tối ưu hóa quá trình làm trong dịch nho ép bằng enzyme pectinase

i

LỜI CÁM ƠN

Trước tiên xin cám ơn trường đại học Nha Trang nói chung và khoa Chế
Biến nói riêng đã truyền đạt những kiến thức và kĩ năng hữu ích trong suốt 4 năm
qua để em hoàn thành chương trình đại học ngày hôm nay.

Em xin gửi lời cám ơn tới TS Nguyễn Minh Trí đã nhiệt tình hướng dẫn em
thực hiện đề tài.

Cám ơn Ths Đặng Thu Hương, giáo viên chủ nhiệm lớp 49TP2, cô đã nhiệt
tình giải đáp, hướng dẫn em khi thực hiện tính toán các số liệu, phương thức bố trí
thí nghiệm trong quá trình thực hiện.

Cám ơn cô Lê Thiên Sa, giáo viên phụ trách phòng thí nghiệm Công nghệ
thực phẩm, luôn ủng hộ và giúp đỡ em trong quá trình thực hành ở phòng thí
nghiệm.

Cám ơn mẹ, gia đình, bạn bè đã ủng hộ và giúp đỡ để hoàn thiện được đề tài
tốt nghiệp.

ii

MỤC LỤC
1.1 Giới thiệu chung về nho 3

1.1.1 Hình dạng, cấu tạo 3

1.1.2 Thành phần hóa học 5

1.1.2.1 Đường 6

1.1.2.2 Acid hữu cơ 6

1.1.2.3 Hợp chất phenol 7

1.1.2.4. Hợp chất nito 8

1.1.2.5. Hợp chất thơm 8

1.1.2.6. Chất khoáng 8

1.1.2.7. Hợp chất pectin 9

1.2. Tổng quan về enzyme 9

1.2.1 Đặc điểm của enzyme 9

1.2.2 Enzyme pectinase 13

1.2.2.1 Giới thiệu về enzyme pectinase 13

1.2.2.2 Ứng dụng của enzyme pectinase 16

1.2.2.3 Những nghiên cứu sử dụng enzyme pectinase làm trong dịch quả 25

1.3 Giới thiệu về phép thử cảm quan cho điểm 26

1.3.1 Giới thiệu về phép thử 26

1.3.2 Phương pháp tiến hành 27

1.3.3 Xử lý kết quả 27

CHƯƠNG 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.1

Nguyên liệu 28

2.1.1 Nho 28

2.1.2 Enzyme pectinase 28

2.2

Phương pháp nghiên cứu 29

iii

2.2.1 Quy trình 29

2.2.2 Xác định các thông số biên 30

2.2.2.1 Bố trí thí nghiệm xác định giá trị biên về nhiệt độ 30

2.2.2.2 Bố trí thí nghiệm xác định giá trị biên về thời gian 31

2.2.2.3 Bố trí thí nghiệm xác định giá trị biên về nồng độ 31

2.2.3 Bố trí thí nghiệm tối ưu phương pháp làm trong dịch nho ép bằng enzyme
pectinase 32

2.2.4 Đánh giá cảm quan khi sử dụng các phương pháp làm trong 33

2.2.4.1 Đánh giá cảm quan làm trong bằng phương pháp lọc 34

2.2.4.2 Đánh giá cảm quan làm trong bằng phương pháp ly tâm 34

2.2.4.3 Đánh giá cảm quan làm trong bằng phương pháp sử dụng enzyme
pectinase 35

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN … 36

3.1

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình làm trong dịch nho sử dụng
enzyme pectinase 36

3.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đối với quá trình làm trong 36

3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian ủ trong quá trình làm trong 38

3.1.3 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme trong quá trình làm trong 40

3.2 Xử lý kết quả quá trình tối ưu hóa theo phương pháp thực nghiệm 41

3.3

Kết quả đánh giá cảm quan của các phương pháp làm trong dịch nho ép 46

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 54

Kết luận 54

Đề xuất ý kiến 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

Phụ lục 1 62

Phụ lục 2 64

iv


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Nho Phan Rang 3

Hình 1.2 Cấu tạo nho 5

Hình 1.3 Cơ chế phản ứng của Pectinesterase và Polygalacturonase 16

Hình 1.4 Quy trình sản xuất nước táo ép 18

Hình 1.5 Quy trình sản xuất rượu vang 22

Hình 2.1 Quy trình thí nghiệm 29

Hình 2.2 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đối với quá trình lọc trong dịch
nho bằng enzyme pectinas 30

Hình 2.3 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của thời gian đối với quá trình lọc trong dịch
nho bằng enzyme pectinase 31

Hình 2.4 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ enzyme đối với quá trình làm
trong dịch nho bằng enzyme pectinase 31

Hình 2.5 Đánh giá cảm quan đối với dịch ép làm trong bằng phương pháp lọc 34

Hình 2.6 Đánh giá cảm quan đối với dịch ép làm trong bằng phương pháp ly tâm34

Hình 2.7 Đánh giá cảm quan đối với dịch ép làm trong bằng phương pháp sử dụng
enzyme 35

Hình 3.1:Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ đối với quá trình làm trong dịch nho
bằng enzyme pectinase 37

Hình 3.2 : Biểu đồ ảnh hưởng của thời gian đối với độ đối với quá trình làm trong
dịch nho bằng enzyme pectinase 39

Hình 3.3 Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ đối với độ đối với quá trình lọc trong
dịch nho bằng enzyme pectinase 40



v

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của nho Phan Rang 5

Bảng 2.1: Bố trí thí nghiệm quy hoạch tối ưu hóa quá trình làm trong bằng enzyme
pectinase 32

Bảng 2.2: Bố trí thí nghiệm tâm 33

Bảng 3.1: Số liệu tương ứng giữa độ đục với nhiệt độ khi làm trong dịch nho ép
bằng enzyme pectinase 36

Bảng 3.2: Số liệu tương ứng giữa độ đục và thời gian trong quá trình làm trong dịch
nho ép bằng enzyme pectinase 38

Bảng 3.3: Số liệu tương ứng giữa nồng độ và độ đục trong quá trình làm trong dịch
nho ép bằng enzyme pectinase 40

Bảng 3.4: Kết quả bố trí thí nghiệm theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm 41

Bảng 3.5: Hệ số b
j
42

Bảng 3.6: Kết quả thí nghiệm tâm 42

Bảng 3.7: Kết quả tính S
bj
43

Bảng 3.8: Kết quả tính t
j
43

Bảng 3.9: Kết quả kiểm định sự tương thích của phương trình theo tiêu chuẩn Fisher
44

Bảng 3.10: Bảng kết quả thí nghiệm tối ưu hóa 45

Bảng 3.11 Kết quả đánh giá của cảm quan viên về độ trong và màu sắc theo phương
pháp cho điểm 46

Bảng 3.12: Bảng phân tích phương sai 48

Bảng 3.13: Bảng số điểm trung bình của các mẫu sắp xếp theo chiều giảm dần 49

Bảng 3.14: Kết quả đánh giá của cảm quan viên về mùi theo phương pháp cho điểm
50

Bảng 3.15: Xử lý kết quả 50

Bảng 3.16: Bảng phân tích phương sai 51



vi

Bảng 3.17: Kết quả đánh giá của cảm quan viên về mùi theo phương pháp cho điểm
51

Bảng 3.18: Xử lý kết quả 52

Bảng 3.19: Bảng phân tích phương sai 52



1

LỜI MỞ ĐẦU
Hiện nay trên thị trường Việt Nam có khoảng 300 loại nước giải khát các
loại, mỗi loại đều đánh vào những thị hiếu khác nhau như giải nhiệt, đẹp da, giảm
béo, chữa bệnh Trước đây thị trường nước giải khát ở nước ta đa phần là sản
phẩm nước uống có gas, rất ít những sản phẩm chiết xuất từ trái cây và không có
gas. Nhưng mấy năm gần đây do xu hướng người tiêu dùng ưa chuộng các sản

phẩm nước không gas nên doanh nghiệp kinh doanh nước giải khát đã mạnh dạn
đầu tư dây chuyền mới để tung ra hàng loạt sản phẩm theo nhu cầu của khách hàng.
Kết quả bán hàng năm 2004-2005 của Công ty nước giải khát hàng đầu Việt
Nam Bidrico cho thấy, gần 50% người tiêu dùng thành phố đang chuyển sang các
loại nước uống có chứa vitamine, ít ngọt, mùi vị tự nhiên.
Năm 2010 các doanh nghiệp kinh doanh nước giải khát đã tăng sản lượng
trên mức 20% so với năm 2009: Vinamilk tăng 30% sản lượng nước trái cây nhãn
hiệu Fresh; Pepsi tăng 30% sản lượng nước giải khát không gas. Các nhà nhập khẩu
cũng làm đa dạng thêm thị trường bằng những mặt hàng cùng loại có thương hiệu:
Ligo, Welch"s, Regain, Berri, Drwitt Công ty Delta cũng khẳng định sẽ sản xuất
nhiều sản phẩm nước trái cây, đặc biệt là các loại sử dụng nguyên liệu có tác dụng
thanh nhiệt: atisô, mía lau, sâm, bí đao
Nhờ ưu thế là một nước nhiệt đới có nhiều loại trái cây đa dạng, hiện nay
nước giải khát sản xuất từ trái cây đang được nhiều doanh nghiệp Việt Nam quan
tâm khai thác. Theo công bố nhu cầu tiêu thụ nước giải khát không gas, đặc biệt là
nước trái cây tại Việt Nam tăng rất mạnh, đạt gần 30%/năm.
Nắm bắt được xu hướng đó, việc tính nghiên cứu phát triển sản phẩm mới và
nâng cao chất lượng nước trái cây được đẩy mạnh ở từng doanh nghiệp thực phẩm.
Thường trong các công đoạn sản xuất nước quả có sử dụng các enzyme để nâng cao
chất lượng và hiệu suất sản xuất. Ứng dụng của các enzyme đã được chứng minh
tính hiệu quả cao từ lâu. Những enzyme thường được sử dụng như amylase,
protease, pectinase… ứng dụng khá nhiều, đặc biệt là pectinase trong công nghệ chế


2

biến nước giải khát. . Vì thế việc sử dụng enzyme trong ngành công nghệ giải khát
là cần thiết để nâng cao chất lượng sản phẩm.
Trong lĩnh vực thức uống, enzyme pectinase có tác dụng là một chất làm
trong dịch quả nhằm tránh tình trạng sản phẩm bị phân tầng trong thời gian bảo

quản. Những nghiên cứu về enzyme pectinase cho thấy enzyme này hoạt động tốt ở
khoảng nhiệt độ 30-60
o
C với thời gian ủ 60-120 phút và ứng dụng với dịch chuối
nhiệt độ tối ưu là 43,2
o
C với thời gian ủ 80 phút [69], dịch sapoche ở nhiệt độ tối ưu
là 40
o
C, thời gian ủ 120 phút [28]. Trong luận văn này tôi nghiên cứu sâu hơn quá
trình lọc trong dịch nho ép bằng enzyme pectinase để tìm ra nhiệt độ, thời gian ủ và
nồng độ tối ưu.

Mục tiêu đề tài
Mục tiêu của đề tài nhằm xác định các thông số về nồng độ enzyme
pectinase nhiệt độ ủ, thời gian xử lý trong quá trình làm trong dịch nho ép.

Nội dung nghiên cứu của đề tài
 Xác định các thông số trong quá trình làm trong dịch nho ép
- Xác định khoảng nghiên cứu của nhiệt độ ủ, thời gian xử lý, nồng độ
enzyme pectinase
- Tối ưu hóa các thông số của nhiệt độ ủ, thời gian xử lý, nồng độ enzyme
pectinase trong quá trình làm trong dịch nho
 So sánh chất lượng cảm quan của dịch nho ép giữa các phương pháp làm
trong khác nhau

3

CHƯƠNG 1- TỔNG QUAN
1.1 Giới thiệu chung về nho
Nho là nguyên liệu thô quan trọng để làm rượu và dịch quả vì thế khi hiểu rõ
tính chất vật lý và thành phần hóa học sẽ cải thiện tốt hơn chất lượng sản phẩm.


Hình 1.1 Nho Phan Rang
Nguồn:
1.1.1 Hình dạng, cấu tạo
Nho là loại quả mọng, mọc thành chùm trên các cây dạng dây leo thân gỗ,
sinh trưởng lớn hơn 2 năm và rụng lá theo mùa. . Nho khi chín có thể được sử dụng
trực tiếp hoặc dùng làm mứt, nước ép, thạch, dấm, rượu, chiết xuất dịch từ hạt, nho
khô, mật đường và chiết xuất dầu từ hạt. Nho thường được sử dụng nhiều trong sản
phẩm có chứa nhiều đường. Nó có hình dạng cầu và elips đặc trưng.
Các phần chính trong quả nho là vỏ, thịt và hạt.
Vỏ nho
Nho có lớp vỏ mỏng được xem như là lớp vỏ ngoài bao xung quanh trái, gồm
có 6-10 lớp tế bào, nó được bao phủ bởi láp sáp gọi là cutin. Không giống như các
loại thực vật khác, cấu trúc của vỏ nho rất ít các lỗ khí. Vì thế hàm lượng nước
muốn thoát ra phải qua lớp sáp cutin và thường thì tốc độ thoát hơi nước rất chậm.
Dưới lớp vỏ mỏng bên ngoài thì nho còn một lớp mỏng gọi là lớp dưới da
gồm các tế bào hình dạng phẳng. Những tế bào này có xu hướng tạo ra hợp chất


4

phenol nồng độ cao khi nho chín, đây cũng là hợp chất ảnh hưởng tới mùi, vị, màu
sắc của nho đồng thời các yếu tố cảm quan của sản phẩm từ nho như nước ép, rượu
vang.
Thành phần chính của lớp vỏ: yếu tố tạo màu, tannin, hợp chất thơm, kiềm
và các chất khoáng.
Thịt quả
Tế bào chủ yếu trong thịt quả thường có kích thước lớn và hình cầu khác so
với tế bào ở vỏ.
Những tế bào này thưòng có kích thước không bào lớn, nơi này sẽ bị thay thế
bởi các hợp chất đường, acid, hợp chất phenol khi nho chín.
Những tế bào thịt quả phân chia rất nhanh sau ba tuần nho ra hoa, và tỉ lệ
phân chia còn phụ thuộc vào yếu tố môi trường. Sau giai đoạn phân chia thì các tế
bào hoạt động chậm lại, và thường có xu hướng tổng hợp để tăng kích thước.
Kích thước thịt quả thường được quyết định bởi số lượng và kích thước của
các tế bào bên trong.
Tế bào thịt quả chứa nhiều khoảng không bào lớn bên trong có dịch hoặc
chất dinh dưỡng. Khi nho bị dập, những tế bào trong thịt quả thường bị phá vỡ và
làm thoát dịch ra ngoài.
Hạt nho
Hạt nho thường có lớp vỏ bao ngoài, nội nhũ, phôi, thường khi mới phát
triển, nội nhũ sẽ là nguồn dinh dưỡng để nuôi phôi của hạt. Kích thước của nho
cũng bị ảnh hưởng bởi số hạt có bên trong nó. Vỏ hạt cũng chứa hàm lượng tannin
cao, cũng như hợp chất phenol. Tuy nhiên hợp chất phenol này giảm dần khi nho
chín và phenol thì thường tạo vị đắng chát nếu sử dụng hạt nho.




5

Hình 1.2 Cấu tạo nho
Nguồn:

1.1.2 Thành phần hóa học
Nho tươi chứa 70-80% lượng nước và nhiều chất hòa tan khác bên trong.
Những chất hòa tan này bao gồm cả chất hữu cơ và vô cơ. Một số chất quan trọng
như:
 Đường
 Acid hữu cơ
 Hợp chất phenol
 Hợp chất nito
 Hợp chất thơm
 Hợp chất pectin
 Khoáng
Bảng 1.1 Thành phần hóa học của nho Phan Rang
Nguồn:http//Wikipedia.com/nhophanrang
Chỉ tiêu

Nước
(%)
pH Đường
(g/l)
Acid
tổng số
(g/l)
Pectin
(g/l)
Tro (%)

Nito
(g/l)
Tỷ lệ 90 3,3 126 6,45 2,196 0,68 0,276



6

1.1.2.1 Đường
Trong nho, đường chiếm một phần lớn trong hàm lượng chất tan. Glucose và
fructose là 2 đường chính ở trong dịch ép. Hàm lượng đường trong nho chín có thế
đạt từ 100-150g/l dịch ép. Đối với nho chưa chín thì hàm lượng glucose chiếm
nhiều hơn. Khi nho bắt đầu chín thì tỉ lệ glucose và fructose hiện diện ngang nhau,
còn nho chín quá thì hàm lượng fructose vượt quá glucose nhiều lần. Fructose,
glucose và sucrose có độ ngọt khác nhau, sắp xếp theo thứ tự tăng dần theo độ ngọt
thì : fructose, sucrose, glucose. Nếu tính theo tỉ lệ fructose là 100 thì sucrose là 84
và glucose là 66. Đây là một yếu tố quan trọng đối với nhà sản xuất rượu hoặc nước
giải khát. Ví dụ nếu nhà sản xuất mong muốn nước giải khát có vị ngọt cao thì họ sẽ
cần nhiều sucrose hơn fructose để đạt tới điểm cảm quan mong muốn.
Glucose và fructose là những loại đường có thể lên men. Trong suốt quá trình
lên men, nấm men sẽ chuyển hóa đường thành rượu và CO
2
. Hàm lượng alcohol sản
sinh ra có liên quan tới hàm lượng đường ban đầu trong dịch ép, vì thế để khống
chế hàm lượng alcohol trong dịch thì nên khống chế hàm lượng đường ban đầu. Có
thể tham khảo thêm công thức giữa lượng đường và alcohol trong rượu:
o
Brix x 0,55 = % alcohol trong rượu.
Hàm lượng đường trong dịch nho ép thường được biểu hiện thông qua độ

Brix. Đơn vị Brix được biểu hiện cho hàm lượng đường có trong 100gram dịch ép,
tuy nhiên thông thường thì có thể quy đổi thành hàm lượng đường có trong 100ml
dịch ép. Thông số này có thể được đo bằng thiết bị khúc xạ kế. Hàm lượng đường
cũng có thể đo bằng tỷ trọng kế sau đó chuyển đổi qua độ Brix.
1.1.2.2 Acid hữu cơ
Cũng như hàm lượng đường thì acid hữu cơ cũng đóng vai trò quan trọng
trong dịch ép và rượu nho. Nó đóng vai trò tạo vị chua và ảnh hưởng tới các tính
chất ổn định, màu sắc và pH trong rượu. Các acid quan trọng được tìm thấy trong
nho là: tartaric, malic và citric. Nhiều acid hữu cơ khác như amino acid cũng được
thấy tuy nhiên acid tartaric và malic đã chiếm trên 90% tổng acid có trong nho. Ở


7

giai đoạn đầu phát triển thì hàm lượng acid trong nho tăng dần tuy nhiên khi nho
càng chin, hàm lượng đường càng nhiều thì hàm lượng acid lại giảm. Nhìn chung
acid malic giảm nhiều nhát vì thế khi nho trưởng thành thì lượng acid tartaric chiếm
nhiều hơn acid malic.
Nho là một trong những trái cây chứa nhiều acid tartaric và muối của nó.
Bitartrate là một hợp chất quan trọng ảnh hưởng tới pH và sự ổn định ở nhiệt độ
thấp của rượu.
Thành phần acid trong nho bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như giống loài,
điều kiện địa lý, phương thức trồng trọt… Nồng độ acid ở khí hậu ấm thấp hơn so
với khí hậu lạnh.
Hàm lượng acid có thể đo bằng đơn vị TA, đây là thông số quan trọng dùng
để đánh giá chất lượng của dịch ép và rượu.
1.1.2.3 Hợp chất phenol
Hợp chất phenol là nhóm chất có cấu trúc đa dạng và đóng vai trò quan trọng
trong tạo màu và vị của rượu. Nhóm chức này cũng góp phần vào phản ứng hóa nâu
trong nho và rượu.

Hợp chất phenol có nhiều trong hạt và vỏ của nho, dịch ép chỉ chứa lượng
nhỏ từ 3-5% trên tổng số. Rượu nho trắng ít bị ảnh hưởng bởi vì đã bỏ xác trong
quá trình lên men nên hàm lượng phenol thấp, chỉ từ 100-250mg/l đối với acid
gallic (GAE) . Rượu nho đỏ thì khi lên men có cả hạt và vỏ nên hàm lượng phenol
cao hơn, tùy theo thời gian mà hàm lượng ừ 1000-3500mg/l GAE.
Hai chất chính trong hợp chất phenol là anthocyanins và tannins. Anthocyanin là
yếu tố màu quyết định màu của nho là đỏ hay tím. Ở nho đỏ chưa chín thì
anthocyanins ở dạng tự do, chưa liên kết, đến khi nho chin thì chất này mới liên kết
với các chất khác trong nhóm phenol. Ở trạng thái liên kết thì chất màu này góp
phần vào sự ổn định cho rượu vang đỏ. Tannin là loại hợp chất phức tạp có phân tử
lượng lớn trên 500. Nó có thể màu vàng, nâu hoặc đỏ và có vị chát. Trong suốt quá
trình chế biến và làm chin rượu thì tannin bị polyme hóa nên sẽ làm tăng kích thước


8

phân tử. Khi nho dần chín thì cấu trúc của thành phần hợp chất tannin thay đổi, vì
thế nho bớt đắng, ngon và thơm hơn.
1.1.2.4. Hợp chất nito
Nho chứa nhiều hợp chất nito như ammonium cation và hợp chất nito hữu cơ
như amino acid, peptide, protein. Hàm lượng hợp chất nito phụ thuộc vào giống
nho, khí hậu, thổ nhưỡng, phân bón và kỹ thuật canh tác. Tổng lượng nito tăng dần
khi nho sinh trưởng.
Lượng nito chứa trong hợp chất rất quan trọng bởi vì nó là nguồn dinh dưỡng
cho nấm men và vi khuẩn lactic sinh trưởng. Nito ảnh hưởng tới sự tạo thành sinh
khối của vi khuẩn và nấm, tỉ lệ lên men, các yếu tố cảm quan khác. Protein (hợp
chất nito) có tác dụng tạo sự ổn định trong rượu. Nếu thiếu hàm lượng nito thì sẽ
làm giảm sự lên men và có thể tạo nên hợp chất H
2
S có mùi trứng thối. Để hạn chế

vấn đề này thì nên bổ sung DAP (Diammonium phosphate) vào dịch nho trước khi
lên men. Tỉ lệ lớn nhất DAP cho phép bổ sung là 958,7mg/L hoặc 8lbs/1000 gal.
1.1.2.5. Hợp chất thơm
Nhiều hợp chất thơm bay hơi được tìm thấy trong rượu vang. Những hợp
chất này có thể xuất phát từ nho, quá trình lên men hay ủ rượu.
Phần lớn các hợp chất thơm trong nho nằm trong lớp vỏ hoặc trong tế bào
bên dưới. Sự tập trung của các chất này tăng dần trong quá trình chin nên tốt nhất
thu hoạch nho khi mùi thơm đạt tới điểm cao nhất. Nhiều yếu tố ảnh hưởng tới mùi
thơm trong nho nên khi thực hiện thủ công hay các công đoạn phải cẩn thận để sản
phẩm có hương thơm cao nhất như mong muốn.
1.1.2.6. Chất khoáng
Chất khoáng có trong nho là được hấp thụ từ nguồn đất nơi trồng và thường
chiếm từ 02-0,6% trọng lượng nho tươi. Những chất khoáng quan trọng như: kali,
natri, sắt, phosphate, sulfate và chlorie trong những chất trên thì kali là quan trọng
nhất, chiếm từ 50-70% cation của dịch. Trong quá trình chín, hàm lượng kali trong


9

nho tăng lên, và nó chuyển dần sang trạng thái kali bitartrate nên làm giảm lượng
acid và tăng pH của dịch.
1.1.2.7. Hợp chất pectin
Hợp chất pectin chứa nhiều trong thành tế bào, đây là loại polysaccharide
phức tạp được tạo thành từ các phân tử galacturonic liên kết với nhau. Trong quá
trình chín thì pectin bị thủy phân tự nhiên từ các enzyme pectolytic. Ở trong dịch ép
thì pectin gây nên hiện tượng đục và tạo phân tầng. Để khắc phục vấn đề này thì
nhiều phương pháp sử dụng enzyme thương mại được áp dụng.

1.2. Tổng quan về enzyme
1.2.1 Đặc điểm của enzyme

Khái niệm chung và đặc tính của enzyme
Enzyme là protein có hoạt tính xúc tác. Người ta đã khám phá rằng các
enzyme đã có xúc tác cho hầu hết các phản ứng hóa học xảy ra trong cơ thể sống,
đảm bảo cho quá trình chuyển hóa, tiến hành với tốc độ nhịp nhàng, cần đối theo
những chiều hướng xác định. Như vậy enzyme đã đảm bảo cho sự trao đổi thường
xuyên giữa cở thể sống và môi trường bên ngoài.
Enzyme có hiệu suất xúc tác cực kỳ lớn, có thể gấp hàng trăm, hàng ngàn lần
so với các chất vô cơ và hữu cơ khác.
Enzyme có thể thực hiện hoạt động xúc tác trong điều kiện nhẹ nhàng, ở áp
suất và nhiệt độ bình thường, pH môi trường gần với pH sinh lý, enzyme có khả
năng lựa chọn cao đối với các phản ứng mà nó xúc tác, cũng như đối với chất mà nó
tác dụng.
Bản chất, cấu trúc và cơ chế tác dụng của enzyme
 Bản chất của enzyme
Enzyme đa phần là những protein có hoạt tính sinh học, do vậy nó có đủ
tính chất như một protein thông thường.


10

Enzyme có khối lượng phân tử lớn hơn 12000 Dalton. Giống như các protein
khác, enzyme có thể hòa tan trong nước, trong dung dịch muối loãng nhưng không
tan trong dung môi phân cực Enzyme dễ dàng bị kết tủa bởi các yếu tố vật lý và
hóa học vốn làm kết tủa protein.
Enzyme không bị mất hoạt tính ở nhiệt độ thấp ngược lại dưới tác dụng của
yếu tố gây biến tính protein như nhiệt độ cao, acid hay kiềm đặc, muối kim loại
nặng ở nhiệt độ cao,enzyme thường bị mất hoạt tính xúc tác.
 Cấu trúc của enzyme
Enzyme của nấm mốc cũng như các enzyme khác được chia thành hai loại sau :
o Enzyme một cấu tử (enzyme đơn giản) : trong thành phần phân tử chỉ

có protein, những enzyme này thường xúc tác cho các phản ứng thủy phân.
o Enzyme hai cấu tử (enzyme phức tạp) : trong thành phần cấu tạo của
nó gồm hai thành phần là protein (apenzyme) và phi protein (coenzyme) những
enzyme này thường xúc tác cho các phản ứng oxy hóa-khử, các quá trình vận
chuyển.
Trung tâm hoạt động cua phân tử enzyme chỉ chiếm một tỷ lệ khá nhỏ so với
phân tử enzyme và nó bao gồm nhiều nhóm chức khác nhau. Ở enzyme một cấu tử
thì trung tâm hoạt động là một số nhóm chức nhất định của các acid amin như (-SH,
-OH, -COOH ) Trung tâm hoạt động của enzyme hai cấu tử là do phần polypeptide
kết hợp đặc biệt tham gia vào việc tạo thành trung tâm hoạt động và các nhóm chức
của coenzyme, ngoài ra các trung tâm này còn có sự tham gia của các ion kim loại.
Hoạt tính của enzyme phụ thuộc vào tổng hợp các nhóm tham gia vào cấu
trúc trung tâm hoạt động, nếu vì một lí do nào đó mà trung tâm hoạt động này bị
phá vỡ thì hoạt tính xúc tác của enzyme mất đi.
 Cơ chế tác dụng của enzyme
Enzyme (E) là chất xúc tác sinh học, khi tác dụng với cơ chất (S) để ra sản
phẩm (P) trải qua các giai đoạn theo cơ chế sau :
E+S  ES  P+E


11

o Trong giai đoạn thứ nhất : enzyme kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu tạo
thành phức enzyme cơ chất (ES) không bền, phản ứng này xảy ra nhanh và
đòi hỏi năng lượng hoạt hóa thấp.
o Trong giai đoạn thứ hai : xảy ra sự biến đổi cơ chất dưới tác dụng của
enzyme dẫn đến sự kéo căng và phá vỡ các liên kết đồng hóa trị tham gia
phản ứng này. Kết quả làm cho cơ chất được hoạt hóa dễ dàng tham gia phản
ứng hơn.
o Trong giai đoạn thứ ba : sản phẩm tạo thành, còn enzyme được giải phóng

dưới dạng tự do để tiếp tục tham gia tác dụng với cơ chất khác.

Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng của enzyme
Tốc độ phản ứng của enzyme phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau như bản chất
và nồng độ các chất phản ứng, nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH môi trường, nồng độ
ion trong môi trường, nồng độ các chất kìm hãm, các chất hoạt hóa enzyme
 Ảnh hưởng của nhiệt độ : giống như các phản ứng hóa học, các phản ứng cho
enzyme xúc tác phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt độ. Theo quy luật của phản ứng hóa
học thì khi nhiệt độ tăng thì tốc độ phản ứng tăng, nhưng vì bản chất của enzyme là
protein nên nhiệt độ chỉ tăng cao đến mức nhất định. Đa số các enzyme sẽ bị mất
hoạt tính ở nhiệt độ 60
o
C trở lên, trông nhiệt độ thích hợp nếu cứ tăng lên 10
o
C thì
tốc độ phản ứng tăng lên 1,5-2 lần.
Nhiệt độ thích hợp của enzyme phụ thuộc vào nhiều yếu tố : thời gian tác dụng
dài thì nhiệt độ thích hợp của enzyme càng thấp. Ngoài ra còn phụ thuộc vào nồng
độ enzyme, nồng độ cơ chất, dạng tồn tại của enzyme cũng sẽ làm biến đổi tác dung
của nhiệt độ.
 Ảnh hưởng của pH : enzyme rất nhạy cảm với pH của môi trường. Mỗi
enzyme chỉ thích hợp ở một pH xác định gọi là pH tối thích của enzyme


12

Một số enzyme hoạt động ở pH thấp như pepsin pH=1,8-2,2 và hoạt động ở pH
cao như tripsine pH=5-9, cùng một số loại enzyme thu được ở các nguồn khác nhau
cũng có pH tối thích khác nhau.
 pH của môi trường ảnh hưởng tới tốc độ phản ứng có thể do:

- pH làm thay đổi trạng thái ion hóa của các nhóm định chức ở trung tâm
hoạt động của enzyme, làm thay đổi khả năng phản ứng của các nhóm này trong
phản ứng xúc tác và có thể làm thay đổi cấu trúc trung tâm của enzyme.
- pH cũng làm thay đổi trạng thái ion hóa cơ chất, tại pH tối thích, phân tử cơ
chất được ion hóa tới trạng thái thích hợp nhất cho sự kết hợp với enzyme, nhờ đó
phản ứng có vận tốc cao nhất.
 Ảnh hưởng của thời gian : trong quá trình thủy phân, thời gian tác dụng của
enzyme lên cơ chất có ảnh hưởng tới hoạt động của nó và đến chất lượng của sản
phẩm. Thời gian tác dụng càng dài thì sự tác dụng càng triệt để. Mặt khác nếu thời
gian tác dụng quá ngắn thì sự phân giải protein chưa triệt để, như vậy hiệu suất
thủy phân thấp gây khó khăn cho công đoạn tiếp theo, gây lãng phí nguyên vật
liệu, không tận dụng hết nguyên liệu ban đầu.
 Ảnh hưởng của nồng độ muối : muối ăn có tác dụng kìm hãm hoạt động của
vi sinh vật gây thối rữa và các vi sinh vật không chịu muối, có tác dụng bảo quản
nguyên liệu trong quá trình thủy phân. Mặt khác, muối ăn còn điều vị mặn tùy theo
lượng muối bổ sung vào, ở nồng độ giới hạn cho phép thì thúc đẩy enzyme hoạt
động mạnh, nếu vượt qua giới hạn cho phép thì sẽ kìm hãm sự hoạt động của
enzyme.
 Ảnh hưởng của ion kim loại : một số enzyme không bị ảnh hưởng rõ rệt của
sự có mặt hay không có mặt đối với ion kim loại, nhưng có nhiều enzyme khác
chịu ảnh hưởng sâu sắc của nồng độ và bản chất của ion kim loại. Có những ion
kim loại hầu như tuyệt đối cần thiết cho sự hoạt động của một số enzyme, nhưng
một số ion kim loại lại ức chế hoạt động của enzyme này.
 Ảnh hưởng của chất kìm hãm : chất kìm hãm là chất làm yếu hoặc chấm dứt
toàn bộ phản ứng của enzyme. Có hai loại chất kìm hãm :


13

Kìm hãm cạnh tranh : là những chất kìm hãm thuận nghịch enzyme, có cấu trúc

tương tự với cấu trúc cơ chất, do đó có khả năng kết hợp vào trung tâm hoạt động
của enzyme, do vậy nó chiếm chổ kết hợp của cơ chất làm giảm vận tốc xúc tác.
Kìm hãm không cạnh tranh : là chất kết hợp ở vị trí khác với trung tâm hoạt
động làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzyme theo hướng không có lợi
cho hoạt động xúc tác của enzyme, làm giảm vận tốc phản ứng xúc tác.
 Ảnh hưởng của chất hoạt hóa : chất hoạt hóa là những chất có khả năng làm
tăng hoạt động xúc tác của enzyme hoặc làm cho enzyme ở dạng không hoạt động
thành dạng hoạt động. Chất hoạt hóa có thể làm tăng hay phục hổi hoạt độ của
enzyme một cách gián tiếp hay trực tiếp.
Hoạt hóa không gián tiếp : làm tăng tốc độ phản ứng của enzyme bằng cách
loại trừ chất kìm hãm ra khỏi hỗn hợp phản ứng hoặc tham gia trực tiếp phản ứng,
nhưng không tác dụng trực tiếp với phân tử enzyme.
Hoạt hóa gián tiếp : chất này có tác dụng trực tiếp vào trung tâm hoạt động
của enzyme hoặc làm thay đổi cấu hình không gian của phân tử enzyme theo hướng
có lợi cho hoạt động xúc tác.
1.2.2 Enzyme pectinase
1.2.2.1 Giới thiệu về enzyme pectinase
Enzyme pectinolytic có nhiều trong thực vật và vi sinh vật [74]. Đây là yếu
tố quan trọng trong thực vật mà có thể củng cố thành tế bào [70] và giúp làm mềm
các mô tế bào trong quá trình chín và bảo quản [61,5]. Enzyme này cũng là nhân tố
góp phần vào việc cân bằng môi trường khi phân hủy và tái chế các phần thừa thực
vật [34].
Vi sinh vật sản sinh pectinase cũng được nghiên ngứu nhiều trong những
năm gần đây [36]. Các nghiên cứu về enzyme pectinase từ vi khuẩn [15,14,12], nấm
men [13,56] và nấm [21,56]. Tuy nhiên hầu hết các sản phẩm hiện tại của pectinase


14

được chiết xuất từ nguồn nấm [65]. Aspergillus niger được xem là loại nấm phổ

biến nhất để sản xuất hệ enzyme pectinase công nghiệp [50,26].
Hợp chất pectinase được phân loại [61] [52] như sau:
o Protopectinase: chuyển hóa hợp chất protopectin không tan thành pectin hòa
tan.
o Esterases: cắt và ngăn quá trình ester hóa của hợp chất pectin bằng cách cắt
các nhóm methoxyl ester.
o Depolymerases: cắt và thủy phân mạch α-(1-4)-glycosidic của acid D-
galacturonic trong hợp chất pectin.
Phản ứng de-polyme trên hợp chất pectin có 2 cơ chế khác nhau, thủy phân
và cắt các mạch của pectin có sự tham gia của nước và oxy hoặc là cắt bộ khung
pectin nhưng không có sự hiện diện của các phân tử nước [6,16]. Depolymerase có
thể chia thành 4 loại khác nhau, phụ thuộc vào hợp chất enzyme nền là gì, cơ chế
chung đều là cắt các mạch glycosis [57].
Polygalacturonase và polymethylgalacturonase cắt các mạch pectate và
pectin, chủ yếu là dùng cơ chế thủy phân. Tuy nhiên, polygalacturonate lyase và
polymethylgalacturonate lyase cắt các mặc pectate và pectin bằng loại trừ nhóm β.
Phụ thuộc vào yếu tố phản ứng, ngẫu nhiên hay có mục đích thì enzyme được chia
thành enzyme nội bào hay enzyme ngoại bào [27]. Polygalacturonase (PGases) là hệ
enzyme pectinolytic cắt các mạch acid polygalacturonic cùng với sự tham gia của
nước và oxy. Có nhiều nghiên cứu sâu về các loại enzyme trong hệ này. Hệ enzyme
PGases thủy phân hợp chất pectin gồm có endo-PGase (E.C.3.2.1.15) và exo-Pgases
(E.C.3.2.1.67). PGases có những ứng dụng rộng rãi trong công nghệ thực phẩm.
Endo-PGases có nhiều trong nấm, vi khuẩn và nấm men [42]. Nó được tìm
thấy nhiều trong loại giun tròn kí sinh [63], hay nhiều loài như Aureobasidium
pullulans [64], Rhizoctonia solani Kuhn [48], Fusarium moniliforme [19],
Neurospora crassa [55], Rhizopus stolonife [47], Asppergillus sp.[49],
Thermomyces lanuginosus [40], Peacilomyces clavisporus [66]. Endo-PGases
thường được tìm thấy trên nhiều loài vi sinh vật. Tuy nhiên, exo-PGases ít thấy hơn.

15

Các loài vi sinh vật được nghiên cứu như Erwinia carotovora [52], Agrobacterium
tumefacinens [58], Bacteroides thetaiotamicron [67], E.chrysanthemi [39],
Alternaria mali [57], Fusarium oxysporum [44], Ralstonia solanacearum [31],
Bacillus sp. [39].
Exo-PGases có thể phân thành 2 nhóm : nhóm nấm exo-PGase sản sinh acid
monogalacturonic và nhóm vi khuẩn exo-PGase sản sinh acid digalacturonic như là
nhóm chất chính [63].
Pectinesterase: Pectinesterase (PE, Pectin pectlyhydrolase, E.C.3.1.1.11),
thường được tham khảo như pectinmethylesterase, pectase, pectin methoxylase,
pectin demethoxylase và pectolipase, là acid cacboxylic esterase và thuộc vào nhóm
enzyme thủy phân [72]. Nó cắt các nhóm methyl ester của bộ khung galacturonan
trong hợp chất pectin để giải phóng acid pectin và methanol [18].
PE thương mại có thể được dùng để bảo vệ hay cải thiện bề mặt, tính chắc
của một số công đoạn chế biến trái cây và rau củ cũng như để chiết dịch hay làm
trong dịch quả [22]. PE thường được tìm thấy trong thực vật, vi khuẩn, nấm [30].
Vài nghiên cứu chỉ là một số vi khuẩn có enzyme này như Rhodotorula sp. [68],
Phytophthora infestans [23], Erwinia chrysanthemi B341 [54], Saccharomyces
cerevisiae [24], Aspergillus niger [45,46], Lactobacillus lactis subsp. Cremoris [35],
Penicillium frequentans [37], E.chrysanthemi 3604 [41], Penicillium occitanis [29],
A.japonicus [64]. PE trong thực vật như Carcica papaya [22,33, Lycopersicum
esculentum [71], Prunus malus [45], Vitis ninifera [17], Citrus sp. [10] Poutera
sapota [9] và Malpighia glabra L [11]


16


Hình 1.1 Cơ chế phản ứng của Pectinesterase (a) và Polygalacturonase(b)

Dưới tác dụng của pectinase tính chất của dung dịch pectin thay đổi nhiều.
Pectinesterase tách gốc metyl khỏi phân tử pectin làm lộ các nhóm cacboxyl rất
hoạt động, dễ kết hợp với các ion kim loại(ví dụ Ca
2+
) để tạo thành các muối không
hòa tan, kết lắng lại và có thể tách dễ dàng. Còn polygalacturonase phân hủy phân
tử pectin thành các đoạn mạch ngắn hơn, làm mất khả năng tạo del, làm giảm độ
nhớt của dung dịch, làm độ acid và hàm lượng các chất khử tăng lên.
1.2.2.2 Ứng dụng của enzyme pectinase
Các enzyme pectic được sử dụng rộng rãi trong công nghệ nước quả và làm
rượu thường cos nguồn gốc từ nấm mốc, đặc biệt là từ nấm Aspergillus niger. Dịch
quả được sản xuất trong công nghiệp bao gồm: Nước quả trong (táo, lê, nho ) , nước
quả đục (chanh, mận, cà chua, nước dạng nectar), những sản phẩm dùng enzyme để
thủy phân polysaccharide của lớp vỏ.
Mục đích của việc sử dụng enzyme là khác nhau tùy vào loại dịch quả mong
muốn.

1.2.2.2.1 Nước quả trong
Trong trường hợp sản xuất nước quả trong, enzyme được thêm vào nhằm tăng
lượng dịch thu được trong quá trình ép và làm trong dịch bằng cách làm lắng các


17

yếu tố gây đục. Mục tiêu là thu được tối đa dịch quả và dịch quả không bị đục sau
đó.
Một số sản phẩm ứng dụng enzyme pectinase
a. Nước táo
Nước táo được sản xuất theo cách tự nhiên, không lọc, không làm trong thì
dịch quả chứa hàm lượng thịt quả cao nên dịch sẽ được ly tâm rồi lọc, lúc này dịch

ép táo sẽ có màu vàng nâu. Mặc dù enzyme pectinase có thể cắt các mạch polymer
ở các nhóm ester pecin nhưng không phải chỉ sử dụng enzyme để làm trong mà còn
kết hợp một số phương pháp khác nữa. Sự kết hợp giữa pectinase và cellulose có thể
tăng hiệu suất ép dịch lên tới 100% [7]. Một yếu tố khác làm đục nữa là thành phần
tinh bột, đối với táo chưa chín thì hàm lượng tinh bột chiếm tới 15% tổng thành phần.
Có thể sử dụng thêm enzyme amylase (thường là amyloglucosidase) có thể hoạt động
tốt ở pH của dịch táo và thêm cùng với enzyme pectinase.
Ép dịch: Bước đầu tiên trước khi ép dịch là rửa, phân loại, làm dập bằng máy
nghiền. Mặc dù pectinase thường được thêm ở công đoạn này nhưng kết quả sẽ cao
hơn nếu phần thịt quả được nghiền và giữ trong các thùng lớn từ 15-20 phút để các
chất kìm hãm enzyme (polyphenols) bị oxi hóa bởi các enzyme polyphenol oxidase
có sẵn trong quả. Vì polyphenol là một chất kìm hãm enzyme pectinase nên có thể
bổ sung enzyme polyphenol oxidase vào hoặc thêm chất polyvinyl pyrolidone
(PVP) giúp oxi hóa hợp chất phenol từ đó tạo điều kiện cho sự hoạt động của
enzyme pectinase [20].
Enzyme pectinase được sử dụng trong quá trình ép dịch táo nhằm tạo điều
kiện cho quá trình được thực hiện dễ dàng hơn thu được nhiều dịch hơn, bên cạnh
đó enzyme cũng được sử dụng nhằm tạo kết tủa các chất lơ lửng, và hỗ trợ cho quá
trình lắng cặn hoặc ly tâm. Xử lý bằng enzyme với pectinase diễn ra từ 15 phút cho
đến 2h tùy vào loại dịch ép và nồng độ của enzyme, thời gian, nhiệt độ [38]. Trong
suốt quá trình ủ, enzyme pectinase sẽ cắt các mạch của pectin hòa tan trong trong
thịt quả vì pectin này có thể làm giảm chất lượng dịch ép. Thứ nhất, những phân tử
pectin có tính nhớt nằm trong dịch quả nên gây khó khăn trong quá trình ép dịch từ


18

thịt quả. Thứ hai là pectin làm bít các đường thoát dịch ép từ trong thịt quả ra ngoài
nên tỉ lệ dịch ép không cao[36]. Bên cạnh đó nếu thịt quả không bị nghiền nhiều thì
hiệu suất ép cũng không cao. Xử lý enzyme sẽ đạt hiệu quả cao với táo chín và

được bảo quản lạnh [60].

Hình 1.2 Quy trình sản xuất nước táo ép [25]

Làm trong dịch: Sự làm trong dịch quả bằng enzyme bị ảnh hưởng bởi các
yếu tố nhiệt độ, thời gian ủ, nồng độ enzyme. Dịch quả với pH thấp sẽ làm trong dễ
dàng hơn là làm với pH cao cũng như nhiệt độ càng tăng thì hiệu quả cao hơn, miễn
là xử lý enzyme trong khoảng nhiệt độ 40-60
o
C [38]. Nhìn chung thì thời gian xử lý
sẽ nghịch đảo với nồng độ enzyme trong khoảng nhiệt độ 5-50
o
C [36].


19

Nếu dịch quả muốn đục thì dịch nên được thanh trùng nhanh chóng sau khi
ép để bất hoạt các enzyme tự nhiên trong dịch nhằm tránh gây biến đổi xấu. Sau đó
có thể ly tâm và loại bỏ các phần lơ lửng hay lắng cặn. Đối với dịch quả trong thì
các phần lắng cặn phải loại bỏ hoàn toàn. Các enzyme thương mại được sử dụng
kèm như pectinase, hemicellulase và cellilases được phép dùng [25]. Những
enzyme này có thể được cung cấp bởi Gist-brocades và được dùng với hàm lượng
200-600g/tấn táo nghiền với vận tốc 40-60 vòng/phút trong 3h ở nhiệt độ 50
o
C.
Dịch của táo sau khi nghiền được ly tâm.
Một số nghiên cứu đưa ra phương pháp sử dụng enzyme PG hoặc PME mà
không cần các enzyme khác trong táo. Có nghiên cứu cũng chỉ ra rằng sử dụng
enzyme pectin lyase (PL) ở pH=3-4 có thể làm trong dịch táo. Bên cạnh đó vì dịch

táo chứa 91-91% ester pectin nên cũng dễ dàng lọc bởi PL. Dịch táo trong có thể
làm tăng thời gian bảo quản nếu bảo quản trong điều kiện lạnh.
Lợi ích của việc sử dụng enzyme pectinase trong dịch táo: đa dạng hóa được sản
phẩm như nước táo trong, nước táo đục từ đó tăng được giá trị của nguyên liệu
tươi. Trong sản xuất, thời gian ép dịch được rút ngắn hơn và đặc biệt xử lý bằng
enzyme làm tăng tính ổn định và sản phẩm có mùi vị thơm ngon hơn khi loại bỏ bã
và tiết kiệm hơn về kinh tế (năng suất tăng, ít thiêt bị máy móc).

b. Nước ép lê
Thành phần trong quả lê thay đổi trong quá trình chin và bảo quản sau thu
hoạch. Cũng như táo, thành phần protopectin sẽ giảm do bị chuyển thành pectin nên
độ nhớt tăng trong suốt quá trình chín Khi chín, hợp chất phenol bị oxi hóa và
chuyển thành hợp chất không tan (lignin). Sự hiện diện của xơ cứng làm giảm chất
lượng của lê. Các xơ cứng đó là lignocelluloses và chứa khoảng 18% lignin, 82%
cacbonhydrate, điều này dẫn tới sự khó khăn khi lọc. Araban, hemicelluloses và
cellulose có hàm lượng khá cao trong lê, đó là lý do tại sao sử dụng enzyme
pectinase với hoạt tính của arabanase và arabinosidase cao. Quá trình đối với nước
ép lê cũng tương tự như táo. Lê được nghiền và bổ sung enzyme vào các bước với