở nhiệt độ 90-100
0
C và ở nhiệt độ bình thường trong phòng thí
nghiệm thì Agarose bị đông đặc lại. Dựa vào tính chất này của gel agarose mà ta có thể
lựa chọn nhiệt độ thích hợp với từng nồng độ của gel để có thể điện di được các phân tử
có khối lượng phân tử khác nhau.

Sự di chuyển của DNA trong gel điện di có được hiệu quả hay không được quyết
định bởi một phần rất lớn của nồng độ ion, thành phần các chất có trong đệm điện di.
Trong trường hợp nếu không có sự có mặt của các ion thì sự dẫn điện là rất nhỏ với tốc
độ di chuyển của DNA cũng rất thấp. Nếu nồng độ các ion trong đệm điện di cao thì độ
25